JPH0463594A - 成長ホルモンレセプターのホルモン結合領域蛋白の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ 本発明は成長ホルモンレセプターのホルモン結合領域蛋
白のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含有する改良発
現ベクター、該ベクターを用いた成長ホルモンレセプタ
ーのホルモン結合領域蛋白の製造に関するものである。

本発明は、組換えＤＮＡ技術により、効率よく成長ホル
モンレセプターのホルモン結合領域蛋白を生産する手段
および方法を提供するものである。

本発明を利用すれば、成長ホルモン結合領域蛋白を構成
しているアミノ酸やペプチドを任意に交換することで、
成長ホルモンとの結合が増強されたヒト由来の、あるい
はその他の哺乳動物の改良された成長ホルモンレセプタ
ーを製造することができる。これに加え、さらには、改
良成長ホルモンの製造研究を行うこともできる。本発明
方法により製造された成長ホルモンレセプターのホルモ
ン結合領域蛋白を臨床的に投与した場合には、該蛋白は
、生体内の成長ホルモンレセプターと拮抗することによ
って、成長ホルモンの働きを阻害する可能性かある。こ
れは巨人症や末端肥大症のような成長ホルモンの何らか
の異常に帰因する疾病の治療に役立ちうる可能性かある
。また、該蛋白を動物へ投与することにより、小型の動
物を作成しつる可能性かある。

［従来技術と発明か解決する課題］ 成長ホルモンレセプター遺伝子の相補Ｄ　Ｎ　Ａ　＋；
ｉ、Ｌ　ｅｕｎｇらによりヒトおよびウサキに於いてク
ローニングされ、そのホルモン結合領域蛋白については
、ヒト由来のものか動物細胞を用いて発現されている［
Ｎａｔｕｒｅ、　　３３０．　５３７　５４３（１９８
７）］。さらに最近では、Ｆｕｈら［Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈ
ｅｍ、　　２６５．３１１１−３］１５（１９９０）］
により犬腸閉を用いての発現かなされている。

しかしなから、動物細胞を用いるものはその発現量か極
めて低く、製造に堪えうるちのではない。

また、動物細胞での発現か生体内のレセプターの生合成
条件に極めて類似しているのに比へ、大腸菌ての発現は
、糖鎖の付加か起こらないなど、その発現産物は天然の
ものと異なっていると考えられる。しかもＦｕｈらの発
現産物は培養液あたり１０〜２０ｒｎ／（ｌであるか、
菌体の主な産生物とは言いかたい。従って精製において
は、非常に有効と考えられるヒト成長ホルモンアフィニ
ティーカラムを使用しても、なおも多くの不純物か見い
出され、その精製は極めて困難である。さらに、同レセ
プターの変異体の場合には、上記のアフィニティーカラ
ムが使用出来ない可能性もあり、精製の困難さは更に大
きくなろう。

［課題を解決するための手段］ 本発明者は、成長ホルモンレセプターのホルモン結合領
域をコードする遺伝子を発現するにあたり、昆虫由来の
ウィルス、ノ＼キュロウイルスをベクターとして用い、
昆虫由来の細胞を宿主として用いた。その結果として、
目的産物を効率よく分泌生産することに成功し、本発明
を完成した。

［詳細な説明］ 本発明は遺伝子操作の手法を用いて成長ホルモンレセプ
ターのホルモン結合領域蛋白を製造するためのものであ
り、同領域を暗号化しているＤＮＡ断片を、バキュロウ
ィルス由来の遺伝子制御系に組み込んたプラスミツト、
該ＤＮＡをやはりこの遺伝子制御系のもとに組み込んで
ある組換え型バキュロウィルスベクター、および、間組
換え型ウィルスベクターを用い、昆虫細胞を宿主とする
成長ホルモンレセプターのホルモン結合領域蛋白の製造
方法を提供するものである。

本発明において、成長ホルモンレセプターという用語は
ヒトを含む天然のあらゆる吐乳動物起源の成長ホルモン
レセプターを意味すると共に、遺伝子操作により作られ
るそれら天然の成長ホルモンレセプターの変異体も含ま
れるものとする。

