JPH0458891A - アクレモニウム・クリソゲナムのプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａ。

ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）由来であり、プロモーター活
性を有する新規ＤＮＡ化合物に関するものである。

（従来の技術と解決すべき課題） 糸状菌、アクレモニウム・クリソゲナムは、医薬品とし
て実用に供されている種々のセファロスポリン系抗生物
質の原料となるセファロスポリンＣの生産菌として広く
使用されており、工業的に重要な微生物の１つである。

従来、該菌株のセファロスポリンＣ生産能力の改良等に
使用されて来た技術は古典的突然変異手法のみであった
。しかし乍ら近年、組換えＤＮＡ技術の向上に伴って該
微生物においても形質転換系〔例えば、Ｑｕｅｅｎｅｒ
ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１９８５．　Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ、　　（１９８５）　ｐｐ４６８−４７２．５ｋ
ａｔｒｕｄ　ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（
１９８７）１２：　３３７−３４８　〕が開発され、優
良菌株の育種改良に遺伝子工学的アプローチを施す道が
開けてきた。〔例えば５ｋａｔｒｕｄら、ＢＩＯ／ＴＥ
ＣＨＮＯＬＯＧＹ（１９８９）７．４７７〕。一般にあ
る微生物で遺伝子操作をうま〈実施する為には上述した
形質転換系の開発に加えて、その微生物で効率よく機能
するプロモーター、ターミネータ−等の構造を備えた発
現ベクターの開発が必要とされている。アクレモニウム
・クリソゲナムにおいて、このような発現ベクターの開
発は他の生物系に比べて遅れているのが現状であり、そ
の重要な構成要素となるプロモーターの単離に関しても
２，３の例〔例えば、特開昭（６３−３０１７９０）、
特開昭（６１−２５４１９２）特開昭（６４−８０２９
５）’］が存在するのみで未だ十分とは言いがたい。従
ってアクレモニウム・クリソゲナム内で効率よく機能す
る新規プロモーターの単離が当業者間で望まれていた。

一般に効率のよいプロモーターは宿主細胞内で多量に発
現しているタンパクをコードする遺伝子（以下高発現遺
伝子と略す。）の５′上流領域に存在すると考えられて
いる。この点に着目し、真菌類で最も発現ベクターの開
発が進んでいるサツカロミセス・セレビシェ（Ｓ、　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、高発現遺伝子として
、種々の解糖系支配酵素の遺伝子、及び細胞骨格主要タ
ンパクの１つであるアクチン遺伝子等が単離され、その
プロモーターが有用な発現ベクターの構成要素として利
用されている。〔例えばＫｉｎｇｓｍａｎら、　Ｇｅｎ
ｅ（１９８３）２４．　　１−１４．Ｌｉｎｇ−Ｐａｉ
　　ＴｉｎｇらＢ、　　Ｂ、　　Ｒ，Ｃ，（１９８６）
　１３６．　１０６３−１０７０）（課題を解決するた
めの手段） 上記の点を鑑み、本発明者らは、アクレモニウム・クリ
ソゲナムより解糖系支配遺伝子であるホスホグリセレー
トキナーゼ（以下ＰＧＫと略記する）及びグリセルアル
デヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤと略
記する）の遺伝子、並びにアクチンの遺伝子を単離した
。そしてこれら遺伝子のプロモーターを含む領域が、ア
クレモニウムを宿主とした発現ベクターの開発に利用可
能である事を知り本発明を完成するに至った。

即ち本発明は■アクレモニウム・クリソゲナムのホスホ
グリセードキナーゼ遺伝子のプロモーター活性を有し、
下記式１に示す塩基配列の少なくとも一部を含有するＤ
ＮＡ断片、 式１： ％式％ ■アクレモニウム・クリソゲナムのアクチン遺伝子のプ
ロモーター活性を有し、下記式２に示す塩基配列の少な
くとも一部を含有するＤＮＡ断片、式２： ％式％ ＣＧＧＡＧＴＴＧＣＧＴＡＡＴＣＧＧＣＴＧＣＴＴＣＴ
ＡＴＴＴＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＧＡＧＧＧＡＧＴＡＣＴ
ＣＣＴＡＣＴＣＡＣＧＡＴＣＴＴＧＡＡＴＣＡＣＡＧＧ
ＡＧＧＴＣＣＣＣＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＡＴＧＣＣＧ
ＡＣＧＴＣＧＴＴＴＡＣＧＡＧＡＣＡＣＧＧＴＡＣＡＴ
ＧＧＴＡＣＡＴＣＣＧＡＡＧＡＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧ
ＧＡＡＧＣＡＣＣＴＡＡＡＧＡＣＧＣＴＴＣＣＣＴＣＣ
ＧＡＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＧＧＣＣＡ
ＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣ
ＡＧＧＣＡＧＴＴＧＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＧ
ＡＴＣＴＣＧＣＧＣＣＧＡＡＣＣＧＴＧＡＴＴＡＧＧＴ
ＡＣＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＧＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧ
ＣＴＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＣＧＡ
ＧＡＴＧＣＣＴＡＣＴＣＧＴＡＣＴＡＴＧＣＣＴＡＣＡ
ＧＧＴＡＴＧＧＧＣＴＴＴＣＣＧＣＧＴＧＴＣＧＴＣＡ
ＧＣＴＴＧＣＧＡＣＣＧＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＧ
ＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＡＧＣＴＧＧＴＡＡＣＡＴＧＧＣ
ＧＧＣＡＣＧＡＡＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴ
ＣＧＴＣＣＴＣＴＴＧＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＡＣＧ
ＡＧＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＧＣＡＧＡ
ＧＧＡＧＴＧＡＣＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＣＧＧＴＴＧＧ
ＣＡＣＧＡＧＴＡＣＴＧＴＡＣＧＡＧＴＡＣＴＣＧＴＡ
ＣＴＧＴＡＧＧＴＧＣＡＧＣＧＡＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴ
ＡＣＴＧＣＴＡＧＧＴＧＧＡＡＴＴＧＧＧＴＣＣＡＧＣ
ＡＧＧＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＣＧＴＣ
ＧＴＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＴＴＡＡＡＧＣＡＧＣＡＡ
ＣＧＣＡＡＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＴＴＴＴＴＣＴＧＣＣ
ＡＧＡＡＡＴＴＴＧＧＧＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＣＣＣＣ
ＣＡＧＴＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＣＧＣＣＣＴＴＧＴＣＴ
ＧＧＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＣＡＧ
ＧＴＡＡＣＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＴ
ＴＧＴＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＴＧＡＧＴＧＣＣＣＧＧＴ
ＧＣＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＧＴＡＧＧＣＡＴＣＣ
ＡＣＴＡＧＧＣＧＧＡＣＴＴＧＧＡＡＧＣＣＣＡＴＣＡ
ＧＴＧＡＴＧＣＴＴＣＣＣＴＣＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣ
ＣＡＣＡＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣＧＴＣＡＣＧＣＡＡＧＣ
ＣＡＡＣＣＣＴＣＴＣＴＣＣＣＣＣＣＧＴＣＴＣＣＡＴ
ＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＧＡＣＣＣＴ
ＴＡＡＧＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＡＣＧＴＣＧＡ
ＣＣＡＴＣＣＴＴＣＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＧＡ
ＣＡＴＣＴＧＣＡＴＣＧＴＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＡ
ＣＡＣＴＣＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＴＴＡＴＡＡＡ
ＡＣＣＴＣＴＴＴＡＣＣＧＣＴＣＴＴＣＣＣＧＴＡＡＴ
ＣＣＧＡＣＧＣＣ■アクレモニウム・クリソゲナムのグ
リセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の
プロモーター活性を有し、下記式３に示す塩基配列の少
なくとも一部を含有するＤＮＡ断片に関する。

