JPH022339A - 先端を切断したα―因子リーダー配列を用いた酵母における異種タンパクの改良された発現および分泌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は酵母における組換えタンパクの生産に関する。

特に１本発明は酵母宿主細胞からの異種タンパクの分泌
を与える改良されたα−因子発現系に関する。

（従来の技術） Ｋｕｒｊａｎら（１９８２）　Ｃｅ１ｌ　３０：９３３
−９４３には、酵母のα−因子前駆体遺伝子をコードす
る遺伝子の最初のクローニングおよび配列決定が開示さ
れている。

Ｋｕｒｊａｎら、米国特許第４，５４６，０８２号には
また。この遺伝子のクローニングが報告され、α−因子
リーダー配列は酵母における異種タンパクの分泌を導く
ように用いられ得ることを示唆している。しかしながら
、この特許には、酵母において異種タンパクを発現およ
び分泌させるα−因子リーダーが成功裏に使用されたこ
とを示すデータが含まれていない。

欧州特許公開第１１６，２０１号には、形質転換した酵
母における異種タンパク（表皮増殖因子）の発現および
分泌を導くα−因子リーダーを始めて成功裏に適用した
ことが開示されている。この研究に続いて、α−因子リ
ーダーを用いた酵母における異種タンパクの発現に関し
ては、さらに報告がなされている。例えば、　　Ｅｌｌ
ｉｏｔｔら（１９８３）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０ニア０８
０−７０８４；　Ｂｉｔｔｅｒら　（１９８４）　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ｆ３１
：５３３０−５３３４；Ｓｍ１ｔｈ　ら（１９８５）　
５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２１９−１２２９；欧州特
許公開第１１４，６９５号；第１２３，２２８号；第１
２３．２９４号；第１２３．５４４号；第１２８，７７
３号；および第２０６．７８３号を参照されたい。また
、　Ｂｒａｋｅら、　ｐｒｏｔｅｉｎＴｒａｎｓ　ｏｒ
ｔ　ａｎｄ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ、　ｐ、１０３　（Ｊ
、Ｍ、Ｇｅｔｈｉｎｇ編、　１９８４）　　も参照され
たい。

上記の報告における発現系は、異種タンパクに融合した
全長のα−因子リーダーを生産する。上記の研究はα−
因子発現系が広範囲に有利であることを示しているが１
個々の異種タンパクが成功裏に分泌され、プロセッシン
グを受け、そして生物学的に活性であるかどうかについ
ては、実験を行う前には一般に予測できない。例えば、
欧州特許公開第２０６．７８３号（前出）　、　ｐｐ２
−５；　Ｒｏｔｈｂｌａｔｔら（１９８７）　ＥＭＢＯ
Ｊ、　６　：３４５５−３４６３；　Ｖ、Ｌ、ＭａｃＫ
ａｙ。

５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ
　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ”（印刷中）を
参照されたい。

未公表のデータに基づいて、α−因子リーダーの「プロ
」領域（シグナルペプチドと最初のスペーサーとの間）
を欠失させると、異種構築物により形質転換した酵母に
よって分泌された非酵母タンパクの量が減少するという
いくつかの報告がある。５ｉｄｕら（１９８７）　Ｇｅ
ｎｅ　５４：１７５−１８４には、全長α因子リーダー
および先端を切断したα−因子リーダーの両方を用いた
異種構築物から酵母酸性ホスファターゼ（Ｐｌ！０５）
が培地に分泌されるが、その発現レベルは異種リーダー
の制御下ではＰ　Ｈ０５遺伝子に対して３〜４倍少ない
ことが報告されている。プレプロα−因子前駆体遺伝子
における欠失が天然のα−因子ベプチドの分泌を実質的
に減少させることが報告されている。例えば、　Ｖ、Ｌ
、ＭａｃＫａｙ（前出）　ＨＲｏｔｈｂｌａｔｔら（前
出）を参照されたい。

従って、特に現在のα−因子発現構築物では効果的に生
産されない非酵母タンパクに通用するためにはα−因子
発現系を改良する必要がある。

（発明の要旨） 驚くべきことに、先端を切断した形のα−因子リーダー
配列が酵母において異種ポリペプチドの発現および分泌
を効率的に導き得ることが見出された。特に驚くべきこ
とは、先端を切断したα−因子リーダー配列が、全長α
−因子リーダーを用いた発現系に関して、このような異
種タンパクの発現の効率を実質的に改善するということ
である。

すなわち、より多くの分子が生物学的に活性である異種
タンパクが、より高いレベルで正確にＮ末端プロセッシ
ングを受け、そして分泌されることなどである。これら
の結果は、特にα−因子前駆体のリーダー配列からの欠
失が活性なα−因子の分泌レベルを減少させるという報
告を考慮すると。

驚くべきことである。

従って１本発明は、α−因子に基づく他の発現構築物を
提供する。これらの構築物は、全長α因子リーダー構築
物によっては効率的に発現されないか、あるいはこのよ
うな全長構築物によっては全く発現されない異種ポリペ
プチドの発現に特に有用である。ある実施態様では３本
発明は非酵母タンパクの発現および分泌を与えるＤＮＡ
構築物を含む酵母細胞を目的としている。該ＤＮＡ構築
物は、酵母認識転写開始配列および終結配列の制御下に
あるコード配列を含んでいる。該コード配列は、リーダ
ー配列と、プロセッシング部位により連結された上記の
非酵母タンパクとから構成される前駆体ポリペプチドを
コードしている。そして。

該プロセッシング部位は１該前駆体ポリペプチドから上
記の非酵母タンパクを開裂させる。ここで。

上記のリーダー配列は前駆体ポリペプチドの約２５〜約
５０個のＮ末端残基であり、酵母α−因子前駆体のシグ
ナルペプチドおよび唯一のグリコシル化部位を含んでい
る。

他の実施態様では１本発明は酵母宿主により分泌され得
る前駆体ポリペプチドをコードする領域を有する二本ｔ
ｊｆＤＮＡ分子を目的としている。該領域は、　ＤＮＡ
　ｔｊｆの一方に関しては１次の構造を有する。

５’−ＡＦ−ＣＨＯ−Ｘｎ、−３−遺伝子１−３′ここ
で、　ＡＰは酵母α−因子シグナルペプチドをコ−ドし
、　Ｃｌｌ０はグリコシル化部位をコードし；Ｘｎ。

はグリコシル化部位、または酵母によるインビボでの上
記前駆体ポリペプチドの開裂を与えるプロセッシング部
位を含まず；長さがｎ個のアミノ酸からなるポリペプチ
ドをコードし二〇は０〜約３０までの整数であり；遺伝
子９は非醇母タンパクをコードし；そしてＳは上記の前
駆体ポリペプチドの開裂を与えるプロセッシング部位を
コードする。

本発明はまた。上記の細胞およびＤＮＡ構築物を用いて
組換えタンパクを生産する方法、およびこれらの方法に
より生産される組換えタンパクの組成物を目的としてい
る。他の実施態様は１　当業者には明白である。

（発明の構成） 本発明を実施する際には、特に指摘しなければ従来の分
子生物学、微生物学、および当該分野における組換えＤ
ＮＡ技術が用いられる。このような技術は１文献中に詳
細に説明されている。例えば。

Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　＆　Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａ＋（１９８２）
：　　ＤＮＡ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　　第　１巻および
第■巻（Ｄ、Ｎ、ＧＩｏｖｅｒ編、　１９８５）；　ｏ
ｔｉ　ｏｎｕｃｌｅ−ｏｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ
　　（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ′ｆＡ、　　１９８４）　Ｔｒ
ａｎｓｃｒｉ　　ｔｉｏｎ−ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎ　　（Ｂ、Ｄ、ｌＩａｍｅｓ　＆　Ｓ、Ｊ、ｌ１
１ｇｇ１ｎｓ　　’１Ｍ１９８４）；　　Ｉｍｍｏｂｉ
ｌｉｚｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　　ａｎｄ　Ｅｎｚ　ｍｅｓ　
　（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ１９８６）；　　Ｂ、Ｐｅｒｂ
ａｌ、Ａ　　ＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅ　　ｔｏ　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒすμ性態（１９８４）を参照された
い。

本発明について述べる場合には９次の用語を以下に示す
定義に従って用いる。

「レプリコン」とは、インビボにおけるＤＮＡ複製の自
律単位として機能する（すなわち、それ自体の制御下で
複製可能な）あらゆる遺伝要素（例えば、プラスミド、
コスミド、染色体、ウィルス）である。

［ヘクター」とは、結合した部分の複製が起こるように
、他のＤＮＡ部分を結合させ得るレプリコン（例えば、
プラスミド、ファージ１またはコスミド）である。

「二本鎖ＤＮＡ分子」とは、デオキシリボ核酸（アデニ
ン、グアニン、チミジン、またはシトシン）の多量体で
あって１通常の二本鎖らせん状のものを意味する。この
用語は１分子の一次構造および二次構造のみを意味し、
特定の三次形態に限定されるものではない。従って、こ
の用語は、特に鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限酵素処理
断片）、ウィルス、プラスミド、および染色体で見出さ
れる二本１￥ＤＮＡを包含する。特定の二本鎖ＤＮＡ分
子の構造を考察する場合、ここでは配列を、　ＤＮＡの
非転写鎖（すなわち、特定のコード配列から生じるｍＲ
ＮＡに相同的な配列を有する鎖）に沿って５゛がら３′
方向へ向かう配列のみを与える通常の習慣に従って記述
する。

