JPH0459799A - 高純度ネコインターフェロンの製造法 - Google Patents
高純度ネコインターフェロンの製造法Info
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- JPH0459799A JPH0459799A JP2173298A JP17329890A JPH0459799A JP H0459799 A JPH0459799 A JP H0459799A JP 2173298 A JP2173298 A JP 2173298A JP 17329890 A JP17329890 A JP 17329890A JP H0459799 A JPH0459799 A JP H0459799A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野コ
本発明は、蛋白質の一次構造がネコの遺伝情報由来であ
るインターフェロンを遺伝子組換え核多角体病ウィルス
を利用して量産し、以って医薬品（抗ウィルス剤）とす
ることを目的とした、組換えカイコ核多角体ウィルスお
よびカイコ幼虫を利用して生産したネコインターフェロ
ン（以下、ＦｅＩＦＮと略す）を高純度で製造する方法
に関する。
るインターフェロンを遺伝子組換え核多角体病ウィルス
を利用して量産し、以って医薬品（抗ウィルス剤）とす
ることを目的とした、組換えカイコ核多角体ウィルスお
よびカイコ幼虫を利用して生産したネコインターフェロ
ン（以下、ＦｅＩＦＮと略す）を高純度で製造する方法
に関する。
［従来の技術］
インターフェロンは、抗ウィルス作用を示す蛋白質を主
成分とする生理活性物質でＩＦＮと略記される。
成分とする生理活性物質でＩＦＮと略記される。
遺伝子操作技術の進歩によりヒトのＩＦＮのみならず、
ウシ、ウマ、イヌなどの動物のＩＦＮも大量生産が可能
となり、その結果、ウィルス病や腫瘍などの治療薬とし
てのＩＦＮの用途開発研究が行なわれているものもある
。
ウシ、ウマ、イヌなどの動物のＩＦＮも大量生産が可能
となり、その結果、ウィルス病や腫瘍などの治療薬とし
てのＩＦＮの用途開発研究が行なわれているものもある
。
ネコについても、α、β、γ各タイプのＩＦＮが報告さ
れている（文献１）。
れている（文献１）。
ネコには、ネコエイズ、ネコ白血病、ネコウィルス性鼻
気管炎、ネコカリキウイルス病、ネコ伝染性腹膜炎はじ
め多数のウィルス病が知られている。
気管炎、ネコカリキウイルス病、ネコ伝染性腹膜炎はじ
め多数のウィルス病が知られている。
そこで、ヒトのαＩＦＮやウシのβＩＦＮを経口投与し
、ネコ白血病ウィルス感染ネコの延命を図った事例が報
告されている。経口ではなく、体内注射を行なえば、よ
り頭著な効果が期待されるものの、異種ＩＦＮに対する
中和抗体の生産が起こることが懸念される。同種ＩＦＮ
、つまりネコのＩＦＮが容易に入手可能となれば、ネコ
の抗ウィルス剤、抗腫瘍剤としての用途が開かれると期
待される。
、ネコ白血病ウィルス感染ネコの延命を図った事例が報
告されている。経口ではなく、体内注射を行なえば、よ
り頭著な効果が期待されるものの、異種ＩＦＮに対する
中和抗体の生産が起こることが懸念される。同種ＩＦＮ
、つまりネコのＩＦＮが容易に入手可能となれば、ネコ
の抗ウィルス剤、抗腫瘍剤としての用途が開かれると期
待される。
本発明者らは、以前にＦｅＩＦＮを遺伝子操作技術によ
り生産する方法、すなわちＦｅＩＦＮをコードするＤＮ
Ａをクローニングし、サルのＣ０８１細胞、チャイニー
ズハムスターのＣＨＯ細胞、大腸菌などを利用して生産
する方法を開発した（文献２）。
り生産する方法、すなわちＦｅＩＦＮをコードするＤＮ
Ａをクローニングし、サルのＣ０８１細胞、チャイニー
ズハムスターのＣＨＯ細胞、大腸菌などを利用して生産
する方法を開発した（文献２）。
［発明が解決しようとする課題］
しかしながら、実用に供する程度の高純度のＦｅＩＦＮ
を大量に生産するという方法は未だ確立されていない。
を大量に生産するという方法は未だ確立されていない。
本発明の目的は、遺伝子操作技術を利用し、ＦｅＩＦＮ
をさらに高純度に、かつ大量生産する方法を提供するこ
とにある。
をさらに高純度に、かつ大量生産する方法を提供するこ
とにある。
［課題を解決するための手段］
本発明者らは、かかる状況に鑑み、創意工夫をなし、カ
イコ核多角体病ウィルスのＤＮＡをＦｅＩＦＮの蛋白を
コードするＤＮＡで組換えた組換え体ウィルスを単離し
、この組換え体ウィルスをカイコ生体中で増殖させてＦ
ｅＩＦＮを生産することに成功し、さらにＦｅＩＦＮを
高純度で精製する方法を確立し、かくして本発明を完成
させるに至った。
イコ核多角体病ウィルスのＤＮＡをＦｅＩＦＮの蛋白を
コードするＤＮＡで組換えた組換え体ウィルスを単離し
、この組換え体ウィルスをカイコ生体中で増殖させてＦ
ｅＩＦＮを生産することに成功し、さらにＦｅＩＦＮを
高純度で精製する方法を確立し、かくして本発明を完成
させるに至った。
すなわち本発明は、Ｆｅ１ＦＮの蛋白質をコードするＤ