式３： ％式％ また本発明ＤＮＡ断片はイントロンにより分断されたタ
ンパクコード領域及びそれに続＜３′非翻訳領域と共に
単離された。このタンパクコード領域の一部は所望の遺
伝子を融合タンパクとして発現させる場合、発現ベクタ
ーの一構成要素として用いられる。又３′非翻訳領域に
は一般に、ターミネータ−を含め、効率よい転写終結を
行なわせる為のシグナルが存在すると考えられており、
これも発現ベクターの一構成要素として用いられる。

従ってこれらの領域も本発明に包含される。アクレモニ
ウム・クリソゲナム由来のＰＧＫ遺伝子、アクチン遺伝
子及びＧＡＰＤ遺伝子のイントロンにより分断されたコ
ード領域並びに３′非翻訳領域を含む特定の塩基配列を
本発明のプロモーター含有断片の配列とともに図３．４
．５に示した。更に本発明は上記プロモーター含有断片
ターミネータ−含有断片が種々の様式でプラスミドに組
込まれた、連のアクレモニウム・クリソゲナム用発現ベ
クターも提供する。

本発明のプロモーター含有ＤＮＡ断片は、大略下記の工
程によって造成することができる。

（１）　　アクレモニウム・クリソゲナムから染色体Ｄ
ＮＡを抽出し、適当な制限酵素（例えばＭｂｏ　１等）
で切断する。

（２）　　（１）で得られたＤＮＡ断片を適当なファー
ジベクター（例えばＥＭＢＬ３　、ＥＭＢＬ４等）に組
み込んで、アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮ
Ａライブラリーを構築する。

（３）すでに単離され、構造が明らかになっている他種
生物由来のＰＧＫ遺伝子、アクチン遺伝子及びＧＡＰＤ
遺伝子コード領域の少なくとも一部を含有するＤＮＡ断
片を取得する。

（４）　　（３）で得たＤＮＡを３２ｐでラベルし、（
２）で得られた染色体遺伝子りＮＡライブラリーとプラ
ークハイブリダイゼーションを行なわせ、該ＤＮＡプロ
ーブと相補性を示したプラークを選択分離する。

（５）選択したファージからＤＮＡを抽出し、同上のプ
ローブを用いてサザンハイプリダイゼーションを行ない
、適当なサイズの制限酵素断片上に目的の遺伝子を位置
ずけ、それをプラスミドベクターにサブクローニングす
る。

（６）　　（５）でサブクローニングしたＤＮＡ断片の
塩基配列を決定し、他種生物由来の相応する遺伝子構造
と比較する事により、取得した遺伝子が目的のものであ
る事を確認し、その正確なコード領域を決定する。本発
明の目的とするプロモーターは通常該コード領域の５′
上流に位置するＤＮＡ断片内に存在する。

（７）上記５′上流領域を含むＤＮＡ断片と細菌由来の
薬剤耐性マーカー遺伝子を発現に好適な配置で連結しア
クレモニウム・クリソゲナムに導入する事により、本発
明ＤＮＡ断片上にプロモーターが存在している事を確認
する。上記の工程中で大腸菌、ファージ、及びＤＮＡの
取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行わ
れているものであり、例えば、マニアティス（Ｍａｎ　
ｉａｔ　ｉｓ）らの実験操作書（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｇ　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ、　　Ｃ
ｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏ
ｒ−ａｔｏｒｙ　１９８２．１９８９）にしたがえば、
容易に実施できる。使用される酵素、試薬類および大腸
菌の汎用ベクターＤＮＡもすべて市販の製品が用いられ
、特に断らないかぎり、製品で指定されている使用条件
にしたがえば、完全にそれらの目的を達成することがで
きる。

上記（１）において、ＤＮＡ抽出源としてはアクレモニ
ウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０，アクレモニウ
・クリソゲナムｌ５−５等の菌株が使用できる。

なお、アクレモニウム・クリソゲナムｌ５−５株は、平
成２年２月５日付で通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第１１２３２号の寄託番号で寄託
されている。

また、該菌からの全ＤＮＡ抽出は、例えば、Ｊｏｈｎｓ
ｔｏｎｅら〔Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｅ
ＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ（１９８５）４１３０７−１３１
１　）の方法、もしくは、Ｍｉｎｕｔｈら（Ｍｉｎｕｔ
ｈ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ（１９８２）５：２２７−２３１　）の方法に準じて
行なうことができる。

上記（３）及び（６）における他種生物由来のＰＧＫ遺
伝子としては、例えばサツカロマイセス・セレビシェ−
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）のＰＧＫ遺伝子［Ｈｉｔｚｅｍａｕら、Ｔｈｅ　Ｊｏ
ｕｒｒａｌ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ（１９８０）２５．１２０７３−１２０８０３　
、　　ＣＩ（ｉｔｚｅｍａｎらＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（１９８２）１０．７７９１−
７８０８３　。

アスペルギルス・ニデユランス（Ａｓｐｅｒｇ　ｉ　ｌ
　１ｕｓＮｉｄｕｌａｎｓ）のＰＧＫ遺伝子〔Ｃ１ｅｍ
ｅｎｔｓらＧｅｕｅ　（１９８６）４４９７−１０５　
Ｅ等が挙げられる。またアクチン遺伝子としては、例え
ばサツカロマイセス・セレビシェ−のアクチン遺伝子Ｃ
Ｇａ１１ｗ１ｔｚら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ（１９８０）８．１０４３−１０５５　〕
ＣＧａ１１ｗ１ｔｚら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８０）　７７゜２５
４６−２５４９）　、　　ヒトのβ−アクチン遺伝子［
ＮＡＫＡ−ＪＩＭＡら、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　
Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　　（ＪＳＡ（１９８５）　８２６
１３３−６１３７　：］等が挙げられる。また、ＧＡＰ
Ｄ遺伝子としては、ヒトのＧＡＰＤをコードするｃＤＮ
Ａ　［（例えば、Ｈａｎａｕｅｒ　らＥＭＢＯＪ、　（
１９Ｂ４）３．　２６２７−２６３３　：］　。

サツカロマイセス・セレビシェ−のＧＡＰＤ遺伝子（Ｈ
ｏｌｌａｎｄらＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９８
０）２５５２５９６２６０５）　、アスペルギルス・ニ
デユランスのＧＡＰＤ遺伝子［ＰｕｎｔらＧｅｎｅ（１
９８８）６９４９−５７３等が挙げられる。これらの遺
伝子は、上記文献に記載されている方法、もしくは既知
の塩基配列に相当するＤＮＡオリゴマーを合成し、該オ
リゴマーを用いたハイブリダイゼーション法によって取
得する事ができる。尚、ＤＮＡオリゴマーの合成は、市
販のＤＮＡ合成機を用い、その操作手順に従って実施す
ることができる。（６）におけるＤＮＡ塩基配列の決定
法も、公知であるジデオキシ法［Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｉ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、［ＪＳＡ（１９７７
）７３．５４６３）が用いられる。

上記（７）における、細菌由来の薬剤耐性マーカー遺伝
子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺
伝子〔例えば、Ｂｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ（
１９８２）１９３２７−３３６　）　、ハイグロマイシ
ンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子〔例えば、Ｇｒｉ
ｔＺｅｔａｌ、、Ｇｅｎｅ（１９８３）　２５１７９−
１８８）等が用いられる。

これらの薬剤耐性マーカー遺伝子を利用したアクレモニ
ウム・クリソゲナムの形質転換も公知の方法に準じて行
なう事ができる〔例えば、Ｑｕｅｅｎｅｒら、Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ　１９８５．　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５
ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　ｇｙ、　
（１９８５）ｐｐ４６８−４７２　〕。アクレモニウム
・クリソゲナム由来のプロモーター断片は、発現に好適
な配置で上記マーカー遺伝子に連結された場合、該マー
カー遺伝子によるアクレモニウム・クリソゲナムの形質
転換効率を著しく上昇させることが知られている。　Ｃ
３ｋａｔｒｕｄら、ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓ（
１９８７）１２：３７−３４８　：］従って本発明ＤＮ
Ａ断片が機能的プロモーターを含有してるか否かは、該
断片と上記マーカー遺伝子が発現に好適な配置で結合し
たプラスミドを構築し、該プラスミドによるアクレモニ
ウム・クリソゲナムの形質転換頻度を調べる事により確
認することができる。