成長ホルモンレセプターのホルモン結合部分を暗号化す
るＤＮＡ断片としては、すでに知られている天然のヒト
成長ホルモンレセプターのアミノ酸配列（Ｌ　ｅｕｎｇ
ら（＋９８７）、Ｎａｔｕｒｅ、　３３０．５３７−５
４３）を暗号化するＤＮＡを用いればよく、本実施例に
おいてもそれの合成りＮＡを用いている。しかしなから
必ずしもそれらに制約されるものではない。この目的部
分を暗号化するＤＮＡ断片に、細胞外への分泌産生のた
めに、シグナルペプチト部分も含めておけば、作られた
成長ホルモンのホルモン結合部分は、細胞外へ分泌生産
される。また、この状態では細胞内にも成長ホルモンの
ホルモン結合部分か蓄積する。

この成長ホルモンレセプターのホルモン結合部分を暗号
化するｌ）　Ｎ　Ａ断片を、昆虫細胞を宿主として発現
させるためには、あらかじめ、このＤＮＡ断片を）ｋｌ
ｌ壬子現系と連結しておく必要かある。

昆虫細胞の遺伝子発現系としては、昆虫を宿主とするバ
キュロウィルスの一種である核多角体病ウィルス（Ｎ　
ｕｃｌｅａｒ　Ｐｏ１ｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ
　：　Ｎ　Ｐ　Ｖ　）の発現系が知られており、Ａ　ｕ
ｔｏｇｒａｐｈａ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　Ｎ　Ｐ　
Ｖ　（ＡｃＮ　Ｐ　Ｖ）とＢｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉＮ　
Ｐ　Ｖ　（ＢｍＮＰＶ）の２種類がある。宿主としては
、ＡｃＮｐｖの場合は夜盗蛾由来の細胞（Ｓ　ｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ　ｒｒｕｇｉｐｅｒｄａ　：　Ｓ　、　ｆ、
細胞）、ＢｍＮＰＶの場合は、蚕蛾由来の細胞（Ｂｏｔ
ｎｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ　：　８ｍＮ細胞）を用いる。

両バキュロウィルスは、ともに多角体遺伝子を含み、そ
れは強い多角体プロモーターの支配下にある。従ってこ
れらのウィルスベクターを用いて発現させる場合には、
この多角体プロモーターの下流に所望の遺伝子を挿入し
た組換え型バキュロウィルスを調製し、これを宿主細胞
に感染させた後培養し、目的とする蛋白質を発現させる
。この発現ウィルスベクターの調製に際しては、このウ
ィルスが約１３０キロ塩基対と大きいため、それに直接
目的とする遺伝子を挿入することか出来ない。そこで、
実際の手順としては、まず、遺伝子発現制御領域、つま
り多角体プロモーターを含む多角体遺伝子部分のみを切
り出し、これを大腸菌を宿主とするベクター、例えばｐ
Ｕｃ８に挿入し、次いで目的とする遺伝子を多角体プロ
モーターの下流へ挿入する。続いてこのベクターＤＮＡ
を、野生型バキュロウィルスＤＮＡと共に昆虫細胞に同
時に移入して培養し、昆虫細胞中で、細胞内ＤＮＡ組換
えをおこさせることで組換え型バキュロウィルスを得る
。さらに得られた組換え型／　ｓｊキュロウイルスを幼
虫に感染させ、幼虫より目的物を抽出する方法もある。

本発明においては、ＡｃＮＰ■ベクター系を用い、Ｓ、
ｒ細胞へ感染し、培養後目的物を培養液および細胞より
抽出する方法について述べているか、本発明はこれに限
定されるものではない。大腸菌を用いての遺伝操作法は
、代書（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）、Ｍｏ１ｅｕ
ｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）１ａｒ
ｂｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ）など最近の多くの実
験書に詳述されている。バキュロウィルスおよびその宿
主を用いての実験に関しては、代書［Ｓ　ｕｍｍｅｒｓ
とＳｍ１ｔｈ（１９８７）＋　Ａ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ
　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　
ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　１ｎｓｅｃｔ　ｃｅｌｌ　ｃ
ｕｌｔｕｒｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、、Ｔｅｘａｓ　
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５
ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５．
　ＴｅｘａｓＡ＆ＭＵ　ｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ］あるいは
［前出（１９８９）、実験医学、７巻、１４６−１５１
頁］にその手技について詳しい記述がなされている。

