JPH0460633B2

JPH0460633B2 -

Info

Publication number: JPH0460633B2
Application number: JP30914290A
Authority: JP
Inventors: Takayasu Sonoyama; Bunji Kageyama; Shigeo Yagi
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1990-11-14
Filing date: 1990-11-14
Publication date: 1992-09-28
Also published as: JPH03164166A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は２−ケト−Ｌ−グロン酸の生産に関し
特に２−ケト−Ｄ−グルコン酸を培地中に蓄積す
ることなく、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸よ
り２−ケト−Ｌ−グロン酸を微生物的に得る製造
方法実施のために使用する変異微生物に係る。本発明者らは、さきに２，５−ジケト−Ｄ−グ
ルコン酸より２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成し得
る多くの微生物（２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌
株（）と称する）を見い出し之を使用する２−
ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法を発明した。（特
公昭50−21559号、特公昭53−25033号、および特
公昭56−15877号公報参照）。（）はいずれも原
料２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸より主生成物
２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成するほか副生成物
として２−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成する。こ
の不所望な２−ケト−Ｄ−グルコン酸を培地中に
蓄積させない為に混合培養法を発明した。（特公
昭54−19468号公報参照）今回、本発明者らはコリネバクテリウム属に属
する２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株（）を通
常の方法で変異処理し、変異した（）の中より
５−ケト−Ｄ−グルコン酸に生育せずＤ−グルコ
ン酸に生育する変異株（この変異株を５−ケト−
Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株（）と称する）
を誘導し、この変異株（）が２，５−ジケト−
Ｄ−グルコン酸より２−ケト−Ｄ−グルコン酸を
生成しない性質を有することを見い出した。また
（）を培養し２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸
と接触させると不所望な２−ケト−Ｄ−グルコン
酸を培地中に実質的に蓄積することなく２−ケト
−Ｌ−グロン酸が蓄積することを見い出し、この
知見にもとづいて冒頭の特許請求の範囲にその要
旨を記載した通りの発明を完成した。すなわち、本発明によれば２−ケト−Ｌ−グロ
ン酸生産菌株（）より誘導した５−ケト−Ｄ−
グルコン酸代謝欠損変異株（）が提供される。
この（）またはその処理物に、２，５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸またはその塩類を含む培地と接
触させて培地中に２−ケト−Ｌ−グロン酸を蓄積
させ、これを採取することにより２−ケト−Ｌ−
グロン酸を製造することができる。（）より（）を効率より得るには、紫外線
照射、Ｘ線照射などの処理を施すか、Ｎ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（N.T.
G.）、アクリフラビン、エチルメタンスルフオン
酸などの変異誘導剤に接触させる方法が採られ
る。変異処理を施した（）を適当な濃度に希釈
するか、再度培養後適当な濃度に希釈し、希釈液
の１部（0.5〜１ml）を0.5〜２％のＤ−グルコン
酸を含む最少寒天培地（生育に必要なビタミン、
微量元素を含む）に塗布し生育させる。生育した
菌の集落を0.5〜２％の５−ケト−Ｄ−グルコン
酸を含む最少寒天培地に転写し（レプリカ法）、
５−ケト−Ｄ−グルコン酸培地に生育しない集落
を選択する。選択された変異株は５−ケト−Ｄ−
グルコン酸の代謝活性を失つているかもしくは親
株（）の1/10以下に低下している（この様にし
て得られた変異株を５−ケト−Ｄ−グルコン酸代
謝欠損変異株（）と称する）。（）を培養し
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸と接触させたと
ころ得られたすべての（）は２−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸を実質的に生成することなく２−ケト−
Ｌ−グロン酸を生成することが確認された。上記
の方法で得られた（）の例として、（）であ
るコリネバクテリウム・スピーシーズ
（Corynebacterium sp.FERM−Ｐ 2770、
ATCC No.31090）の変異株（微工研条寄FERM
−BP−108）や、（）であるコリネバクテリウ
ム・スピーシーズ（Corynebacterium sp.FERM
−Ｐ 2687、ATCC No.31081）の変異株（微工
研条寄FERM−BP−107）などがあげられる。