ＤＮＡ　　ｒコード配列」とは、適当な調節配列の制御
下に置かれた場合に、インビボで転写され、ポリペプチ
ドに翻訳され得るＤＮＡ配列である。コード配列の境界
は、５″（アミノ）末端における翻訳開始コドンと、３
°（カルボキシル）末端における翻訳停止コドンとによ
り決定され、そしてこれらのコドンを含む。コード配列
は、原核生物のＤＮＡ配列、ウィルスのＤＮＡ配列、真
核生物源（例えば。

哺乳動物）のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列、および
合成りＮＡ配列をも包含し得るが、これらには限定され
ない。

「酵母認識転写開始配列および終結配列」とは。

コード配列に隣接し、該コード配列に相同的なｍＲＮＡ
の酵母における転写に関与する。該ｍ　ＲＮ　Ａは９次
いで、コード配列によりコードされているポリペプチド
に翻訳され得る。転写開始配列には酵母プロモーター配
列が含まれ、該酵母プロモーター配列は、細胞内で酵母
ＲＮＡポリメラーゼが結合し１下流（３゛方向）のコー
ド配列の転写を開始し得るＤＮＡ制御配列である。本発
明を定義する目的では、プロモーター配列は、その３°
末端において、コート配列の翻訳開始コドンにより境界
が設けられ（そして、取り除かれる）、上流（５゛方向
）に延びてバックグラウンド以上の検出可能なレベルで
転写を開始するのに必要な最小限の数のヌクレオチドま
たは構成要素を含んでいる。プロモーター配列の中には
、転写開始部位（Ｓｌヌクレアーゼによるマンピンクに
より便宜的に定義される）、および酵母ＲＮＡポリメラ
ーゼの結合に関与するタンパク結合ドメイン（共通配列
）が見出される。本発明に有用なプロモーターには、野
生型α−因子プロモーター、および他の酵母プロモータ
ーが含まれる。特に、解糖系の酵素（例えば、ホスホグ
リコイソメラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、ホスホト
リオースイソメラーゼ、ホスホグルコムターゼエノラー
ゼ、ピルピックキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ）
に関連するプロモーター。

およびこれらのプロモーターのハイブリッドが好ましい
。例えば、欧州特許公開第１２０，５５１号および第１
６４，５５６号を参照されたい。転写開始配列にはまた
。プロモーターの調節または増幅に関与する他の調節領
域が含まれ得る。同様に、翻訳停止コドンに対して３°
側に位置する転写終結配列は野生型α−因子転写終結配
列であるか、あるいは他の酵母認識終結配列（例えば１
上記の解糖系酵素に対する遺伝子からの配列）であり得
る。

コード配列は、　　ＩＩＮＡポリメラーゼが転写開始配
列に結合し、該コード配列をｍＲＮＡに転写し、転写終
結配列で終結させ、そして該ｍＲＮＡが該コード配列に
よりコードされているポリペプチドに翻訳される（すな
わち、「発現」される）場合には、転写開始配列および
終結配列の「制御下」にある。

本発明のコード配列がコードする前駆体ポリペプチドは
、少なくとも一部（通常、リーダー配列のない非酵母タ
ンパク）が細胞外へ輸送されて細胞増殖培地に存在する
場合には、「分泌」される。

通常、リーダー配列より下流の前駆体タンパク部分のみ
が分泌され、そしてこの下流部分はまた分泌の間に付加
プロセッシングを受ける（例えば。

ペプチド鎖開裂、　ｔ！付加、折りたたみ、　Ｓ−Ｓ結
合の形成など）。

外来ＤＮＡが細胞壁内に導入されていると、この細胞は
外来ＤＮＡにより「形質転換」されている。

外来ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに
組み込まれる（共有結合で連結される）こともあれば１
組み込まれないこともある。外来ＤＮＡは。

プラスミドのようなレプリコンで染色体とは独立に保持
される。外来ＤＮＡが染色体に組み込まれると、染色体
の複製によって娘細胞に遺伝される。

染色体に組み込まれた外来ＤＮＡにより形質転換されて
いる細胞は、「安定な」形質転換細胞と呼ばれる。「ク
ローン」または「クローン集団」とは減数分裂により単
一の細胞または共通の祖先から誘導された細胞の集団で
ある。

２つのＤＮＡ配列において、その分子の定められた長さ
のうちで、ヌクレオチド配列の少なくとも約６０％（好
ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少な（と
も約９０％）が一致している場合。

これらのＤＮＡ配列は「実質的に相同性を有する」とい
う。実質的に相同性を有する配列は、特定の系で定めら
れるような選択的な厳密条件下におけるサザンハイブリ
ダイゼーション実験により同定され得る。適切なハイブ
リダイゼーション条件の定義は当該分野における技術範
囲内にある。例えば、　Ｍａｎｉａｔｉｓら　（前出）
＋　ＤＮＡ　ＣＩｏｎｉｎ　　（前出）Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄ　Ｈｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　（前出）を参
照されたい。

ＤＮＡ分子の「非相同領域」は、天然の巨大分子とは関
連性のない巨大ＤＮＡ分子内の同定可能なりＮＡ部分で
ある。このように、非相同領域が哺乳動物タンパクをコ
ードする場合には、核非相同領域は。

通常、その起源となる生物のゲノム内の哺乳動物ＤＮ＾
配列には隣接していないＤＮＡに隣接している。

非相同コード配列の他の例は、コード配列自体が自然界
には存在しない構築物（例えば１ゲノムコ一ド配列がイ
ントロンを含むｃＤＮへ、あるいは同一またはＭ（Ｒの
タンパクをコードする生物とは異なるコドンを有する合
成配列）である。対立遺伝子の変化、または自然に発生
する変異現象は、ここで用いられるようなりＮＡの「非
相同」領域を生じるものではない。

ここで用いられるように、「酵母」は、アスコスポロゲ
ナス酵母（Ｅｎｄｍｙｃｅｔａｌｅｓ）　＋　　バシデ
ィオスポロゲナス酵母、および不完全菌類に属する酵母
（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）が含まれる。アスコス
ポロゲナス酵母は、　Ｓｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅ
ａｅおよび５ａｃｃｈａｒ。

ｍｙｃｅ　ｔａｃｅａｅという２つの科に分類される。

後者はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａ
ｅ　（例えば、　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ−ｍｙ
ｃｅｓｌｉ　）　、　Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ、　
Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ、およびＳａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｏｉｄｅａｅ　　（例えば、　Ｐｉｃｈｉａ属。

Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、およびＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ属）の４つの亜科から構成される。ハシデ
ィオスポロゲナス酵母には、　Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄ
ｉｕｍ属、　Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、　５ｐ
ｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属、　Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕ
ｍ属、およびＦｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ属が含まれ
る。不完全菌類に属する酵母は、　Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏ
ｍｙｃｅｔａｃｅａｅ　　（例えば、　Ｓｐｏｒｏｂｏ
ｌｏｍｙｃｅｓ属、およびＢｕｌｌｅｒａ　、ｌｉ）お
よびＣｒｙｐむ０ｃｏｃｃａｃｅａｅ　　（例えば、　
Ｃａｎｄｉｄａ属）の２つの科に分類される。本発明に
特に興味潤いものは、　Ｐｉｃｈｉａ属、　Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ属、　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属
、　５ｃｈｉｚ。

ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、およびＣａｎｄｉｄａ
属である。中でも特に興味深いものは、　Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ属のＳ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、　　Ｓ、　ｃａｒｌｓｂｅｒ　
ｅｎＳｉｓ、　　Ｓ、　ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓＳ、並
■山ｈｓｉｉ、　　Ｓ、　桂膨η山Ｓ、　ｎｏｒｂｅｎ
ｓｉｓおよびＳ、　ｏｖｉｆｏｒｍｉｓである。Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の特に興味深い種には、　　Ｋ
、　１ａｃｔｉｓがある。酵母の分類が将来変更される
こともあるので１本発明では、酵母は次の文献に記載さ
れているように定義する（Ｂｉｏｌｏ　　ａｎｄ　Ａｃ
ｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｙｅａｓｔ　（Ｆ、Ａ。

５ｋｉｎｎｅｒ、Ｓ、Ｍ、Ｐａｓｓｍｏｒｅ　＆　Ｒ，
Ｒ，Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ編、　　１９８０）（Ｓｏｃ、
Ａｐｐ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｓｙｍｐ、５ｅｒｉｅｓ
　Ｎｏ、９）。上記に加えて、当業者はおそらく酵母の
生物学および酵母の遺伝学操作に精通している。例えば
、　Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｓむｒ　　　ａｎｄ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　
　ｏｆ　　Ｙｅａｓｔ　　（Ｍ、Ｂａｃｉｌａ、　　　
Ｂ。

Ｌ、ｌ１ｏｒｅｃｋｅｒ　　＆　　八、Ｏ，Ｍ、５ｔｏ
ｐｐａｎｉ　　ｋＬ　　１９７８）；　　　ＴｈｅＹｅ
ａｓｔｓ　（八、Ｉｌ、Ｒｏｓｅ　＆　Ｊ、Ｓ、ｌ１ａ
ｒｒｉｓｏｎ鯛、第２版、　１９８７）　：Ｔｈｅ　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ　　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙ
ｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ（Ｓ　ｔｒａ　
ｔｈｅｒｎら）Ｌ　１９８１）を参照されたい。上記の
文献の開示内容は参照文献としてここに採用する。

本発明は酵母α−因子遺伝子由来の先端を切断したリー
ダー配列を使用する。α−因子は、約１００個と２００
個との間（典型的には約１２０〜１６０個）の残基から
なる大きな前駆体ポリペプチド（プレプロ−α−因子）
から生産される長さが約１３残基のオリゴペプチド成熟
フェロモンである。該前駆体は、約２０残基（例えば、
約１９〜２３個、典型的には約２０〜２２個）の疎水性
「シグナル配列」と、後に続く約６０個の親水性残基（
「プロ」領域）付加リーダー領域と、該付加リーダー領
域は、成熟フェロモンのタンパク分解プロセッシングを
与える短いオリゴペプチドスペーサ領域（典型的には約
６〜８残基）により分断される成熟フェロモン配列（典
型的には約２〜６）のいくつかのタンデム配列に連結し
ている。

