JPH025891A - ヒルディン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒルディンの誘導体およびその遺伝子工学的製造方法に
間しては、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第０．１７１．０
２４号明細書に開示されている。

現在、下記のようなアミノ酸配列のヒルディン誘導体が
多くの利点を有することが明らかになっている。

２、　請求項１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡ。

３、　請求項２に記載のＤＮＡ配列を含むベクＬｅｕ−
Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇ
、１ｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−
Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃ；ｌｕ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−
Ａｓｎ−Ｖａｌ　−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−
Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｉ　１　ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−５ｅｒ−Ａｇｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−
Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌｕ−
Ｃ１ｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−
５ｅｒ−Ｘｉ　ｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
−Ｃ；ｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＧｉｎＥＰ−Ａ第０．１
７１．０２４号明細書において用いられた番号をこの配
列でも用いた。ヒルディンとその誘導体は、生物活性が
異なっている。これはトロンビンに対する親和性の相違
および／または安定性の相違によると考えられる。本発
明によるヒルディン誘導体は、驚いたことに、特異的な
活性によって特徴づけられる。

また、本発明によるヒルディン誘導体は、酵母中でとく
に有利に発現されることも明らかにされた。比較実験よ
って、Ｎ−末端Ｔｈｒ−Ｔｙｒまたは１１ｅ−Ｔｙｒで
始まる類似ヒルディン誘導体は、低収量でしか発現され
ないことが示された。

酵母細胞による発現は、ヒルディン誘導体が分泌される
からだけでなく、とくに、それが実質的に量的に正しく
折り畳まれたかたちで高活性を有するので、有利である
。

第１図は、酵母ＭＦα前駆体タンパク質および本発明に
よるヒルディン誘導体をコードする遺伝子構造物を構築
するために有用なりローニングベクターを示す。第２図
は、この遺伝子構造物を含む酵母発現ベクターを示す。

本発明によるヒルディン誘導体は、もちろん、他の方法
、例えは、細菌または昆虫細胞あるいは動物細胞などの
高等真核細胞における発現などによっても製造される。

しかしながら、酵母系（ｓｙｓｔｅｍ）による発現、例
えばＥＰ−Ａ第０．２４８，２２７号明細書に列記され
た酵母種、例えばピチア・バストリス（Ｐｉｃｈｉａ　
ｐａｓｔｏｒｉｓ）　、ハンセヌラ・ポリモルフイス（
ｌｌａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓ）。

スキゾサッカロミセス・ボンへ （Ｓｃｌｌｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍ
ｂｅ）または好ましくはサツカロミセス・セレビシｘ　
（５ａｃｃｌ〕ａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）などを用いる発現は、好ましい。

酵母における発現のためのベクターは、例えばＥＰ−Ａ
明細書第０　、０６０　、０５７号、第０．００８，６
３２号、第０．１１６，２０１号、第０．１２１，８８
４号、第０　、、＋　２３　；５４４号および第０．１
９５，６９１号に記載のものなど、多数が知られている
。本発明によるヒルディン誘導体の製造法は、以下に酵
母α因子系を用いて記述されるが、これが単なる例示で
あることは、既知の方法によって池の発現系を用いるこ
とも可能であることから自明である。

酵母フェロモン（ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ）遺伝子ＭＦａは
、にｕｒｊａｎおよび１ｌｅｒｓｋｏｖｉｔｚ　（Ｃｅ
ｌｌ　Ｗ、９３３−９４３．１９８２）の記述で公知で
あるが、ここでは他の遺伝子の発現と遺伝子産生物の分
泌の可能性についても検討されている。この点に関して
は、Ｂｒａｋｅら（Ｐｒ、ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＬ、　４６４２−４６４６．１９８
４）の記述も参照されたい。

有利に用いられる酵母ベクターは、細菌プラスミドおよ
び酵母プラスミドの複製開始点と雨宿主系における選択
のための遺伝子とを有する、いわゆるシャトルベクター
である。さらに、このタイプのベクターは、外来性遺伝
子の発現に必要なプロモーター配列と、必要であれば収
量を上げるためのターミネータ−配列を含み、ここには
（適宜分泌シグナルに融合した）異種構造 （ｈｅｔｅｒｏ　ｌ　ｏｇｏｕｓ）の遺伝子がプロモー
ターとターミネータの間に位置している。

