JPH0459795A

JPH0459795A - カルシトニン様活性を有するポリペプチド誘導体及びその用途

Info

Publication number: JPH0459795A
Application number: JP2165738A
Authority: JP
Inventors: Masatsune Kurono; 昌庸黒野; Takahiko Mitani; 隆彦三谷; Haruo Takahashi; 治雄高橋; Kiichi Sawai; 喜一澤井
Original assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Current assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Priority date: 1990-06-26
Filing date: 1990-06-26
Publication date: 1992-02-26
Also published as: EP0464549A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、カルシトニン様活性を有する新規なポリペプ
チド誘導体（カルシトニンアナログ）及びその用途に係
り、又その製造用原料をも対象とする。

本発明による生理活性型カルシトニンアナログは医薬品
成分として、殊にカルシウム代謝系疾患の治療に、例え
ば高カルシウム血症の治療、骨粗髭症における疼痛の軽
減や骨量減少の抑制、骨ベージェット病の治療等に用い
ることができる。

（従来の技術）カルシトニンは、１９６１年、Ｄ、　Ｈ，Ｃｏｐｐ等が
、ヒトの頚部静脈血中に、血中カルシウム濃度を低下さ
せる作用を有する物質の存在することを指摘すると共に
、当該物質に対して命名したものである。

一方、１９６３年にＰ、　Ｆ、　１ｌｌｒｓｃｈ等は同
様な活性を有する物質がラットの甲状腺中にも存在する
ことを見い出した。その後、１９Ｅｉ８年に至り、Ｊ、
Ｔ。

Ｐｏｔｔｓ等がブタに関するカルシトニンの構造を決定
シて以来、ヒト、ウシ、ヒツジ、ラット、サケ、ウナギ
、ニワトリの８種類の動物から、１０種類のカルシトニ
ン様活性を有する物質が抽出精製され、アミノ酸構造が
決定されるに至っている。

カルシトニンの構造的な特徴としては、３２個のアミノ
酸から構成され、Ｎ末端のシスティンと７番目のシステ
ィンとがジスルフィド結合により環状となっており、Ｃ
末端がアミド型となっている点にある。カルシトニンの
生理活性作用としては、血中カルシウム濃度の低下、骨
形成の促進、尿中への燐酸排泄の促進、胃酸分泌抑制等
が知られているが、これらの作用の内で最も重要なもの
はカルシウム代謝調節作用である。構造的な特徴の内で
、Ｃ末端のアミド構造は、活性発現に不可欠のものであ
り、この部分が加水分解を受けるとカルシトニンは、ホ
ルモン作用を失ってしまう。

−船釣に、従来の技術により大腸菌を用いポリペプチド
を産生させてＣ末端がアミド型のポリペプチドを得るた
めには、発現したポリペプチドを分離精製する場合にＣ
末端アミド化酵素を用いる等の特殊な技術を必要として
いた。しかしながら、この種の酵素は高価であるのみな
らず目的物質の収率が低下し、従って、このような酵素
処理を要件とする従来技術方法は工業的な生産に適して
いるものとは云えなかった。

尚、カルシトニンとは直接的な関係を有しないが、本発
明者等は腸の螺動運動を促進するモチリン様生理活性物
質（モチリンアナログ）に関して、Ｃ末端がホモセリン
型のものであっても本来のものと同等程度又はそれ以上
の活性を有していることを見い出し、このようなモチリ
ンアナログを廉価に且つ大量に生産する方法を提案した
（特願昭８４−２８Ｇ）。

（発明が解決しようとする課題及び発明の目的）従来技
術によれば、カルシトニンを得るには合成法又は生物試
料からの抽出に頼らざるを得ず、前ｔはカルシトニンが
３２個のアミノ酸から構成されているために操作的に面
倒であり且つ合成や精製に時間を要するために、又後者
は原料面からの制約があり且つ精製操作が面倒であるた
めに、何れにせよ、カルシトニンを廉価に且つ大量に提
供することは極めて困難とされてきた。

尚、バイオテクノロジーを利用する技術も、既述のよう
にＣ末端のアミド化に特殊な技術が要求され、従って有
利な調製法とは云えなかった。

本発明は従来技術における上記のような課題を解決する
ためになされたものであり、ブロムシアンを用いる切断
によってＣ末端にホモセリン　（ホモセリンラクトンを
も含む）を有し且つカルシトニン様構造を有するポリペ
プチドを先ず調製しく生理活性型カルシトニン様ポリペ
プチド調製用原料の合成）、これに簡単な化学反応を施
すことにより、カルシトニンと同等又はそれ以上の活性
を有するポリペプチド誘導体を提供することを主たる目
的とするものである。

