JPH0755156B2 - ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃＤＮＡ及び遺伝子及び発現方法 - Google Patents
ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃＤＮＡ及び遺伝子及び発現方法Info
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- JPH0755156B2 JPH0755156B2 JP5098330A JP9833093A JPH0755156B2 JP H0755156 B2 JPH0755156 B2 JP H0755156B2 JP 5098330 A JP5098330 A JP 5098330A JP 9833093 A JP9833093 A JP 9833093A JP H0755156 B2 JPH0755156 B2 JP H0755156B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組換えＤＮＡ技術によ
る蛋白質製造に関する。より詳しくは、本発明は、脈管
形成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列及びそ
れらの配列を発現する方法に関する。
る蛋白質製造に関する。より詳しくは、本発明は、脈管
形成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列及びそ
れらの配列を発現する方法に関する。
【０００２】背景技術 脈管形成、血管網目の発達過程は固体腫瘍の増殖に必須
であり、且つ正常の傷治癒及び増殖過程の一成分であ
る。それは又アテローム発生、関節炎及び糖尿病性網膜
症の病態生理学においても関係してきた。それは新たな
毛細血管の特定の刺戟に向けての方向付けられた増殖に
より特徴付けられる。この内皮細胞の移動により媒介さ
れる増殖は、内皮細胞有糸分裂とは独立に進行すること
がある。
であり、且つ正常の傷治癒及び増殖過程の一成分であ
る。それは又アテローム発生、関節炎及び糖尿病性網膜
症の病態生理学においても関係してきた。それは新たな
毛細血管の特定の刺戟に向けての方向付けられた増殖に
より特徴付けられる。この内皮細胞の移動により媒介さ
れる増殖は、内皮細胞有糸分裂とは独立に進行すること
がある。
【０００３】脈管形成の過程に対する原因となる分子メ
ッセンジャーが長く探索されてきた。グリーンブラット
及びシュビック(Greenblatt and Shubik) は (J. Natl.
Cancer Inst. ４１：１１１−１２４、１９６８）、腫
瘍−誘発新血管形成は核酸性物質により媒介されている
と結論した。引続き、各種の可溶性媒介物質が新血管形
成の誘発に係わってきた。これらには、プロスタグラン
ジン類［アウエルバッハ(Auerbach)、Pick and Landy編
「リンホカイン類 (Lymphokines)」、６９−８８、Acad
emic Press, New York １９８１］、ヒトウロキナーゼ
［ベルマン等 (Berman et al.)、Invest Opthalm. Vis.
Sci. ２２：１９１−１９９、１９８２］、銅［ラジュ
等(Raju et al.) 、J. Natl. Cancer Inst. ６９：１１
８３−１１８８、１９８２］及び各種「脈管形成因子」
が含まれる。
ッセンジャーが長く探索されてきた。グリーンブラット
及びシュビック(Greenblatt and Shubik) は (J. Natl.
Cancer Inst. ４１：１１１−１２４、１９６８）、腫
瘍−誘発新血管形成は核酸性物質により媒介されている
と結論した。引続き、各種の可溶性媒介物質が新血管形
成の誘発に係わってきた。これらには、プロスタグラン
ジン類［アウエルバッハ(Auerbach)、Pick and Landy編
「リンホカイン類 (Lymphokines)」、６９−８８、Acad
emic Press, New York １９８１］、ヒトウロキナーゼ
［ベルマン等 (Berman et al.)、Invest Opthalm. Vis.