本発明は、以下の語例によって詳細に説明される通りで
ある。パーセント表示は、重重パーセントである。

例」−二発現ベクターの構築 まず、ＤＮＡ配列配列表１）をホスファイト法にて合成
する。このＤＮＡ配列は、ＭＦα前駆体タンパク質のア
ミノ酸４９〜８０をコードし、実質的には天然の（ｎａ
ｔｕｒａｌ）　Ｄ　Ｎ　Ａ配列に相当する。

ＤＮＡ配列配列表最初はα因子をコードする遺伝子の単
離のためのプローブとして用いられ、この目的のために
、３２　ｐで標識する。このプローブを用いて遺伝子を
ゲノムλｇｔｌｌ酵母遺伝子バンク［例えば、　Ｃ１ｏ
ｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ。

（４０５５Ｆａｂｉａｎ　Ｗａｙ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔ
ｏ、　ＣＡ９４３０３）から現在市販されているもの］
から単離する。この目的のために、α因子遺伝子を有す
るλｇｔｌｌファージをプラークハイブリダイゼーショ
ン実験において同定する。陽性と同定されたプラークか
らのファージを単離して増殖させて、ＤＮＡを得る。

後者をＥｃｏＲＩにて切断して０．８％アガロースゲル
上で分析する。サザントランスファー実験の後、膜を３
２　ｐ−標識ＤＮＡ配列■とハイブリダイズさせる。Ｄ
ＮＡ配列■とハイブリダイズする約１．７５ｋｂのフラ
グメントを有するファージＤＮＡを、再びＷ＃素で切断
して、対応するフラグメントを単離する。ベクターｐＵ
ｃ１９をＥｃｏＲＩて開裂して、Ｔ４リガーゼを用いて
１．７５ｋｂフラグメントと反応させる。クローニング
ベクターｌが得られる。

表２に列記したクローニングベクターは、全てｐＵＣプ
ラスミドを基礎に構築されたものである。

この表はこれらベクターのポリリンカー領域のみを通常
の５’−３’の方向で示したものである。ここで、ＭＦ
α配列を点線で、ヒルディン配列を破線で示した。実線
は、ｐＵＣおよびリンカ−配列を表す。第１図は、これ
らクローニングベクターを模式的に図示したものである
（比例尺で示したものではない）。

大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　７９１０２株をライゲーシ
ョン反応混合液にて形質転換させる。白色のコロニーを
単離して、プラスミドＤＮＡをこれらから得て、１．７
５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを含むプラスミドを同
定する。ＭＦαの前駆体タンパク質の天然のＤＮＡ配列
は、アミノ酸８〜１０をコードする領域にＰｓｔＩ切断
部位を、アミノ酸４Ｂ／４９をコードする領域にＴａｑ
　Ｉ切断部位を、各々含む。ＭＦα前駆体配列のアミノ
酸９〜４８をコードするフラグメントは、単離されたプ
ラスミドＤＮＡからＰｓｔｌおよびＴａｑ　Ｉの反応に
よってここで単離される。ベクターｐＵＣ１８をＰｓｔ
ｌおよびＫ　ｐ　ｎ　Ｉによって開裂させ、Ｔ４リガー
ゼを用いてＰｓｔＩ−ＴａｑＩフラグメントおよび合成
りＮＡ配配列上反応させる。大腸菌７９１０２をライゲ
ーション反応混合液で形質転換きせる。形質転換反応混
合物をＩＰＴＧ−Ｘｇａｌ−Ａｐプレートにブレーティ
ングする。白色コロニーを単離して、これらクローンの
プラスミドＤＮＡを制限酵素分析によって特徴づけする
。

このようにして、ＭＦα前駆体配列のアミノ酸８〜８０
をコードするクローニングベクター２を得る。

ＰｓｔＩおよびＫｐｎｌを用いる反応によってクローニ
ングベクター２から該コード配列を切り出゛して、下記
のライゲーション反応に導入する。

この目的のために、クローニングベクターｌをＥｃｏＲ
Ｉおよび部分的にＰｓｔｌと反応させて、ＭＦα前駆体
配列の最初の８個のアミノ酸をコードする配列からなる
フラグメントを単離する。さらに、ベクターｐＵＣ１９
をＥｃｏＲＩおよび１（ｐｎＩにて開裂させて、記述し
た二つのフラグメントと連結させて、クローニングベク
ター３を得る。後者は、アミノ酸８０までの完全なＭＦ
α前駆体配列物をコードする。

