JPH0458318B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｌ−フエニルアラニンの製造方法に
関する。

Ｌ−フエニルアラニンは、必須アミノ酸の一つ
であつて、栄養強化剤、医薬用アミノ酸輸液、結
合アミノ酸製剤等に使用されるのほか、食品添加
剤としても使用される有用な化合物であり、ま
た、近年では、甘味料アスパルテームの原料とし
ても注目を集めている化合物である。

Ｌ−フエニルアラニンを製造する従来の方法
は、大別すると、発酵法による製法と、化学合成
したラセミ体の分割による製法の二つに分けられ
る。発酵法により製法によればＬ−体のみを生産
することはできるが、Ｌ−フエニルアラニンにつ
いては、他のアミノ酸の製造にあたつてみられる
程、培養物中にそれを著量に蓄積せしめる方法は
見い出されていない。一方、化学合成によるラセ
ミ体を分割して製造する方法は、その分割を酵素
を用いて行う方法が主流をなしていて、それ等は
エステラーゼを用いる方法とアシラーゼを用いる
方法とに分けることができる。エステラーゼ法に
ついては、例えば特公昭57−35956号にその例を
見ることができる。この方法は、Ｎ−アシル−
DL−フエニルアラニンメチルエステルを原料に
して、これにエステラーゼ活性を有する酵素を作
用させ、Ｎ−アシル−Ｌ−フエニルアラニンとＮ
−アシル−Ｄ−フエニルアラニンメチルエステル
に分離する方法であるが、この両化合物は、性質
が酷似していることから、両者を完全に分離する
ことは困難である。また、この方法を介してＬ−
フエニルアラニンを得る方法については、アシル
基を除去する必要がある。

前記アシラーゼ法は、現在、最も多く実施され
ている方法ではあるが、Ｎ−アシル−DL−フエ
ニルアラニンを原料にするものであり、生成物の
Ｌ−フエニルアラニンとＮ−アシル−Ｄ−フエニ
ルアラニンを有機溶剤により抽出分離する場合、
Ｎ−アシル−Ｄ−フエニルアラニンが有機層に、
そしてＬ−フエニルアラニンが水層にそれぞれ移
るときの両者の分配が完全に行われないことから
抽出や塩析抽出を繰り返し行うことを必要とする
ことおよびＮ−アシル−Ｄ−フエニルアラニンを
再使用する場合のラセミ化を、無水酢酸を用いて
高温（〜100℃）で行わなければならないこと等
種々の欠点が存在していた。

本発明者等は、光学活性フエニルアラニンの製
造法につき、種々研究したところ、Ｎ−アシル−
DL−フエニルアラニンアルキルエステルにアシ
ラーゼを作用せしめると、酵素が、まず、エステ
ル部位のアルキル基を脱離せしめ、次いでＮ−ア
シル部位のアシル基を脱離せしめるという２段階
の作用を行うことおよびこの作用がＬ体のみに行
われることを見出した。また、この際の酵素反応
において、その反応を有機溶剤と水との２相系溶
媒中で行わしめると、生成したＬ−フエニルアラ
ニンが水層に溶解し、反応に関与しなかつたＮ−
アシル−Ｄ−フエニルアラニンアルキルエステル
が、有機溶剤層中に溶解しているため、この両化
合物を２層に分けるという極めて簡便な操作で分
離し得ることを見出した。

本発明は、かかる知見に基づいてなされたもの
である。したがつて、本発明は、水と混和し得ず
２相系を形成する有機溶剤と水との２相系溶媒を
用い、その溶媒中で、一般式、 （式中、R¹，R²は、それぞれ、同一か又は異つ
て、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換
アリールを表わす）で表わされるＮ−アシル−
DL−フエニルアラニンアルキルエステルにアシ
ラーゼを作用させることにより、Ｎ−アシル−Ｌ
−フエニルアラニンアルキルエステルにアシラー
ゼを作用させることにより、Ｎ−アシル−Ｌ−フ
エニルアラニンアルキルエステルのアシル基およ
びアルキル基を脱離せしめ、次いで水相中に溶解
している生成したＬ−フエニルアラニンを取得す
ることを特徴とするＬ−フエニルアラニンの製造
方法を提供するものであり、また、同時にＤ−フ
エニルアラニンの製法をも提供するものである。