（実施例） 実施例に記載の略称ないし略号は、以下のとおりのもの
である。

ＣＭ培地：ショ糖２０ｇ／リン酸二水素カリウム０，５
ｇ／リン酸水素二カリウム０．．，５　ｇ　／塩化カリ
ウム０．５ｇ／硫酸マグネシウム（７水塩）０．５ｇ／
硫酸鉄（ＩＦ）　　（７水塩）０．０１ｇ／硝酸ナトリ
ウム３ｇ／イーストエキストラクト４ｇ／ペプトン１０
ｇを水１１に溶解したもの。

ＣＭ固形培地：１．５％の寒天を含有するＣＭ培地。

ＧＡＧ培地：グリセロール４０汀／アスパラギン４ｇ／
塩化カルシウム０．１ｇ／塩化ナトリウム０．１ｇ／微
量金属溶液〔硫酸マグネシウム（７水塩）４ｇ／硫酸鉄
（ＩＩ）　　（７水塩）０．４ｇ／硫酸マンガン（４水
塩）０．１６ｇ／硫酸亜鉛（７水塩）０，４ｇ／無水硫
酸銅０．０４　ｇを水ＩＩ！に溶解したもの］２５ｄ１
０．１　Ｍリン酸バッフｙ　−（ｐＨ７，０）　３０７
ｒＬｌを水１１に含有する培地、６ＸＳＳＣ：　０．９
Ｍ塩化ナトリウム／９０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０
　Ｘ　５ＳＰＥ　：塩化ナトリウム２１０　ｇ　／リン
酸二水素ナトリウム（２水塩）　３１．２ｇ１０．５Ｍ
　ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸）４０
−を水１１に溶解したもの、５０×デンハルツ：フイコ
ール５ｇ／ポリビニルピロリドン５ｇ／牛血清アルブミ
ン５ｇを水５００７ｎｌに溶解したもの。

Ｐ−バッファー：　　０．６Ｍ塩化カリウム１０．　Ｏ
ＩＭ、塩化マグネシウム１０．０２５Ｍ塩化カルシウム
ＰＥＧ溶液：２５％ポリエチレングリコール（分子量的
４０００）　１０．０１Ｍ　トリス（ｐＨ８，０）１０
．０５塩化カルシウム１０．６Ｍ塩化カリウム。

実施例１　〔アクレモニウム・クリソゲナムホスホグリ
セレートキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子の単離〕（１）アク
レモニウム・クリソゲナムの遺伝子ライブラリー作成 アクレモニウム・クリソゲナムｌ５−５株（微工研菌寄
第１１２３２号）の全ＤＮＡをジョンストン（１，Ｌ、
Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ）らがアスペルギラス・ニデユラン
スについて用いた方法〔文献：エンボジャーナル（ＥＭ
ＢＯＪ、）、　４．１３０７−１３１１．１９８５．）
に従って抽出した。

そしてこの全ＤＮＡ的６０μｇを制限酵素ＭｂｏＩで部
分消化し、次いでアルカリフォスファターゼで処理した
。一方ラムダベクターＥＭＢＬ　３　（プロメガバイオ
テックス社）１０ＭｇをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで完全
に消化し、イソプロパツール沈澱により、短いＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ　リンカ一部分を除去した。

次いで、上記部分消化ＤＮＡ断片約１μｇとＢａｍＨＩ
末端を有するベクター約２μｇとをＴ４・リガーゼを用
いて連結せしめ、ラムダファージ粒子内へ封入した。こ
うして得た組換えファージ懸濁液を適当に希釈し、ニジ
エリシア・コリ（Ｅ、　ｃｏ　ｌ　ｉ　）ＮＭ５３９（
プロメガバイオチック社）に感染させ、出現するプラー
ク数を計測した。その結果この懸濁液は、３×１０５個
の組換えファージを含有する事が判明した。このファー
ジ液をアクレモニウム・クリソゲナムの遺伝子ライブラ
リーとし、４℃に保存した。尚上述の供与体ＤＮＡ及び
ベクターの調製、そして両者の結合等に関する詳細な方
法、条件はフリラシャオフ（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ）らが
記載したものを採用した。〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラーバイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ）、　
１７０．８２７−８４２１９８３〕又ＤＮＡのラムダ粒
子内への封入は、プロメガバイオチック社のパッケージ
ングエクストラクトを用い、それに添付されたプロトコ
ールに従って行った。

（２）プローブの調製 ｐＹＰＧＫ　１　（サツカロミセス・セレビシェ由来Ｐ
ＧＫ遺伝子全体を含む２．９ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片
を有するこのプラスミドは、サツカロミセス総ＤＮＡの
ＨｉｎｄＩＩＩ消化物をＰＢＲ３２７（ＡＴＣＣ３７５
１６’）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入して作成された遺
伝子ライブラリーを、既にヒララマン等により報告され
ている、サツカロミセスＰＧＫ遺伝子の塩基配列〔文献
：ヌクレイツクアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）、　１０７７９１７８０８、１
９８２）をもとに設計された合成オリゴヌクレチド：　
５’−ＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＴＡＴ
ＣＴ−３’を用いてスクリーニングする事により得られ
た。）２０μｇをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化後
、１％アカ〒−スゲル電気泳動を行った。そして、マニ
アティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら著モレキュラー・
クローニング・ア・ラボラトリ−・マニュアル、コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−出版、　１９
８２年（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２、以
下この成帯をマニュアティスの実装置と略す。）ｐ１６
４−１６５に記載されている方法に従って、２．９Ｋｂ
の断片をゲルから回収、精製した。そして、この断片約
２００ｎｇを宝酒造株式会社製ニックトランスレーショ
ンキットを用い、それに付属するプロトコールに従って
、〔α−３２Ｐ〕デオキシシチジン３リン酸（ｄＣＴＰ
）５０μＣｉで標識した。次いで反応液を７０°Ｃで１
０分間加温した後、ファルマシア社製ニックカラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃ　ｉａ社、Ｎｉｃｋ−ｃｏｌｕｍｎＴＩＪ
）を用いて、精製し、約１１０７ｃｐの放射能を持つプ
ローブを得た。　（以後このプローブをＹＰ−プローブ
と称する。） （３）ハイブリダイゼーションによるスクリーニング （１）で得られたファージ液（遺伝子ライブラリー）の
一部をＮＭ　５３９に感染させ、４枚のプレートに上に
計２Ｘ１０’個のプラークを形成させた。これらプラー
クをベントン（Ｂｅｎｔｏｎ　Ｗ、　Ｄ、　）らの方法
〔文献：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９６．１８
０−１８２．１９７７゜〕に従って、ニトロセルロース
フィルターに転写し、アルカリ変性、中和処理を行ない
、　ＤＮＡを固定した後、上記（２）で得たＹＰ−プロ
ーブとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼ
ーションは、３０％ホルムアミド、５×デンハルツ、　
　５ＸＳＳＰＥ。

０゜１％ＳＤＳ、及び終濃度５Ｘ１０’ｃｐｍ／７ｎｌ
でＹＰ−プローブを含有する溶液を用いて、４２℃で１
６時間行った。続いて、フィルターを０．１％のＳＤＳ
を含む６ＸＳＳＣ溶液中、室温で１０分間ずつ２回洗浄
し、さらに０．１％のＳＤＳを含むｌＸ５ＳＣ溶液中４
２°Ｃで３０分間洗浄した。次いでインテンシファイヤ
ー・スクリーンを用いて、−８０°Ｃで１６時間オート
ラジオグラフィーを行った。その結果７個の陽性スポッ
トが見出された。このうち、４個の陽性スポットに相応
する寒天領域よりファージを抽出し、再度上記の工程に
従ってプラークハイブリダイゼーションを行ない、４個
の純化ポジティブファージクローンを得た。これらのク
ローンをそれぞれλＰＧＫＩ、　２．３．４と命名した
。