組換え型バキュロウィルスを感染させた宿主細胞の培養
は、公知の培地、例えばブレース昆虫細胞用培養培地（
キブコ社、Ｇｒａｃｅ’ｓ　ｌ　ｎ５ｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ）に１０％になるよう
に牛胎児血清を加えたもので行うことか出来る。得られ
た培養液から細胞を除いた後、成長ホルモンをリガンド
としたアフィニティーカラムクロマトグラフィーにかけ
ることにより、純粋な成長ホルモンレセプターのホルモ
ン結合領域ペプチドを得ることか出来る。アフィニティ
ーカラムはＳ　ｐｅｎｃｅｒら（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６３．７８６２　７８６７（
１９８８））の方法により作成することか出来る。得ら
れた発現産物は、挿入したＤＮＡかコードするアミノ酸
配列から予測される分子量より大きい。

これは、産物への糖鎖の付加を示すものである。

事実、これは蛋白質に結合した糖鎖をはずす酵素である
グリカナーゼの処理により予測される分子量と一致する
ようになるものである。培養に際しては、血清を含まな
い培地としてイーエフスルセル４００（Ｊ　Ｒ５ｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ社、ＥＸ−Ｃ，ＥＬＬ４００）を用いても
同じように成長ホルモンレセプターのホルモン結合領域
ペプチドを得ることが出来る。また、培養された細胞を
回収し、ホモンナイザーで破砕することにより、さらに
該ペプチドを回収することか出来る。

Ｕ発明の効果］ 以上述へたように、本発明は昆虫細胞を宿主とした成長
ホルモンレセプターホルモン結合領域ペプチドの分泌生
産系を新しく確立したものである。

この系を用いれば、従来の動物細胞に比へてはるかに大
量の純粋なペプチドを得ることか出来る。

大腸菌を用いることに比へても、天然に近い状態のペプ
チドが得られる効果かあるばかりでなく、より容易に純
粋な標品を得ることか出来る。

実施例１　　ｐＡ　ｃＹ　ＭｈＧ　ＨＲプラスミツドの
構築ＡｃＮＰＶの多角体タンパク質をコードする部分を
含むｐＡｃＹＭｌ（松浦らＪ　、ｇｅｎ、　Ｖ　１ｒｏ
１．　（１９８７）、６８．１２３３−１２５０）の多
角体プロモーター下流にヒト成長ホルモンレセプターホ
ルモン結合領域（ｈＧ　ＨＲと以下略す）をコードする
ＤＮＡを挿入する。

ｈＧＨＲをコードするＤＮＡとしては、本発明者らの特
許願（特願平０ｌ−０２０１８２）（ヒト成長ホルモン
レセプターのホルモン結合領域のアミノ酸配列をコード
している合成遺伝子、平成１年１月３０日）に記載され
ているプラスミツド、ｐＵＳＲに組み込まれているｈＧ
ＨＲＤＮＡのＣ末端から、３アミノ酸に相当する塩基配
列を欠失させ、さらにｐＡｃＹＭＩに組み込みやすいよ
うに制限酵素認識部位に若干の変更を加えたものを使用
した。その概略は第１図に示されている。まずｐＵＳＲ
から制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ、５ａｌＩ消化により、ｈＧ
ＨＲＤＮＡの断片を切り出す。続いて同断片を、やはり
ＨｉｎｄＩＩＩ、５ａｌｔ消化したプラスミツドｐＨ３
Ｖ８　　ＤＮＡと混合し、Ｔ４リガーセ処理し、大腸菌
Ｊ　Ｍ　Ｉ　Ｏ５［Ｙ　ａｎｉｓｃｈ　−Ｐ　ｅｒｒｏ
ｎら、Ｇｅｎｅ、３３，１０３　１１９（１９８５）］
に導入し、プラスミツドｐＨＳ　Ｒ８を作成した。ｐＨ
Ｓ　Ｖ　８とは、当技術分野で広く使われているプラス
ミツドｐＵｃ１１８（タカラ社より購入出来る）の制限
酵素部位に若干の変更を加えたプラスミツドである（ｐ
Ｕｃ１１８のＢｂｅ１部位をクレノー酵素処理により除
き、ざらにＥｃｏＲ１部位とＸｂａ１部位の間を欠失さ
せている）。続いてプラスミツドｐＨ５Ｒ８上のＢｇｌ
ＩＩ酵素の認識部位を下流へ移動させるために、該プラ
スミツドをＢｇｌＩＩ、５ａｌｌ消化して大きなりＮＡ
断片を切り出した。一方において、Ｂｇ１１１部位と５
ａｌ１部位の間に挿入するＤＮＡ断片として、第１図お
よび第２図に記載の合成オリゴヌクレオチドＵ　Ｉ　４
−ＢＡＣＳＬ　１４−ＢＡＣ。

