JPH03164166A - ５―ケト―ｄ―グルコン酸代謝欠損変異株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は２−ケト−Ｌ−グロン酸の生産に関し特に２−
ケト−Ｄ−グルコン酸を培地中に蓄積することな＜，２
．５−ジケトーＤ−グルコン酸より２一ケトーＬ−グロ
ン酸を微生物的に得る製造方法実施のために使用する変
異微生物に係る．本発明者らは、さきに２．５−ジケト
ーｐ−グルコン酸より２一ケトーＬ−グロン酸を生或し
得る多くの微生物（２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株（
Ｉ）と称する）を見い出し之を使用する２−ケト−Ｌ−
グロン酸の製造方法を発明した．（特公昭５０−２１５
５９号、特公昭５３−２５０３３号、および特公昭５　
６　−　１　５　８７　７号公報参照）．（Ｉ）はいず
れも原料２，５−ジケトーＤ一グルコン酸より主生成物
２−ケト−Ｌ−グロン酸を生或するほか副生成物として
２−ケト−Ｄーグルフン酸を生戒する．この不所望な２
−ケト−Ｄ−グルコン酸を培地中に蓄積させない為に混
合培養法を発明した．（特公昭５４−１９４６８号公報
参照） 今回、本発明者らはコリネバクテリウム属に属する２−
ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株（Ｉ）を通常の方法で変異
処理し、変異した（Ｉ）の中より５一ケトーＤ−グルコ
ン酸に生育せずＤ−グルコン酸に生育する変異株（この
変異株を５一ケトーＤ−グルコン酸代謝欠損変異株（ｎ
）と称する）を誘導し、この変異株（ｎ）が２．５−ジ
ケトーＤ　−　’；ｆル−２　’／酸ヨＩ）　２−ケト
−Ｄ−グルコン酸ヲ生成しない性質を有することを見い
出した．また（ｎ）を培養し２．５−ジケトーＤ−グル
コン酸と接触させると不所望な２−ケト−Ｄ−グルコン
酸を培地中に実質的に蓄積することなく２−ケト−Ｌ−
グロン酸が蓄積することを見い出し、この知見にもとづ
いて冒頭の特許請求の範囲にその要旨を記載した通りの
発明を完成した． すなわち、本発明によれば２−ケト−Ｌ−グロン酸生産
菌株（Ｉ）より誘導した５−ケト−Ｄーグルコン酸代謝
欠損変異株（ＩＩ）が提供される．この（Ｉ［）または
その処理物に、２．５−ジケトーＤ−グルコン酸または
その塩類を含む培地と接触させて培地中に２一ケトーＬ
−グロン酸を蓄積させ、これを採取することにより２−
ケト−Ｌ−グロン酸を製造することができる． （Ｉ）より（Ｉ［）を効率よく得るには、紫外線照射、
Ｘ線照射などの処理を施すか、Ｎ−メチル−Ｎ’一二ト
ローＮ−ニトロングアニジン（Ｎ．Ｔ．Ｇ．）、アクリ
フラピン、エチルメタンスルフオン酸などの変異誘導剤
に接触させる方法が採られる．変異処理を施した（Ｉ）
を適当な濃度に希釈するか、再度培養後適当な濃度に希
釈し、希釈液の１部（０．５〜１ｍｌ）を０．５〜２％
のＤ−グルコン酸を含む最少寒天培地（生育に必要なビ
タミン、微量元素を含む）に塗布し生育させる．生育し
た菌の集落を０．５〜２％の５一ケトーＤ一グルフン酸
を含む最少寒天培地に転写し（レプノカ法）、５−ケト
−Ｄ−グルコン酸培地に生育しない集落を選択する．選
択された変異株は５ーケトーＤ−グルコン酸の代謝活性
を失っているかもしくは親株（Ｉ）のＩ／，。以下に低
下している（この様にして得られた変異株を５一ケトー
Ｄーグルフン酸代謝欠損変異株（Ｉ）と称する）．（ｎ