はとんどのヒルディン配列の出発材料は合成遺伝子てあ
り、これはＥＰ−Ａ第０．１７１．０２４号明細書にｒ
　Ｄ　Ｎ　Ａ−配列Ｉ」として開示され、本発明におい
てはＤＮＡ配列ｔＶとして表１に示されている。

この配列の制限酵素切断部位はアンダーラインで強調し
て示されている。Ａｃｃｌはアミノ酸１〜３の領域を切
断し、ＢａｍＨＩはアミノ酸３０／３１の領域を切断し
、５ａｃｌは最後の終止コードンの最初を切断する。Ｘ
ｂａ　Ｉの突出配列は遺伝子の５′末端に位置し、５ａ
ｌｌの突出配列は３′末端に位置している。この合成遺
伝子を二つの部分にサブクローニングさせた（ＥＰ−Ａ
第０．１７１，０２４号明細書の第１および第２図）。

これらサブクローニングベクターは２表のＮ０１４（Ｅ
　Ｐ−Ａ第０．１７１．０２４号明細書第２図に対応）
およびＮｏ、６　（ＥＰ−Ａ第０．１７１，０２４号明
細書第１図に対応）に示されている。

クローニングベクター４をＨｉ　ｎ　ｃ　ＩＩおよびＨ
ｉ　ｎ　ｄ　１１１で開裂させて、線状になったＤＮＡ
をＤＮＡ配列配列表１）に連結させる。このようにして
得たクローニングベクター５において平滑末端連結（ｂ
ｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ　ｌｉｇａｔｉｏｎ）をした部位
にＮｃｏ　Ｉ切断部位が形成される。

ヒルディンの部分配列をコードするフラグメントを、Ｂ
ａｍＨ［およびＡｃｃｌを用いる全消化によってクロー
ニングベクター６から切り出す。

次いで、このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎ
　Ｉて開裂しておいたクローニングベクター３とＤＮＡ
配列配列表１）とに連結させる。

ＤＮＡ配列■中の最後の三つのコードンをＤＮＡ配列配
列表１）と同様に番号を付す。この結果、ＭＦα前駆体
配列の最初の８０個のアミノ酸および本発明によるヒル
ディン誘導体の最初の３０個のアミノ酸をコーＩＳする
クローニングベクター７が形成される。これをＤＮＡ配
列分析によって確認する。

ヒルディンのアミノ酸３１〜６４をコードするフラグメ
ントをＢａｍＨＩおよびＨｉ　ｎ　ｄ　ｍによってクロ
ーニングベクター５から切り出す。このフラグメントを
同じ酵素で開裂させておいたクローニングベクター７に
連結させる。その結果、ＭＦα前駆体配列の最初の８０
個のアミノ酸および本発明によるヒルディン誘導体の完
全な配列をコードするクローニングベクター８が得られ
る。

このプラスミドの構造を制限酵素分析にて確認する。

プラスミドＹ　ｅ　ｐ　１３　（Ｂｒｏａｃｈら：　Ｇ
ｅｎｅ　ａ、１２１．１９７９）をＢａｍＨＩで開裂し
て、突出末端をクレノウボリメラーゼで埋填する。ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させて、牛アルカリホスファター
ゼで処理する。

ヒルディン誘導体およびＭＦα前駆体配列をコードする
フラグメントをＮｅｏ　ＩおよびＥｃｏＲＩでクローニ
ングベクター８（表２）から切り出して、突出末端を上
記のようにして埋填する。

二つの平滑末端ＤＮＡをともに連結させて、プラスミド
ｐａｆＨｉ　ｒ　１７およびｐａｆＨ１ｒ１８を構築す
る（第２図）。これら二つのプラスミドは、挿入フラグ
メントの位置方向が異なるのみである。