Ｕ１５、Ｌｉ２、Ｕ１６−３ＢＧＬＳＬ１６−３ＢＧＬ
の各ＤＮＡ断片をＴ４リガーゼ処理により結合させたも
のを用いた。両方のＤＮＡを混合し、Ｔ４’Ｊガーゼ処
理、大腸菌ＪＭ１０５への移入によりプラスミツドｐＢ
Ｒ３８−３を作成した。第２図に示したこのＤＮＡ末端
（そのＮ末端は、ＢｇＩＩＩ酵素切断部位と対含塩基を
形成する）を挿入するとＢｇｌＩＩ酵素認識部位は消失
する。一方において消失したＢｇｌｌｌ制限酵素認識部
位は終結コドンの下流に移動するよう設計されている。

また、この場合はさらにｐＵｓＲのｈＧ　ＨＲのＤＮＡ
断片に比へて、ｈＧＨＲのＣ末端のフェニルアラニン、
プロリン、トリプトファンの３アミノ酸カ欠失スる形、
つまり３アミノ酸欠失型で設計されているものを使って
いる（第２図）。目的とするＤＮＡ配列か得られている
かとうかは、ＤＮＡシークエンス法で確認した。この実
施例を念めて、本発明におけるオリゴヌクレオチドの合
成は全て、アプライドバイオシステム社（モデル３８１
Ａ）のＤＮＡ合成機を用いて行なった。

こうしてｐＢＳＲ８−３に挿入したｈＧＨＲ（３アミノ
酸欠失型）ＤＮＡの、ｐＡｃＹＭｌへの挿入の概略は、
第３図に示されている。まずｐＡｃＹＭｌは、ＢａｍＨ
Ｉ酵素で消化し、切り出したものを用いた。ｐＢｓＲ８
−３に挿入したｈＧＨＲＤＮＡ断片は制限酵素Ｍｌｕｌ
およびＢｇｌＩＩ消化によってシグナル配列部分以外の
その大部分を切り出す。

Ｂｇ１１１部位は、その塩基配列からＢａｍＨＩ酵素で
処理したＤＮＡ断片と、対合する塩基対をつくることが
出来る。除かれてしまったそのシグナル配列部分には合
成ヌクレオチド８ｇｌｌｌサイトＵ−シグナル、Ｌ−シ
グナルを使った（第４図）。この合成ヌクレオチドは、
ｈＧＨＲのシグナル配列をコードするとともに、その開
始コドンＡＴＧの５′末端は、制限酵素ＢａｍＨＩで切
り出されたＤＮＡ断片と相捕的な塩基対をつくれるよう
に設計されている。続いてこの３つのＤＮＡ断片を混合
させＴ４リガーゼで処理して連結させ、大腸菌ＫＩ２・
ＪＭ１０５へ移入して増殖させて、プラスミツド、ｐＡ
ｃＹＭｈＧＨＲを得た。このプラスミツドを導入した大
腸菌Ｋ　１２　・ＪＭｌ　０５（ｐＡｃＹＭｈＧＨＲ）
は茨城県つくば市東１−１−３の通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されている（微工研菌寄第
１１５６４号、寄託日：平成２年６月２８日）。

実施例２　組換えウィルスＡｃｈＧＨＲの作成実施例１
で得られたプラスミツドｐＡｃＹＭｈＧＨＲＤＮＡより
組換えバキュロウィルスを作成する。それは、野生型Ａ
ｃＮＰＶ　ＤＮＡとともに、このプラスミツドＤＮＡを
塩化カルシウム−リン酸沈澱法で昆虫細胞に移入し、さ
らにそれの細胞内における組換えによりそれを作成する
ものである。その概略は第５図に示す。まず野生型バキ
ュロウィルスＡｃＮＰＶのＤＮＡＩ　μｇ（ＡｃＮＰＶ
はＭ、　Ｄ　、　Ｓ　ｕｍｍｅｒｓより入手可能。Ｄ　
ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙ、　Ｔ
ｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｅｘａｓ　Ａ＆Ｍ
　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｃ。