ＮＡを外来遺伝子として遺伝子組換えされた組換えカイ
コ核多角体病ウィルスを、カイコ生体中で増殖させてＦ
ｅＩＦＮを生産させた後、生産されたＦｅＩＦＮを含む
溶液を、銅をキレート結合させた担体に接触させ、次い
で該担体への吸着物を溶出剤で溶出させることを特徴と
する高純度ネコインターフェロンの製造法を提供するも
のである。
ＮＡを外来遺伝子として遺伝子組換えされた組換えカイ
コ核多角体病ウィルスを、カイコ生体中で増殖させてＦ
ｅＩＦＮを生産させた後、生産されたＦｅＩＦＮを含む
溶液を、銅をキレート結合させた担体に接触させ、次い
で該担体への吸着物を溶出剤で溶出させることを特徴と
する高純度ネコインターフェロンの製造法を提供するも
のである。
以下、本発明に関し逐次詳細に説明する。
本発明の組換えカイコ核多角体病ウィルスは、例えば文
献２に記載のＥ、ｃｏｉｌ （ｐＦｅＩＦＮｌ）（微
工研条寄第１６３３号）から抽出したプラスミードから
ＦｅＩＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡを切り出して、
カイコのクローニングベクター（文献３）に連結して作
製した組換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウィルス
ＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコ・トランスフェクショ
ンすることにより容易に作製することができる。従って
、本発明の組換え体ウィルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方
法で作製することができる。
献２に記載のＥ、ｃｏｉｌ （ｐＦｅＩＦＮｌ）（微
工研条寄第１６３３号）から抽出したプラスミードから
ＦｅＩＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡを切り出して、
カイコのクローニングベクター（文献３）に連結して作
製した組換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウィルス
ＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコ・トランスフェクショ
ンすることにより容易に作製することができる。従って
、本発明の組換え体ウィルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方
法で作製することができる。
すなわち、ＦｅＩＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡを含
むプラスミドｐＦｅ Ｉ ＦＮＩを含有する大腸菌形質
転換体（微工研条寄第１６３３号）から、例えば文献４
のような一般的な方法により抽出したプラスミドｐＦｅ
ＩＦＮ１からＦｅ１ＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡ部
分を、例えばｐＢＭＯ３０（文献３）などのカイコのク
ローニングベクターの発現調節部分の下流に連結すると
いう一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを
作製することができる。この組換え体プラスミドとカイ
コ核多角体病ウィルスＤＮＡ （文献３）とを、文献３
のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ−Ｎ株（文
献３）にコ・トランスフェクションした後、培養を続け
、培養液中に出現した非組換え体（野生型）と組換え体
のウィルスの中から限界希釈法、もしくはプラーク法な
どの一般的な方法によって組換え体ウィルスをクローニ
ングすることができる。組換え体ウィルスは多角体の形
成能がないことから、野生型ウィルスと容易に区別でき
る。
むプラスミドｐＦｅ Ｉ ＦＮＩを含有する大腸菌形質
転換体（微工研条寄第１６３３号）から、例えば文献４
のような一般的な方法により抽出したプラスミドｐＦｅ
ＩＦＮ１からＦｅ１ＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡ部
分を、例えばｐＢＭＯ３０（文献３）などのカイコのク
ローニングベクターの発現調節部分の下流に連結すると
いう一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを
作製することができる。この組換え体プラスミドとカイ
コ核多角体病ウィルスＤＮＡ （文献３）とを、文献３
のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ−Ｎ株（文
献３）にコ・トランスフェクションした後、培養を続け
、培養液中に出現した非組換え体（野生型）と組換え体
のウィルスの中から限界希釈法、もしくはプラーク法な
どの一般的な方法によって組換え体ウィルスをクローニ