（４）　　ＰＧＫ遺伝子のサブクローニゲ及びその位置
の限定 （３）で得たファージクローン４種より、クロスバーガ
ー（Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒ）記載の方法〔文献：ヌク
レイツクアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）。

１５、６７３７］に従ってＤＮＡを抽出した。次いでこ
のラムダＤＮＡをＢａｍＨＩで切断して、アガロースゲ
ル電気泳動を行った後、ＹＰ−プローブを用いてサザン
ハイプリダイゼーション〔方法については文献ササン（
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、　　ジャーナル・オブ・モレキュ
ラーバイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、９
８，５０３−５１７゜１９７５〕を行った。尚、ハイブ
リダイゼーション及びフィルター洗浄等は、（３）に記
載したものと同様に行った。その結果、すべてのクロー
ンに存在する、約５．５ＫｂのＢａｍＨＩ断片のみが該
プローブとハイブリダイズすることが判明した。この断
片をシーンクリーン（ＧＥＮＥ　−ＣＬＥＡＮ”、　　
フナコシ社）を用いて、添付プロトコールに従って、ア
ガロースゲルから回収、精製した。一方ベクターとして
用いるｐＬｌｃ１８（宝酒造株式会社）はＢａｍＨで切
断し、アルカリホスファターゼ処理を行った。次いで両
者をＴ４−リガーゼにより連結し、マニアティスの実験
書ｐ２５２〜ｐ２５３記載の方法に準じて、Ｅ、ｃｏｌ
ｉＪＭ　１０５に導入した。アンピシリン（Ａｍｐ）、
　１００μｇ／−２５−ブロム−４−クロル−３−イン
ドリル−β−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）　、０．００
４％を含有するＬ−ブロス寒天培地上に生育して来た白
色コロニーを６個選び、簡便法（マニアティスの実験書
ｐ３６８〜ｐ３６９に記載の方法）でプラスミドＤＮＡ
を抽出し、ＢａｍＨＩ消化による解析を行ったところ６
クローン中５クローン中のプラスミドに、目的の断片が
挿入されている事が判明した。さらに上記と同様、サザ
ンハイプリダイゼーションによる解析を行ない、このイ
ンサートが目的の断片である事を確認した。これらのう
ちプラスミドの１つをｐＧＫ５と命名した。

該プラスミドｐＧＫ５を種々の制限酵素で切断し、アガ
ロースゲル電気泳動により解析した結果、第１図で示さ
れる５、　５Ｋｂインサートの制限酵素切断地図が得ら
れた。次いでこの断片中に存在するＰＧＫコード領域を
限定するために、ＹＰ−プローブを用いて、サザンハイ
プリダイゼーションを行った。その結果、約０．７Ｋｂ
のＰｓｔｌ−３ｔｕｌ断片内に、ＰＧＫコード領域の少
なくとも一部が存在することが推定された。

（５）アクレモニウム・クリソゲナムＰＧＫ遺伝子の塩
基配列 まず、ＰＧＫ遺伝子のコード領域の一部を含むと推定さ
れた０、　７ＫｂのＰｓｔｌ−５ｔｕｌ断片をＭ１３ｍ
ｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９のＳｍａ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ
間にそれぞれサブクロニングして、各々の配列の一部を
サンガーらの方法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、サイエンス５
ｃｉｅｎｃｅ　２１４．１９８１など）に基づき決定し
た。そして既知のＰＧＫ遺伝子と比較する事により、遺
伝子の方向、及び、この領域がＰＧＫ−タンパクのどの
部分をコードしているかを推定した。該領域から上流及
び下流に向かって配列決定を行ない、最終的に第１図に
アンダーラインで示した全領域をカバーする、３３０６
ｂｐの塩基配列を決定した。

塩基配列決定の具体的実験手技は、タカラのシーフェン
シングキットを用いて、その添付プロトコールに従って
行った。尚、決定した全塩基配列及び予想される翻訳産
物を第５図に示した。遺伝情報処理ソフトウェア（ＳＤ
Ｃソフトウェア開発株式会社）を用いて、この配列をコ
ンピューター解析した結果以下の事が判明し、前述の工
程を経て、単離して来た遺伝子が真のＰＧＫ遺伝子であ
るという確証を得た。１）アクレモニウム・クリソゲナ
ムのＰＧＫ遺伝子は、４１８個のアミノ酸からなる、分
子量４４，３００ダルトンのタンパクをコードする。２
）コード領域は１４５．６４ｂｐからなる２つのイント
ロンにより分断されている。そのイントロンの大きさは
異なるが存在位置は、同じ糸状菌である、アスペルギラ
ス・ニデユランスのＰＧＫ遺伝子と同一であった。３）
塩基配列から予想されるアミノ酸の一次構造は、ヒト、
サツカロミセス・セレビシェ。

アスペルギラス・ニデユランス由来のＰＧＫのものと非
常に類似しており、それぞれ、６８．７０．７５％の相
同性を示した。尚上記のごとく構造を決定したＢｇｆｆ
ｉｎ■−Ｋｐｎｌ断片〔第１図（Ａ）領域〕はＰＧＫ遺
伝子の開始コドン（ＡＴＧ）から５′上流１２５１ｂ＋
）に及ぶ領域をカバーしており本発明の目的とするＰＧ
Ｋプロモーターは、該断片上に存在すると考えられる。

以下に示す実施例２，３はこの推定が正しい事を強く支
持した。

実施例２　ＣｐＰＧＫＭ　５の構築〕 第７図に示される工程に従って、細菌由来のネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（以降ＫｍＲ遺伝子
と略記する。）をアクレモニウム・クリソゲナム由来の
ＰＧＫプロモーター支配下に発現させる為のプラスミド
ｐＰＧＫＭ　５を構築した。以下に各工程を説明する。

（１）　　ｐＧＫＢＬの作製 実施例１−（４）で得たプラミドｐＰＧＫ−５をＢｇｌ
ｍで消化し、ＰＧＫ遺伝子を含む３．６Ｋｂの断片を分
離精製した。該断片を実施例１（４）で調製した、ｐＵ
ｃ１８のＢａｍＨＩ部位に挿入する事によりｐＧＫＢＬ
を得た。

又同上の断片が、ｐＧＫＢＬとは逆方向に挿入されたプ
ラスミドも同時に取得し、これをｐＧＫＢＬ’と命名し
た。

（２）　ｐＧＫＣ３の作製 上記（１）で得たプラスミドｐＧＫＢＬをＭｌｕ　Ｉと
、Ｘｈｏ　Ｉで切断し、４．８ｋｂの断片を分離・精製
した。

該断片と次式で示される合成リンカ−を連結する事によ
りｐＧＫＣ３を得た。　式： ％式％ 又ｐＧＫＢＬの代わりにｐＧＫＢＬ’を用いて同上の操
作を行ないｐＧＫＣ３’も構築した。ｐｃＫｃｓ及びｐ
ＧＫＣ３’はアクレモニウム・クリソゲナム由来のＰＧ
Ｋ　・プロモーター、ターミネータ−を含む断片がユニ
ク制限酵素部位（、ＢｇｌＩＩ、　Ｘｈｏ　Ｉ　）を介
して発現に好適な配置でつながった構造を有するプラス
ミドであり、種々の外来遺伝子をアクレモニウム・クリ
ソゲナム内で発現させる為のベクターを構築する際有用
な出発材料となる。尚上記リンカ−は、アプライド・バ
イオシステム社のＤＮＡシンセサイザー・モデル３８０
−Ａを用い、常法どうり、２本の１本鎖として合成され
た。