）を培養し２．５−ジケトーＤ−グルコン酸と接触させ
たところ得られたすべての（Ｉｆ）は２一ケトーＤ−グ
ルコン酸を実質的に生成することなく２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸を生成することが確認された．上記の方法で得ら
れた（ＩＩ）の例として、（Ｉ）であるコリネバクテリ
ウム・スピーシーズ（　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｓｐ．　　Ｆ　Ｅ　Ｒ　Ｍ　−　Ｐ　　２７７０、
ＡＴＣＣ　　Ｎｏ．３１０９０）の変異株（微工研条寄
ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０８）や、（Ｉ）であるコリネバク
テリウム・スピーシーズ（　Ｃｏｒｙｎａｂａｃｔ．ｅ
ｒｉｕｍ　ｓｐ．　　Ｆ　Ｅ　ＲＭ　−　Ｐ　　２　６
　８７、ＡＴＣＣ　　Ｎｏ．３１０８１）の変異株（微
工研条寄ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０７）などがあげられる． （以下余白） 上記の事実、すなわち、５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝
能を欠損させることによって２一ケトーＤ−グルコン酸
産生能を欠損あるいは著しく弱化させ得た事実は、フリ
ネフォーム．グループ（パージーズ●マニュアル●才プ
●デタミナティブ・バクテリ才ロジー　第８版の定義に
よる）に属するすべての２一ケトーＬ−グロン酸生産菌
に関して共通のことである． （Ｉ［）の培養にあたって使用される培地としては特別
な制限はない．たとえば、炭素源としてはグルフース、
シュークロース、グリセリン、廃糖蜜など糖類や多価ア
ルコールを使用し、窒素源としては一般的に用いられる
窒素化合物、たとえば、コーン・スティーブ・リカー、
ペブトン、肉エキスやアンモニウム塩、硝酸塩などが使
用される．無機塩類（たとえばカルシウム、マグネシウ
ム、カリウム、亜鉛、マンガン、鉄などの塩ＩＩ）や目
的物質の生成を促進する因子などを添加してもよい．培
地組或は、用いる菌株の特性や原料２，５−ジケトーＤ
−グルコン酸の使用量やその他の条件により異なる． 原料の２．５−ジケトーＤ−グルコン酸としては、２．
５−ジケトーＤ−グルコン酸塩の水溶液を用いることも
出来るし、あるいは、エルウイニア属、グルフノバクタ
ー属（ここに言うグルコノバクター属とは、バージーズ
・マニュアル・才ブ・デタミナテイブ・バクテリオロジ
ー　第８版に準拠するもので同第７版に於けるアセトバ
クター属、アセトモナス属、グルフノバクター属を含む
）に属する、Ｄ−グルコースより２．５−ジケト−Ｄ−
グルコン酸を生産する能力を有する微生物を培養して得
られる発酵液の濾過除菌液あるいは、薬剤（例えばドデ
シル硫酸ナトリウム）による殺菌処理液を用いることも
出来る． ２．５−ジケトーＤ−グルコン酸の添加条件は、菌株や
培地条件により異なるが、普通１〜１０％の２．５−ジ
ケトーＤ−グルコン酸を１度にあるいは、少量ずつ間欠
的に添加する．２．５−ジケトーＤ−グルコン酸の添加
時期は、培養開始時に添加するかもしくは、菌の生育が
終了する前後１０時間以内に添加することが望ましい． 培養時間は、原料の２．５−ジケトーＤ−グルコン酸の
添加条件により異なるが、普通２，５一ジケトーＤ−グ