ングすることができる。組換え体ウィルスは多角体の形
成能がないことから、野生型ウィルスと容易に区別でき
る。
ＦｅＩＦＮの生産は、前記の組換えカイコ核多角体ウィ
ルスをカイコ生体中で増殖させることにより行なう。前
記の組換え体ウィルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射
して、クワの葉または合成飼料を与えて飼育する。飼育
後、体液を採取し、その上清からＦｅＩＦＮを回収する
。
ルスをカイコ生体中で増殖させることにより行なう。前
記の組換え体ウィルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射
して、クワの葉または合成飼料を与えて飼育する。飼育
後、体液を採取し、その上清からＦｅＩＦＮを回収する
。
体液中に存在する組換えカイコ核多角体病ウィルスはｐ
Ｈ１〜４で、４℃で１日保存することによって失活させ
ることができる。
Ｈ１〜４で、４℃で１日保存することによって失活させ
ることができる。
本発明で使用する銅をキレート結合させた担体（以下、
銅キレート担体と略す）としては、アガロース、セルロ
ース、ポリアクリルアミドゲルなどに、例えばビスカル
ボキシメチルイミノ基［Ｎ（ＣＨ２Ｃ００Ｈ）２］など
のキレート能を有する交換基が結合した担体を、硫酸銅
などの銅塩の溶液で処理した担体が挙げられる。好まし
くは、“キレ−ティングセファロース” （Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ 社製）などの不溶性多糖類系担体に銅をキレ
ートさせた担体が用いられる。
銅キレート担体と略す）としては、アガロース、セルロ
ース、ポリアクリルアミドゲルなどに、例えばビスカル
ボキシメチルイミノ基［Ｎ（ＣＨ２Ｃ００Ｈ）２］など
のキレート能を有する交換基が結合した担体を、硫酸銅
などの銅塩の溶液で処理した担体が挙げられる。好まし
くは、“キレ−ティングセファロース” （Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ 社製）などの不溶性多糖類系担体に銅をキレ
ートさせた担体が用いられる。
銅キレート担体によるＦｅＩＦＮの精製操作は次のよう
に行なう。
に行なう。
すなわち、まずＦｅＩＦＮを含む溶液を銅キレート担体
に接触吸着させる。吸着は、バッチ法、カラム法どちら
でも可能であるが、カラム法の方が吸着効率が高い。
に接触吸着させる。吸着は、バッチ法、カラム法どちら
でも可能であるが、カラム法の方が吸着効率が高い。
溶離は、リン酸、酢酸、クエン酸などの酸性緩衝液で行
ない、ｐＨ５以下が好ましい。しかし、高イオン強度下
では、さらに高いｐＨでの溶離が可能となる。
ない、ｐＨ５以下が好ましい。しかし、高イオン強度下
では、さらに高いｐＨでの溶離が可能となる。
イオン強度は、リン酸、酢酸、クエン酸などの緩衝液の
濃度を上げたり、塩化ナトリウム、塩化カリウムのよう
な中性塩の添加（０，２〜１．０Ｍ）により増加させる
ことができる。
濃度を上げたり、塩化ナトリウム、塩化カリウムのよう
な中性塩の添加（０，２〜１．０Ｍ）により増加させる
ことができる。
溶出剤の組成、液量は特に限定されるものではなく、最
適な溶離条件は存在する夾雑蛋白質、およびＦｅＩＦＮ
の量、カラムの寸法などに応じて適宜決定される。
適な溶離条件は存在する夾雑蛋白質、およびＦｅＩＦＮ
の量、カラムの寸法などに応じて適宜決定される。
このようにしてＦｅ１ＦＮを銅キレート担体に吸着・溶
離させることにより、粗ＦｅＩＦＮ中に混在していた夾
雑蛋白質を除去して、選択的にＦｅＩＦＮを精製分離す
ることができる。
離させることにより、粗ＦｅＩＦＮ中に混在していた夾
雑蛋白質を除去して、選択的にＦｅＩＦＮを精製分離す
ることができる。
また本発明方法は、他のアフィニティークロマトグラフ
ィーと組み合わせて使用することもできる。他のアフィ
ニティークロマトグラフィーとしては、ブルー色素を結
合させた担体（以下、ブルー担体と略す）を用いる方法
が好ましく、特にブルー担体を銅キレート担体の前に用
いるのが好ましい。また、これらを連続して使用しても
よい。
ィーと組み合わせて使用することもできる。他のアフィ
ニティークロマトグラフィーとしては、ブルー色素を結
合させた担体（以下、ブルー担体と略す）を用いる方法
が好ましく、特にブルー担体を銅キレート担体の前に用
いるのが好ましい。また、これらを連続して使用しても
よい。
ブルー担体としては、次のものが使用される。
ブルー色素は一般客をＣＩリアクティブブルー２といい
、例えばＣＩ ＢＡ−ＧＥ ＩＧＹ社から“シバクロン
ブルーＦ３ＧＡ″、または“シバクロンブルー３ＧＡ”
という商品名で市販されている青色色素などが挙げられ
る。実際のクロマトグラフィーに用いるブルー担体とし
ては、“ブルー・セファ０−スＣＬ −６Ｂ” （Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ社）、“ブルー−セファロース６フア