（３）　　ｐＰＧＫＭ５の作製 プラスミドｐＥＸＯＯ２をＢａｍＨＩとＢｇＡＩＩで切
断し、ＫｍＲ遺伝子を含む１．５ｋｂの断片を分離精製
する。

該断片をＢｇｆｆＩＩで切断し、アルカリホスファター
ゼ処理を施した、ｐＧＫＣ８と図７に示す方向で結合さ
せる事により、ｐＰＧＫＭ　５を得た。尚上記で用いた
プラスミドｐＥＸＯＯ２は、１ａｃＵ■５・プロモータ
ー及び、トランスポゾン５（Ｔａ２）由来のＫｍＲ遺伝
子を有する大腸菌用発現ベクターであり、その造成方法
は、特開昭６３−７４４８８に記載されている。

以上実施例２において、制限酵素消化断片の分離は、す
べて１％アカロースゲル電気泳動により行ないアガロー
スゲルからのＤＮＡ断片の調製は、シーンクリーン（Ｇ
ＥＮＥ　−ＣＬＥＡＮＴＭ、　　フナコシ社販）を用い
て、その添付プロトコールにしたがって行った。また、
プラスミドとＤＮＡ断片の連結、大腸菌のトランスフォ
ーメーション等、ならびにサブクローニングの結果得ら
れたプラスミドの調製、解析等の基本操作は、すべてマ
ニアナイスの実装置に記載された方法に準じて行った。

実施例３　［ｐＰＧＫＭ５を用いたアクレモニウム・ク
リソゲナムの形質転換〕 （１）プロトプラストの調製二ＣＭ固形培地上で３０’
Ｃ５日間生育させたアクレモニウム・クリソゲナムｌ５
−５の菌糸体（約１　ｃｒｊに相当する菌糸体）を、Ｃ
Ｍ培地５０１ｄに接種し、回転式振盪機（２５０ｒ、　
ｐ、　ｍ）上、３０℃で３日間培養した。さらに該菌液
１ｍ７！を５０−〇ＧＡＧ培地に接種して、回転式振盪
機（２５Ｏｒ、ｐ、ｍ）上、３０°Ｃで２０時間培養し
た。得られた培養液５０７７！７！を３５０Ｏｒ、　ｐ
、　ｍで１０分間遠心し、菌糸体を沈澱させた後、０．
９％のＮａＣ！！溶液で洗浄し、０．０１Ｍジチオスレ
イトールを含んだマクイルベイン（ＭｃＩ　ｌ　ｖａｉ
ｎｅ）緩衝液（０，１Ｍクエン酸、０．２Ｍリン酸ナト
リウム、ｐＨ７，３）　２０−に懸濁し、３０℃で１時
間、穏やかに振盪した。

ついで菌糸体を３２００ｒ、ｐ、ｍ　１０分間の遠心で
沈澱させ、Ｐ−バッファーで洗浄した後、ノボザイム（
Ｎｏｖｏ社製）を１Ｏｎ＋ｇ／ｍ／の濃度で含有するＰ
−バッファー１０７７！７！に懸濁し、３０℃で１時間
穏やかに振盪した。該反応下記を８０Ｏｒ、ｐ、ｍで３
０秒間遠心して得た上清を、濾紙（ＴＯＹＯＦＩＬＴＥ
ＲＰＡＰＥＲ５Ａ）を用いて濾過する事により、菌糸体
とプロトプラストを分散した。ついで該濾液を３００Ｏ
ｒ、　ｐ、　ｍで５分間遠心し、プロトプラストを沈澱
させた後、Ｐ−バッファーで１回洗浄し、プロトプラス
トが３×ｌ０１ｌ／７ｎｌの濃度となるようにＰ−バッ
ファーに懸濁した。

（２）ｐＰＧＫＭ５によるプロトプラスト形質転換上記
（１）で得たプロトプラスト懸濁液０．１−に、プラス
ミドｐＰＧＫＭ５を５μｇ　（１０μｌ）を加えた後、
０．０５７ｎｌのＰＥＧ溶液を加え、かるく混合した。

水上に２５分間静置した後、同上のＰＥＧ溶液をｌｄ加
えて、室温でさらに３０分間静置した。かくして得られ
た形質転換プロトプラスト懸濁液を０．２７１１１ずつ
プロトプラスト再生培地〔文献（ｌｓｏｇａｉら：Ａｇ
ｒｉｃ、Ｂｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、　１９８７．５１．２
３２１〜２３２９）に記載されているＢＲＩＪ培地〕を
２５ｄ含有するプレート上に広げ１５°Ｃで２０時間培
養した後、３ｍｇのＧ４１８を含み５０°Ｃに保温した
同上のＢＲＭ培地５−を重層した。そして２８℃で１０
〜２０日間培養することにより、Ｇ４１８耐性となった
形質転換株を選択した。以上の実験を数回行ったところ
、ｐＰＧＫＭ　５．５μｇあたり５０〜１５０個の０４
１８耐性株が出現した。これに対してコントロールプラ
スミドｐＥＸＯＯ２を用いて同上の実験を行った場合、
０〜２個の０４１８耐性株しか出現しなかった。以上の
結果は前記式ｌに示した配列を有する、ｐＰＧＫＭＳ上
のＸｂａｌ−Ｂｇ１１Ｉ断片内に、アクレモニウム・ク
リソゲナムＰＧＫ遺伝子のプロモーターが含まれている
事を強く示唆している。尚上記耐性株の染色体中に、導
入に用いたプラスミドが挿入されている事は、ＫｍＲ遺
伝子コード領域の大半を含むｐＥＸＯＯ２のＰｓｔｌ断
片（約９００ｂｐ）をプローブとした、サザンハイプリ
ダイゼーション実験により確かめられた。

実施例４　〔アクチン遺伝子のクローニング〕（１）ハ
イブリダイゼーションによるアクチン遺伝子含有クロー
ンのスクリーニング ３２Ｐで標識したヒトβ−アクチン遺伝子の第３エクソ
ンを含む、Ｈｉｎｆ　Ｉ　４０Ｑｂｐ断片（和光純薬販
）をプローブ（以下ＡＣＴプローブと略す）として用い
、実施例１−（１）で作製したアクレモニウム・クリソ
ゲナムの遺伝子ライブラリーを実施例１−（３）と同じ
条件でスクリーニングし、該プローブとハイブリダイズ
する４個のファージを取得した。

（２）アクチン遺伝子のサブクローニング及びその位置
の限定 （１）により得られたファージの１つからＤＮＡを抽出
し、これをλＡＣＴ５と命名した。ついでλＡＣＴ５を
ＸｈｏＩ、　５ａｆｆ　Ｉで、それぞれ消化し、アガロ
ースゲル電気泳動を行った後、上記ＡＣＴプローブを用
いて、サザンハイプリダイゼーションを行った。

その結果５．４ＫｂのＸｈｏ　Ｉ断片、１．３Ｋｂ及び
１．５Ｋｂのサイズををする２種の５ａβＩ断片が該プ
ローブとハイブリダイズする事が判明した。そこでこれ
ら３種の断片（Ｘｈｏ　Ｉ　−５，４に断片、Ｓａｄ　
Ｉ−１，５に断片、Ｓａ　Ｉ！　Ｉ−１，３に断片）を
各々ｐＬｌｃ　１８のｓａ、ｇｉ部位にサブクローニン
グする事により、ｐＡＣＴ５Ｘ。

ｐＡＣＴ５ＳＳ、　ｐＡＣＴ５ＳＬを得た。ついでこれ
らのプラスミドの部分制限酵素地図を作製し、それらを
オーバーラツプさせる事により、アクチン遺伝子を含む
と思われる約６ＫｂのＤＮＡ断片の部分制限酵素地図を
第２図に示すとうり作製した。