以下に、本発明を詳細に説明する。

本発明方法においては、原料として、前記一般
式（）で表わされるＮ−アシル−DL−フエニ
ルアラニンアルキルエステルが用いられるが、代
表的な実施態様例においては、これを、水と混和
し得ず２相系を形成する有機溶剤に溶解する。一
方、アシラーゼを水に溶解又は懸濁し、PHを6.5
〜8.5、望ましくは、7.0〜7.5に調製する。次い
で、上記の有機溶剤溶液と上記の水溶液（又は水
懸濁液）とを合する。両溶液は、混和し得ず２相
系を形成するが、この全反応系を温度20〜40℃に
調整し、激しく撹拌する。この際、使用する酵素
の種類に応じて、活性化剤として、Co、Ca、
Mg、Mn、Zn等の金属イオンを反応系中に加え
ておくことが望ましい。反応時間は、通常、３時
間ないし２日間であり、この間撹拌を続ける。

この撹拌の間に、アシラーゼは、一般式（）
で表わされるＮ−アシル−DL−フエニルアラニ
ンアルキルエステルのうちのＬ体のみに特異的に
作用し、先ずそのアルキルエステル部位のアルキ
ル基を脱離し、次いでＮ−アシル部位のそのアシ
ル基を脱離する。そして結局、Ｌ−フエニルアラ
ニンが生成し、酵素反応に関与しなかつたＮ−ア
シル−Ｄ−フエニルアラニンアルキルエステルが
残留する。反応液は、撹拌終了後、しばらく静置
すると水層と有機溶剤層の２層に分離する。水層
には生成したＬ−フエニルアラニンが溶解して存
在しており、有機溶剤層にはＮ−アシル−Ｄ−フ
エニルアラニンアルキルエステルが溶解して存在
している。

この水層を分取し、そのPHを約5.8に調整して
静置するか、又は分取した水層を濃縮後、冷却す
るかすると、Ｌ−フエニルアラニンが晶出する。
このＬ−フエニルアラニンは、再結処理しなくて
もよいほど高光学純度のものである。

水層を分離した残りの有機溶剤層中に存在する
Ｎ−アシル−Ｄ−フエニルアラニンアルキルエス
テルは、これをラセミ化してＮ−アシル−DL−
フエニルアラニンアルキルエステルに変換し、本
発明方法の原料として循環的に使用することがで
きる。その際のＮ−アシル−Ｄ−フエニルアラニ
ンアルキルエステルのラセミ化は、前記有機溶剤
層を格別の処理に付することなく、そのまま使用
し、それにアルカリ金属アルコラートの0.1〜0.5
％（重量比）量を加え、30〜50℃程度の温度に加
温処理することにより達成することができる。

また、これとは別に、有機溶剤層中に存在する
Ｎ−アシル−Ｄ−フエニルアラニンアルキルエス
テルは、Ｄ−フエニルアラニンを製造する目的に
も使用することができる。その場合には、分取し
た有機溶剤層を水洗し、例えば無水硫酸マグネシ
ユーム等の無機酸の無水金属塩の脱水剤で脱水処
理し、有機溶剤を留去し、残留分に塩酸、臭化水
素酸等の無機酸を加え、煮沸処理した後、無機酸
を留去し、残留分のPHを適宜調整するとＤ−フエ
ニルアラニンを晶出させることができる。

本発明方法において、前記の２相系溶媒の水相
中には、反応を行わしめるにあたり、緩衝塩例え
ば、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸
水素カリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウ
ム、リン酸カリウム、トリス−（オキシメチル）−
アミノメタン等の含有せしめておくことができ
る。

本発明方法で使用される有機溶剤の例として
は、ヘキサン、ペンタン、クロロホルム、エチレ
ンジクロリド、トリクレイン、ベンゼン、トルエ
ン、酢酸エチルエステル、酢酸メチルエステル、
プロピオン酸メチルエステル等のあげることがで
きる。

本発明方法で使用されるアシラーゼは、特に、
特定されず、微生物由来のものであつても、動物
組織由来のものであつてもいずれでもよい。酵素
系統（EC3・５・１・14）のアシラーゼ、アミノ
アシラーゼを使用することができる。具体例とし
ては、例えばアシラーゼ「アマノ」15000、アシ
ラーゼなどをあげることができる。