１１Ｃｇｅ　５ｔａｔｉｏｎ、　Ｔｅｘａｓ、　　７７
８４３　２４７５゜そのＤＮＡの抽出法は実験医学Ｖｏ
１７、Ｎｏ１３．１４６−１５１．１９８９、前出によ
る）とｐＡｃＹＭｈＧＨＲＤＮＡ沈澱物ｇ（塩化セシウ
ム密度勾配法で２回精製したものを用いる）を塩化カル
シウムを含むヘペスーリン酸緩衝液（ｐＨ７，０５）中
で、沈澱させる。一方において昆虫細胞Ｓ　ｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ９　（Ａｍｅｒｉｃｕ
ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
、　　１２３０１　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、
　　Ｒｏｃｋｖｌｌｅ、ＭＤ２０８５２　・１７７６よ
り入手可能、以下ＳＪ、９．と略す）の１０％牛脂児血
清を含むブレース培地（ギブコ社）で培養したもの（約
１〜１．５Ｘ１０’個／２ｊｌのを３５ｍｍの細胞培養
用シャーレ（ファルコン社３００１）に入れて１時間ｆ
ｔＬｉｆし、細胞を培養させておく。ついで、この細胞
上清を抜き取り、上記のＤＮＡ沈澱物を滴下し、１時間
静置する。さらに細胞上清を抜き取り、新らたに１０％
牛脂児血清を含むブレース培地を２１Ｃ加えて２６．５
９Ｃで４日間培養する。得られた培養液には、野生型Ａ
ｃＮＰＶに加えて［１的とする組換え型バキュロウィル
スＡ　ｃｈＧ　ＩＩ　Ｒか含まれている。

この培養液からＡｃｈＧＨＲを取り出すためにプラーク
アッセイを行う。まず、前記と同様に生育させたＳ、ｆ
、９細胞（１０”個／　３５　ｍｍシャーレ）の培地を
抜き取り、約４倍から１万倍に希釈した培養液０．１１
Ｉρを加える。約１時間静置後、培養液を抜き取り、１
％アガロース溶液［３％アガロース（低融点ジ−プラー
クアガロース、エフ・エムンー社）と１０％牛脂児血清
を含むブレース培地を１対２で混合し、３７°Ｃに保温
したもの］を１ｍ１重層する。アガロースの固化後、】
ｙＱの１０％牛脂児血清を含むブレース培地をさらに重
層し、２６．５℃で４日間、保温し、ウィルスプラーク
を生じさせる。生じたプラークの中で、中心が透明なも
のをピペットの先などでアガロースごとすい上げ、１ｍ
ｆｆの１０％牛脂児血清を含むブレース培地に懸濁して
単離する（野生型ウィルスはプラークの中心に白い濁り
かあり、組換え型は、透明である）。透明なプラークか
見い出しにくい時は、プラークが判別しやすいように適
当な濃度に、もとの培養液を希釈しなおして、プラーク
アッセイをやりなおす。ひろい上げた透明プラークのプ
ラーク懸濁液は、それぞれ１００倍から１０００倍程度
に希釈して、その０．２ｔＲＱを上記と同様な方法でＳ
、ｆ、９細胞に重層することでプラークアッセイを繰り
返し、他の野生型ウィルス等のプラークの混りのないも
のとする。こうして単離したものが組換え型バキュロウ
ィルスＡｃｈＧＨＲである。