尚上記サザンハイプリダイゼーションはＡＣＴプローブ
を使用した事態外すべて実施例１−（４）と同様の条件
で行った。

（３）塩基配列の決定及び解読 上記（２）の結果より、０．７ｋｂのＳｍａｌ−Ｘｈｏ
　Ｌ断片内に、アクチンコード領域の少なくとも一部（
ヒトβ−アクチンの第３エクソンに相当する部分）が存
在することが強く示唆されたので、まずこの部分の塩基
配列を決定した。そして既知のアクチン遺伝子と比較す
る事により、遺伝子の方向、イントロンの有無、この領
域がアクチンタンパクのどの部分をコードしているか等
を推定した。ついで該領域から上流及び下流に向って配
列決定を行ない最終的に第２図にアンダーライン（Ｂ）
で示した全領域をカバーする、３７４８ｂｐの塩基配列
を決定した。尚決定した全塩基配列及び予想される翻訳
産物を第５図に示した。該核酸配列及び翻訳産物のアミ
ノ酸配列を既知のアクチンのものと比較解析した結果、
以下の事が判明し、前記工程を経て、単離した遺伝子が
真のアクチン遺伝子であるという確証を得た。

１）アクレモニウム・クリソゲナムのアクチン遺伝子は
３７５個のアミノ酸からなる、分子量４１８００ダルト
ンのタンパクをコードする。この残基数はを推動物の骨
格筋アクチン（α−タイプ）を除（、他のすべてのアク
チンと同一である。

２）塩基配列から予想されるアミノ酸配列は既知のアク
チンのそれと極めてよく類似しており、サツカロミセス
・セレビシェのアクチン、ヒトのγ−タイプアクチンと
それぞれ９２％、９０％の相同性を示した。尚上記のご
とく単離し、構造を決定したＮ５ｉＩ−３ａβＩ−断片
（第２図）はアクチン遺伝子の開始コドンから５′上流
１２９３　ｂｐに及ぶ領域をカバーしており、本発明の
目的とするアクチンプロモーターは、該断片上に存在す
ると考えられる。以下に示す実施例５，６は上記推定が
正しい事を強く支持した。

実施例５　（ｐＡｃＴｔ（Ｙ８３の構築〕第８図に示さ
れる工程に従って、細菌由来の／’％イグロマイシンＢ
ホスホトランスフエラーセ遺伝子（以後ＨＹＢＲ遺伝子
と略記する。）をアクレモニウムクリソゲナム由来のア
クチンプロモーター支配下に発現させる為のプラスミド
ｐＡＣＴＨＹ８３の構築した。以下に各工程を説明する
。

（１）ｐＡＣＴ八ＮＰへ作製 実施例４−（２）で得たプラスミドｐＡＣＴ５ＸをＮ５
ｉｌとＰｓｔｌで同時に消化して５．３Ｋｂの断片を調
製した。

ついで該断片をＴ４リガーゼを用いて再結合（自己閉環
）させることにより、ｐＡＣＴΔＮＰを得た。

（２）ｐＡｃＴＢｌ、　ｐＡＣＴＢ２．、　ｐＡＣＴＢ
３の作製（１）で得たｐＡＣＴΔＮＰをまずＮｅｏ　Ｉ
で消化し、生じた粘着末端をＤＮＡポリメラーゼクレノ
ウ断片（以後ＤＮＡｐｏＣと略記する）と４種のデオキ
シヌクレオチド３リン酸（デオキシアデノシン三リン酸
、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リ
ン酸、チミジン三リン酸、以後４ｄＮＴＰＳと略記する
。）を用いて平滑末端に変換する。ついで５′末端がリ
ン酸化され、下記の配列からなるＢａｍＨＩ該末端にＴ
４リガーゼで結合させた後、ＢａｍＨＩで消化した。該
消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、４ＫｂのＤＮ
Ａ断片を分離精製した。そして該断片をＴ４リガーゼに
より自己閉環させｐＡＣＴＢ　１を得た。又上記リンカ
−とは配列及び塩基数の異なる同上の操作を行ない、そ
れぞれｐＡＣＴＢ２．　ｐＡＣＴＢ３を得た。

（３）ｐＡｃＴｃｓｌ、　ｐＡＣＴＣ３２，ｐＡＣＴＣ
３３の作製実施例４−（２）で得たプラスミドｐＡＣＴ
ＳＳをＢａｍＨｌで消化し、ＤＮＡｐｏＡ、　　と４　
ｄＮＴＰＳを用いて末端を平滑化した後、Ｔ４リガーゼ
で自己閉環させることにより、Ｂａｍ８１部位を失った
プラスミド、ｐＡＣＴＳＳΔＢａｍを得た。ついで該プ
ラスミドを５ｃａＩとＥｃ。

Ｒ１で消化し、アクチン遺伝子のターミネータ−を含む
と考えられる０、９Ｋｂの断片を分離精製した。

そして該断片をｐＡｃＴＢｌのＳｍａ　Ｉ　−ＥｃｏＲ
Ｉ間に挿入することによりｐＡＣＴＣ８１を得た。又同
上の０．９Ｋｂの断片をｐＡＣＴＢ２．　ｐＡＣＴＢ３
のＳｍａ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ間に挿入することにより、
ｐＡＣＴＣ３２，ｐＡＣＴＣ３３をそれぞれ取得した。

これら３種のプラスミドは、アクレモニウム・クリソゲ
ナム由来のアクチンプロモータ、ターミネータ−を含む
断片がユニーク制限酵素切断部位Ｂａｍ）ＩＩ（アクチ
ン開始コドンＡＴＧのすぐ下流に位置する。）を介して
発現に好適な配置でつながった構造を有するプラスミド
であり、種々の、目的遺伝子をアクレモニウム・クリソ
ゲナム内で融合タンパクとして発現させる為のベクター
を構築する際、有用な出発材料となる。これら３種のプ
ラスミドのいずれかを用いる事により、所望の遺伝子を
アクチン遺伝子と同じ読み枠で連結する事が可能となる
。

（４）ｐＡＣＴＨＹ８３の作製 プラスミドｐＬＧ８３　　（バストウール研、ジュリア
ン・デービス（Ｊｕｌｉａｎ　Ｄａｖｉｅｓ）教授より
入手〕をＢａｍＨで切断し、ＨＹＢＲ遺伝子を含む１．
３Ｋｂの断片を分離精製した。該断片をＢａｍＨで消化
し、アルカリホスファターゼ処理を施したｐＡｃＴｃｓ
ｌと第８図に示す方向で結合させる事により、ｐＡＣＴ
ＨＹ８３を得た。尚、上記ｐＬＧ８３はＨＹＢ”遺伝子
を有する酵母用のベクターであり、その諸性質は、公知
の文献［Ｇｒｉｔｚら、Ｇｅｎｅ　（１９８３）　２５
．１７９〜１８８　〕に記載されている。以上実施例５
において、制限酵素消化断片の分離精製、プラスミドと
該断片との連結、大腸菌の形質転換、並びにサブクロー
ニングの結果得られたプラスミドの調製、解析等の基本
操作はすべて実施例２と同様に行った。

実施例６ ｐＡＣＴＨＴ８３によるアクレモニウム・クリソゲナム
形質転換 前記ｐＡＣＴＨＹ８３及びｐＬＧ８３を用いて、アクレ
モニウム・クリソゲナムｌ５−５株の形質転換実験を行
った。ｐＡＣＴＨＹ８３を５μｇ用いた場合、４０〜１
００個の形質転換体（ハイグロマイシイＢ耐性株）が得
られたのに対して、ｐＬＧ８３を用いた場合は形質転換
体が全く出現しなかった。この事は前記式２に示した配
列を有するｐＡＣＴＨＹ８３上の旧ｎｄＩＩ［−Ｂａｍ
ＨＩ■断片（第８図）内に、アクレモニウム・クリソゲ
ナムアクチン遺伝子のプロモーターが含まれている事を
強く示唆している。尚上記実験において、アクレモニウ
ム・クリソゲナムｌ５−５株のプロトプラスト調製は実
施例３−（１）と同様に行ない、プロトプラスト形質転
換は、Ｇ４１８の代わりに４．５ｍｇハイグロマイシン
Ｂを使用した事を除き、すべて実施例３−（２）と同様
に行った。