種々のプレプロ−α−因子遺伝子のクローニングが報告
されている。例えば、　Ｋｕｒｊａｎら、米国特許第４
，５４６，０８２号、　Ｓｉｎｇｈ　ら（１９８３）、
　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、旦：４０４９−
４０６３；　１９８８年７月２８日出願の特願昭６３−
１８９５５２を参照されたい。これらの文献の開示内容
は参照文献としてここに採用する。さらに。

プレブローα−因子遺伝子をコードするＤＮＡ配列は１
既知のプレプロ−α−因子配列由来のプローブとのハイ
ブリダイゼーションにより同定され得る。例えば、　Ｂ
ｒａｋｅら（１９８３）　Ｍｏ１ｅｃ、　＆　Ｃｅ１ｌ
　Ｂｉｏｌ。

３　：１４４０−１４５０を参照されたい。α−因子は
また酵母種より精製し、配列を決定し、プレプロ−α因
子遺伝子をクローン化するためプローブを設計する例え
ばＭｃＣｕ　１　＋ｏｕｇｈら（１９７９）　Ｊ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ。

１３８：１４６−１５４；　５ａｔｏら　（１９８１）
　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

４４：１４５１−１４５３ＨＳｉｎｇｈら（１９８３Ｌ
　（前出）を参照されたい。ある酵母種のα−因子リー
ダー配列が他の酵母種においても機能し得ることが確認
されている。例えば、米国特許出願第０７８，５５１号
（前出）を参照されたい。このように２本発明は。

般的な酵母由来のα−因子リーダー配列を使用すること
だけでなく、異種酵母種において、このようなリーダー
配列を使用することをも意図している。しかし、記述を
簡単にするために１本発明は。

Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のプレプロ−α−因子
遺伝子ＭＦａｌに関して考察する。例えば、　Ｋｕｒｊ
ａｎら、米国特許第４，５４６，０８３号ｊ　Ｓｉｎｇ
ｈら（１９８３）、　（前出）を参照されたい。

本発明は、リーダー配列および非酵母ポリペプチドから
成るハイブリッド前駆体ポリペプチドをコードするキメ
ラＤＮＡ構築物を使用する。本発明では、リーダー配列
ＤＮＡは、前駆体ポリペブチＹのＮ末端開始コドン（メ
チオニン）から始まり。

リーダー配列と非酵母タンパクをコードする配列との間
を分断するプロセンシング部位前方の最後のアミノ酸残
基をコードするコドンまでの配列として定義する。本発
明のリーダー配列は、先端を切断した形の酵母α−因子
リーダー配列からなり。

その典型的な長さは、約２５〜５０個のアミノ酸残基で
ある。このように２本発明のリーダー配列は。

典型的な全長α−因子リーダーよりも短く、約３０個の
アミノ酸残基である。例えば、　ＭＦａｌは、８３個の
アミノ酸残基からなるリーダー配列と、後に続く、酵母
プロセンシング酵素により開裂をうけるヘキサペプチド
のスペーサー配列とを有する。リーダー配列から欠失体
を調製する場合には、充分な分泌を与えるために、少な
くとも１つのグリコシル化部位（−Ａｓｎ−Ｙ−Ｔｈｒ
／５ｅｒ−）を保持することが重要である。

また、リーダーは機能性α−因子シグナル配列を保持す
ることが必要である。上で示したように。

シグナルペプチドは９通常、長さが約２０個のアミノ酸
であり、疎水性コア部分を有するという特徴がある。例
えば、　ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、（１９８４）　Ｊ、Ｍ
ｏ１．Ｂｉｏｌ。

…：２４３−２５１を参照されたい。今日までに調べら
れた全てのプレプロ−α−因子配列は、長さが約２０残
基の疎水性ペプチドをコードする。分泌経路へ前駆体ポ
リペプチドを導くのに必要なシグナルペプチドの正確な
長さは決定されていないが１通常、約１９個と約２３個
との間の残基が必要である。

必要とされる最小配列は欠失変異体を試験することによ
り、容易に決定することができる。

このように１本発明では、　ＭＦａｌに関して、約３０
〜約６０個の残基、典型的には約３３個と約５８個との
間の残基、さらに典型的には約４８個と約５８個との間
の残基の範囲内の欠失を考慮する。これらの欠失は２通
常、２６〜８３番目の残基の領域内（両端を含む）に生
ずる。５７〜５９番目および６７〜６９番目の残基にお
けるグリコシル化部位を含む欠失が好ましい。欠失性α
−因子リーダー配列は、必要に応じて、その一部を非−
α−因子リーダー配列で置換し得る。これらの配列は、
一般に、親水性アミノ酸残基はコードするが、グリコシ
ル化部位およびプロセッシング部位はコードせず、リー
ダーの全長が約５０個の残基またはそれ以下１好ましく
は約２３〜４０個の残基、最も好ましくは約２５〜３５
個の残基を保持するように選択すべきである。

上で示したように１本発明のリーダー配列は。

その３″側の直く下流に、前駆体ポリペプチド内でリー
ダーが融合された非酵母タンパク配列からリーダーを切
断させるプロセッシング部位を有する。

本発明で用いられるプロセッシング部位は９選択された
工程（例えば、化学的工程、酵素的工程など）による開
裂に対して特異的に認識される最小数のアミノ酸残基を
定めるコドンとして定義する。

種々のプロセンシング部位が当該分野において知られて
おり、インビボおよびインビトロで活性なプロセッシン
グ部位が含まれる。例えば１　プロセッシング部位は、
酵母宿主中には存在しないタンパク分解酵素の切断部位
をコードすることによりインビトロでのプロセッシング
を与える。回収した前駆体ポリペプチドは２次いでタン
パク分解酵素で処理して前駆体由来の非酵母タンパクを
開裂させる。他のインビトロプロセンシング部位は臭化
シアンを用いた発現後処理により開裂を受けるメチオニ
ンコドンである。例えば３本国特許第４．３６６．２４
６号を参照されたい。

インビボプロセッシング部位は、所望の非酵母タンパク
配列の発現を行う酵母タンパク分解酵素により認識され
るあらゆるペプチドシグナルから選択され得る。特に好
ましいプロセンシング部位は、天然のプレプロ−α−因
子のプロセッシングに関連する酵素が認識し得るもので
ある。例えば。

ジペブチジルアミノペブチダーゼへ（ＤＰ八へａ５ｃ’
Ａ）は末端−Ｘ−Ａｌａ−配列（ここで、ＸはＧｌｕま
たは八ｓｐである）を除去する。例えば、　Ｊｕｌｉｕ
ｓら（１９８３）Ｃｅｌｌ　３２：８３９−８５２を参
照されたい。ＫＥＸ２　　ｉｆｆ伝子によりコードされ
るエンドペプチダーゼは、　Ｌｙｓ残基およびＡｒｇ残
基からなる塩基性ジペプチド（すなわち、　Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ、八ｒｇ−Ａｒｇ、　Ａｒｇ−Ｌｙｓ＋　　および
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）を開裂する。例えば、　Ｆｕｌｌｅｒ
ら、　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌｏ　　１９８６．　ｐｐ、２７３−２７８　（
１９８６）を参照されたい。酵母では、α−因子前駆体
は、まずＫＥＸ２エンドペプチダーゼにより開裂され１
次いでＮ末端がＤＰＡＰａｓｅ　Ａにより整えられて成
熟α−因子フエ口モンを与える。後者のタンパク分解工
程が律速段階であるらしいので、プロセッシング部位が
にＥＸ２エンドペプチダーゼに対するシグナルのみから
なるように　ＤＰＡＰａｓｅ　Ａに対するシグナルを除
去することが好ましい。従って、このような実施態様に
おいては　リーダー配列は、　ＫＥＸ２エンドペプチダ
ーゼの二塩基性ペプチド認識部位（例えばＬｙｓＡｒｇ
またはＡｒｇ−Ａｒｇ　）により非酵母タンパク配列に
連結される。

本発明の前駆体ポリペプチドのカルボキシル末端部分は
非酵母タンパクである。この部分をコードするＤＮＡ配
列は、プロセッシング部位の最後のコドンの下流（３“
方向）にある最初のコドンから始まり、前駆体ポリペプ
チドのカルボキシル末端を定める翻訳停止コドンまでの
配列として定義される。このＤＮＡ配列は、酵母が発現
するポリペプチドに対して実質的に相同性を有さないポ
リペプチドを定める場合、「非酵母タンパク」をコード
すると考えられる。一般に、好ましい非酵母タンパクは
哺乳動物タンパク配列（その類似体、すなわち「突然変
異タンパク」１断片などを含む）である。従って、ここ
で定義されているように、非酵母タンパクには、哺乳動
物および酵母の配列からなる融合タンパク、ならびに成
熟哺乳動物タンパクの「プロ」形が含まれ得る。

非酵母タンパクをコードするＤＮＡ配列は、非酵母生物
よりクローン化された配列であり得る。また、これらの
ＤＮＡ配列は２合成配列１通常、酵母に適したコドンを
用いて調製された合成配列であり得る。通常、非酵母タ
ンパクは、少なくとも長さが約８個のアミノ酸であり、
約１００，０００ダルトンまたはそれ以上までのポリペ
プチドを包含し得る。通常、非酵母ポリペプチド配列は
約３００．０００ダルトンより小さく、より一般的には
約１５０．０００ダルトンより小さい。特に興味深いも
のは約５，０００〜約１５０，０００ダルトンのポリペ
プチドであり、さらに興味深いものは約５，０００〜約
１００，０００ダルトンのポリペプチドである。興味深
い非酵母タン）ｉりの例としては、成長ホルモン、ソマ
トメジン。