Sci. ２２：１９１−１９９、１９８２］、銅［ラジュ
等(Raju et al.) 、J. Natl. Cancer Inst. ６９：１１
８３−１１８８、１９８２］及び各種「脈管形成因子」
が含まれる。
【０００４】脈管形成因子は腫瘍細胞、創傷流体［バン
ダ等(Banda et al.)、 Proc. Natl.Acad. Sci. USA７
９：７７７３−７７７７，１９８２年；バンダ等(Banda
et al.)米国特許４，５０３，０３８号明細書）及び網
膜細胞［ダモーレ(D'Amore)、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA ７８：３０６８−３０７２、１９８１年］から得ら
れてきた。腫瘍−由来の脈管形成因子は一般的に貧弱に
特徴付けられているにすぎない。フォークマン等(Folkm
an et al.)(J. Exp. Med. １３３：２７５−２８８、１
９７１年）は Walker ２５６ラット腹水腫瘍から腫瘍脈
管形成因子を単離した。この因子は毛細管内皮細胞に対
して有糸分裂誘発性であり、RNase により不活性化され
た。チュアン等(Tuan et al.)(Biochemistry１２：３１
５９−３１６５、１９７３年）は Walker ２５６腫瘍の
非ヒストン蛋白質に有糸分裂誘発性及び脈管形成活性を
見出した。活性画分は蛋白質と炭水化物の混合物であっ
た。各種動物及びヒト腫瘍は脈管形成因子を産生するこ
とが示された［フィリップス及びクマール(Phillips an
d Kumar)、Int. J. Cancer ２３：８２−８８、１９７
９年］が、しかしこれらの因子の化学的性質は決定され
なかった。 Walker ２５６腫瘍からの低分子量非蛋白質
成分も又脈管形成及び有糸分裂誘発性であることが示さ
れた［ワイス等(Weiss et al.)、Br. J. Cancer ４０：
４９３−４９６、１９７９年］。４００〜８００ダルト
ンの分子量を有する脈管形成因子がフェンスロウ等(Fen
selau et al.)(J. Biol. Chem. ２５６：９６０５−９
６１１、１９８１年）により均質になるまで精製された
が、それは更に特徴付けられなかった。ヒトの肺腫瘍細
胞が高分子量担体及び低分子量の、おそらくは非−蛋白
質、活性成分よりなる脈管形成因子を分泌することが示
された［クマール等(Kumaret al.) Int. J. Cancer ３
２：４６１−４６４、１９８３年］。バレー等(Vallee
et al.)(Experientia. ４１：１−１５、１９８５年］
はWalker２５６腫瘍からの三つの画分に関連した脈管形
成活性を見出した。トルバート等(Tolbert et al.)（米
国特許４，２２９，５３１号明細書）はヒト腺癌細胞系
統ＨＴ−２９からの脈管形成因子の産生を開示している
が、しかしこの物質は単に部分的に精製されたに過ぎ
ず、化学的に特徴付けられなかった。脈管形成因子の産
生を荷う遺伝子の単離は少なくとも部分的にこれらの因
子の純度及び特徴付けの欠乏によりこれ迄報告されてい
ない。
ダ等(Banda et al.)、 Proc. Natl.Acad. Sci. USA７
９：７７７３−７７７７，１９８２年；バンダ等(Banda
et al.)米国特許４，５０３，０３８号明細書）及び網
膜細胞［ダモーレ(D'Amore)、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA ７８：３０６８−３０７２、１９８１年］から得ら
れてきた。腫瘍−由来の脈管形成因子は一般的に貧弱に
特徴付けられているにすぎない。フォークマン等(Folkm
an et al.)(J. Exp. Med. １３３：２７５−２８８、１
９７１年）は Walker ２５６ラット腹水腫瘍から腫瘍脈
管形成因子を単離した。この因子は毛細管内皮細胞に対
して有糸分裂誘発性であり、RNase により不活性化され
た。チュアン等(Tuan et al.)(Biochemistry１２：３１
５９−３１６５、１９７３年）は Walker ２５６腫瘍の
非ヒストン蛋白質に有糸分裂誘発性及び脈管形成活性を
見出した。活性画分は蛋白質と炭水化物の混合物であっ
た。各種動物及びヒト腫瘍は脈管形成因子を産生するこ
とが示された［フィリップス及びクマール(Phillips an
d Kumar)、Int. J. Cancer ２３：８２−８８、１９７
９年］が、しかしこれらの因子の化学的性質は決定され
なかった。 Walker ２５６腫瘍からの低分子量非蛋白質
成分も又脈管形成及び有糸分裂誘発性であることが示さ
れた［ワイス等(Weiss et al.)、Br. J. Cancer ４０：
４９３−４９６、１９７９年］。４００〜８００ダルト
ンの分子量を有する脈管形成因子がフェンスロウ等(Fen
selau et al.)(J. Biol. Chem. ２５６：９６０５−９
６１１、１９８１年）により均質になるまで精製された
が、それは更に特徴付けられなかった。ヒトの肺腫瘍細