本発明の附随的な、但し重要な目的は効率的に且つ廉価
に提供できるカルシトニン様ポリペプチド誘導体を有効
成分とするカルシウム代謝系疾患治療剤を提供すること
にある。

本発明による他の目的は、生理活性型カルシトニン様ポ
リペプチド誘導体の調製用原料として有用なポリペプチ
ド誘導体を提供することである。

（課題を解決し、目的を達成する手段及び作用）本発明
者等は鋭意検討を重ねた結果、醗酵法又は合成法により
得られ且つカルシトニン様の構造を有するポリペプチド
に関して、ブロムシアンにより切断した後に、得られる
ポリペプチドはＣ末端がホモセリン（ホモセリンラクト
ンをも含む）になっているが、このラクトン型のものに
は比較的容易にアミドや脂肪族アミン等を通常の合成法
により結合せしめ得ることを見い出し且つこのようにし
て得たポリペプチド誘導体が、Ｃ末端にアミド構造を有
する本来のカルシトニンと同等又はそれ以上の活性を有
することを見い出し、これによって本発明を完成するに
至った。

即ち、本発明によれば、既述の従来技術における課題は
、一般式（１）％式％（式中Ａ１　はＳｅｒ、　Ｇｌｙ又はＡｌａであり、Ａ
２はＶａｔ又はＭｅｔであり、Ａ３はＴｈｒ又はＬｙｓ
であり、Ａ４はＴｙｒ又はＬｅｕであり、Ａ６はＴｈｒ
又はＳｅｒであり、Ａ６はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ａ
７はＰｈｅ又はＬｅｕであり、Ａ８はＡｓｎ又は旧Ｓで
あり、ＡｓはＴｙｒ、　Ｐｈｅ又はＬｅｕであり、Ａｌ
ｌはＨｌｓ又はＧｉｎであり、ＡｌｌはＴｙｒ又はＰｈ
ｅであり、Ａ１２はＧｌｎ又はＡｒｇであり、Ａ、３は
Ａ、ｌａ、　５ｅｒ１Ａｓｎ又はＡｓｐであり、Ａ１４
はＩｌｅ、　Ｔｈｒ又はＶａｌであり、Ａｔ６はＶａｌ
ｌＳｅｒ又はＡｌａであり、ＡｎはＡｌａＸＴｈｒ又は
Ｖａｌであり、Ｙはホモセリンのアミド化されているも
の、ホモセリンラクトンに炭素数が２０個以下の第一級
脂肪族アミンを反応させたもの、又はＣ末端にホモセリ
ンのアミド化されているものを含む任意のポリペプチド
を意味する）にて示され且つカルシトニン様活性を有するポリペプチ
ド誘導体により解決されると共に、上記の主たる目的が
達成される。

本発明の、上記の附随的な目的は、このポリペプチド誘
導体を有効成分とするカルシウム代謝系疾患治療剤によ
り達成される。

上記の式（１）にて示される生理活性型カルシトニン様
ポリペプチド誘導体調製用の本発明によるポリペプチド
誘導体は式（１′）Ｂ−Ｃｙｓ−Ａｔ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−
Ｃｙｓ−Ａ２−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａ３　−　　Ａ４−　
　Ａ６−Ｇｌｎ−Ａａ−Ａｔ−Ａｓ−Ｌｙｓ−Ａｓ−Ａ
ｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌｌ−Ｐｒｏ−Ａｔ　２−Ｔｈｒ−Ａ
、　３−ＡＩＪ−Ｇｌｙ−Ａｔ−ｓ−Ｃ；＋ｙ−ｉ１６
−ｐｒｏ−Ｙ［式中Ａ１　はＳｅｒ、　Ｇｌｙ又はＡｌａであり、Ａ
２はＶａｌ又はＭｅｔであり、Ａ３はＴｈｒ又はＬｙｓ
であり、１４はＴｙｒ又はＬｅｕであり、Ａ６はＴｈｒ
又はＳｅｒであり、Ａ６はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ａ
ｔはＰｈｅ又はＬｅｕであり、Ａ・はＡｓｎ又はａｔＳ
であり、ＡｌはＴｙｒＸＰｈｅ又はＬｅｕであり、Ａｌ
９はＨｌｓ又はＧｉｎであり、ＡｌｌはＴｙｒ又はＰｈ
ｅであり、Ａｔ２はＧｌｎ又はＡｒｇであり、Ａ１３は
Ａｌａ、　５ｅｒ１Ａｓｎ又はＡｓｐであり、Ａ１４は
Ｉｌｅ、　Ｔｈｒ又はＶａｌであり、Ａ１６はＶａ　ｌ
、　Ｓｅｒ又はＡｌａであり、Ａ１６はＡｌａｌＴｈｒ
又はＶａｌであり、Ｙはホモセリン（ホモセリンラクト
ンをも含み、ｌ１ｓｅで示される）を意味する］にて示される。