表皮成長因子、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン
、オキシトシン、インシュリン、バソプレッシン、レニ
ン、カルシトニン、卵胞刺激ホルモン　プロラクチン、
エリスロポエチン、コロニ刺激因子、リンフ才力イン（
例えば、インターロイキン２）、グロビン、免疫グロブ
リン、インターフェロン（例えば＋　ａ、　ｂ、または
ｑ）、　　酵素。

ｂ−エンドルフィン、エンケファリン３　ダイノルフィ
ン、インシュリン様増殖因子などのホルモンや因子が挙
げられる。

（以下余白） 本発明の好適な実施態様では、上述の前駆体ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ構築物は、５’　−ＡＦＣｉｌＯ
−Ｘｎ−３−遺伝子１−３″の構造を有する。ここで　
ＡＰは、酵母のα−因子のシグナルペプチドをコードし
、　ＣＨＯは、グリコシル化部位をコードし；Ｘｎは、
グリコシル化部位もしくはプロセッシング部位（インビ
ボで、酵母宿主により前駆体ポリペプチドを開裂させる
）を含有しない長さのｎ個のアミノ酸のポリペプチドを
コードし；ｎは０から約３０までの整数であり：遺伝子
４は、非酵母タンパクをコードし；そして、Ｓは、上記
前駆体ポリペプチドを開裂させるプロセッシング部位を
コードする。

八Ｆによってコードされるシグナルペプチド上記と同じ
α−因子シグナルペプチドである。それは、長さにして
約２０残基（例えば、約１９〜２３残基）であり、そし
てそれは、前駆体ポリペプチドを，酵母分泌経路へ誘導
するのに十分な長さである。正確な最少もしくは最大の
長さは．一連の欠失構築物のスクリーニングによって特
定のα−囚子について決定され得る。

Ｃ１（０により定義されるＤＮＡ配列は、グリコシル化
部位をコードする。それは一般的に、長さにして９個の
ヌクレオチドであり、アミノ酸へｓｎ　−ＹＹｏに対応
する３つのコドンを含む。ここでＹは任意のアミノ酸残
基、そして、ｙ″は、スレオニンもしくはセリンである
。

Ｘｎが存在する場合には１例えば、欠失していないα−
因子リーダ一部分もしくは無関係のアミノ酸配列をコー
ドする。一般に、　Ｘｎは、最大約３０アミノ酸残基で
あり、より好ましくは最大約２０残基そしてもっとも好
ましくは最大約２０残基である。

Ｘｎは３いかなるポリペプチドをもコードする必要１よ
ない（つまりｎ＝０）が、グリコシル化部位Ｃｌｌ０と
プロセッシング部位Ｓとの間に、あるスペースを有する
ことが２次の条件下において望ましい。

つまり、グリコシル化部位での糖の付加によりプロセッ
シング部位を開裂する物質が接近するのを立体的に阻害
するという条件下において、望ましい。そのような場合
には、ｎは１通常、最少の約１であり、より好ましくは
最少の約２であり、そして最も好ましくは最少の約３で
ある。

Ｘｎが存在する場合には、該Ｘｎは、いかなる機能的グ
リコシル化部位もしくは酵母宿王によって認識されて開
裂するプロセッシング部位をも含んでいないことが好ま
しい。さらに、α−因子リーダー中に見い出される配列
から外れる場合には、親水性アミノ酸残基を選択するの
が好ましい。Ｘｎの長さが、非酵母性タンパクの発現お
よび分泌の効率に影習する。発現を最適にするためのＸ
ｎの適当な長さの選択は１種々の大きさの構築物をスク
リニングすることによりなされ得る。

遺伝子１によりコードされる非酵母性タンパクおよびＳ
によりコードされるプロセッシング部位は、上記のとお
りである。

本発明のＤＮＡ構築物は、宿主中、特に酵母宿主中では
安定に保持され得るレプリコン中に１通常保持される。

レプリコン（通常、プラスミドである）は、１もしくは
それ以上の複製系、好ましくは２つの複製系を含有し５
発現のための酵母宿主およびクローニングのための原核
生物宿主でのレプリコンの維持を許容する。そのような
酵母−細菌シャトルベクターの例としては、　ＹＥｐ２
４　　（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、　　（１９７９）　Ｇｅ
ｎｅ　８　：　１７　２４）　ｐｃ１／１　（Ｂｒａｋ
ｅ　ら（１９８４））　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａ
ｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８１：４６４２−４６４６およ
びＹＲｐ１７　　（Ｓｔｎｉｃｈｏｍｂら、　　（１９
８２）　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

１５８　：　１５７）が包含される。さらに、プラスミ
ド発現ベクターは、高もしくは低コピー数のプラスミド
であり得、そのコピー数は、一般に約１から約２００の
範囲である。高コピー数の酵母ベクターでは、単一宿主
中で一般に少なくとも１０．好ましくは少なくとも２０
であり、そして通常、約１５０コピーを越えない。選択
された非酵母タンパクに依存して、高もしくは低コピー
数のベクターのいずれかが望ましく、それは、ベクター
の効果および宿主の外来タンパク依存している。例えば
、　Ｂｒａｋｅら（前出）を参照されたい。本発明のＤ
ＮＡ構築物もまた２組み込みベクターによって酵母ゲノ
ム中に組み込まれ得る。そのようなベクターの例は当該
分野で知られている。例えば、　Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　（
前出）を参照されたい。

本発明の実施にあたり適当な酵母および他の微生物宿主
の選択は、当業者の技術範囲内にある。

発現のための酵母宿主を選択する場合、好適な宿主は、
特に、良好な分泌能力、低いタンパク溶解活性、そして
総合的な強健さを持つことを示すものが包含され得る。

酵母および他の微生物は般に３種々の供給源から入手可
能である。その供給源には、カリフォルニア州バークレ
ーのカリフォルニア大学の生物物理学および医学物理学
科のイースト　ジェネティノク　ストック　センター；
およびメリーランド州ロックウィルのアメリカンタイプ
　カルチャー　コレクションが包含される。

酵母宿主中への外来のＤＮＡを導入する方法は当該分野
で既知である。酵母を形質転換するための広範な種々の
方法がある。例えば、スフェロプラスト形質転換が１例
えば、　　（Ｉｌｉｎｎｅｎら　（１９７８）Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７
５　；　１９１９−１９３３およびＳｔ：ｎｃｈｃｏｍ
ｂら、ヨーロッパ特許公ＩＨｊ４５．５７３号により教
示される。形質転換体を適切な栄養培地中で増殖させ、
そして、適切であるなば、外来ＤＮＡの保持を保証する
選択圧の下で保持される。

発現が誘導性である場合には、酵母宿主に増殖を行ない
、高密度の細胞を生しさせると発現が誘導される。分泌
され、加工された非酵母性のタンパクは、従来のあらゆ
る方法によっても回収され。

そしてクロマトグラフィー、電気泳動、透析、溶媒−溶
媒抽出などによって精製されうる。

（実施例） 次の実施例は１本発明を例証する目的で示されたもので
あり１本発明の範囲を限定するものではない。生物学的
出発材料の寄託は１本発明の実施に際し、必要ではない
と考えられる。なぜなら同一のもしくは同等の材料は、
公に入手可であるためである。

尖籐Ａ土 次の実施例は、ヒト・プロインシュリンの発現に使用さ
れる修飾されたα−因子構築物で得られる発現および分
泌のレベルの比較を行なっている。

３つの構築物は、全長のα−因子リーダー配列を用いて
いる。そのひとつは、３つの天然のグリコシル化部位を
持つα−因子リーダー配列を有し他のひとつは、３つの
グリコシル化部位のすべてが除去されており、そして、
さらに他のひとつは２３位のアスパラギンを除いてすべ
てのグリコシル化部位が除去されている。第４の構築物
は、２３位のＡｓｎに単一のグリコシル化部位を保持す
る先端を切断されたα−因子リーダー配列である。

Ａ、■薊旦 このプラスミドは、ヒト・プロインシュリンに結合した
α−因子リーダー配列（Ｂｒａｋｅら　（１９８４）Ｐ
ｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　
　ＵＳＡ　　　８↓：　　４６４２−４６４６　　。

ヨーロッパ特許公開第１１６，２０１号）をコードする
。

このプロインシュリンは、酵母に好適なコドン（第１図
）によりつくられる合成遺伝子によってコードされる。

α−因子す−ダー配列２合成プロインシュリン遺伝子、
そしてα−因子ターミネータ配列は、　ｐｙＢｃＡ５由
来であり、その構築物は、第１図に示されている。転写
は、　４０４ｂｐのＢａｍＨＩ　　ＮｃｏｌＧ　Ａ　Ｐ
　Ｄ　１１プロモ一タ断片（Ｔｒａｖｉｓら、　　（１
９８５）　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｒｎ、　２６０二４３８４−４３８９）によって
媒介される。ＧＡＰＤＨプロモータ、プロインシュリン
に結合したα−因子をコードする配列、およびα−因子
ターミネータからなる１２０６ｂｐのＢａｍ１ｌ（発現
力セントを、酵母シャトルヘクタ−１）ＡＢ２４　　（
後述）もしくはρＣ１／１の唯一のＢａｍ１ｌ　１部位
中に、　ＧＡＰＤＩＩのプロモータ配列がベクターの５
ａｌ１部位に近（なるようにクローニングすると、プラ
スミドｐＹＧＡＩｌ−ＡＢ２４もしくはｐＹＧＡｌｌ−
ＣＩ／１　が得られる。１２０６ｂｐのＢａｍＨ１発現
カセットをまた。　ｐＢＲ３２２の誘導体（ｐＢＲ３２
２（ＷＥｃｏＲＩＳａｌｌ）　ＢａｍＨＩ　；　Ｔｒａ
ｖｉｓら、　（前出））の唯一のＢａｍＨ１部位中にサ
ブクローン化した。このプラスミドはｐＧＡｌｌ　と命
名された。