実施例７　　〔ＧＡＰＤ遺伝子のクローニング〕（１）
ハイブリダイゼーションによるＧＡＰＤ遺伝子含有クロ
ーンのスクリーニング ３２ｐで標識したヒトＧＡＰＤ−ｃＤＮＡ由来のＨｉｎ
ｃＩＩＡＣＣＩ約１．　ＩＫｂ断片〔ヒトＧＡＰＤ−ｃ
ＤＮＡクローンは、既にＨａｎａｕｅｒらにより報告さ
れているヒトＧＡＰＤ　ｃＤＮＡの塩基配列に基づいて
合成されたオリゴヌクレオチド５’　ＣＣＴＧＧＣＣＡ
ＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡ−３’を用いて、ヒ
ト肺由来のλｇｔｌｌｃ　−ＤＮＡライブラリー（Ｃ１
ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、
）を常法に従ってスクリーニングする事により得られた
。〕をプローブ（以下ＧＡＰ−プローブと略す）として
用い、実施例１−（１）で作製したアクレそニウム・ク
リソゲナムの遺伝子ライブラリーを実施例１−（３）と
同じ条件でスクリーニングし、該プローブとハイブリダ
イズする４個のファージクローンを取得した。

（２）　ＧＡＰＤ遺伝子のサブクローニング及びその位
置の限定 上記（１）により得た４種のファージからＤＮＡを抽圧
し、それぞれλＧＡＰＩ、　　λＧＡＰ２．　　λＧＡ
Ｐ３．　　λＧＡＰ４と命名した。ついでこれら４種の
λＤＮＡをＢａｍＨｌとＰｓｔｌで同時に消化し、アガ
ロースゲル電気泳動を行った後、上記ＧＡＰプローブを
用いてサザンハイプリダイセーションを行った。その結
果上記４種すべてのλ−ＤＮＡに存在する約３．７Ｋｂ
のＰｓｔｌ−Ｂａｍ旧断片のみが、該プローブとハイブ
リダイスする事が明らかになった。そこで該ＤＮＡ断片
をｐＵｃ１８のＰｓｔｌ−Ｂａｍ旧間にサブクローンし
ｐＧＡＰｌを得た。

ついで該プラスミドを種々の制限酵素で消化した後、ア
ガロースゲル電気泳動で解析し、上記３．７Ｋｂ　ＤＮ
Ａ断片の部分制限酵素地図を第３図に示すとうり作製し
た。更にこの断片中に存在するＧＡＰＤコード領域を限
定する為、ＧＡＰプローブを用いてサザンハイプリダイ
ゼーションを行ったところ、約２．７ＫｂのＫｐｎＩ−
Ｘｈｏｌ断片に、ＧＡＰＤ全コード領域が存在すると推
定された。

（３）塩基配列の決定及び解読 上記Ｋｐｎ　Ｉ−Ｘｈｏ　１間２６５９ｂｐの塩基配列
を常法に従って決定した。全塩基配列及び予想される翻
訳産物を第６図に示した。該核酸配列及び翻訳産物のア
ミノ酸配列を既知のＧＡＰＤのものと比較解析したとこ
ろ、以下の事が判明し、前記工程を経て、単離した遺伝
子が真のＧＡＰＤ遺伝子であるという確証を得た。

（１）アクレモニウム・クリソゲナム由来のＧＡＰＤ遺
伝子は３３７個のアミノ酸からなる、分子量３６２００
ダルトンのタンパクをコードする。

（２）コード領域は、２１７ｂｐ、　６５ｂｐからなる
２つのイントロンにより分断されており、その存在位置
は、アスペルギラス・二゛デユランス遺伝子に存在する
、第５イントロン、第６イントロンの位置とそれぞれ完
全に一致していた。又アスペルギラス・ニデユランスの
ＧＡＰＤ遺伝子と同様に、５′非翻訳領域内にもイント
ロンが存在する事が推定された。

（３）塩基配列より予想される翻訳産物のアミノ酸配列
は、既知のＧＡＰＤと非常に類似しており、例えば、ヒ
ト、サツカロマイセス・セレビシェ、アスペルギラス・
ニデユランス由来のＧＡＰＤとそれぞ゛れ、６６％、６
４％、７７％の相同性を示した。またＧＡＰＤの活性部
位形成に関与すると考えられている２０残基は、アクレ
モニウム・クリソゲナムＧＡＰＤにおいても完全に保存
されていた。尚上記のごとく単離した、ｐＧＡＰｌ上の
ＰｓｔＪ−Ｂａｍ旧断片（約３．７Ｋｂ）はＧＡＰＤ遺
伝子の開始コドンから５上流約１．７　Ｋｂに及ぶ領域
を含有しており、本発明の目的とするＧＡＰＤプロモー
ターと、該断片上に存在していると考えられる。以下に
示す実施例は、この推定が正しい事を強く支持した。

実施例８ 第１９図に示される工程に従ってＨＹＢ”遺伝子をアク
レモニウム・クリソゲナム由来のＧＡＰＤ・プロモータ
ー支配下に発現させる為のプラスミドｐＥＧ−ＡＰＨＹ
８３を構築した。以下に各工程を説明する。

（１）ｐＧＡＰΔシリーズの作製 まず実施例７で得たｐＧＡＰＩをＥｃｏＲＶで消化した
後ヌクレアーゼＢａ７３１を作用させ、ＥｃｏＲＶ部位
から該ＤＮＡの内部へ向けて１００〜２００ｂｐの欠失
を生じさせた。ついでＢａｆｆ３１による消化末端をＤ
ＮＡｐｏ　ｌ　、　と４　ｄＮＴＰＳを用いて平滑末端
に修復した後、そこにＴ４リガーゼを用いて、ＢｇｌＩ
Ｉリンして該反応物をＢｇｆｆｉＩＩで消化した後、ア
ガロースゲル電気泳動を行って、ＤＮＡ断片を分離精製
し、Ｔ４リガーゼで自己閉環させ、該反応液で、大腸菌
を形質転換した。かくして得られた形質転換（アンピシ
リン耐性）コロニーをランダムに８個選択し、それぞれ
が保有するプラスミドを抽出し、それぞれｐＧＡＰΔ１
〜Δ８と命名した。ついでこれら８種のプラスミドを、
各々、Ｂｇｊ２ＩＩと５ａｃｌで同時に切断し、生ずる
２００〜４００ｂｐの断片を分離精製した。そして該断
片を、Ｍ　１３ｍｐ１８のＢａｍＨＩＳａｃＩ間にサブ
クローンした後それらの塩基配列を決定した。その結果
、各々プラスミドにおける、ＥｃｏＲＶ部位からＧＡＰ
Ｄ遺伝子の５′側への欠失点が第１Ｏ図に示すとうり明
らかになった。

（２）ｐＥＧＡＰ３．　ｐＥＧＡＰ５及びｐＥＧＡＰ８
の作製上記１で得たｐＧＡＰΔ３をＢｇＡ’ＩＩとＰｓ
ｔｌで消化して、約１．６Ｋｂの断片を調製した。一方
丈層側２−（２）で得たｐＧＫＣ３をＢｇｆｆＩＩとＰ
ｓｔｌで消化して、３．６Ｋｂの断片を分離精製した。