ーストフロー”（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、“マドレッ
クスゲル・ブルーＡ” （Ａｍｉｅｏｎ社）、および“
アフィゲル・ブルー（Ｂｉｏｒａｄ社）などの商品名で
市販されているブルーアガロースゲル、または“ブルー
−トリスアクリル−Ｍ″ （ＬＫＢ社）、“ブルーセル
ロースゲル” （チッソ社）などの商品名で市販されて
いるブルーセルロースゲルなどが適当であり、容易に入
手することができる。
、例えばＣＩ ＢＡ−ＧＥ ＩＧＹ社から“シバクロン
ブルーＦ３ＧＡ″、または“シバクロンブルー３ＧＡ”
という商品名で市販されている青色色素などが挙げられ
る。実際のクロマトグラフィーに用いるブルー担体とし
ては、“ブルー・セファ０−スＣＬ −６Ｂ” （Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ社）、“ブルー−セファロース６フア
ーストフロー”（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、“マドレッ
クスゲル・ブルーＡ” （Ａｍｉｅｏｎ社）、および“
アフィゲル・ブルー（Ｂｉｏｒａｄ社）などの商品名で
市販されているブルーアガロースゲル、または“ブルー
−トリスアクリル−Ｍ″ （ＬＫＢ社）、“ブルーセル
ロースゲル” （チッソ社）などの商品名で市販されて
いるブルーセルロースゲルなどが適当であり、容易に入
手することができる。
ブルー担体からの溶離は、溶出剤のｐＨ値、イオン強度
、疎水度によって決定される。例えば、高イオン強度下
ではｐＨ６〜８でＦｅＩＦＮは溶出される。高イオン強
度は、リン酸、酢酸、クエン酸、ホウ酸、トリス・塩酸
などの緩衝液の濃度を上げたり、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、塩化カルシウムのような中性塩の添加（０８
２〜１゜ＯＭ）により増加させることができる。また、
溶出剤中にエチレングリコール、プロピレングリコール
などの疎水的相互作用を弱める溶剤を帛む場合、ｐＨ５
〜８での溶出が可能になる。
、疎水度によって決定される。例えば、高イオン強度下
ではｐＨ６〜８でＦｅＩＦＮは溶出される。高イオン強
度は、リン酸、酢酸、クエン酸、ホウ酸、トリス・塩酸
などの緩衝液の濃度を上げたり、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、塩化カルシウムのような中性塩の添加（０８
２〜１゜ＯＭ）により増加させることができる。また、
溶出剤中にエチレングリコール、プロピレングリコール
などの疎水的相互作用を弱める溶剤を帛む場合、ｐＨ５
〜８での溶出が可能になる。
［実 施 例］
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例１
（１）抗ウイルス活性測定法
ウィルスはＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ
Ｖｉｒｕｓ、感受性細胞はネコＦＣ９（文献１）を用
い、ＣＰＥ法に従って抗ウィルス活性を測定した。スタ
ンダードリファレンスとして、ＮＩＨのヒトの天然型α
ＩＦＮ換算したＨｕ Ｉ ＦＮαを用いた。
Ｖｉｒｕｓ、感受性細胞はネコＦＣ９（文献１）を用
い、ＣＰＥ法に従って抗ウィルス活性を測定した。スタ
ンダードリファレンスとして、ＮＩＨのヒトの天然型α
ＩＦＮ換算したＨｕ Ｉ ＦＮαを用いた。
形質転換大腸菌Ｅ、ｃｏｌｔ （ｐＦｅＩＦＮｌ）（微
工研条寄第１６３３号）から文献４の方法で抽出したプ
ラスミドｐＦｅ、ＩＦＮ、１ ２０μｇを制限酵素５ｆ
ａＮ１、ＨｉｎｃＩＩで完全分解し、得られた複数のＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分け、約７５０ｂ
ＰのＤＮＡ断片をエレクトロエリューションで取り出し
、約２μｇを回収した。こうして、ＦｅＩＦＮをコード
するＤＮＡを含む５ｆａＮ１−ＨｉｎｃＩＩ断片を得た
。
工研条寄第１６３３号）から文献４の方法で抽出したプ
ラスミドｐＦｅ、ＩＦＮ、１ ２０μｇを制限酵素５ｆ
ａＮ１、ＨｉｎｃＩＩで完全分解し、得られた複数のＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分け、約７５０ｂ
ＰのＤＮＡ断片をエレクトロエリューションで取り出し
、約２μｇを回収した。こうして、ＦｅＩＦＮをコード
するＤＮＡを含む５ｆａＮ１−ＨｉｎｃＩＩ断片を得た
。
クローニングベクターｐＢＭＯ３０（文献３）５μｇを
制限酵素Ｂｇｌｎ、ＳｍａＩで完全分解し、上記の５ｆ
ａＮ１−ＨｉｎｃＩＩ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼでライ
ゲーションした。この反応液をコンピテント化したＥ、
ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ（全酒造製）と混合し、形質転
換を行なった。１１００ｔｔ／ｍｌのアンピシリンを含
むＬＢプレート上に生育するコロニーの中から、アルカ
リミニスクリーン法で抽出したプラスミドのＨｉｎｄＩ
［Ｉでの制限分析により、クローニングベクターｐＢＭ
０３０に約７５０ｂｐのＤＮＡ断片が組み込まれている
プラスミドを得た。そのプラスミドのＦｅＩＦＮをコー
ドするＤＮＡの開始コドンを含む約１００ｂａｉｅのＤ
ＮＡシーケンスを行なって、ｐＢＭＯ３０にＦｅＩＦＮ
をコードするＤＮＡが組み込まれているプラスミドを得
た。この組換え体プラスミドをｐＢｍＦｅＩＦＮｌとし
た。ｐＢｍＦｅＩＦＮｌの作製法を第１図に示す。
制限酵素Ｂｇｌｎ、ＳｍａＩで完全分解し、上記の５ｆ
ａＮ１−ＨｉｎｃＩＩ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼでライ
ゲーションした。この反応液をコンピテント化したＥ、
ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ（全酒造製）と混合し、形質転
換を行なった。１１００ｔｔ／ｍｌのアンピシリンを含
むＬＢプレート上に生育するコロニーの中から、アルカ
リミニスクリーン法で抽出したプラスミドのＨｉｎｄＩ
［Ｉでの制限分析により、クローニングベクターｐＢＭ
０３０に約７５０ｂｐのＤＮＡ断片が組み込まれている
プラスミドを得た。そのプラスミドのＦｅＩＦＮをコー
ドするＤＮＡの開始コドンを含む約１００ｂａｉｅのＤ
ＮＡシーケンスを行なって、ｐＢＭＯ３０にＦｅＩＦＮ
をコードするＤＮＡが組み込まれているプラスミドを得
た。この組換え体プラスミドをｐＢｍＦｅＩＦＮｌとし
た。ｐＢｍＦｅＩＦＮｌの作製法を第１図に示す。
文献３の方法で組換え体ウィルスを作製した。
すなわち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７，
１，０，２８Ｍ ＮａＣ１，０，７ｍＭＮａ２ＨＰＯ
＋、０．７ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４からなる２、５ｍｌ
の溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０，２５Ｍ
ＣａＣｌ２、カイコ核多角体病ウィルスＢｍＮＰＶ
７３株（文献３）のＤＮＡｌｏｐｇ、組換え体プラスミ
ドｐＢｍＦｅＩＦＮ１のＤＮＡ６５μｇを含む）を滴下
し、生じた懸濁液の０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を添加したＴＣ−１０培地（文献５）中、２５ｃｎｆの
フラスコで平面培養した約３Ｘ１０５個のＢＭ−Ｎ細胞
（文献３）の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入
した。２０日間後、新鮮な培地と交換し、さらに５日間
培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄
化した上清を希釈して、平面に培養したＢＭ−Ｎ細胞の
培養基に添加して７日間培養後、顕微鏡観察によりウィ
ルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない培養基
を選択した（限界希釈法）。限界希釈法を２回繰り返す
ことによって組換え体ウィルスをクローニングし、ここ
で作製したＦｅＩＦＮをコードするＤＮＡを含む組換え
体ウィルスをＢｍＦｅＩＦＮｌと七た。
１，０，２８Ｍ ＮａＣ１，０，７ｍＭＮａ２ＨＰＯ
＋、０．７ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４からなる２、５ｍｌ
の溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０，２５Ｍ
ＣａＣｌ２、カイコ核多角体病ウィルスＢｍＮＰＶ
７３株（文献３）のＤＮＡｌｏｐｇ、組換え体プラスミ
ドｐＢｍＦｅＩＦＮ１のＤＮＡ６５μｇを含む）を滴下
し、生じた懸濁液の０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を添加したＴＣ−１０培地（文献５）中、２５ｃｎｆの
フラスコで平面培養した約３Ｘ１０５個のＢＭ−Ｎ細胞
（文献３）の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入
した。２０日間後、新鮮な培地と交換し、さらに５日間
培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄
化した上清を希釈して、平面に培養したＢＭ−Ｎ細胞の
培養基に添加して７日間培養後、顕微鏡観察によりウィ
ルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない培養基
を選択した（限界希釈法）。限界希釈法を２回繰り返す