Ｅ　Ｐ−Ａ第０．１７１．０２４号明細書に記載されて
いるように、挿入配列の下流にターミネータ−を挿入す
ることが可能である（ＥＰ−Ａ第０．１７１，０２４号
明細書第４〜６図）。この目的には、Ｎｃｏｌおよび／
またはＢａｍＨＩ切断部位が適している。

プラスミドＤＮＡを大腸菌ＭＭ２９４中で増殖させた後
に、プラスミドｐαｆＨｉｒ１７にてロイシン要求性（
Ｉ　ｅｕｃ　ｉ　ｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）酵母Ｙ７
９株（α、ｔ　ｒ　ｐ　１−１．　　ｌ　ｅ　ｕ　２−
１　）　　（Ｃａｎｔｒｅｌｌら：　Ｐｒｏｃ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｎａｔ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　ａ２．６２５０
．１９８５）およびＤＭ６−６株＜ａ／ａ　ｌ　ｅｕ　
２−３．１１２：　：ｕｒａ３＋／１ｅｕ２：　　：　
１ｙｓ２＋ｔｒｐｌ　　／１ｒｐｌ　　　ｈｉｓ３−１
１．１５／ｈｉｓ３−１１．１５、ｕｒａ３　　／ｕｒ
ａ３−１ｙｓ２　　／１ｙｓ２　　　ａｒｇ４−１７／
ａｒｇ４＋　ａｄｅｌ　　／ａｄｅｌ＋）（ＭａｙａＨ
ａｎｎａ、　Ｄｅｐｔ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｍａ
ｓｓａｃ＋＋ｕｓｅｔｔｓＧｅｎｅｒａｌ　Ｈｏ５ｐｉ
ｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、　ＵＳＡ）をｌｔｏらのリチウ
ム法（ｌｔｏ、Ｈ，ら：　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
　Ｌ５．（、１６３，１９８３）によって形質転換させ
る。ロイシン無添加の選択培地上で増殖することができ
る単一コロニーを単離する。酵母ミニマル培地に各々の
コロニーを接種して、２８℃で２４時間培養する。細胞
を遠心分離して、上清液をトロンビン阻害分析してヒル
ディン活性を調べる。上清液がヒルディン活性を示した
酵母クローンからのプラスミドＤ　Ｎ　Ａを再び単離し
て、制限酵素分析にて特徴づけをする。形質転換させた
酵母株を次の発現試験に用いる。

例２：発現 １０ｍ１の酵母完全培地に例１で得られた株の選択培地
からの新鮮な一晩培養液から採取した細胞を接種して、
吸光度ＯＤ６θ、＝０．１になるようにする。培養液を
振とうしながら２８℃で８時間培養し、その後、９０ｍ
１の新鮮培地を加える。ざらに娠とうしながら２０時間
培養を続ける。細胞を遠心分離して、上清液中のヒルデ
ィン活性を測定する。

例３：積製 例２のようにして得られた上清液を、ｐＨ３〜５の酸性
にして、０．１Ｍｉ￥酸で平衡にしておいたスチレンお
よびジビニルベンゼンのコポリマーからなる有孔性吸着
樹脂（（ｌｌ’Ｄ　ＩＡ　ｌ０ＮＨＰ２０）を含む吸着
カラムにて処理する。トリス−ＭＣＩ　　（ｐＨ８，５
）および５０ｍＭ酢酸にて洗浄した後に、３０％強度の
イソプロパツールにて溶出を行う。ヒルディン誘導体を
含む両分を集めて、２０ｍＭピペラジン−ＨＣｌ　（ｐ
Ｈ６）で平衡にしておいたＱ−Ｓ　Ｅ　Ｐ　Ｈ−Ａ　Ｒ
ＯＳ　Ｅ　”カラムにて精製する。この場合の溶出は、
０〜０．２５ＭＮ　ａ　Ｃｌ　３度勾配にて行う。ヒル
ディン誘導体を含む両分を再び集めて、Ｃ１８逆相クロ
マトグラフィーカラム上のＨＰＬＣによって精製する。

このようにして得られる精製産物を、次いて自動タンパ
ク質配列分析機にかける。

例４：比較例 例１の同様の操作を行う。ただし、ＤＮＡ配列配列表１
）の代わりに次式の配列を用いる。その結果、酵母培養
液の上清液には微少のヒルディン活性しか検出されない
。