（実施例等）次に、製造例及び薬理活性試験例に関して本発明を更に
詳細に且つ具体的に説明する。尚、以下においてはサケ
カルシトニン様ポリペプチド誘導体に関連して説明する
が、醗酵法を用いた場合、一般式（１）中のＡ２をＶａ
ｌにすることにより同様にして、他のカルシトニン様ポ
リペプチド誘導体を調製し得ることに留意され度い。

聚１璽（１）カルシトニンアナログの合成ペプチドの合成はアプライドバイオシステムズ社のペプ
チドシンセサイザー４３０人にて行った。

先ず、以下に示すアミノ酸配列を有するペプチドを合成
した。

Ｈ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−丁ｈｒ
−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−
Ｓｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　１ｕ−Ｌｅｕ−旧ｓ−Ｌｙｓ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｎ−、Ｔｈｒ−Ｇ　１ｙ−５ｅｒ−Ｇ　ｌｙ
−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａ　１ａ−５ｅｒ合成した
ポリペプチドサンプルをウォーターズ社製のマイクロボ
ンダスフェアのＣ−１８カラム（１９ｍｍ　ｘ　１５ｃ
ｍ）を用いＨＰＬＣにて精製した。

サンプル１０ｍｇを秤取した後、７０％蟻酸溶液３０ｍ
１に溶解させ、ブロムシアン５０ｍｇを添加シ、３７℃
で２４時間反応させた。その後、蒸溜水２００ｍ１を添
加し凍結乾燥することにより蟻酸及びブロムシアンを除
去した。次いで、再度ウォーターズ社製のマイクロボン
ダスフェアのＣ−１８カラム（１９ｍｍ　ｘ　１５ｃｍ
）を用いＨＰＬＣにて以下の条件下で精製した。

溶出液＝０．１％トリフルオロ酢酸中２０％から７０χ
のアセトニトリルの直線勾配、３０　分間。

流速　：　７．Ｏｍｌ／ｍｌｎ。

）ＩＰＬｃによるメインビーク部分を回収して凍結乾燥
する。以上の過程を経ると、ポリペプチドサンプルのＣ
末端は、ホモセリンまたはホモセリンラクトンとなる。

更に、酸処理（例えば、０．ＩＮ　ＨＣＩ中３０℃、３
時間）を施し凍結乾燥することにより、Ｃ末端の１０％
以上をラクトン型に変換することができる。

このようにして形成されたラクトン型のものをＨＰＬＣ
で分取し、凍結乾燥粉末をジメチルホルムアミド中に１
０％のアンモニアを含む溶液で室温下に２４時間処理す
ることによりＣ末端がホモセリンアミド型のカルシトニ
ンアナログを調製することができる。このカルシトニン
アナログの一部を採取してアプライドバイオシステムズ
社のベプチドシークエンサーにより調べたところ、サン
プルはメチオニン　（Ｎｅｔ）の位置で正しく切断され
ており、Ｃ末端のアミド化されていることが確認された
。

尚、ホモセリンラクトン型のカルシトニンにＣＨｓ（Ｃ
Ｈ２）ｓＮＨ２、ＣＨｓ（ＣＨ２）＋ｄ［ｈ等の第一級
脂肪族アミンをジメチルスルホキシド中で反応させると
Ｃ末端に脂肪族アミンが付加したものを容易に得ること
ができる。

虫１１■ｕ【１璽試験液を１％酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４，０，０，１
％ウシ血清アルブミン含有）にて適当に希釈した後、雄
ラット　（体重的　１００ｇ）　１匹当り　０．１ｍｌ
を尾静脈に注射し、１時間後に心臓より採血し、血清中
のカルシウム濃度を分光学的方法（和光カルシウム測定
用キット）にて測定する。この方法を利用して、血清中
のカルシウム濃度を１０％低下させるのに必要とされる
カルシトニンアナログの量を調べた。この薬物量［１０
％ＭＲＣＵ　（ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏ
ｕｎｃｉｌ　Ｕｎｉｔ）と定義するコは下記の通りであ
った。