プラスミドｐＡＢ２４　　（第４図）は、完全な２ｍ配
列（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ
　　ｏｆ　ｔｈｅ　ＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍ　ｃ
ｅｓ、　　Ｖｏｌ、　１　、　　ｐ、　　４４５（１９
８１）　　）　とｐＢＲ３２２配列とををする酵母シャ
トルヘクターである。

それはまた、プラスミドＹＥｐ２４　（Ｂｏｔｓｔｅｉ
ｎら、　　（１９７９）Ｇｅｎｅ　　旦：１７）由来の
酵母ＵＲＡ　３遺伝子およびプラスミドｐｃＩ／１由来
の酵母ＬＥＵ２ｄ遺伝子も含む。

ヨーロッパ特許公開第１１６，２０１号参照。プラスミ
ドｐＡＢ２４は、　ＹＥｐ２４をＥｃｏＲＩで消化し、
ベクターを再連合して部分的に２ｍ配列を除去すること
によって構築される。得られたプラスミドＹＥｐ２４Ｗ
［は、　Ｃｌａ！消化によって２直線化され、そしてＣ
１ａｌで直線化された完全な２ｍプラスミドを連結され
る。得られたプラスミド、　ｐＣＢｏｕを１次に、　Ｘ
ｂａＩで消化し、そして８６０５ｂｐのヘクター断片を
、ゲル分離した。この分離したＸｂａｌ断片を、　ｐｃ
ｔ／１から分離したＬＥＵ２ｄ遺伝子を含有する４４６
０ｂｐのＸｂａ　１断片に連結した。ＬＥＵ２ｄ遺伝子
の方向は、　ＵＲＡ３遺伝子と同じ方向である。

Ｂ、餞い■ プラスミドｐＹＧＡ　［３は、修飾α−因子リーダー配
列をコードしている点でｐＹＧＡｌｌと異る。この修飾
α−因子リーダー配列においては、第２３．５７　　お
よび６７番目の残基のＡｓｎのコドンがＧｌｎに変化し
ている。そのことによりＮ結合グリコシル化のためのす
べての信号が除去されている。

このプラスミドによってコードされるα−因子リーダー
配列とプロインシュリンのＮ末端の１３アミノ酸とを合
成オリゴヌクレオチドの連結によって構築し、　５’Ｎ
ｃｏＩ突出部分と３”１ｌｉｎｄ［［突出部分を持つ２
９４ｂρを得た。その配列を第２図に示す。適切なオリ
ゴヌクレオチドの配列を合成の間に改変したので、天然
のα−因子リーダー配列の第２３゜５７、および６７位
のアスパラギンに特異的なコドンは、今や同じ位置に存
在するグリタミンに特定する。プロインシュリンのＮ末
端１３アミノ酸を特定するＤＮＡ配列は、　ｐＹＧＡｌ
ｌ中のそれと同一であった。

２９４　ｂｐの合成り、ＮＡ　　（Ｎｃｏｌ−Ｈｉｎｄ
ｌＩ［）断片を、類似の断片であルｐＧＡ１１およびｐ
ＹＧＡｌｌ−Ｃ１／１　ニ置換し。

プラスミドｐＧＡＩ３およびｐＹＧＡＩ３を得た。

Ｃ，バ銃」 プラスミドｐＹＧＡ１８は、３つのグリコシル化部位の
うち２つを除去されたα−因子リーダー配列をコードす
るＤＮＡを有する。第５７および６７位のアスパラギン
を、グルタミンに修飾した。得られたプラスミドは第２
３位のアスパラギンに唯一の単一のグリコシル化部位を
持っている。ｐＹＧＡＩ８は以下のように調製された。

まず第１に、５゛断片を、ＩＩｐａＩＩ切断によってｐ
ＧＡｌｌの発現カセットから分離し２次にＢａｍ１ｌ　
１で切断し。

そしてＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｉ＋プロモータを含有する５０
４　ｂｐ断片とα−因子リーダー配列の１から３３残基
をコードする配列をゲル分離した。次に、グリコシル化
部位を欠失しているα−因子リーダー配列をコードする
プラスミドｐＹＧＡＩ３もまた。連続的にＨｐａ　Ｉ［
およびＢａｎ＋ＨＩで切断した。分離した７０２　ｂｐ
の断片は３４〜８３残基の修飾α−因子リーダー配列、
　Ｌｙｓ　Ａｒｇプロセッシング部位、プロインシュリ
ン配列およびα−因子ターミヱータを有する。この断片
を。

次に、　ｐＧＡ１１由来の５０４　ｂｐ断片に連結し、
　Ｂａｍ１ｌ　Ｉで切断し、そして１２０６ｂｐ断片を
分離した。

完全なＧＡＰＤＨプロモータ／α−因子リーダー配列／
プロインシュリン／α−因子ターミネータ発現カセット
を含有する１、２ｋｂ　Ｂａｍ１（ｒ断片を１次に、　
Ｂａｍ１ｌ　Ｉ切断およびホスファターゼ処理ρＢＲ３
２２（ＷＥｃｏＲＩ−５ａｌｌ　）　Ｂａｍ）！１中に
連結させてプラスミドｐＧＡＩ８を得、それをＥ、　　
ｃｏｌｉにクローニングした。

ｐＧＡＩ８由来の１．２　ｋｂの発現力セントをＢａｍ
１目切断によって除去し、そして、その断片をゲル分離
した。それを、ＢａｍＨＩ切断し、そしてホスファター
ゼ処理した酵母シャトルヘクターｐＡＢ２４中に連結し
た。発現カセットの挿入は、　ｐＢＲ３２２配列の唯一
のＢａｍＨ１部位にＧＡＰＤＨプロモータが、そのヘク
ターの唯一５ａｌ１部位に近くなるように１行なわれた
。

このプラスミドがｐＹＧＡＩ８であった。

Ｄ−パ臥亘 プラスミドｐＹＧＡＩ７は、先端を切断したα−因子リ
ーダー配列とヒト・プロインシュリンに対する合成遺伝
子とをコードするＤＮＡを有する。α−因子リーダー配
列が短縮されているので　それはα因子の１から３５ア
ミノ酸配列だけをコードし　それゆえ、第２３位のアス
パラギンのグリコシル化のための単一部位を含む。この
酵母発現ヘクターを。

以下のように構築した。

まず、　ｐＧＡ［１を旧ｎｄＩ１１で切断した。ＩＩｐ
ａＵ−旧ｎｄＩ［Ｉリンカ−を次の構造物に付加した。

： ５’−ＣＧＧＣＴＭＡＡＧＡ リンカ−を付加後、直線状にしたプラスミドを。

Ｂａｍ１ｉ　Ｉで切断し、そして５５８　ｂｐのＨｐａ
　　ＩＩ　−ＢａｍＨ１断片をゲル分離した。この断片
は、リジン−アルギニンのプロセッシング部位に直接に
結合したα−因子リーダー配列の３４〜３５残基をプロ
インシュリン配列のコドンとを含有する。α−因子のリ
ーダー配列の３５番目の残基のコドンと、プロインシュ
リン配列に直接隣接するプロセッシング部位との間には
、介在する配列はない。

次に、　ｐＧＡＩｌをＨｐａ　ＩＩとＢａｍＨＩとで切
断し、そして５０４　ｂｐ断片をゲル分離した。この断
片は　ＧＡＰＤＩ（プロモータとα−因子リーダー配列
の１から３３位のアミノ酸をコードするヌクレオチドを
含有し。

３゛末端は、上述のｓｓｓ　ｂｐのＨｐａ　ＩＩ　−Ｂ
ａｎ）Ｉ　Ｔ断片の５゛末端に相補的なＨｐａ　Ｕ部位
で終結する。これら２つの断片を、−緒に連結し５そし
てＢａｍＨｌで切［ｉＬ、　ＧＡＰＤＩＩプロモータ、
リジンーアルギニンフ。

ロセソシング部位に直接に結合する１〜３５残基を含有
する修飾されたα−因子リーダー配列をコードする配列
、プロインシュリン遺伝子、およびα因子ターミネータ
を有する発現力セントを得る。

次に　そのカセットを、　ｐＢＲ３２２（ＷＥｃｏＲｒ
−５ａｌｌ）ＢａｍＨＩのＢａｍ１＋１部位に連結し、
そしてＥ、ｃｏｌｉ中にクローニングし、プラスミドｐ
ＧＡＩ７を得た。

次に、　ｐＧＡＩ７をＢａｍ１ｌ　Ｉ切断し、そして、
　１０６２ｂｐの発現カセットをゲル分離した。その発
現カセットを、　ｐＡＢ２４のＢａｍ１ｌ　Ｉ部位に連
結し、プラスミドｐＹＧＡＩ７を得た。

Ｅ、ル校発現 プラスミドｐＹＧＡＩＩ　　Ｃ１／１．　　ｐＹＧＡＩ
３．　ｐＹＧＡｌｌ−八Ｂ２．１．　ｐＹＧＡ＋７およ
びｐＹＧＡＩ８を、顕胚江ごユ匹並ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ　　ＡＢ１０３．１株　（Ｍａｔａ、　　↓ｅｕ２−
３．　１１２．　　ｕｒａ３５２、　ｈｉｓ４−５８０
．　と閃−３［ｃｉｒｉ　）　　（Ｈｉｎｎｅｎら（１
９７８）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、ＵＳＡ　７５　：　１９２９−１９３３゜に本質的に
記述されている）中に形質転換した。