５′ １１１ａ　　　３１ （Ｐｒｏ）　　Ｌｅｕ−Ａｓｐ　　　Ｌｙｓ　　　Ａｒ
ｇＣＴ　　　ＴＴＣＧＡＴ　　　ＡＡＡ　　ＡＧＡＣＡ
Ｔ　　　ＧＧＡ　　　　ＡＡＣＣＴＡ　　　　ＴＴＴ　
　　ＴＣＴ（ＫｐｎＩ） Ｔｈｒ　　（Ｔｙｒ） ＡＣＧ　　Ｔ ＴＧＣＡＴＡ （Ａ（：Ｃ４） Ｈｂ （Ｐｒｏ）　　Ｌｅｕ　　　Ａｓｐ　　　Ｌｙｓ　　　
ＡｒｇＣＴ　　ＴＴＣＧＡＴ　　　ＡＡＡ　　　ＡＧＡ
ＣＡＴ　　ＧＧＡ　　　ＡＡＣＣＴＡ　　　ＴＴＴ　　
　ＴＣＴ（Ｋｐｎｌ） ＤＮＡ配列配列ｍ用いる場合には、クローニングベクタ
ー７および８（表２）に対応するベクターはＡｃｃＩ切
断部位を含まない。

表１：ＤＮＡ配列 Ｉ。

ＣＧＡＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＣＣＡ　
ＴＴＣＴＣＣＴＡ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＣＡＡ　ＡＡＣＧ
ＧＴ　ＡＡＧ　ＡＧＧ（ＴａｑＩ） ＡＡＣＡＧＴ　ＡＣＴ　ＡＡＴ　ＡＡＣＧＧＴ　ＴＴＡ
　ＴＴＧ　ＴＴＣＴＴＧ　ＴＣＡ　ＴＧＡ　ＴＴＡ　Ｔ
ＴＧ　ＣＣＡ　ＡＡＴ　ＡＡＣＡＡＧＡＴＴ　ＡＡＴ　
ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＡＴＴ　ＧＣＴ　ＡＧＣＡＴＴ　ＧＣ
ＴＴＡＡ　ＴＴＡ　ＴＧＡ　ＴＧＡ　ＴＡＡ　ＣＣ；Ａ
　ＴＣＧ　ＴＡＡ　ＣＧＡＧＣＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　Ｇ
ＡＡ　ＧＧＧ　ＧＴＡ　ＣＣＧＡ　Ｔ’ｒＴ　ＣＴＴ　
ＣＴＴ　ＣＣＣ（Ｋｐｎｌ） Ｉｌ、　　　Ｓ’ ＣＡＴＧＧＡ　　　　　　　　３’ ＧＴＡＣＣＴＴＣＧ八　　　　　５１ （ＨｌｎｄＺＩＩ） （Ｐｒｏ）　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　
　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　（Ｔｙｒ）ＩＩｌ、　Ｓ’　　　
　　ＣＴ　　ＴＴＧ　　ＧＡＴ　　ＡＡＡ　　ＡＧＡ　
　ＣＴＴ　　ＡＣＧ　　Ｔ　　　　３’３’　ＣＡＴ　
　ＧＧＡ　　ＡＡＣＣＴＡ　　ＴＴＴ　　ＴＣＴ　　Ｇ
ＡＡ　　ＴＧＣＡＴＡ　　　５’（ＫｐｎＩ）　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　（ＡｃｃＩ）ｔｎｏ
ｕ　　　　　Ｏ（：ｌＯｏｕｔｂ　　　　　Ｑ、＜Ｅ−
ＩＬ１′１為　（Ｅ−１ｕ’ｌｋ　　（Ｊリ　のｇｈ＜
ｕ＜ｈの−＜Ｅ−１ｃＰ山　００　の山　Ｈく　　φ　
Ｈく：ｌ０（ｌ−１細ｏυｏ　　　　　ｏ、ｏｕｏ　　
　　　ｃ：ｏｕｏゆ一一＜８　寸ＡぐＯＯ寸のトくＨぐ
−〇＜８ｍｌ＋３ｒ−ＩＬＩ（Ｊ　　ＱＥ４ｒ４＜ＨＸ
（ｒ４Ｌ）Ｃｕ　　ｔＯＬｌへＯＯ＞Ｆ４（：１−＋ｆ
−１＜　　　＞ＣＪ（ｊ　　　コ　８（ｒｐ＋、−＋　
　ＬＩＣＪ　　Ｆｌ、−Ｉ　　Ｌｌ（Ｊ　　ｃｑ−Ｃ）
ＣＪ　　Ｆ１ａ　８く０ロ　ＯＯ寸Ｑ　　Ｌ）（Ｊ　　
ＬＩ’ｌＬＩ　　Ｑυ　ψ−００Ｑ、Ｃ）Ｌ）　　　”
Ｊ＜Ｅ−４Ｑｌ（ＪＣ５ｋ　　ＯＯへψ　＜８　へ−＜
Ｅ−ｊ　　Ｎ（１＋　　＜）１　〜為　く８のく　０υ
　ψａ　　Ｃ）（Ｊ　　ｕ’＋＜　　じＣＪ　　ｌ！１
１ｈ　　Ｅ−＋（：ｎｎ コ　　Ｅ−１＜　　　　、−＜Ｅ−＋＜　　　　ｗＥ−
＋＜　　　　ＯＨ（ωＯＥ＠＜　　ω１１１　　Ｅ＠＜
　　（７１Φ　ＯＯ■−〇〇ＮＱ　　（ＪＬＩ　　Ｆｌ
＞　　ＯＣＪ　　ぐ（／ｌ　　）ｔ＜　　Ｌｌ’１ｌｌ
Ｌ＋　　ＣＪＣ）く 表２＝クローニングベクター Ｅ’−（１，７５ｋｂ　ａ−ＦｒａｇＩＴ＋ｅｎｔ）・
＝Ｅ−Ｋ・・・（α−８０−４９）・・・Ｔ・・・（α
−４８−８）・・・Ｐ−Ｂ−Ｋ・・・（ｗ−８０−４９
）・・４・・（ａ−４８−８）”・Ｐ−−Ｅ−Ｂ−−−
（Ｈ１ｒ３１−６４）−９−Ｈｃ−Ｈｄ−Ｂ−−−（Ｈ
ｉｒ３１−６４）−５−Ｎ−Ｈｄ−Ｂ−−−（Ｈ１ｒ３
０−３）−−−Ａ−−−Ｘ−Ａ−Ｈｄ−Ｂ−−−（Ｈｉ
ｒ３０−３　）−−−Ａ−−−Ｋ・・・（ａ−８０−８
）　＝　Ｐ−Ｅ−Ｈｄ−Ｎ−９−−−（Ｈ１ｒ６４−３
）−−−Ａ−−−に−（α−８０−８）・−４’−Ｅ−