ことによって組換え体ウィルスをクローニングし、ここ
で作製したＦｅＩＦＮをコードするＤＮＡを含む組換え
体ウィルスをＢｍＦｅＩＦＮｌと七た。
ＢｍＦｅＩＦＮｌは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆＡｎｉｍｓｌ Ｃｅ１ｌ Ｃｕｔｕｒｅ
ｓにブダペスト条約に基づき寄託されている（Ａｃｃｅ
ｓｔｉｏｎ Ｎｏ、 ＶＢ９０６２７０１）。
ｔｉｏｎ ｏｆＡｎｉｍｓｌ Ｃｅ１ｌ Ｃｕｔｕｒｅ
ｓにブダペスト条約に基づき寄託されている（Ａｃｃｅ
ｓｔｉｏｎ Ｎｏ、 ＶＢ９０６２７０１）。
η） 組換え体ウィルス液の調製
７５ａｌのフラスコ底面で、１５ｍ１の１０％ＦＢＳを
含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０６のＢ
Ｍ−Ｎ細胞に、前記（３）でクローニングした組換え体
ウィルスを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μ！をＢＭ−
Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を３
．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心分離して遠心上清を組換え
体ウィルス液として得た。それぞれのウィルス液を１０
−７希釈し、その１ ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添
加して２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によ
って培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウィルス感染が認められた
。
含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０６のＢ
Ｍ−Ｎ細胞に、前記（３）でクローニングした組換え体
ウィルスを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μ！をＢＭ−
Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を３
．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心分離して遠心上清を組換え
体ウィルス液として得た。それぞれのウィルス液を１０
−７希釈し、その１ ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添
加して２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によ
って培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウィルス感染が認められた
。
（５） カイコ生体中でのＦｅＩＦＮの生産５令１日
目のカイコ幼虫に、（４）で得た組換え体ウィルスのウ
ィルス液をそれぞれ５０μｌ／頭注射し、２５℃で４日
間、市販の合成飼料（ビタミルク販売株式会社）を与え
て飼育後、尾脚を切り、体液を氷冷したエッペンドルフ
・チューブに採取し、遠心し、上清を得、抗ウィルス活
性を調べた。
目のカイコ幼虫に、（４）で得た組換え体ウィルスのウ
ィルス液をそれぞれ５０μｌ／頭注射し、２５℃で４日
間、市販の合成飼料（ビタミルク販売株式会社）を与え
て飼育後、尾脚を切り、体液を氷冷したエッペンドルフ
・チューブに採取し、遠心し、上清を得、抗ウィルス活
性を調べた。
７．７Ｘ１０７単位／ｍｌ（体液）のＦｅ１ＦＮが生産
されていた。
されていた。
（６） 組換えカイコ核多角体病ウィルスの失活０．
１ｍｌ当たり４×１０８ＴＣ■Ｄ５ｏの組換えカイコ核
多角体病ウィルスＢｍＦｅｌＦＮ１を含むカイコ体液を
、０．ＩＮ塩酸でｐＨ１，５にして４℃で１日保存した
。２Ｎ ＮａＯＨ溶液で中和し、その１ ｍｌをＢＭ
−Ｎ細胞の培養液に添加したがＢＭ−Ｎ細胞はウィルス
感染しなかった。
１ｍｌ当たり４×１０８ＴＣ■Ｄ５ｏの組換えカイコ核
多角体病ウィルスＢｍＦｅｌＦＮ１を含むカイコ体液を
、０．ＩＮ塩酸でｐＨ１，５にして４℃で１日保存した
。２Ｎ ＮａＯＨ溶液で中和し、その１ ｍｌをＢＭ
−Ｎ細胞の培養液に添加したがＢＭ−Ｎ細胞はウィルス
感染しなかった。
塩酸によって組換え体ウィルスＢｍＦ ｅ Ｉ ＦＮｌ
を失活させ、ＮａＯＨ溶液によって中和したカイコ体液
と粗ＦｅＩＦＮ溶液とした。
を失活させ、ＮａＯＨ溶液によって中和したカイコ体液
と粗ＦｅＩＦＮ溶液とした。
（７）ブルー色素を結合させた担体を用いたＦｅＩＦＮ
の精製 前記（６）項の３． ８ Ｘ １０６ 、Ｕ／ｍｌのＦ
ｅＩＦＮ活性を含み、ＦｅＩＦＮ比活性が１．２Ｘ１０
６Ｕ ／ ｍｇ蛋白質である粗ＦｅＩＦＮ溶液１４．５
Ａ’を、“ブルーセファロース（ファースト・フロータ
イブ）”２７０ｍ１を含むカラムにかけ、続いてこのカ