ルコン酸添加後２４時間〜９６時間培養し、２．５−ジ
ケトーＤ−グルコン酸が消失した時点を培養の終点とす
る． 発酵液中の２一ケトーＬ−グロン酸、２−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸や２．５−ジケトーＤ−グルコン酸は、一般的
な糖類及びその関連物質を分析する手段により分離、定
量し得る．たとえば、ガスクロマトグラフィー、ペーパ
ークロマトグラフイー、薄層クロマトグラフイ一などが
用いられる．これらは、その目的に応じて種々使い分け
られる． 以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明する． 束』１腹一」２（２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造）互一
里亙迩 Ｄ−グルフース　　　　　　　　　　　　１．０％バク
ト・イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ）　０．５％
バクト・ベプトン（Ｄｉｆｃｏ）　　　　　　　　０．
　５％第１リン酸カリウム（ＫＨ．ＰＯ．）　　　　　
　　０．１％硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯｖ７Ｈ１０）
　　　　　０．　０２％（Ｉ０％ＮａＯＨにてｐＨ７　
〜７．２に調整し５００ｍｌ容三角フラスコに５０ｍｌ
宛分注し１１５℃、２０分間滅菌する．） 且一生亙１亙１ Ｄ−グルフース　　　　　　　　　　　　１，０％フー
ン・スティープ・リカ−（ＣＳＬ）　　　　３．０％ｘ
ｕ＊ｐｏａ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ．１
％ＭｇＳＯｖ７Ｈ＊Ｏ　　　　　　　　　　　　　　Ｏ
．　０２％（Ｉ０％ＮａＯＨにてｐＨ７　〜７．２に調
整し５００ｍｌ容三角フラスコに５０ｍｌ宛分注し１１
５℃、２０分間滅菌する．） 粉末の２．５−ジケトーＤ−グルコン酸カルシウムを５
．０％の水溶液にし、この水溶液を予め滅菌された濾過
器で濾過除菌する． （旬　２，５−ジケトーＤ−グルコン エルウィニア・ブンクタータ（ＦＥＲＭ−Ｐ５４５２、
ＡＴＣＣ　　Ｎｏ．３１６２６）を、種培地（Ｉ％Ｄ−
グルフース、５％ＣＳＬ，０．１％ＫＨ．ＰＯい０．０
２％ＭｇＳＯａ　４Ｈ＊Ｏ−　０　．　５％炭酸カルシ
ウム（　ＣａＣＯｓ　）、ｐＨ６．８　〜７．０、５０
０ｍｌ三角フラスコに５０ｍ１分注、１１５℃、２０分
間滅菌）に１白金耳植菌し２８℃で８〜１１時間振盪培
養する．（振幅７　１　ｍＩＩＩ，　２　７　０　ｒ．
ｐ．ｍ．、以下同じ）．この種培養液４５ｍｌを４５５
ｍｌの２．５−ジケトーＤ−グルコン酸発酵培地（２０
％Ｄ−グルコース、３％ＣＳＬ，０．１％ＫＨｍＰＯ．
、６．３％（ａｃｏｓ、ｐＨ６．８　〜７．０、１１５
℃、２０分間滅菌）に加えて予め滅菌された１２発酵檀
で２８℃、１７〜３０時間、６　０　０　Ｎｍｌ／分の
通気下で１　７　４　Ｏｒ．ｐ．ｍ．の攪拌を行ないな
がら発酵する．（２．５−ジケトーＤ−グルコン酸１９
ｗ／ｖ％）．この発酵液を遠心分離機で菌体を除去し、
その上清を予め滅菌された濾過器で濾過除菌する．これ
を２，５−ジケトーＤ−グルコン酸発酵液とする． 畳一ｊ目Ｌ友迭 ２−ケト−Ｌ−グロン酸、２−ケト−Ｄ−グルコン酸の
定量は、ガスクロマトグラフィー及びペーパークロマト