ｐＹＧＡｌｌ−ＣＬ／ＬおよびｐＹＧＡ１３の形質転換
体については　ロイシンの栄養要求性について選抜し、
他ノブラスミドの形質転換体については、ウラシルの栄
養要求性について選択した。

表１に示されるデータにおいては、天然のα−因子リー
ダー配列（ｐＹＧＡｌｌ−Ｃ１／１　）もしくは２３゜
５７および６７位のアスパラギンの位置を置換したグリ
タミンを持つα−因子リーダー配列（ｐＹＧＡＩ３）に
よって媒介されるプロインシュリンの分泌を比較してい
る。接種培養物（個々の形質転換体０．２ｍｌ１）を、
ロイシンを欠失した合成完全培地（ＳＤｌｅｕ　　；　
Ｓｈｅｒｍａｎ　　ら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅ
ａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓｐ、６２　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、
　１９８２）　）中で４８時間増殖し、そして同培地中
に２０倍に希釈した。培養物を、４８から７２時間増殖
させ、遠心分離により培養上清を調製し、そして１２５
１標識されたインシュリンによる競合放射性免疫検定に
より免疫性交差反応インシュリン様物質（ＩＬＭ　）に
ついての分析を行なった。表１に見られるように。

α−因子リーダー配列からの３つのグリコシル化部位を
除去した結果、天然のα−因子リーダー配列により媒介
されるものに比べ、インシュリン様物質は本質的に分泌
されなくなった。

表２中に表わされているデータでは、インシュノン様物
質の分泌能力について、　ｐＹＧＡｌｌ−ｐＡ２４　　
（完全長の天然のα−因子リーダー配列）　、　ｐＹＧ
ＡＩ８（グリコシル化部位を２３位のＡｓｎに１カ所の
み有する先端を切断したα−因子リーダー配列）の形質
転換体を比較する。各形質転換体をＳＤ−Ｌｅｕ中で３
０゛Ｃで０．４８時間増殖させた接種培養物０．２ｍｌ
を遠心分離によりベレット化し、洗浄し、そしてｕｒａ
−培地中に２０から５０倍に希釈した。この培地は、　
０．６７％の酵母窒素ヘース、１％コハク酸、　０．３
５％水酸化ナトリウム、０．５％カザミノ酸、２％グル
コース、　０．００５％アデニン、　０．０１％トリプ
トファン。

および０．０２％スレオニンを含有する。培養物を。

３０°Ｃで４８〜７２時間培養し、そして培養上清を調
製し上記のように分析した。表２に示されるデータによ
ると、２３位のアスパラギンに単一のグリコシル化部位
を保持する先端を切断したα−因子リーダー配列をもつ
構築物を有する形質転換体は、完全長の天然のα−因子
リーダー配列を持つ構築物を有する形質転換体が分泌す
るよりも通常、より多くの免疫反応性のインシュリン様
物質を分泌した。同じ単一のグリコシル化（Ａｓｎｚ：
＋　）を持゛つ完全長のα−因子リーダー配列を供有す
る構築物をもつ形質転換体は、完全長の天然のα−因子
リーダー配列もしくは先端を切断したα−因子リーダー
配列をもつ形質転換体が分泌するよりもはるかに少ない
量のインシュリン交差反応物質を分泌した。

（以下余白） 表１ α−因子リーダー配列 ＩＩＪ上 ｍｇ／ｍｌ　　　　　ｍｇ／ｍ１ ＡＢ１０３．１　［ｐＹＧＡ＋１−Ｃ１／ｌ］　−、５
，９，２４，０４５，９，２４，０４ ２，１，０８，０４ ＡＢ１０３．１　［ｐＹＧＡＩ３］　　　　−１検知さ
れない　　、００３検知されない　　、００７ ０Ｄ、５゜ ”２５１標識されたインシュリンおよびインシュリン積
重物質を用いて競合放射免疫測定法により測定された交
差反応性インシュリン様物質（ＩＬＭ）。

データは、培養物１　ｍｌあたりに分泌されたＩＩＪＩ
として記載されている。

そして、ある場合には、培養物１　ｍｌあたりに分泌さ
れたＩＬＭを、　　６５０ｎｍの波長での吸光度＝１と
したときの細胞密度に標章化した値として記載さている
。

乃缶例■ この実施例では、すべてのグリコシル化部位を保持する
完全長α−因子リーダー構築物の発現とＡｓｎｚ３に１
つだけグリコシル化部位を保持している先◇：；１を切
断したα−因子配列を用いた構築物の発現とを比較する
。この実施例で用いられている非酵母性タンパクは、ヒ
ト・プロインシュリン類似体であり、接続している″“
Ｃ°°ペプチドが酵母ＫＥＸ２エンドペプチダーゼ開裂
部位により置換されている。

Ａ・戸以吐り プラスミド−ｐＧＡｌｃ３は、　ｐＧＡｌｌ　のｌ１ｉ
ｎｄ　ｒＥ−５ａｌＩ断片２３１　ｂｐを１合成１１ｉ
ｎｄ［ＩＩ　　５ａｌｌｉｆｆ伝子断片（第３図に示す
）と置換することにより調製された。このｐＧＡｌｌの
１Ｉｉｎｄ［Ｉ　　５ａｌＩ断片は、Ｂ鎖の１４〜３０
アミノ酸、Ｃペプチド、Ａ鎖、および２つの翻訳停止コ
ドンをコードする。そして上記合成旧ｎｄＩＩ［Ｓａｌ
遺伝子断片は、　　Ｂｔｊ’（〕１４〜３０７　ミ／　
酸、　Ｌｙｓ−Ａｒｇ　ＫＥＸ２エンドペプチダーゼ開
裂部位、Ａ鎖、および翻訳停止コドンをコードする。プ
ラスミドｐＧＡ　ＩＣ３はｐＧＡｒｃ３から下記のよう
にして調製した。

プラスミドｐＧＡ　ＩＣ３をＢａｍＨ１分解し、　１１
０７ｂｐのＢａｍ）Ｉ　Ｉ発現カセット（ＧＡＰ叶プロ
モータ、プロインシュリン類似体に連結したα−因子リ
ーダーをコードする配列、α−因子転写終結因子を有す
る）を単離し、　ＢａｍＨＩ消化およびフォスファター
ゼ処理したｐＡＢ２４に連結させ２次に、虹延にクロー
ニングした。プラスミドｐＹＧＡＩｃ３は、　ＧＡＰＤ
Ｈプロモータかヘクターの唯一の５ａｌＩ部位に隣接す
るような向きに発現力セントがおくようにして得られた
。

Ｂ、躾扛ｄ蔓 プラスミドｐＹａＦｔ７Ｃ３は、上記ｐＹＧＡＩ７にお
ける先端を切断したα−因子リーダーをコードするＤＮ
Ａが、プロインシュリン類似体配列（上記ｐｙｃＡＩＣ
３で記ｆ２）に連結したものを有する。

このプラスミドは１次のようにして構築された。

まず、　ｐＧＡＩｃ３を旧ｎｄｌＩ［および５ａｌＩ分
解し、　１３２ｂｐ断片を単離した。この断片は、プロ
インシュリン類似体の最初の１２コドンを除いた全ての
コード配列を有する。それを旧ｎｄｎｌ−３ａｌｌ消化
したｐＧＡＩ７由来の４６４０ｂｐゲル単撮断片に連結
させ、プラスミドｐａｆ＋、７ｃ３を得る。Ｅ、　　ｃ
ｏｌｉクローニングした後、このプラスミド′をＢａｍ
１ｌｌで切断し、　１０６２ｂｐのＢａｍ１ｌＩ断片を
ゲル単離した。

（以下余白） この発現力セントは１通常のプロインシュリン配列の代
わりにプロインシュリン類似体をもったＰＧＡＩ７の先
端を切断し、α−因子リーダー構築物を含んでいる。次
に、この発現カセットを、上述のように、　ｐＡＢ２４
のＢａｍ１（ｒ部位に連結し、　ｐＹａｆｔ７ｃ３を得
た。

北欣光嬰 発現をＳ、　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２つの株でｐＹ
ＧＡ　ＩＣ３およびｐＹ’ａｆｔ７ｃ３について測定し
た。ＡＢ１０３．１株は実施例Ｉで記述している。ＡＢ
Ｉ１０−４株は１Ｅｕ遺伝子の中に欠失が導入されてい
る鎖匹匝皿粒並Ｌｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＢＩ１０株
の誘導体（Ｍａｔａ、　１ｅｕ２．　ｕｒａ３−５２、
　Ｐｇ３−３．　ｈｉｓ４−５８０　［ｃｉｒ　’　］
　）である。これらの株を、プラスミドｐＹＧＡＩｃ３
およびｐＹａｆｔ７ｃ３で上述のように、形質転換し、
　ｕｒａ原栄養株を選択した。接種培養物を５Ｄ−Ｌｅ
ｕ　［Ｓｈｅｒｍａｎ　ら、前述］で３０°Ｃにて２４
〜２８時間、増殖させ５次に１遠心によりペレット化し
、洗浄し、そしてｕｒａ−培地（上述）中に２０倍に希
釈し、３０°Ｃで４８〜７２時間で増殖させた。無細胞
状態の培養培地を、拮抗インシュリン放射免疫検定での
検定を目的として、遠心により調製した。

結果を表３に示した。表３かられかるように先端を切断
したα−因子構築物は天然のα−因子リーダー配列に比
べて、免疫反応し得るプロインシュリン類似体分泌の増
加を媒介する。