Ａ）一般式（１）において、Ａｔ　：　Ｇｌｙ。

Ａ２＝Ｍａ１．　Ａａ　：Ｔｈｒ、　Ａ、：Ｔｙｒ、　
Ａｓ　：Ｔｈｒ。

Ａ６　：　ＡＳＩ）、　ＡＴ　：　Ｐｈｅ、　Ａ＠　＝
　Ａｓｎ＋　Ａｓ　：　Ｐｈｅ。

ａ＋ｇ　　　”　　　　旧Ｓ、　　Ａｌ　＋　　　”　
　Ｐｈｅ、　　　Ａｌ２　　　：　　Ｇｉｎ、　　　Ａ
ｓ３　　：　　Ａｌａ。

Ａ４４　”　Ｉｌｅ、　Ａｓｓ　”　Ｖａｌ、　Ａ４ｓ
　”　Ａｌａのもの（”ｈ−Ｃａ群”と命名）であって
、この群の内でａ）　Ｙ　＝　ｕｓｅ−ＮＨ２のもの：
１００　ＭＲＣＵ／ｍｇｉｂ）　Ｙ　＝　ｕｓｅ−ＮＨ（ＣＨ２）ｅｃＨ３のもの
：１１０　ＭＲＣＵ／ｍｇ；ｃ）　Ｙ　＝　Ｈｓｅ−Ｎｉｌ（ＣＨ２）＋５ＣＨａの
もの：９０　ＭＲＣＵ／ｍｇであった。

崎ｒＢ）一般式（１）において、Ａ、　＝　Ｓｅｒ。

Ａ２　＝　　Ｖａｌ、Ａａ　　＝　　Ｌｙｓ、Ａａ　　
＝　　Ｌｅｕ＋　　Ａｓ　　：　　Ｓｅｒ＋ＡＳ　：　
Ｇｌｕ、　Ａｖ　：　Ｌｅｕ、　Ａｓ　”旧Ｓ＋　Ａｓ
　”　Ｌｅｕ。

Ａｕｇ　　＝　Ｇｌｎ、Ａ＋＋　　”　Ｔｙｒ、Ａｌａ
　”　Ａｒｇ＋　　Ａｓｓ　　：　Ａｓｎ。

ＡＩＪ　：　Ｔｈｒ、　Ａｇｅ　”　Ｓｅｒ、　Ａｔｅ
、　”　Ｔｈｒのもの（”５−Ｃａ群”と命名）であっ
て、この群の内でｄ）　Ｙ　＝　ｕｓｅ−ＮＨ２のもの
：３０００　　ＭＲＣＵ／ｍｇ；ｅ）　Ｙ　＝　ｕｓｅ−ＮＨ（ＣＨ２）ｓＣＨｓのもの
：２９００　　ＭＲＣＵ／ｍｇｉｆ）　Ｙ　：　Ｈｓｅ−Ｎ）ｌ（ＣＨ２）＋＊ＣＨｓの
もの：２８００　ＭＲＣＵ／ｍｇであった。

Ｃ）一般式（１）において、Ａ、　＝　Ｓｅｒ。

Ａ、＝　　Ｖａｌ、Ａ、＝　　Ｌｙｓ、Ａｄ　　＝　　
Ｌｅｕ、Ａｓ　　：　　Ｓｅｒ＋Ａｓ　＝　ＡＳＩ）、
　Ａ？　＝　Ｌｅｕ、　Ａｓ　：　Ｈｌｓ、　Ａｓ　：
　Ｌｅｕ。

Ａｇｅ　　：　Ｇｌｎ＋　　Ａ＋＋　　：　　Ｐｈｅ、
Ａｌａ　　：　　Ａｒｇ、Ａｓｓ　　：　　Ａｓｐ＋Ａ
ＩＪ　：　Ｖａｌ、ム１６　：　Ａｌａ、　Ａｇｅ　：
　Ｖａｌのもの（”ｅ−Ｃａ群”と命名）であって、こ
の群の内でｇ）　Ｙ　＝　ｕｓｅ−Ｎ）１２のもの：Ｇ
ＯＯＯＭＲＣＵ／ｍｇ；ｈ）　Ｙ　＝　ｕｓｅ−ＮＨ（ＣＨ２）ｓｃＩ’ｌａの
もの：８２００　　ＭＲＣ■／ｍｇ；ｉ）　Ｙ　：　Ｕｓｅ−Ｎｉｌ（ＣＨ２）＋　ｓＣＨｓ
のもの：５９００　ＭＲＣＵ／ｍｇであった。