ラムを０．５Ｍ塩化カリウムを含む５０ｍＭ）リス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８）１２５０ｍｌで洗浄した後、１Ｍ塩
化カリウムを含む５０ｍＭ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８
）１．０８１および１Ｍ塩化カリウム、４０％エチレン
グリコールを含む５０ｍＭ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ−
８）１．０８１でＦｅＩＦＮを溶出した。溶出されたＦ
ｅＩＦＮは４．２Ｘ１０７Ｕ／ｍｌのＦｅ１ＦＮ活性を
含み、比活性１．ｌＸ１０８Ｕ／■蛋白質であった。こ
のときのＦｅＩＦＮ活性回収率は８２．４％で、比活性
は９２倍に上昇した。
の精製 前記（６）項の３． ８ Ｘ １０６ 、Ｕ／ｍｌのＦ
ｅＩＦＮ活性を含み、ＦｅＩＦＮ比活性が１．２Ｘ１０
６Ｕ ／ ｍｇ蛋白質である粗ＦｅＩＦＮ溶液１４．５
Ａ’を、“ブルーセファロース（ファースト・フロータ
イブ）”２７０ｍ１を含むカラムにかけ、続いてこのカ
ラムを０．５Ｍ塩化カリウムを含む５０ｍＭ）リス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８）１２５０ｍｌで洗浄した後、１Ｍ塩
化カリウムを含む５０ｍＭ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８
）１．０８１および１Ｍ塩化カリウム、４０％エチレン
グリコールを含む５０ｍＭ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ−
８）１．０８１でＦｅＩＦＮを溶出した。溶出されたＦ
ｅＩＦＮは４．２Ｘ１０７Ｕ／ｍｌのＦｅ１ＦＮ活性を
含み、比活性１．ｌＸ１０８Ｕ／■蛋白質であった。こ
のときのＦｅＩＦＮ活性回収率は８２．４％で、比活性
は９２倍に上昇した。
（８） 銅をキレート結合させた担体を用いたＦｅＩ
ＦＮの精製 前記（７）項のブルー担体からのＦｅＩＦＮ溶出液ｉ、
ｏ８ｉを、銅をキレート結合させた“キレ−ティングセ
ファローズ１５０ ｍｌを含むカラムに直接かけ、０．
３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４
，２）で洗浄後、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３，９）７５０ｍｌでＦｅＩＦＮを
溶出した。溶出されたＦｅＩＦＮは２．７Ｘ１０７Ｕ／
ｍｌのＦｅＩＦＮ活性を含み、比活性１．４ｘ１０８Ｕ
／■蛋白質であった。このときのＦｅＩＦＮ活性回収率
は４５％で、比活性は１．３倍に上昇した。
ＦＮの精製 前記（７）項のブルー担体からのＦｅＩＦＮ溶出液ｉ、
ｏ８ｉを、銅をキレート結合させた“キレ−ティングセ
ファローズ１５０ ｍｌを含むカラムに直接かけ、０．
３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４
，２）で洗浄後、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３，９）７５０ｍｌでＦｅＩＦＮを
溶出した。溶出されたＦｅＩＦＮは２．７Ｘ１０７Ｕ／
ｍｌのＦｅＩＦＮ活性を含み、比活性１．４ｘ１０８Ｕ
／■蛋白質であった。このときのＦｅＩＦＮ活性回収率
は４５％で、比活性は１．３倍に上昇した。
［発明の効果］
本発明によれば、ネコの抗ウィルス剤、抗腫瘍剤として
期待されるＦｅＩＦＮを高純度で、かつ大量生産するこ
とができる。
期待されるＦｅＩＦＮを高純度で、かつ大量生産するこ
とができる。
［参考文献］
（１） Ｊ、 Ｋ、 Ｙｘｍａｍｏｔｏら：Ｖｅｔ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ。
ｐａｔｈｏｌｌ、 １１． １−１９． （１９８
６）。
６）。
（２） Ａ、Ｙａｎａｉら：ヨーロッパ公開特許 第
３２２８７０号 （３） Ｔ、 Ｈｏｒｉｕｃｈｉら：＾ｇｒｉｃ、
Ｒｉｏｔ、 Ｃｈｅｗ、、 ５１． １５７．３
−１５８０． （１９８７）。
３２２８７０号 （３） Ｔ、 Ｈｏｒｉｕｃｈｉら：＾ｇｒｉｃ、
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（４） Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら編：Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ｅｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ
Ｍａｎｕａｌ、 （１９８２） ｐＨ６〜９６．
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｔ Ｌａ
ｂｏｔａｔｏｒ７． Ｎｅｗ Ｗｏｒｋ。