本発明の方法において、原料として使用される
Ｎ−アシル−DL−フエニルアラニンアルキルエ
ステルは、従来知られている方法により容易に製
造することのできるものである。その等の方法と
しては、例えばDL−フエニルアラニンをアシル
クロリドを用いてＮ−アシル−DL−フエニルア
ラニンとし、次いでこれをエステル化して得る方
法、DL−フエニルアラニンをエステル化し、次
いで、これをアシル化して得る方法がある。また
これ等以外の方法として、一般式（）で表わさ
れる化合物が最も一般的なＮ−アセチル−DL−
フエニルアラニンメチルエステルである場合につ
いて述べると、Ｎ−アセチルグリシンとベンズア
ルデヒドから２−メチル−４−（フエニルメチレ
ン）−５（4H）−オキサゾロンを得〔Org.
Synthesis、Coll.Vol.、１（1943）に記載の方法
による〕、これをメタノール中ナトリウムメトキ
シサイドで処理してα−Ｎ−アセトアミド桂皮酸
メチルエステルとし（A.H.Cook、et al.、J.
Chem.Soc.、1056（1948）参照）、次いで、ラネー
ニツケルを触媒として用いて接触還元する〔J.
M.Roper et al、Sythesis1041（1983）参照〕こ
とにより得る方法もある。

本発明の方法は、工業的方法として下記の〜
の如き、各種の利点を有する。

原料のＮ−アシル−DL−フエニルアラニン
アルキルエステルが、水にほとんど溶けない物
質であり、生成するＬ−フエニルアラニンが水
溶性であることおよび、反応に関与しなかつた
Ｎ−アシル−Ｄ−フエニルアラニンアルキルエ
ステルが有機溶剤層に溶解していること、この
両物質の水層有機溶剤層に対する分配率が極め
て高いことにより両物質の分離を極めて効率的
に行うことができる。

Ｄ−フエニルアラニンを目的とする場合は、
分離したＮ−アシル−Ｄ−フエニルアラニンア
ルキルエステルを希酸で処理してＤ−フエニル
アラニンを取得することができる。

Ｎ−アシル−Ｄ−フエニルアラニンアルキル
エステルをアルコラートを用いて処理するとい
う簡単な方法によりラセミ化し、本発明方法の
原料に循環使用することができる。

以下に実施例を掲げ、本発明を具体的をもつて
説明する。

実施例 １ アシラーゼ14mg（SIGMA0.23units／mg
solid）と塩化コバルト６水和物10.8mgを２％
NaHCO₃水15mlに溶解し、水溶液とする。Ｎ−
アセチル−DL−フエニルアラニンメチルエステ
ル2.0ｇをトルエン15mlに溶解し、上記水溶液に
加える。37℃で５時間激しく撹拌する。静置して
水層とトルエン層とを分液し、水層をトルエン15
mlで抽出する。両トルエン層を合わせ、無水硫酸
マグネシウムで脱水後、留去するとＮ−アセチル
−Ｄ−フエニルアラニンメチルエステル1.0ｇ
（〔α〕_D＝−84.4°（トルエン、ｃ＝２）光学純度96
％）が得られた。一方、水層は、5N−NaOHを
用いてPH7.0に調整した後、37°で24時間熟成し
た。水、約2/3量を留去すると、Ｌ−フエニルア
ラニン627mg〔Ｙ：84％、〔α〕_D＝−32.7°（水、ｃ
＝２）光学純度99％〕が得られた。