表３．先端を切断したα−因子リーダーまたは天然のα
−因子リーダーにより媒介されるプロインシュリン類似
体構築物からのｌＬ？Ｉの分泌［ｐｙＧＡＩＣ］］ ＡＢＬＯ３，１ ［ｐＹａｅし７Ｃコ］ ［ｐＹＧＡＩＣ３］ ［ｐＹａｆＬ７Ｃ３］ ６　　　１−２．７５　　　　Ｌ、６６　　　．６５　
　　、ＬＬ−，２０，１４，０４ ６１，５−６，６３４，４６２，１５，１４−，６０，
４０，１９ ３Ｌ、１５−１．４　１．２Ｂ　　　　、１３　　　、
ＬＯ−、Ｌ２　　　、ＬＬ、０１ ３２．１５−４．１２３．４６Ｌ、１４．１９−．３８
．３１．１０ １）最小限３つの独立した形質転換体を試験した。

２）分泌された交差反応インシュリン様物質（ＩＬＭ　
）を１ｚ５Ｉ−標識インシュリンおよびインシュリン標
準品を用いた競合放射免疫測定法により測定した。結果
を培養液１　ｍｌ当りのＩＬＭの１．および１蔵当りの
分泌された量を６５０　ｎｍ波長での吸光度−１とした
ときの細胞密度に標準化した値として示す。

尖詣炎ｌ この実施例には、活性なインシュリン様増殖因子−１の
発現レベルの増加を媒介する。先端を切断したα−因因
子発現ツクター構築を記述した。

まず、先端を切断したα−因子リーダー及びＩＧＦＩに
対するコート配列をコードするＤＮＡ配列を調製した。

合成配列を、製造者の指示に従って、　Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ａ　ＤＮＡ合成装置を用
いて標準方法により調製した。１４のＤＮＡ配列を２２
から５７塩基長の範囲で合成し、　Ｐ−ＡＧＨにより精
製し＾ＴＰの存在下でＴ４キナーゼにより個々にリン酸
化した。次にその配列をアニールさせ、標準方法により
連結した。

合成遺伝子の配列を第５図に示す。精製した合成遺伝子
断片をＮｃｏｌ／５ａｉｌ処理したｐＢ３１００にクロ
ーン化した（後述）。生じたプラスミドをｐＢｓ１００
Ｔａｆ＋　ＩＧＦＩと命名した。

プラスミドｐＢｓ１００は、　ｐＢＲ３２２誘導体であ
るｐＡＢ１２にクローン化された酵母発現カセットを含
む。この発現力セントはハイフ゛りントへＤｌ＋−２／
ＧＡＰＤＩＩプロモータ及び必須でない遺伝子の断片に
隣接しているＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　ＩＩターミネータを含む
。

ＡＤＩ＋−２／ＧＡＰＤＩ＋プロモータはｐＪＳ１０３
　（下記を参照）から単離された１２００ｂｐのＢａｍ
１ｌｌ−Ｎｃｏｌ断片であり。

そしてＧＡＰＤ）ＩターミネータはプラスミドｐＰＡＧ
１から単離した９ｏｏｂｐのＳａｌｌ−Ｂａｍｌｌｌ断
片である。ヨーロッパ特許出願第１６４　、５５６号。

プラスミドｐＢｓ１００もまた。目的とする遺伝子断片
により置き換えられた。　ＮｃｏｌおよびＳａｌｌ部位
間の必須ではない断片を含む。発現カセットは、　Ｂａ
ｍ１ｌｌで分解することにより、）［１５１００から除
去され得、酵母シャトルヘクターヘクローン化し、酵母
細胞へ導入され得る。

上で用いられたハイプリントＡＤＩ＋−２／ＧＡＰＤＩ
＋プロモータを含むプラスミドｐＪｓ１０３は次のよう
に構築された。そのプロモータのＡＤＩ＋−２部分はプ
ラスミドｐＡＤＲ２［Ｂｅ１ｅｒ　　ら、　　（１９８
２）　　Ｎａｔｕｒｅ　３００：１２４〜７２８］由来
の野生型Ａ　Ｄ　１１２遺伝子を含むプラスミドを制限
酵素ＥｃｏＲ５で切断することよって構築された。この
制限酵素は、　ＡＴＧ開始コドンに対して＋６６の位置
で切断を行い、そして、　ＭＤ１１２領域の外側であっ
てｐＡＤＲ２中の２つの他の部位での切断を行なう。得
られたベクター断片と２つの小断片との混合物は、　Ｂ
ａ１３１エキソヌクレアーゼと反応させ。

約３００　ｂｐが除去された。合成Ｘｈｏｌリンカ−は
Ｂａｌ　３１で処理されたＤＮＡに連結された。その結
果化じたＤＮＡ　リンカ−ベクター断片（約５ｋｂ）は
、カラムクロマトグラフィーによってリンカ−から分離
され制限酵素Ｘｈｏｌで切断され、再連結され、そして
大腸菌をアンピシリン耐性に形質転換するために用いら
れた。Ｘｈｏｌリンカ−の位置はＤＮＡの配列決定によ
り決定された。ＭＤＩ＋２遺伝子の５°非転写領域（Ａ
ＴＧから−２３２の位置）の範囲内にＸｈｏｌリンカを
含む１つのプラスミドは、制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで切断さ
れ　ヌクレアーゼＳｔで処理され７次に制限酵素！Ｅｃ
ｏ旧で処理され、　Ｘｂｏｌリンカ−の部位およびＥｃ
ｏＲＩ末端で１つの平滑末端を持つ直線状のベクター分
子が得られる。そのプロモータのＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　１部
分は。

プラスミドｐＰＧＡＰ　　［ヨーロンパ特許公開第１６
４，５５６号１を酵素Ｂａｍ！ＩＩおよびＥｃｏＲＩで
切断した後、０．４Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を単離する
ことによって構築された。それから、この精製された断
片は、酵素Ａｌｕ［で完全に分解され１約２００　ｂｐ
の断片が単離された。

このＧＡ１１叶プロモータ断片は、上記の直線ベクター
に存在するＭＤＩ＋−２断片に連結され、プラスミドｐ
Ｊｓ１０３が得られた。

次に、　ｌｌａｍｌｌ！断片は、　ｐＢｓｌｏｏ　Ｔａ
ｆｙＬＩＦＧＩから単２月１された。この断片は、　Ａ
Ｄ１１４／ＧＡＰ旧１プロモータ、先端を切断したα−
因子リーダー（アミノ酸１〜２５．８１〜８３）、リジ
ン−アルギニンプロセッシング部位、　ＩＧＦＩのコー
ド配列およびＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｉ＋ターミネータ配列を
含んでいる。このＢａｍ１ｌｌ断片は１次に、あらかじ
めＢａｍＨＩで分解されたｐＡＢ２４にクローン化され
た。陽性クローンが選択され、　ｐ’／ＬＵＩＧＦＩ５
５と命名された（これは最初、プラスミド１８．５と呼
ばれていた）（第６図参照）。

第２の発現ベクター、　ｐＹＬＵＩＧＦｌ−２４もまた
、類似の方法によって調製された。制限酵素地図を第７
図に示す。このベクターは、３つのグリコシル化部位を
持ち１分泌を指示する完全長のα−因子リーダー（実施
例ｍＡ、項と比較されたい）；およびα−因因子ターミ
ー−ター持っていることを除いてｐＹＬＵＩＧＦｌ−５
５と類似している。

酵母菌株ＡＢ１１０（ヨーロッパ特許公開第１６４，５
５６号）は、従来のスフェロプラスト化技術［ｌｌ１ｎ
ｎｅｎら（１９７８）　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　
　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　ヱ５：１９１
９〜１９３３　］を用い、　ｐＹＬＵＩＧＦｌ−５５お
よびｐＹＬＵＩＧＦｌ−２／１で形質転換され、そして
１発現が比較された。

ＡＢＩ１０（ｐＹＬＵＩＧＦｌ−５５）およびＡＢＩ１
０（ｐＹＬＵＩＧＦｌ−２４）の発現は非構成的である
。ＩＦＧＩ発現の誘導は１発育培地中に低濃度のグルコ
ースを持ちこむことによって達成される。標準条件下で
、振とうフラスコ培俣物（２５ｍｆ）は殖菌後１８〜２
４時間で培地中のグルコースを完全に利用する。このよ
うに、　ＡＢＩ１０（ｐＹＬＵ［ＧＦｌ−５５）および
ＡＢｌｌｏ（ｐＹＬ［ＩＩＧＦｌ−２４）の培養物（２
５ｍｌ）を、標準条件下で７２時間増殖した。植菌後４
９時間および７２時間で上澄み試料が採取されＩＧＦＩ
生物学的活性（ＲＲＡ）および抗ＩＧＦＩ抗体との免疫
反応性（ＲＩＡ）を分析した。表かられかるように。

先端を切断したα−因子リーダーを存するｐＹＬＵＩＧ
Ｆｌ−５５は、その実質上の主画分が生物学的に活性で
あるタンパクを分泌した。ｐＹ＋、ＵＩＧＦＩ−２４は
ＩＧＦＩ抗体との反応性を示すより多くのタンパクを分
泌したがこのタンパクのほとんどが生物学的に活性では
なかった。

その結果を表４に示す。その放射レセプタ測定法（ＲＲ
Ａ）により、　ＩＧＦ−１がその受容体に結合する能力
が測定される。ＩＧＦ−１がその受容体を通じてその活
性の全てに生じさせると考えられているので、上記測定
は９組み換え体ポリペプチドの生物学的活性の測定に相
当する。このレセプタ測定法は、　Ｍａｒｓｈａｌｌら
（１９７４）、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｒｉｎｏｌ、
Ｍｅｔａｂ。