実施例３　　ＡｃｈＧＨＲを用いたヒト成長ホルモンレ
セプターホルモン結合領域の分泌発現こうして得た組換
え体ウィルスＡ　ｃｈＧ　ＨＲをＳ。

ｆ、９細胞に感染させる。まず、前記と同様な方法で増
殖させたＳ、ｆ、９細胞の約１０６個を２５ｃｍ”の細
胞培養用のフラスコに移し、数日培養後（細胞は約５Ｘ
１０”個にふえている）培地を抜き取り、組換え体ウィ
ルス（約５Ｘ１０７個プラーク形成能を含む１次Ｑ溶液
）を接種する。さらに１時間の静置後、細胞上清を抜き
取り、５ｍＱのｌＯ％牛脂児血清を含むブレース培地を
加え、２６，５°Ｃて３日間培養し、培養液を回収した
。同様な操作は野生型ウィルスＡｃＮＰＶを用いても行
なった。

培養液中のｈＧＨＲ活性の測定は、Ｌ　ｅｕｎｇらの方
法［Ｎａｔｕｒｅ、３３０．５３７　５４３（１９８７
）］に若干の修正を加えて行なった。つまり９０ｍＭト
リス塩酸緩衝液、５ＱｍＭ塩化力ルンウム０１　ｔｎ／
　ｍ（ｌウシ血清アルブミン溶液中てヨード川２５枕識
したヒト成長ホルモン（タイナホット社、約３０ｔｔＣ
１／１ｔｆｌ、約４０００ｃｐｍ、以下、ヒト成長ホル
モンはｈＧＨと略す）とｈＧＨＲ画分を混合し、ｐＨは
最終的に８．２、溶液量は２００μａとなるよう調節す
る。これを−晩、室温で保温する。続いて、５０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ塩化カルシウムで
５００倍に希釈した抗ｈＧＨＲ抗体を０．０２ｍＣ添加
し、２時間室温に静置する。抗ｈＧＨＲ抗体は、Ｌ　ｅ
ｕｎｇらにより明らかにされたｈＧＨＲのアミノ酸配列
をもとに、それを若干修正したアミノ酸配列を有する３
つのペプチド（第６図）に対する抗体をウサギを用いて
作成した。この抗体はさらに抗原である。それぞれのペ
プチドを結合させたカラムで精製し、混合したものを用
いている。次に０．２２ｘ（のＯＩ％ウシγ−グロブリ
ン溶液、０．４４ｍ１２の３０％ポリエチレングリコー
ル溶液を加え、よく混合してから水平ローター、６００
０回転で遠心し、さらにアングルローターで１５，００
０回転で遠心して、上清を抜き取り、沈澱物をγ−カウ
ンター（パ・ノカード社コブラ）でカウントする。その
結果は第１表に示す。

第１表 （対称値としての感染ウィルスなしの培養液１μｇを反
応液に添加した時の値６１６ｃｐｍを差し引いている。

） この結果はＡｃｈＧＨＲウィルスを感染した場合には、
培養液に、ｈＧＨＲ活性か分泌していることか示される
。

さらに培養上清について、ラベルしたｈＧＨとともにラ
ベルしていない天然のｈＧＨ（タイナボノト社）が共存
する形で、ｈＧＨとｈＧＨＲの結合定数を求めた。その
結果は第７図に示した通りであり、スキャチアードプロ
ットより約３Ｘ１０９Ｍ１の高い結果定数が得られた。

培養液中へのｈＧＨＲの分泌産生は、ウェスタンプロッ
ト法でも検出出来る。ウェスタンプロット法は代書（続
生化学実験講座第１巻、日本生化学全編、東京化学同人
）なとに記載された方法で行うことが出来る。ここては
ノぐビオ９．フ１社のキット（［ｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ、
　　Ｇｏａｔ　　Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ　　ＩｇＧ（
Ｈ＋Ｌ）Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　
Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を使用しており、手順もそれに添
付されているものに従っている。これによると約３８キ
ロダルトンに対応する位置にｈＧＨＲのバンドか検出さ
れる。移入したＤＮＡでコードされるアミノ酸配列から
は約３２キロダルトンの大きさにｈＧＨＲか検出される
ことか予想される。これよりも大きいことは、ここで生
産されたｈＧＨＲに糖鎖か付加されていることを示唆す
るものであり、実際に糖鎖をはずす酵素、グリカナーゼ
の処理により、約３２キロダルトンにｈＧＨＲは検出さ
れるようになる。