【表】

【表】上記の事実、すなわち、５−ケト−Ｄ−グルコ
ン酸代謝能を欠損させることによつて２−ケト−
Ｄ−グルコン酸産生能を欠損あるいは著しく弱化
させ得た事実は、コリネフオーム・グループ（バ
ージーズ・マニユアル・オブ・デタミナテイブ・
バクテリオロジー第８版の定義による）に属す
るすべての２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌に関し
て共通のことである。（）の培養にあたつて使用される培地として
は特別な制限はない。たとえば、炭素源としては
グルコース、シユークロース、グリセリン、廃糖
蜜など糖類や多価アルコールを使用し、窒素源と
しては一般的に用いられる窒素化合物、たとえ
ば、コーン・ステイープ・リカー、ペプトン、肉
エキスやアンモニウム塩、硝酸塩などが使用され
る。無機塩類（たとえばカルシウム、マグネシウ
ム、カリウム、亜鉛、マンガン、鉄などの塩類）
や目的物質の生成を促進する因子などを添加して
もよい。培地組成は、用いる菌株の特性や原料
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の使用量やその
他の条件により異なる。原料の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸として
は、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸塩の水溶液
を用いることも出来るし、あるいは、エルウイニ
ア属、グルコノバクター属（ここに言うグルコノ
バクター属とは、バージーズ・マニユアル・オ
ブ・デタミナテイブ・バクテリオロジー第８版
に準拠するもので同第７版に於けるアセトバクタ
ー属、アセトモナス属、グルコノバクター属を含
む）に属する。Ｄ−グルコースより２，５−ジケ
ト−Ｄ−グルコン酸を生産する能力を有する微生
物を培養して得られる発酵液の濾過除菌液あるい
は、薬剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）によ
る殺菌処理液を用いることも出来る。２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の添加条件
は、菌株や培地条件により異なるが、普通１〜10
％の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を１度にあ
るいは、少量ずつ間欠的に添加する。２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の添加時期
は、培養開始時に添加するかもしくは、菌の生育
が終了する前後10時間以内に添加することが望ま
しい。培養時間は、原料の２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸の添加条件により異なるが、普通２，５−
ジケト−Ｄ−グルコン酸添加後24時間〜96時間培
養し、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸が消失し
た時点を培養の終点とする。発酵液中の２−ケト−Ｌ−グロン酸、２−ケト
−Ｄ−グルコン酸や２，５−ジケト−Ｄ−グルコ
ン酸は、一般的に糖類及びその関連物質を分析す
る手段により分離、定量し得る。たとえば、ガス
クロマトグラフイー、ペーパークロマトグラフイ
ー、薄層クロマトグラフイーなどが用いられる。
これらは、その目的に応じて種々使い分けられ
る。以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明
する。実施例１（２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造） (1) 種培地Ｄ−グルコース 1.0％バクト・イーストエキストラクト（Difco）
0.5％バクト・ペプトン（Difco） 0.1％第１リン酸カリウム（KH₂PO₄） 0.1％硫酸マグネシウム（MgSO₄・7H₂Ｏ） 0.02％（10％NaOHにてPH７〜7.2に調整し500ml容三
角フラスコに50ml宛分注し115℃、20分間滅菌す
る。） (2) 本培養培地Ｄ−グルコース 1.0％コーン・ステイーブ・リカー（CSL） 3.0％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂Ｏ 0.02％（10％NaOHにてPH７〜7.2に調整し500ml容三
角フラスコに50ml宛分注し115℃、20分間滅菌す
る。） (3) ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸カルシウム
水溶液の調製粉末の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸カルシ
ウムを5.0％の水溶液にし、この水溶液を予め滅
菌された濾過器で濾過除菌する。 (4) ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液の調
製エルウイニア・プンクタータ（FERM−
P5452、ATCC No.31626）を、種培地（１％Ｄ
−グルコース、５％CSL、0.1％KH₂PO₄、0.02％
MgSO₄・7H₂Ｏ、0.5％炭酸カルシウム
（CaCO₃）、PH6.8〜7.0、500ml三角フラスコに50
ml分注、115℃、20分間滅菌）に１白金耳植菌し
28℃で８〜11時間振盪培養する。（振幅71mm、
270r.p.m.、以下同じ）。この種培養液45mlを455
mlの２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵培地
（20％Ｄ−グルコース、３％CSL、0.1％KH₂
PO₄、6.3％CaCO₃、PH6.8〜7.0、115℃、20分間
滅菌）に加えて予め滅菌された１発酵槽で28
℃、17〜30時間、600Nml／分の通気下で1740r.p.
m.の攪拌を行ないながら発酵する。（２，５−ジ
ケト−Ｄ−グルコン酸19w／ｖ％）。この発酵液
を遠心分離機で菌体を除去し、その上清を予め滅
菌された濾過器で濾過除菌する。これを２，５−
ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液とする。 (5) 分析方法２−ケト−Ｌ−グロン酸、２−ケト−Ｄ−グル
コン酸の定量は、ガスクロマトグラフイー及びペ
ーパークロマトグラフイーを使用する。ガスクロマトグラフイーの実施条件カラム：シリコンガム SE52（５％）キヤリアーガス：ヘリウムカラムの温度：160℃〜210℃ サンプル：トリメチルシリル化ペーパークロマトグラフイーの実施条件担体：東洋濾紙No.50 展開液：フエノール：ギ酸：水＝75：４：25 発色：AHF溶液（アニリン0.93ｇとフタール
酸1.66ｇを水飽和ｎ−ブタノール100mlに溶
解したもの）を噴霧、105℃で２分間処理し
て発色させる。 (6) ２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造第１表に掲げる２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌
株あるいは、５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損
変異株を(1)の種培地に１白金耳植菌し、28℃で24
時間振盪培養したのち、この種培養液、５mlを(2)
の本発酵培地に植菌し振盪培養した。この本発酵培地に対し２，５−ジケト−Ｄ−グ
ルコン酸液（(3)あるいは(4)）を培養開始時又は培
養開始後16時間で最終濃度が２％になるように添
加し、4.8時間培養した。得られた培養液を(5)の
ガスクロマトグラフイーで２−ケト−Ｌ−グロン
酸及び２−ケト−Ｄ−グルコン酸を定量し、第２
表の結果を得た。５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝
欠損変異株（）の培養液からは、２−ケト−Ｄ
−グルコン酸は検出されなかつた。さらにフエノ
ール：ギ酸：水＝75：４：25を使用して、ペーパ
ークロマトグラフイーを行ない、２−ケト−Ｄ−
グルコン酸の検出を行なつたが、２−ケト−Ｄ−
グルコン酸代謝欠損変異株（）の培養液から２
−ケト−Ｄ−グルコン酸は検出されなかつた。