胞が高分子量担体及び低分子量の、おそらくは非−蛋白
質、活性成分よりなる脈管形成因子を分泌することが示
された［クマール等(Kumaret al.) Int. J. Cancer ３
２：４６１−４６４、１９８３年］。バレー等(Vallee
et al.)(Experientia. ４１：１−１５、１９８５年］
はWalker２５６腫瘍からの三つの画分に関連した脈管形
成活性を見出した。トルバート等(Tolbert et al.)（米
国特許４，２２９，５３１号明細書）はヒト腺癌細胞系
統ＨＴ−２９からの脈管形成因子の産生を開示している
が、しかしこの物質は単に部分的に精製されたに過ぎ
ず、化学的に特徴付けられなかった。脈管形成因子の産
生を荷う遺伝子の単離は少なくとも部分的にこれらの因
子の純度及び特徴付けの欠乏によりこれ迄報告されてい
ない。
【０００５】脈管形成因子の単離は、高性能液体クロマ
トグラフィー［バンダ等(Banda etal.)、前記］；溶媒
抽出［前記フォークマン(Folkman) 等］；シリカゲル上
クロマトグラフィー［前記フェンスロウ(Fenselau)等］
ＤＥＡＥセルロース［前期ワイス(Weiss) 等］或いはSe
phadex［前記チュアン(Tuan)等］及びアフィニティクロ
マトグラフィー［前記ワイス(Weiss) 等］を用いてき
た。
トグラフィー［バンダ等(Banda etal.)、前記］；溶媒
抽出［前記フォークマン(Folkman) 等］；シリカゲル上
クロマトグラフィー［前記フェンスロウ(Fenselau)等］
ＤＥＡＥセルロース［前期ワイス(Weiss) 等］或いはSe
phadex［前記チュアン(Tuan)等］及びアフィニティクロ
マトグラフィー［前記ワイス(Weiss) 等］を用いてき
た。
【０００６】最近、バレー(Vallee)等（米国特許出願 S
erial No. ７２４，０８８、１９８５年４月１７日出願
及び本出願と同時に出願したＵＳＳＮ 、これ
らの両者は本発明において準用する）はヒト腺癌細胞系
統からの脈管形成蛋白質を精製した。このアンギオゲニ
ンとして知られる精製蛋白質は化学的に特徴付けられ、
及びそのアミノ酸配列が決定された。
erial No. ７２４，０８８、１９８５年４月１７日出願
及び本出願と同時に出願したＵＳＳＮ 、これ
らの両者は本発明において準用する）はヒト腺癌細胞系
統からの脈管形成蛋白質を精製した。このアンギオゲニ
ンとして知られる精製蛋白質は化学的に特徴付けられ、
及びそのアミノ酸配列が決定された。
【０００７】脈管形成因子は傷の治癒において重要な役
割を果し［レチュラ等(Rettura etal.) FASEB Abstract
＃４３０９、第６１回 Annual Meeting 、シカゴ１９
７７年］、又、悪性のスクリーニング試験の開発におい
て応用を有するので［クラグスバーン等(Klagsburv et
al.)、Cancer Res. ３６：１１０−１１４、１９７６
年；及びブレム等(Brem et al.) 、Science １９５：８
８０−８８１、１９７７年］、脈管形成蛋白質をそれら
の治療及び診断における応用を可能にするのに十分な量
を製造することは明らかに有利である。遺伝子工学の技
術はこれらの蛋白質の製造水準を増大するのに理想的に
適したものである。脈管形成蛋白質をコードする遺伝子
のクローニングがその様な大規模製造の必要な第一段階
である。
割を果し［レチュラ等(Rettura etal.) FASEB Abstract
＃４３０９、第６１回 Annual Meeting 、シカゴ１９
７７年］、又、悪性のスクリーニング試験の開発におい
て応用を有するので［クラグスバーン等(Klagsburv et
al.)、Cancer Res. ３６：１１０−１１４、１９７６
年；及びブレム等(Brem et al.) 、Science １９５：８
８０−８８１、１９７７年］、脈管形成蛋白質をそれら
の治療及び診断における応用を可能にするのに十分な量
を製造することは明らかに有利である。遺伝子工学の技
術はこれらの蛋白質の製造水準を増大するのに理想的に
適したものである。脈管形成蛋白質をコードする遺伝子
のクローニングがその様な大規模製造の必要な第一段階
である。
【０００８】更に、ある種の腫瘍生成物による汚染が受
入れられない場合であるヒトの治療の場合などのよう
に、これらの蛋白質を非−腫瘍細胞から得ることが望ま
しい場合がある。本発明は従って組換えＤＮＡ技術を用
いて非−腫瘍細胞において脈管形成蛋白質の製造を提供
するものである。
入れられない場合であるヒトの治療の場合などのよう
に、これらの蛋白質を非−腫瘍細胞から得ることが望ま
しい場合がある。本発明は従って組換えＤＮＡ技術を用
いて非−腫瘍細胞において脈管形成蛋白質の製造を提供
するものである。
【０００９】発明の開示 簡単に述べると、本発明は脈管形成活性を有する蛋白質
をコードするＤＮＡ配列を開示する。アンギオゲニンを
コードするＤＮＡ配列、又はアンギオゲニンと実質的に
同一な活性を有する蛋白質も又開示される。このＤＮＡ