実施例４　　ｈＧＨＲの精製 培養液中のｈＧＨＲは、ｈＧＨをリガンドとしたｈＧＨ
−アフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製出来
る。ｈＧＨ−アフィニティーカラムクロマトグラフィー
の作製法はＳ　ｐｅｎｃｅｒら［Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅ
ｍ、、　２６３．７８６２−７８６７（１９８８）］の
方法に従った。この場合にアフィニティ−カラムの担体
であるグリセリンコントロールボアグラス（シグマ社１
２０−２００メツシュ）に結合させるｈＧＨは、徳永ら
［Ｅ　ｕｒ、　Ｊ　、　Ｂ　１ｏｃｈｅＩ１１．　。

１５３．４４５−４４９（１９８５）］の方法により合
成ｈＧＨ遺伝子を大腸菌内で不溶化状態で大量に発現さ
せ、グアニジン塩酸を用いて巻きもとしたものを使用し
ている。実施例３で調製したΔｃｈＧ　ＩＩ　Ｒに感染
させた細胞培養液３ｍＱに１０ｍＭになるように塩化マ
グネシウムを加えたものを０６ｍＱのｈＧＨ−アフィニ
ティーカラムに添加する。

カラムの素通り液は、再度、カラムに添加する。

この操作をさらに一度、繰返す。その後に３０ｚ（！の
１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）でカラムを洗滌する。ｈＧＩ（Ｒ活性は、
１．２Ｍｇの４．５Ｍ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液で溶出される。ＳＤＳを含む１０％の
ポリアクリルアミド電気泳動による分析の結果は、溶出
されたタンパク質は単一標品であり、その分子量は約３
８牛ロタルトンで、先にウェスタンプロットで検出され
た分子量と完全に一致した。またＮ末端アミノ酸シーク
エンス法によると、この標品のＮ末端アミノ酸シークエ
ンスは、Ｌ　ｅｕｎｇら［Ｎａｔｕｒｅ、　　３３０．
　５３７−５４３（１９８７）］の示した／グナルベブ
チトが切断されたところの天然のｈＧＨＲのＮ末端アミ
ノ酸シークエンスに対応するものであった。以上の結果
は、精製されたタンパク質か目的とするｈＧＨＲである
ことを示すものである。単一標品としてのｈＧ　Ｉ−Ｉ
　Ｒの溶出は、８Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝
液でもなされる。

実施例５　無血清培地を用いてのｈＧＨＲの分泌発現 無血清培地によるｈＧＨＲの産生は実施例３に準じて行
われる。つまり、１０％牛脂児血清を含むブレース培地
で培養したＳ、ｆ、９細胞の約１０６個を２５ｃｍ”の
細胞培養フラスコに移し、数日培養しく細胞数は約５８
１０’個にふえている）細胞上清を抜き取り、組換えウ
ィルスＡ　ｃｈＧ　Ｉ−Ｉ　Ｒ（約５ＸｌＯ’個のプラ
ーク形成能を含む１好溶液）、を接種する。さらに１時
間静置後、細胞上清を抜き取り、５ｆｆ１２の無血清培
地イーエクスセル４００（Ｊ　ＲＳ　ｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ社、ＥＸ−ＣＥＬＬ４００）を加えて２６．５°Ｃで
３日間静置培養し、培養液を回収した。

培養液中のＩＩＣＩ（Ｒ活性は、実施例３と同様に行な
った。その結果は第２表に示す。これは、無血清培養に
おいても１０％牛脂児血清を含むブレース培地による培
養と同様にｈＧ　ｌ−Ｉ　Ｒか分泌産生されることを示
している（産生量も血清を含む場合と変らない）。

第２表 （対称値としての感染ウィルスなしの培養液１μｅを反
応液に添加した時の値６１６ｃｐｍを差し引いている。

） ウェスタンプロット法による結果も血清を含む培養液と
同様約３８キロクルトンにｈＧＩ−ＩＲか検出されこれ
を支持している。無血清培養液を直接にＳＤＳポリアク
リルアミドケルに添加して泳動し、クマシ染色した。そ
の結果としては、対応する野生型ＡｃＮＰＶ感染では存
在しない位置に蛋白質のハンドか検出された。このバン
ドは、ウェスタンプロットにより検出された位置、およ
び実施例４で精製されたｈＧＨＲの位置に対応すること
から目的とするｈＧＨＲと考えられる。