【表】ルコン酸
実施例２（変異微生物（）の誘導） (1) 液体培地バクト・ビーフエキストセクト（Difco）1.0％バクト・ペプトン（Difco） 1.0％ NaCl 0.5％（PH7.2、50ml／500ml容三角フラスコ、115℃、
20分間滅菌） (2) 最少寒天培地 NH₄Cl 0.5％ NH₄NO₃ 0.1％ Na₂SO₄ 0.2％ MgSO₄・7H₂Ｏ 0.1％ CaCO₃ 0.0001％ KH₂PO₄ 0.3％ K₂HPO₄ 0.1％微量元素液（注１） 0.1％ビタミン液（注２） 0.1％寒天 2.0％（PH7.2、115℃、15分間滅菌）（注１）微量元素液（１中次の成分を含む） Na₂B₄O₇・10H₂Ｏ 88mg （NH₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂Ｏ 37mg FeCl₃・6H₂Ｏ 970mg ZnSO₄・7H₂Ｏ 8.8mg CuSO₄・5H₂Ｏ 270mg MnCl₂・4H₂Ｏ 72mg （注２）ビタミン液（１中次の成分を含む）チアミン 1.0mg パントテン酸 10mg ニコチン酸アミド 10mg ビオチン 0.1mg (3) Ｄ−グルコン酸、５−ケト−Ｄ−グルコン酸
溶液Ｄ−グルコン酸ナトリウム、２−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸ナトリウムを各々10％水溶液にしPHを
6.8〜7.2であることを確認後、濾過滅菌して調製
した。 (4) 変異誘導法コリネバクテリウム・スピーシーズ
（Corynebacterium sp.FERM−Ｐ 2770）ある
いは、コリネバクテリウム・スピーシーズ
（Corynebacterium sp.FERM−Ｐ 2687）を
各々(1)の液体培地に１白金耳植菌し、28℃、８時
間振盪培養した。之に予め無菌濾過された0.2％
のＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン溶液を最終濃度0.02％になるように加え30
分間培養を継続し、遠心分離（10000r.p.m.15分）
したのち菌体を集め、３回無菌生理食塩水で洗菌
し、無菌生理食塩水10mlに懸濁させた。この懸濁
液１mlを(1)の培地に植菌し15時間、28℃で振盪培
養した。この培養液を無菌生理食塩水で生菌が
10²〜10³個／mlになるように希釈した。次にこの
希釈液を(3)のＤ−グルコン酸水溶液と(2)の最少寒
天培地を１：９に加えた平板培地に0.5〜１ml塗
布し３〜５日間28℃で培養した。生育した菌（第３表のＤ−グルコン酸培地に生
育する株(1)）の集落を(3)の５−ケト−Ｄ−グルコ
ン酸水溶液と(2)の最少培地を１：９に加えた平板
培地にビロード布等でレプリカした。これを３〜
５日間培養したのち先のＤ−グルコン酸培地に生
育するが５−ケト−Ｄ−グルコン酸培地に生育し
ない菌の集落をＤ−グルコン酸培地に釣菌したう
え生育させた。この選択された変異株（第３表の５−ケト−Ｄ
−グルコン酸培地に非生育の株(2)）を５−ケト−
Ｄ−グルコン酸１％を含む(1)の培地に植菌し24時
間28℃で振盪培養した。この培養液を実施例１で
記載したペーパークロマトグラフイーにて５−ケ
ト−Ｄ−グルコン酸を定量しこの菌株(2)が５−ケ
ト−Ｄ−グルコン酸を資化していないことを確認
した。この５−ケト−Ｄ−グルコン酸を資化していな
いことを確認された変異株（第３表の５−ケト−
Ｄ−グルコン酸非資化株(3)）を、実施例１、(2)記
載の培地に１白金耳植菌し20時間培養後、実施例
１、(3)記載の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸カ
ルシウム水溶液を最終濃度1.0％になるように加
え、さらに24時間培養した。この培養液をペーパ
ークロマトグラフイーによつて含有２−ケト−Ｄ
−グルコン酸および２−ケト−Ｌ−グロン酸を定
量し第３表の結果を得た。このようにしてコリネ
バクテリウム・スピーシーズ（FERM−Ｐ
2770）を変異処理し生育させた84520株より５−
ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株308株、コ
リネバクテリウム・スピーシーズ（FERM−Ｐ
2687）の変異処理株29100株より11株の５−ケ
ト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株を得た。