実施例 ２ アシラーゼ（「アマノ」15000）200mgと塩化コ
バルト６水和物10.8mgを２％NaHCO₃水15mlの溶
解し、水溶液とする。Ｎ−アセチル−DL−フエ
ニルアラニンメチルエステル4.0ｇをトルエン18
mlに溶解させ、このトルエン溶液を上記水溶液に
加える。この混合物に、Ｎ−NaOHを滴下して、
PHを7.0〜7.3に調整しながら、37℃で３時間激し
く撹拌する。撹拌終了後、静置し、水層とトルエ
ン層とを分液する。この水層に更にＮ−アセチル
−DL−フエニルアラニンメチルエステル4.0ｇの
トルエン溶液を加え、PHを7.0〜7.3に調整しなが
ら37℃で３時間激しく撹拌する。前述の操作と同
様にしてトルエン層を分液した後、再び上記の操
作を繰り返し、上記のトルエン溶液を加え、37℃
で６時間激しく撹拌する。トルエン層を分液した
後、水層をトルエン18mlで抽出した。トルエン層
を合わせ、得られた全トルエン層を水洗した後、
無水硫酸マグネシウムで脱水し、留去した。残留
物に4N−HCI15mlを加え、２時間煮沸した。塩
酸ガスを減圧留去した後、5N−NaOHでPHを5.6
に調整すると、Ｄ−フエニルアラニン3.7ｇ
（Ｙ：82.6％、〔α〕_D＝＋32.3°光学純度98％）が得
られた。一方、水層には濃塩酸17mlを加え、1.5
時間煮沸した。水を半量程度留去し、5N−
NaOHを用いて、PHを5.6に調整するとＬ−フエ
ニルアラニンが析出した。これを取した後、少
量の氷水で洗浄し、次いで乾燥すると3.6ｇ
（Ｙ：80.4％、〔α〕_D＝−32.1°（水、ｃ＝２）光学
純度97.3％）の収量が得られた。

参考例 １ Ｎ−アセチル−Ｄ−フエニルアラニンメチルエ
ステルのラセミ化 実施例１で得られたＮ−アセチル−Ｄ−フエニ
ルアラニンメチルエステル1.5ｇをトルエン30ml
に溶解し、これにナトリウムメトキシサイド38mg
を加え、40℃で１時間激しく撹拌した。ナトリウ
ムメトキシサイドをデカンテーシヨンにより除
き、トルエンを留去する。Ｎ−アセチル−DL−
フエニルアラニンメチルエステル1.41ｇ（Ｙ：94
％、ラセミ化率100％）が得られた。

参考例 ２ (1) α−Ｎ−アセトアミド桂皮酸メチルエステル
の合成〔A.H.Cook、G.Harris、Ian Heilbron
and G.Shaw、J.Chem.Soc.、1056−1060
（1948）参照〕 ナトリウムメトキサイド0.54ｇ（0.01モル）を
メタノール25mlの溶解し、これに２−メチル−４
−（フエニルメチレン）−５（4H）−オキサゾロン
（Org.Synth.Coll.Vol.、（1943））18.7ｇ（0.1モ
ル）を加える。室温で15分撹拌した後、メタノー
ルを留去する。残留分を塩化メチレン120mlに溶
解し、これを、Ｎ−HCl40ml、水100mlの順で洗
浄する。塩化メチレン層をとり、無水硫酸マグネ
シウムで脱水した後、留去するとα−Ｎ−アセト
アミド桂皮酸メチルエステル（mp.122〜123.5℃）
21.9ｇ（Ｙ：定量的）が得られた。

(2) Ｎ−アセチル−DL−フエニルアラニンメチ
ルエステルの合成〔J.M.Roper、D.P.Bauer、
Synthesis1041（1983）参照〕 (1)で得られたα−Ｎ−アセトアミド桂皮酸メチ
ルエステル21.9ｇ（0.1モル）をメタノール70ml
の溶解する。これに、10％Pd−Ｃ（50重量％）2.2
ｇを加え、水素雰囲気下、室温で２時間、接触還
元をおこなつた。触媒を除去し、メタノールを留
去するとＮ−アセチル−DL−フエニルアラニン
メチルエステル（m.p60〜61℃）22.1ｇ（Ｙ：定
量的）が得られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水と混和し得ず２相系を形成する有機溶剤と
   水との２相系溶媒を用い、その溶媒中で、一般
   式、 （式中、R¹，R²は、それぞれ、同一か又は異つ
   て、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換
   アリールを表わす）で表わされるＮ−アシル−
   DL−フエニルアラニンアルキルエステルにアシ
   ラーゼを作用させることにより、Ｎ−アシル−Ｌ
   −フエニルアラニンアルキルエステルのアシル基
   およびアルキル基を脱離せしめ、次いで、水相中
   に溶解している生成したＬ−フエニルアラニンを
   取得することを特徴とするＬ−フエニルアラニン
   の製造法。