対称となる蛋白質のクマシ染色と比較したところ無血清
培地による産生量は数ｍ９／　（ｌと推定される。

こうして産生されたｈＧＨＲも実施例３と同様にｈＧＨ
−アフィニティーカラムクロマトグラフィーで単一標品
に精製出来る。

実施例６．ｈＧＨＲの細胞内発現 ｈＧｆ（Ｈの細胞内発現は実施例３に準じて行うことか
出来る。つまり実施例３と同様に組換え型ウィルスＡ　
ｃｈＧ　ＨＲをＳ、ｆ、９細胞（約５Ｘ１０６個）に感
染させ（５ｍｆ２培養液／２５ｃｍ２フラスコ）、２６
．５℃で３日間培養し、細胞を回収した。細胞は０．１
　ｍｌ　５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７゜５）、
２５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、
１０ｍＭベンゾアミド、５０，０ＯＯＫＩＵ／Ｑアブロ
テイニン溶液中でホモジナイズする。得られた抽出液は
、全体で５ｍＯになるように希釈して、実施例３の方法
で測定した。その結果は第３表に示されており、やはり
、実施例４の方（Ｊコで精：９２出来る。

第３表 （対称値としての細胞分画を添加しない時の値６１３ｃ
ｐｍを差し引いている）

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミツドｐＢＳＲ８−３の構築模式図、第
２図はプラスミツドｐＢＳＲ８−３の構築に使用される
合成オリゴヌクレオチドの配列模式図、第３図はプラス
ミツドｐＡｃＹＭｈＧＨＲの構築模式図、第４図は合成
オリコヌクレオチＮ’ＢｇｌｌｌサイトＵ−シグナル、
Ｌ−シグナルの配列模式図、第５図は組換えバキュロウ
ィルスの構築模成因、第６図は抗ｈＧＨＲ抗体作成に用
いたペプチドの配列図、第７図（ａ）はｈＧＨとｈＧＨ
Ｒと結合量を示すグラフ、第７図（ｂ）は第７図（ａ）
の結果をスキャチアードプロノトしたグラフである。 特許出願人　株式会社蛋白工学研究所 代理人弁理士青山　葆（外１名） 槙５図 ＡｃＮＰＶ　ＤＮＡ ◆ 上清 ↓ プラークア・ンセイ ＡｃｈＧ）−ＩＲ 八六−口男ルス 第 図 Ｃｙｓ−３ｅｒ　−Ｇｌｙ　−５ｅｒ−Ｇｌｕ　−Ａｌ
ａ　−Ｔｈｒ−Ａｌａ　−Ａｌａ−１１ｅ　−Ｌｃｕ−
Ｓｅｒ　−Ａｒｇ　−Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｔｒｐ　−
５ｅｔＳｅｒ　−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ　−Ｓｅｒ　−Ｖａｌ
　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｌｙｓ　−
Ｔｈｒ　−Ａｓｎ　−Ｓｅｒ　−Ｓｅｒ　−Ｌｙｓ　−
Ｇｌｕ　−Ｐｒ。 Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−ＣｙｓＣｙｓ　−１
１ｉｓ　−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ　−Ａｓｐ　−Ｇｌｕ　−Ｖ
ａｔ　−１１ｉｓ　−１１ｉｓ　−Ｇｌｙ　−Ｔｈｒ　
−Ｌｙｓ　−Ａｓｎ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｙ　−Ｐｒｏ−
１１ｅＧｉｎ−Ｌｅｕ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト成長ホルモンレセプターのホルモン結合領域蛋
   白のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ断片をバキュ
   ロウイルスの遺伝子発現系制御下に含有している組換え
   型のプラスミッド。 ２、ヒト成長ホルモンレセプターのホルモン結合領域蛋
   白のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ断片を遺伝子
   の発現系制御下に含有している組換え型バキュロウイル
   ス。 ３、請求項２記載の組換え型バキュロウイルスを昆虫細
   胞に感染して培養することからなる、ヒト成長ホルモン
   レセプターのホルモン結合領域蛋白の製造法。 ４、無血清培地中で培養することからなる請求項３に記
   載の製造法。 ５、培養後、細胞抽出液よりヒト成長ホルモンレセプタ
   ーのホルモン結合領域蛋白を回収することからなる請求
   項４に記載の製造法。