ついでこれら２つの断片を、Ｔ４リガーゼで連結させｐ
ＥＧＡＰ３を得た。又ｐＧＡＰΔ３の代わりに、ｐＧＡ
ＰΔ５．　　ｐＧＡＰΔ８を用いて同上の操作を行なう
ことにより、ｐＥＧＡＰ５．ｐＥＧＡＰ　８をそれぞれ
作製した。これら３種のプラスミドは、アクレモニウム
・クリソゲナム由来のＧＡＰＤ・プロモーター、ＰＧＫ
ターミネータ−を含む断片がユニク制限酵素切断部位Ｂ
ｇ　（！　ＩＩ　（ＧＡＰＤ開始コドンＡＴＧから数〜
数十ｂｐＴ流に位置する。）を介して発現に好適な配置
でつながった構造を有するプラスミドであり、種々の目
的遺伝子をアクレモニウム・クリソゲナム内で、融合タ
ンパクとして発現させる為のベクターを構築する際、有
用な出発材料となる。これら３種のプラスミドのいずれ
かを用いる事により、所望の遺伝子をＧＡＰＤ遺伝子と
同じ読み枠で連結する事が可能となる。

（３）ｐＥＧＡＰ８３の作製 実施例５−（４）で調製した、ＨＹＢＲ遺伝子を含む１
、３　ＫｂのＢａｍＨＩ断片を、上記ｐＥＧＡＰ３のＢ
ｇｊ７１１部位に、第９図に示す方向で挿入する事によ
りｐＥＧＡＰ８３を得た。以上実施例８において、制限
酵素消化断片の分離精製、プラスミドと該断片との連結
、大腸菌の形質転換、並びにサブクローニングの結果得
られたプラスミドの調製、解析等の基本操作は、すべて
実施例２と同様に行った。

実施例９ ｐＥＧＡＰ８３によってアクレモニウム・クリソゲナム
の形質転換 実施例８で得たｐＥＧＡＰ８３及びコントロールとして
ｐＬＧ８３を用いて、アクレモニウム・クリソゲナムｌ
５−５株の形質転換実験を行った。その結果、ｐＥＧＡ
Ｐ８３を５μｇ用いた場合２０〜８０個の形質転換体が
得られた。これに対してｐＬＧ８３を用いた場合は、前
回と同様全く形質転換体が出現しなかった。この事は請
求項３に示した配列を含有するｐＥＧＡＰａ上のＢｇｌ
ＩＩ−Ｐｓｔｌ断片（約１．６Ｋｂ）内に、アクレモニ
ウム・クリソゲナムＧＡＰＤ遺伝子のプロモーターが含
まれている事を強く示唆している。

（発明の効果） 本発明のプロモーターを利用する事により、種々の遺伝
子をアクレモニウム・クリソゲナム内で効率的に発現さ
せる事か可能となる。

又セファロスポリン発酵に関与する種々の遺伝子を、ア
クレモニウム・クリソゲナム内において、本発明プロモ
ーターの支配下に効率良く発現させる事により、セファ
ロスポリンの発酵収率が向上する事が期待できる。又実
施例に詳述したとうり本発明プロモーターを使用する事
により、効率のよいアクレモニウム・クリソゲナム用形
質転換ベクターを構築する事が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図はアクレモニウム・クリソゲナムＰＧ’に遺伝子
を含むＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す。第２図はアク
レモニウム・クリソゲナムアクチン遺伝子を含むＤＮＡ
断片の制限酵素地図を示す。第３図はアクレモニウム・
クリソゲナムＧＡＰＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵
素地図を示す。第１，２゜３図中の■はそれぞれの遺伝
子のエキソンを示す。 尚それぞれの遺伝子において第１エキソンの５′末端、
及び最終エキソンの３′末端は不明である。 第４図は第１図中←で示した（Ａ）領域の塩素配列を示
す。又予想されるＰＧＫタンパクのアミノ酸配列を塩基
配列の下段に示した。第５図は第２図中Ｈで示した（Ｂ
）領域の塩基配列を示す。又予想されるアクチンタンパ
クのアミノ酸配列を塩基配列の下段に示した。第６図は
第３図中←で示した（Ｃ）領域の塩基配列を示す。又予
想されるＧＡＰＤタンパクのアミノ酸配列を塩基配列の
下段に示した。第７図はプラスミドｐＰＧＫＭ５の作製
過程を示す。第８図は、プラスミドｐＡＣＴＨＹ８３の
作製過程を示す。第９図は、ｐＥＧＡＰ８３の作製過程
を示す。第１０図はｐＧＡＰΔシリーズにおけるＥｃｏ
ＲＶ部位からＧＡＰＤ遺伝子の５′側への欠失点（８ｇ
ｎｎリンカ−）付着点を示すものである。尚図中で新た
に使用した略称ないし略号は、以下のとおりのものであ
る。 Ｂ：ＢａｍＨＩ／Ｂｇ：ＢｇＡ　ＩＩ　／Ｂ　−Ｂ：Ｂ
ａｍＨＩ　とＢｇｊ２１１との結合部位／Ｐ：ＰｖｕＩ
［／Ｐｓ：Ｐｓｔｌ／Ｍ：ＭＩｕＩ／に：Ｋｐｎｌ／Ｓ
：ＳｍａＩ／Ｓａ：Ｓａ、ｊ　Ｉ／Ｓｔ：５ｔｕＩ／Ｓ
ｃ：５ｃａＩ／Ｘ：Ｘｈｏｌ／Ｘｂ：Ｘｂａｌ／ＮＮ５
ｉＩ／Ｎｃ：Ｎｃｏｌ／Ｅ：ＥｃｏＲＩ　／Ｒ￥：Ｅｃ
ｏＲＶ／Ｈ：１（ｉｎｄ［Ｉ／Ｂｓ：Ｂｓ５ＨＩＩ／Ｐ
ｓ−Ｎｓ：ＰｓｔｌとＮ５ｉＩとの結合部位／２ｕｏｒ
ｉ：酵母２μプラスミドの複製起点／ＣＹＣＰ：酵母の
イソ−１−チトクロームＣ遺伝子のプロモーター／ＣＹ
ＣＴ　：酵母のイソーＩ−チトフロームＣ遺伝子のター
ミネータ−／ＰＧＫＰ　：アクレモニウムクリソゲナム
ＰＧＫ遺伝子のプロモーター／ＰＧＫＴ　：アクレモニ
ウムクリソゲナムＰＧＫ遺伝子のターミネータ−／ＡＣ
ＴＰ：アクレモニウム・クリソゲナムアクチン遺伝子の
プロモーター／ＡＣＴＴ　：アクレモニウム・クリソゲ
ナムアクチン遺伝子のターミネータ−／ＧＡＰＤＰ　：
アクレモニウム・クリソゲナムＧＡＰＤ遺伝子のプロモ
ーター／Ｌ：Ｂｇｆｆｉ　Ｕ　　ｌ１ｎｋｅｒ　（ＧＧ
ＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣ）挿入部位／■〜■：　ｐＧＡＰ
Δ１〜Δ８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）アクレモニウム・クリソゲナム（Ａ．ｃｈｒｙｓｏ
   ｇｅ−ｎｕｍ）のホスホグリセレートキナーゼ遺伝子の
   プロモーター活性部分を有し、下式１に示す塩基配列の
   少なくとも一部を有するＤＮＡ断片 式１： 【遺伝子配列があります。】 ２）アクレモニウム・クリソゲナム（Ａ．ｃｈｒｙｓｏ
   ｇｅ−ｎｕｍ）のアクチン遺伝子のプロモーター活性部
   分を有し、下式２に示す塩基配列の少なくとも一部を有
   するＤＮＡ断片 式２： 【遺伝子配列があります。】 ３）アクレモニウム・クリソゲナム（Ａ．ｃｈｒｙｓｏ
   ｇｅ−ｎｕｍ）のグリセルアルデヒド−３リン酸デヒド
   ロゲナーゼ遺伝子のプロモーター活性部分を有し、下式
   ３に示す塩基配列の少なくとも一部を含有するＤＮＡ断
   片 式３： 【遺伝子配列があります。】