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Ｍａｎｕａｌ、 （１９８２） ｐＨ６〜９６．
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（５） Ｇ、Ｒ，Ｇａｒｄｉｎｅｔ ａｎｄ Ｈ６
５ｔｏｃｋｄａｌｅ ： Ｊ、 Ｉｎｖｅｒｔｅ
ｂｒｘｔｅ ＰａｔｂｏｌｏｇＴ、 ２５． ３６
３−３７０． （１９７５）。
５ｔｏｃｋｄａｌｅ ： Ｊ、 Ｉｎｖｅｒｔｅ
ｂｒｘｔｅ ＰａｔｂｏｌｏｇＴ、 ２５． ３６
３−３７０． （１９７５）。
第１図は、ネコインターフェロンをコードするＤＮＡを
含む組換え体プラスミドｐＢｍＦｅｌＦＮ１の作製例の
概略図である。 特許出願人 東 し 株 式 会 社第１図
含む組換え体プラスミドｐＢｍＦｅｌＦＮ１の作製例の
概略図である。 特許出願人 東 し 株 式 会 社第１図
Claims (1)
- （１）ネコインターフェロンの蛋白質をコードするＤＮ
Ａにより遺伝子組換えされた組換えカイコ核多角体病ウ
ィルスを、カイコ生体中で増殖させてネコインターフェ
ロンを生産させた後、生産されたネコインターフェロン
を含む溶液を、銅をキレート結合させた担体に接触させ
、次いで該担体への吸着物を溶出剤で溶出させることを
特徴とする高純度ネコインターフェロンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2173298A JP2621595B2 (ja) | 1990-06-28 | 1990-06-28 | 高純度ネコインターフェロンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2173298A JP2621595B2 (ja) | 1990-06-28 | 1990-06-28 | 高純度ネコインターフェロンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0459799A true JPH0459799A (ja) | 1992-02-26 |
| JP2621595B2 JP2621595B2 (ja) | 1997-06-18 |
Family
ID=15957853
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2173298A Expired - Fee Related JP2621595B2 (ja) | 1990-06-28 | 1990-06-28 | 高純度ネコインターフェロンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2621595B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107258708A (zh) * | 2017-07-24 | 2017-10-20 | 广西壮族自治区蚕业技术推广总站 | 不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0322870A2 (en) * | 1987-12-29 | 1989-07-05 | Toray Industries, Inc. | Synthetic plasmid, transformant, feline interferon gene and method for producing feline interferon |
-
1990
- 1990-06-28 JP JP2173298A patent/JP2621595B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0322870A2 (en) * | 1987-12-29 | 1989-07-05 | Toray Industries, Inc. | Synthetic plasmid, transformant, feline interferon gene and method for producing feline interferon |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107258708A (zh) * | 2017-07-24 | 2017-10-20 | 广西壮族自治区蚕业技术推广总站 | 不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法 |
| CN107258708B (zh) * | 2017-07-24 | 2020-07-03 | 广西壮族自治区蚕业技术推广总站 | 不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2621595B2 (ja) | 1997-06-18 |
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