グラフィーを使用する．ガスクロマトグラフィーの実施
条件 カラム：シリコンガム　ＳＥ５２（５％）キャリアーガ
ス：ヘリウム カラムの温度＝１６０℃〜２１０℃ サンプル：トリメチルシリル化 ペーパークロマトグラフィーの実施条件担体：東洋濾紙
Ｎｏ．５０ 展開液：フェノール：ギ酸二水−７５：４：２Ｓ 発色：ＡＨＦ＃液（７二’Ｊン０．９３ｇと：ｙタール
酸１．６　６　ｇを水飽和ｎ−ブタノール１００ｍｌに
溶解したもの）を噴霧、１０５℃で２分間想理して発色
さ せる． （６）２−ケト−Ｌ−グロン　の　造 第１表に掲げる２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株あるい
は、５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株を■の種
培地に１白金耳植菌し、２８゜Ｃで２４時間振盪培養し
たのち、この種培養液、５ｍｌを（力の本発酵培地に植
菌し振盪培養した．この本発酵培地に対し２．５−ジケ
トーＤ−グルコン酸液（ａ３）あるいは（ω）を培養開
始時又は培養開始後１６時間で最終濃度が２％になるよ
うに添加し、４．８時間培養した．得られた培養液を（
勃のガスクロマトグラフィーで２一ケトーＬ−グロン酸
及び２−ケト−Ｄ−グルコン酸を定量し、第２表の結果
を得た．５−ケト−ｐ−グルコン酸代謝欠損変異株（Ｉ
）の培養液からは、２−ケト−Ｄ−グルコン酸は検出さ
れなかった．さらにフェノール：ギ酸：水−７５：４：
２５を使用して、ペーパークロマトグラフィーを行ない
、２一ケトーＤ−グルコン酸の検出を行なったが、５−
ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株（Ｉ［）の培養液
から２−ケト−Ｄ−グルコン酸は検出されなかった． （Ｑｔ下余白） 家』聖４　　２（変異微生物（Ｉ［）の誘導）竺一鬼生
亙羞 バクト・ビーフエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ）　　１．
０％バクト・ペブトン（Ｄｉｆｃｏ）　　　　　　　　
１．０％ＮａＣ１　　　　　　　　　　　　　　　　　
０．　５％（ｐＨ７．２、５　ｏａｔ／　５　０　０ｍ
ｌ容三角フラスコ、１１５℃、２０分間滅菌） 且一豆之患工亙ｌ Ｎ｝Ｉ．ＣＬ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ．
５％ＮＨ，Ｎｏ．　　　　　　　　　　　　　　　　　
０．１％Ｎａ＊ｓｏａ　　　　　　　　　　　　　　　
　　０．２％１１ｇＳＯ４・７Ｈ，Ｏ　　　　　　　　
　　　　　　Ｏ．Ｌ％ＣａＣＯ．　　　　　　　　　　
　　　　　０．　０００１％ＫＨ．Ｐ０．　　　　　　
　　　　　　　　　　　０．３％Ｌｕｐｏａ　　　　　
　　　　　　　　　　　０．ＩＮ微量元素液（注１）　
　　　　　　　　　０．Ｌ角ビタミン液（注２）　　　
　　　　　　　　０．１角寒天　　　　　　　　　　　
　　　　　　２．　０５１１（ｐＨ７．２，１　１　５
℃、１５分間滅菌）（注ｌ）微量元素液（ＩＮ中次の成
分を含む：ＮａＪａＯｙ’ｌＯＨ１０　　　　　　　　
　　　　　　　　８８ｍｇ（ＮＨａ　’）＊ＭＯｔＯｓ
　１４｝１ｔｏ　　　　　　　　　　　　３７■ＦａＣ
１１６ＨａＯ　　　　　　　　　　　　　　　　　９７
０ｍｌ＜ＺｎＳＯ４４Ｈ＊０　　　　　　　　　　　　
　　　　　８．８ａ＠ＣｕＳＯｖ５Ｈ．０　　　　　　