【表】実施例３（菌体懸濁液および抽出液による２−
ケト−Ｌ−グロン酸の生成） (1) 種培養：実施例１、(1)の種培地に、コリネバクテリウム
sp.FERM−Ｐ 2770（）あるいは、その菌株よ
り誘導した変異株FERM−BP 108（）をそれ
ぞれ、１白金耳ずつ植菌し、28℃で24時間振盪培
養した。 (2) 本培養：実施例１、(2)の培地（ただし、消泡剤としてポ
リプロピレングリコールＰ−2000を0.01％含有す
る）500mlを滅菌済１容発酵槽に入れ、(1)で得
た種培養液50mlを植菌し、1740r.p.m.の攪拌、
600Nml／分の通気下に、28℃、16時間の培養を
行なつた。 (3) 菌体懸濁液の調製： (2)で得た培養液を遠心分離（15000r.p.m.，20
分）して菌体をあつめ、生理食塩水で２回洗浄し
た。この洗菌済菌体を、0.05Mトリス・バツフアー
（PH7.5）にOD_660on＝12となるように懸濁した。 (4) 菌体抽出液の調製：上記(3)で得た洗菌済菌体を、0.05Mトリス・バ
ツフアー（PH7.8）に、OD_660on＝100となるよう
に懸濁し、これをフレンチ・プレス（圧力：1000
Kg／cm²）にかけ菌体を破砕した。この破砕から遠
心分離（20000G、30分間）によつて菌体（菌体
および破片）を除去したのち、上澄液を、0.05M
トリス・バツフアー（PH7.5）に対して透析（15
時間）し、これを菌体抽出液とした。 (5) 懸濁液(3)による２−ケト−Ｌ−グロン酸の生
成懸濁液(3)８mlを２，５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸カルシウム溶液（実施例１(3)によつて調製した
もの）２mlと混合し、この混合物を30℃で15時間
振盪反応させた。反応完了後、遠心分離
（15000G、15分間）によつて、菌体を除去し、上
澄液中の２−ケト−Ｌ−グロン酸および２−ケト
−Ｄ−グルコン酸を実施例１(5)項に記載のガスク
ロマトグラフイによつて定量し、次の第４表に示
す結果を得た。

【表】 (6) 抽出液(4)による２−ケト−Ｌ−グロン酸の生
成抽出液(4)0.5mlを、75μmolesの２，５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸カルシウムおよび15μmolesの
NADPH（還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド燐酸）を含む2.5mlの0.1Mトリスバ
ツフアー（PH7.5）に加え、これを30℃で16時間
反応させた。この反応液の定量結果を次の第５表
に示す。

【表】上記第４および第５表に示した結果から、菌体
懸濁液(3)および菌体抽出液(4)を用いた反応によつ
て２−ケト−Ｌ−グロン酸が生成することが確認
された。なお両反応において、親株の２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸生産菌（FERM−Ｐ 2770）から得られ
た処理物はいずれも２−ケト−Ｌ−グロン酸とと
もに２−ケト−Ｄ−グロン酸を併産するものであ
つたのに対し、変異株（）の処理物は２−ケト
−Ｌ−グロン酸のみを生産し、２−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸を併産しないものであつた。

Claims

【特許請求の範囲】

１２−ケト−Ｌ−グロン酸を産生する５−ケト
−Ｄ−グルコン酸代謝欠損株であるコリネバクテ
リウム属に属するコリネバクテリウム・スピーシ
ーズ FERM BP−107もしくはコリネバクテリ
ウム・スピーシーズ FERM BP−108。