製１１本発明によるカルシトニン様ポリペプチド誘導体（製造
例によるポリペプチドＡ−ａ）を１ｍｇ宛含有するよう
にバイアルに無菌的に分配し、凍結乾燥にて水分を除去
し、バイアルを密封することにより注射目的用の粉末製
剤を得た。この粉末製剤は用時には生理食塩水に溶解せ
しめられる。

尚、本発明物質の安定化剤としてはヒト血清アルブミン
等を用いることができる。

（発明の効果）本発明によるポリペプチド誘導体は、カルシトニンと同
程度又はそれ以上の生理活性を示す。

本発明によるポリペプチド誘導体の内でＣ末端側にホモ
セリンアミドを有しているものは、本発明者等が開発し
た方法（特願平１−２１８０３４）を応用して大腸菌に
より発現させたカルシトニンを含む蛋白質をブロムシア
ンにより切断した後、アンモニア又は第一級脂肪族アミ
ンを作用させることにより調製することができる。従っ
て本発明による上記のポリペプチド誘導体の調製に際し
ては従来必須とされてきた酵素処理工程を省略すること
ができるので、製造コストの大幅低減がもたらされる。

特許出願人　株式会社三和化学研究所

Claims

【特許請求の範囲】

（１）式（１）【遺伝子配列があります】（式中Ａ＿１はＳｅｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａであり、Ａ＿
２はＶａｌ又はＭｅｔであり、Ａ＿３はＴｈｒ又はＬｙ
ｓであり、Ａ＿４はＴｙｒ又はＬｅｕであり、Ａ＿５は
Ｔｈｒ又はＳｅｒであり、Ａ＿６はＡｓｐ又はＧｌｕで
あり、Ａ＿７はＰｈｅ又はＬｅｕであり、Ａ＿８はＡｓ
ｎ又はＨｉｓであり、Ａ＿９はＴｙｒ、Ｐｈｅ又はＬｅ
ｕであり、Ａ＿１＿０はＨｉｓ又はＧｌｎであり、Ａ＿
１＿１はＴｙｒ又はＰｈｅであり、Ａ＿１＿２はＧｌｎ
又はＡｒｇであり、Ａ＿１＿３はＡｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓ
ｎ又はＡｓｐであり、Ａ＿１＿４はＩｌｅ、Ｔｈｒ又は
Ｖａｌであり、Ａ＿１＿５はＶａｌ、Ｓｅｒ又はＡｌａ
であり、Ａ＿１＿６はＡｌａ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり
、Ｙはホモセリンのアミド化されているもの、ホモセリ
ンラクトンに炭素数が２０個以下の第一級脂肪族アミン
を反応させたもの、又はＣ末端にホモセリンのアミド化
されているものを含む任意のポリペプチドを意味する）
にて示され且つカルシトニン様活性を有するポリペプチ
ド誘導体。
（２）請求項１に記載のポリペプチド誘導体を有効成分
としていることを特徴とする、カルシウム代謝系疾患治
療剤。
（３）式（１′）【遺伝子配列があります】［式中Ａ＿１はＳｅｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａであり、Ａ＿
２はＶａｌ又はＭｅｔであり、Ａ＿３はＴｈｒ又はＬｙ
ｓであり、Ａ＿４はＴｙｒ又はＬｅｕであり、Ａ＿５は
Ｔｈｒ又はＳｅｒであり、Ａ＿６はＡｓｐ又はＧｌｕで
あり、Ａ＿７はＰｈｅ又はＬｅｕであり、Ａ＿８はＡｓ
ｎ又はＨｉｓであり、Ａ＿９はＴｙｒ、Ｐｈｅ又はＬｅ
ｕであり、Ａ＿１＿０はＨｉｓ又はＧｌｎであり、Ａ＿
１＿１はＴｙｒ又はＰｈｅであり、Ａ＿１＿２はＧｌｎ
又はＡｒｇであり、Ａ＿１＿３はＡｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓ
ｎ又はＡｓｐであり、Ａ＿１＿４はＩｌｅ、Ｔｈｒ又は
Ｖａｌであり、Ａ＿１＿５はＶａｌ、Ｓｅｒ又はＡｌａ
であり、Ａ＿１＿６はＡｌａ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり
、Ｙはホモセリン（ホモセリンラクトンをも含み、Ｈｓ
ｅで示される）を意味する］にて示されるポリペプチド誘導体。