　　　　　　　　　　　２７０ｇＭｔｌＣ１１４ＨｓＯ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　７２■（注２）
ビタミン液（ＩＮ中次の成分を含む）チアミン　　　　
　　　　　　　　　１．０＠バントテン酸　　　　　　
　　　　　　１０ｍｇニコチン酸アミド　　　　　　　
　　ＬＯｍｇビ才チン　　　　　　　　　　　　　０．
　１＋Ｉ＠ｐ−グルコン酸ナトリウム、５−ケト−Ｄ−
グルコン酸ナトリウムを各々１０％水溶液にしｐＨを６
．８〜７．２であることを確認後、濾過滅菌して調製し
た． 生−１』りＬ盈迭 コリネバクテリウム・スピーシーズ（　Ｃｏｒｙｎｅ−
ｂａｃｔａｒｉｕｍ　ｓｐ．　Ｆ　Ｅ　ＲＭ　−　Ｐ　
　２　７　７　０　）あるいは、コリネバクテリウム・
スピーシーズ（　Ｃｏｒｙｎａｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓ
ｐ．　Ｆ　Ｅ　ＲＭ　−　Ｐ　　２　６　８　７　）を
各々（Ｉ）の液体培地に１白金耳植菌し、２８℃、８時
間振盪培養した．之に予め無菌濾過された０．２％のＮ
−メチルーＮ゛−ニトローＮ−ニトロングアニジン溶液
を最終濃度０．０２％になるように加え３０分間培養を
ａｍし、遠心分１！！（　１　０．０　０Ｏ　ｒ．ｐ．
ｍ．　１　５分）したのち菌体を集め、３回無菌生理食
塩水で洗菌し、無菌生理食塩水１０ｍｌに懸濁させた．
この懸濁液１ｍｌを（Ｉ）の培地に植菌し１５時間、２
８°Ｃで振盪培養した．この培養液を無菌生理食塩水で
生菌が１０１〜１０”個／ｍｌになるように希釈した．
次にこの希釈液を■のＤ−グルコン酸水溶液と■の最少
寒天培地を１：９に加えた平板培地に０．５〜ｌｍｌ塗
布し３〜５日間２８℃で培養した． 生育した菌（第３表のＤ−グルコン酸培地に生育する株
■）の集落を■の５一ケトーＤ−グルコン酸水溶液と■
の最少培地をｌ：９に加えた平板培地にビロード布等で
レプリカした．これを３〜５日間培養したのち先のＤ−
グルコン酸培地に生育するが５−ケト−Ｄ−グルコン酸
培地に生育しない菌の集落をＤ−グルコン酸培地に釣菌
したうえ生育させた． この選択された変異株（第３表の５一ケトーＤーグルコ
ン酸培地に非生育の株■）を５一ケトーＤ−グルコン酸
１％を含む■の培地に植菌し２４時間２８℃で振盪培養
した．この培養液を実施例１で記載したペーパークロマ
トグラフィーにて５一ケトーＤ−グルコン酸を定量しこ
の菌株■が５−ケト−Ｄ−グルコン酸を資化していない
ことを確認した． この５−ケト−Ｄ−グルコン酸を資化していないことを
確認された変異株（第３表の５一ケトーＤ−グルコン酸
非資化株■）を、実施例１、（つ記載の培地に１白金耳
植菌し２０時間培養後、実施例１、（３）記載の２．５
−ジケトーＤ−グルコン酸カルシウム水溶液を最終濃度
１．０％になるように加え、さらに２４時間培養した．
この培養液をペーパークロマトグラフィーによって含有
２−ケト−Ｄ−グルコン酸および２−ケト−Ｌ−グロン
酸を定量し第３表の結果を得た．このようにしてコリネ
バクテリウム・スピーシーズ（ＦＥＲＭ一Ｐ　　２７７
０）を変異処理し生育させた８４５２０株より５−ケト
−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株３０８株、コリネバク
テリウム・スピーシーズ（ＦＥＲＭ−Ｐ　　２８８７）
の変異処理株２９１００株より１１株の５一ケトーＤ−