【図面の簡単な説明】

第１′向は、酵母ＭＦα前駆体タンパク質および本発明
によるヒルディン誘導体をコードする遺伝子構造物を構
築するために有用なりローニングベクターを示す、説明
図である。 第２図はこの遺伝子構造物を含む酵母発現ベクターを示
す、説明図である。 、、、ＭＦα配列 一一−ヒルディン配列 制限酵素略号 Ａ　　＝　　ＡｃｃＩ Ｂ＝　　ＢａｒｎＨｌ １：　　＝　　　ＥｃｏＲｌ １（（＝　　）ＩｉｎｃＩｒ Ｈｄ　　＝　　ＨｌｎｄＩＩＩ Ｋ　　＝　　ＫｐｎＩ Ｎ　　＝　　　Ｎｃｏｌ Ｐ　　　＝　　　ＰｓｔＩ Ｓ　　＝　　Ｓａｌ工 Ｔ　　＝　　Ｔａｑｌ Ｘ　　＝　　Ｘｂａｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記のアミノ酸配列を有するヒルディン誘導体。 【遺伝子配列があります】 ２、請求項１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ。 ３、請求項２に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。 ４、請求項２に記載のＤＮＡを宿主細胞において発現さ
   せることからなる、請求項１に記載のポリペプチドの製
   造法。 ５、宿主細胞が酵母細胞である、請求項４に記載の製造
   法。 ６、請求項に記載のポリペプチドを含んでなる医薬物。