１９：２８３−２９２に記載されている。放射免疫測定
法（ＲＩＡ）は、生物学的に活性であろうとなかろうと
天然のＩＧＦ−１と抗原的に交互反応するクンバクの量
を測定する競合的測定法である。その測定法はＺａｐｆ
ら、　　（１９８１）、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓ
ｔ、Ｇ８：１３２１−１２３０に記載されている。

表４．先端を切断したα−因子リーダーまたは天然のα
−因子リーダーによって媒介されるＩＧＦＩの分泌 八Ｂ１１０ （ｐＹＬＵＩＦＧｌ−２４） １．３ ２．７ １）　　ｍｇ／ｍ１ ２）　　ｍｑ／ｍｌ 注１１１質ｐｉＬ匝 次の発現ベクターは、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　　（ＡＴＣＣ）
＋　　１２３０１　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　　Ｄｒｉｖｅ
１７ｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　Ｌｌ、
Ｓ、八、に寄託され、ブダヘスト条約の規定るこより維
持されている。その寄託番刊および寄託口は１次のとお
りである。

Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　（ｐＹＧ入ｌ７）Ｅ、　ｃｏｌｉ
　　（ｐＹａｆｊ７Ｃ３）Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　＜ｐＹ
ＬＵＩＧＦＩ−５５）１２／２９／８７ １２／２９／８７ １２／２９／８７ これらの寄託物は当業者の便宜のために供給される。こ
れらの寄託は、その寄託物が本発明を実行するために要
求される承認ではなく、また、同等の実施態様が１本発
明の開示にもとづく見地から当該分野の技術の範囲外で
あるという承認、でもない。これらの寄託物が公に利用
できるということは、この特許または他の特許のもとに
おいでその寄託物を作り、使用し、売ることのためのラ
イセンスを認可することではない。その寄託物のヌクレ
オチド配列は参考のために本明細書に記載されており、
ここに記述されたどの配列とも一致しない場合には、一
致するようにコントロールされる。

本発明は説明のためにいくらか詳細に記述されてはいる
が、その改変および修飾は、添付の請求の範囲内で当業
者によって実施され得ることが明らかである。

（以下余白） （発明の要約） 本発明によれば、酵母α−因子発現系が提供される。該
発現系は、α−因子シグナルペプチドと１つのグリコシ
ル化部位とを含む先端を切断したリーダー配列を有する
。該リーダー配列は、プロセッシング部位により、非酵
母タンパクのコード配列に連結されている。

４、　゛　　の　　　なう■ 第１図は、　ｐＹＢＣＡ５の構築を示す流れ図、および
実施例Ｉで用いた合成プロインシュリン遺伝子のヌクレ
オチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。構築に
用いられる種々の合成オリゴヌクレオチドは黒点で示し
た。配列上の矢印は、　Ｂ、　ＣおよびＡプロインシュ
リン鎖の始めと終わりとを示す。枠で囲んだ部分は二塩
基性のプロセッシング部位を示す。

第２図は修飾されたα−因子リーダーと、実施例Ｉでｐ
ＹＧＡＩ３を構築するのに用いたプロインシュリン遺伝
子の最初の１３個のアミノ酸とをコードする合成オリゴ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を
示す図である。修飾されたα因子リーダーは、　Ａｓｎ
２３．５７．６７に対するコドンを、Ｇｉｎ（枠で囲ん
だもの）をコードするように変更することにより除去さ
れたグリコシル化部位を存する。矢印は、　ＫＥＸ２エ
ンドペプチターゼ部位をコードする配列と、ヒト・プロ
インシュリンのＮ末端との間の接合部分を示す。

第３図はプロインシュリン類似体をコードスル断片ｐＹ
ＧＡ　ＩＣ３の合成遺伝子を示す図である。ここで、　
ＫＥＸ２エンドペプチターゼ部位はＣペプチド（枠で囲
んだ部分）で置換されている。実施例■で述べる合成１
３３ｂｐ断片はヌクレオチド配列を通じて縦線および横
線で定義している。

第４図は酵母シャトルベクターｐＡＢ２４の制限酵素地
図である。

第５図は実施例■で述べるＩＧＦＩをコードする合成遺
伝子のＤＮＡ配列を示す図である。

第６図は先端を切断したα−因子リーダーの制御下にあ
るＩＧＦＩをコードする発現ベクターであって、実施例
■で述べる発現ベクターｐＹＬＩＩＩＧＦ１−５５の制
限酵素地図である。

第７図は３個のグリコシル化部位を有する全長α−因子
リーダーの制御下にあるＩＧＦＩをコートする発現ベク
ターであって、実施例■で述べる発現ベクターｐＹＬＵ
ＩＧＦ！−２４の制限酵素地図である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、非酵母タンパクの発現および分泌を与えるＤＮＡ構
   築物を含む酵母細胞であって、 該ＤＮＡ構築物が酵母認識、転写開始配列および終結配
   列の制御下にコード配列を有し、該コード配列がプロセ
   ッシング部位により連結されたリーダー配列および該非
   酵母タンパクから構成される前駆体ポリペプチドをコー
   ドしており、該プロセッシング部位が該前駆体ポリペプ
   チドからの該非酵母タンパクの切断を与え、 該リーダー配列が、該前駆体ポリペプチドにおける約２
   ５〜約５０個のＮ末端残基であり、かつ酵母α−因子前
   駆体のシグナルペプチドと単一のグリコシル化部位とを
   有する、酵母細胞。 ２、前記非酵母タンパクが哺乳動物タンパクである、特
   許請求の範囲第１項に記載の細胞。 ３、前記哺乳動物タンパクがヒト・インシュリンの前駆
   体である、特許請求の範囲第２項に記載の細胞。 ４、ヒト・インシュリンの前記前駆体がヒト・プロイン
   シュリンである、特許請求の範囲第３項に記載の細胞。 ５、ヒト・インシュリンの前記前駆体が、インビボで切
   断される酵母認識プロセッシング部位によって結合され
   たインシュリンａ鎖およびインシュリンｂ鎖を有する、
   特許請求の範囲第３項に記載の細胞。 ６、前記プロセッシング部位がサッカロマイセス（Ｓａ
   ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の￥ＫＥＸ２￥遺伝子産物に
   よって切断される、特許請求の範囲第５項に記載の細胞
   。 ７、前記哺乳動物タンパクがインシュリン様成長因子
   I である、特許請求の範囲第２項に記載の細胞。 ８、前記酵母細胞がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａ−
   ｒｏｍｙｃｅｓ）属に由来する、特許請求の範囲第１項
   に記載の細胞。 ９、前記酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ（￥
   Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）である、特許請求の範囲
   第８項に記載の細胞。 １０、前記酵母α−因子前駆体がサッカロマイセス・セ
   レビシエ（￥Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）ＭＦａ１で
   ある、特許請求の範囲第８項に記載の細胞。 １１、酵母宿主により分泌され得る前駆体ポリペプチド
   をコードしている領域を含む二本鎖ＤＮＡ分子であって
   、 該領域がその二本鎖のうちの一方に関して次の構造を有
   する、二本鎖ＤＮＡ分子： ５′−ＡＦ−ＣＨＯ−Ｘ＿ｎ−Ｓ−遺伝子＾＊−３′こ
   こで、ＡＦは酵母α−因子シグナルをコードし；ＣＨＯ
   はグリコシル化部位をコードし；Ｘ＿ｎはｎ個のアミノ
   酸からなるポリペプチドをコードしており、グリコシル
   化部位、またはインビボで酵母による該前駆体ポリペプ
   チドの切断を与えるプロセッシング部位を含まず；ｎは
   ０〜約３０までの整数であり；遺伝子＾＊は非酵母タン
   パクをコードしており；そしてＳは該前駆体ポリペプチ
   ドの切断を与えるプロセッシング部位をコードしている
   。 １２、前記ＡＦが約１９〜２３個のアミノ酸からなるポ
   リペプチドをコードしている、特許請求の範囲第１１項
   に記載のＤＮＡ分子。 １３、前記ｎが約０〜約２０の整数である、特許請求の
   範囲第１１項に記載のＤＮＡ分子。 １４、前記ｎが約０〜約１０の整数である、特許請求の
   範囲第１１項に記載のＤＮＡ分子。 １５、前記ｎが約３〜約１０の整数である、特許請求の
   範囲第１１項に記載のＤＮＡ分子。 １６、前記酵母宿主がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａ
   −ｒｏｍｙｃｅｓ）である、特許請求の範囲第１１項に
   記載のＤＮＡ分子。 １７、前記酵母α−因子シグナルペプチドがサッカロマ
   イセス・シグナルペプチドである、特許請求の範囲第１
   １項に記載のＤＮＡ分子。 １８、前記Ｓが前記酵母宿主によりインビボで認識され
   るプロセッシング部位をコードしている、特許請求の範
   囲第１１項に記載のＤＮＡ分子。 １９、前記ＳがＫＥＸ２エンドペプチダーゼにより認識
   されるジペプチドをコードしている、特許請求の範囲第
   １８項に記載のＤＮＡ分子。 ２０、前記ジペプチドが５′−リジン−アルギニン−３
   ′または５′−アルギニン−アルギニン−３′である、
   特許請求の範囲第１９項に記載のＤＮＡ分子。 ２１、レプリコンを有する、特許請求の範囲第１１項に
   記載のＤＮＡ分子。 ２２、前記前駆体ポリペプチドをコードしている前記領
   域が酵母認識転写開始配列および終結配列の制御下にあ
   り、そして前記レプリコンが酵母レプリコンである、特
   許請求の範囲第２１項に記載のＤＮＡ分子。 ２３、前記レプリコンがプラスミドである、特許請求の
   範囲第２２項に記載のＤＮＡ分子。 ２４、前記レプリコンが染色体である、特許請求の範囲
   第２２項に記載のＤＮＡ分子。