グルコン酸代謝欠損変異株を得た． （以下余白） 東』４匹』−（菌体懸濁液および抽出液による２−ケト
−Ｌ−グロン酸の生成） 且里亙１： 実施例１、■の種培地に、コリネバクテリウムｓｐ．Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ　　２７７０（Ｉ）あるいは、その菌株より
誘導した変異株ＦＥＲＭ−ＢＰ　　１０８（Ｉｔ）をそ
れぞれ、１白金耳ずつ植菌し、２８゜Ｃで２４時間振盪
培養した． 屯生亙１： 実施例１、■の培地（ただし、消泡剤としてポリプロピ
レングリコールＰ−２０００を０．０　１％含有する）
５００ｍｌを滅菌済１２容発酵檀に入れ、（Ｉ）で得た
種培養液５０ｍｌを植菌し、１７４０ｒ．　ｐ．　ｍ．
の攬拌、６　０　０　Ｎｍｌ／分の通気下に、２８℃、
１６時間の培養を行なった． Ｏ〉菌　　．　　　の　　　： （ので得た培養液を遠心分離（　１　５．０　０　Ｏ　
ｒ．ｐ．ｍ．．２０分）して菌体をあつめ、生理食塩水
で２回洗浄した． この洗菌済菌体を、０．０５Ｍトリス・バッツ？一（ｐ
Ｈ７．５）にＯＤ．■．−１２となるように懸濁した． 蜆（Ｉ１ロ■動ユ脛型： 上記■で得た洗菌済菌体を、０．０５Ｍトリス●バッフ
ァ一（ｐＨ７．８）に、ＯＤ．●＠．．−　１　０　０
となるように懸濁し、これをフレンチ・プレス（圧力：
　１　０　０　０ｋｇ／ａｍ″）にかけ菌体を破砕した
．この破砕から遠心分離（２０，ＯＯＯＧ、３０分間）
によって菌体（菌体および破片）を除去したのち、上澄
液を，０．０５Ｍトリス・バツファ−（ｐＨ７．５）に
対して透析（Ｉ５時間）し、これを菌体抽出液とした． ■　　　■による２−ケト−Ｌ−グロン　の感 懸濁液■８ｍｌを２．５−ジケトーｐ−グルコン酸カル
シウム溶液（実施例１０）によって調製したもの）２ｍ
ｌと混合し、この混合物を３０℃で１５時間振盪反応さ
せた．反応完了後、遠心分離（Ｉｓ．ｏｏｏｃ、１５分
間）によって、菌体を除去し、上澄液中の２一ケトーＬ
−グロン酸および２−ケト−Ｄ−グルコン酸を実施例１
（Ｅｌ項に記載のガスクロマトグラフィによって定量し
、次の第４表に示す結果を得た． 第４表 感 抽出液（４）　０　．　５　ｍｌを、７　５　μｍｏｌ
ｅｓの２．５−ジケトーＤ−グルコン酸カルシウムおよ
び１５μ船ｌａｓのＮＡＤＰＨ（還元型二フチンアミド
　アデニン　ジヌクレ才チド燐酸）を含む２　．　５　
ｍｌの０．１Ｍトリスバッファ−（ｐＨ７．５）に加え
、これを３０℃で１６時間反応させた．この反応液の定
量結果を次の第５表に示す． 第５表 上記第４および第５表に示した結果から、菌体懸瀾液■
および菌体抽出液（勾を用いた反応によって２一ケトー
Ｌ−グロン酸が生或することが確認された．

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）コリネバクテリウム属に属する２−ケトＬ−グロン
   酸生産菌株（ I ）を親株として、これより誘導したこ
   とを特徴とする５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異
   株（II）。２）２−ケト−Ｄ−グルコン酸を実質上生産
   しない特許請求の範囲１）に記載の変異株（II）。 ３）特許請求の範囲１）に記載のコリネバクテリウム・
   スピーシーズＦＥＲＭＢＰ−１０７。 ４）特許請求の範囲１）に記載のコリネバクテリウム・
   スピーシーズＦＥＲＭＢＰ−１０８。