配列はｃＤＮＡ或いはゲノムＤＮＡから得られ、或いは
ＤＮＡ合成技術により調製される。
をコードするＤＮＡ配列を開示する。アンギオゲニンを
コードするＤＮＡ配列、又はアンギオゲニンと実質的に
同一な活性を有する蛋白質も又開示される。このＤＮＡ
配列はｃＤＮＡ或いはゲノムＤＮＡから得られ、或いは
ＤＮＡ合成技術により調製される。
【００１０】本発明は更に脈管形成活性を有する蛋白質
をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベクターを開示す
る。アンギオゲニンと実質的に同一な生物活性を有する
蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベクターも
又開示される。これ等のベクターは更にそのＤＮＡ配列
の上流に且つ操作可能に連結されたプロモーター配列を
含んでなる。一般的に、これらのベクターは選択的マー
カーも又含み、且つ用いられる宿主細胞に応じて制御配
列、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー及びＲＮＡ
スプライス部位などの要素を含んでよい。
をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベクターを開示す
る。アンギオゲニンと実質的に同一な生物活性を有する
蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベクターも
又開示される。これ等のベクターは更にそのＤＮＡ配列
の上流に且つ操作可能に連結されたプロモーター配列を
含んでなる。一般的に、これらのベクターは選択的マー
カーも又含み、且つ用いられる宿主細胞に応じて制御配
列、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー及びＲＮＡ
スプライス部位などの要素を含んでよい。
【００１１】本発明の付加的側面は脈管形成活性を有す
る蛋白質を産生するようにトランスフェクト又は形質転
換された細胞を開示する。アンギオゲニンと実質的に同
一の生物学的活性を有する蛋白質を産生するようにトラ
ンスフェクト又は、形質転換された細胞も又開示され
る。これらの細胞は脈管形成活性を有する蛋白質をコー
ドするＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクターを含有する
ようにトランスフェクト又は形質転換される。
る蛋白質を産生するようにトランスフェクト又は形質転
換された細胞を開示する。アンギオゲニンと実質的に同
一の生物学的活性を有する蛋白質を産生するようにトラ
ンスフェクト又は、形質転換された細胞も又開示され
る。これらの細胞は脈管形成活性を有する蛋白質をコー
ドするＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクターを含有する
ようにトランスフェクト又は形質転換される。
【００１２】本発明の更にもう一つの側面は脈管形成活
性を有する蛋白質の製造方法を開示する。この方法は
（ａ）宿主細胞中に脈管形成活性を有する蛋白質をコー
ドするＤＮＡ配列を含んでなるベクターを導入し、
（ｂ）この宿主細胞を適当な培地中で増殖させ、及び
（ｃ）このＤＮＡ配列によりコードされ及びこの宿主細
胞により産生された蛋白質生成物を単離することを含ん
でなる。アンギオゲニンと実質的に同一な生物学的活性
を有する蛋白質の製造方法も又開示される。これらの方
法により製造される蛋白質も又開示される。
性を有する蛋白質の製造方法を開示する。この方法は
（ａ）宿主細胞中に脈管形成活性を有する蛋白質をコー
ドするＤＮＡ配列を含んでなるベクターを導入し、
（ｂ）この宿主細胞を適当な培地中で増殖させ、及び
（ｃ）このＤＮＡ配列によりコードされ及びこの宿主細
胞により産生された蛋白質生成物を単離することを含ん
でなる。アンギオゲニンと実質的に同一な生物学的活性
を有する蛋白質の製造方法も又開示される。これらの方
法により製造される蛋白質も又開示される。
【００１３】本発明のその他の側面は詳細な説明及び図
面を参照して明らかとなるであろう。
面を参照して明らかとなるであろう。
【００１４】発明を実施するための最良の態様 発明を提示する前に、以下に用いる幾つかの用語を定義
する。
する。
【００１５】生物学的活性とは生物学的関係において
（即ち生物体において或いはin vitroの複製において）
分子により行われるある機能或いは機能の組である。ア
ンギオゲニンについては、生物学的活性はその脈管形成
活性により特徴付けられる。
（即ち生物体において或いはin vitroの複製において）
分子により行われるある機能或いは機能の組である。ア
ンギオゲニンについては、生物学的活性はその脈管形成
活性により特徴付けられる。
【００１６】脈管形成活性は、組織における血管発達の
化学的刺戟である。それは一般的に各種細胞タイプによ
り産生される拡散性物質と相関する。脈管形成活性はヒ
ヨコ胚漿尿膜アッセイ［ナイトン等(Knighton et al.)
、Br. J. Cancer ３５：３４７−３５６、１９７７
年］及び／またはウサギ角膜移植アッセイ［ランガー及
びフォークマン(Langer and Folkman)、Nature ２６
３：７９７−８００、１９７６年］における陽性応答に
より特徴付けられる。
化学的刺戟である。それは一般的に各種細胞タイプによ
り産生される拡散性物質と相関する。脈管形成活性はヒ
ヨコ胚漿尿膜アッセイ［ナイトン等(Knighton et al.)
、Br. J. Cancer ３５：３４７−３５６、１９７７
年］及び／またはウサギ角膜移植アッセイ［ランガー及
びフォークマン(Langer and Folkman)、Nature ２６
３：７９７−８００、１９７６年］における陽性応答に
より特徴付けられる。
【００１７】ＤＮＡ構築物はヒトの介入によりさもなく
ば自然においては存在しないように組合わされ及び配列
されたＤＮＡのセグメントを含有するように改変された
ＤＮＡ分子或いはその様な分子のクローンである。
ば自然においては存在しないように組合わされ及び配列
されたＤＮＡのセグメントを含有するように改変された
ＤＮＡ分子或いはその様な分子のクローンである。
【００１８】脈管形成蛋白質は、腫瘍細胞及び網膜細胞
を含む各種細胞タイプにより産生される。最近迄、これ
らの蛋白質はそれらの化学的及び物理的特徴付けを可能
にするのに十分な純度で得られていなかった。新規多段
−精製方法の応用により、以後アンギオゲニンと称する
脈管形成蛋白質の具体例がヒト腫瘍細胞系統の培養培地
から精製された。蛋白質配列の決定は対応するＤＮＡ配
列の単離及びこれらの配列の組換えＤＮＡ技術による発
現を可能にした。
を含む各種細胞タイプにより産生される。最近迄、これ
らの蛋白質はそれらの化学的及び物理的特徴付けを可能
にするのに十分な純度で得られていなかった。新規多段
−精製方法の応用により、以後アンギオゲニンと称する
脈管形成蛋白質の具体例がヒト腫瘍細胞系統の培養培地
から精製された。蛋白質配列の決定は対応するＤＮＡ配
列の単離及びこれらの配列の組換えＤＮＡ技術による発
現を可能にした。
【００１９】脈管形成蛋白質の単離はイオン交換クロマ
トグラフィーによる調整細胞培地の分別に引続く高性能
液体クロマトグラフィーに基づくものである。
トグラフィーによる調整細胞培地の分別に引続く高性能
液体クロマトグラフィーに基づくものである。
【００２０】腫瘍細胞が本発明による脈管形成蛋白質の
好ましい源であるが、その他のタイプの細胞、特に網膜
細胞は脈管形成因子を産生することが知られている。特
に好ましい細胞系統はヒト腺癌細胞系統ＨＴ−２９［フ
ォグ及びトレンプ（Fogh andTrempe)、Fogh編 Human Tu
mor Cells in Vitro 、１１５−１６０、Plemun. ニュ
ーヨーク１９７５年］である。ＨＴ−２９単離体は受入
番号ＨＴＢ３８及びＣＲＬ８９０５の下にアメリカン
タイプ カルチャー コレクション（AmericanType Cul
ture Collection ）に寄託されている。これらの細胞
は公知の方法に従って、例えばダルベッコの改変イーグ
ル培地或いはその他の適当な培地内の単層培養として培
養される。好ましい培地は２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び
５％熱不活性化ウシ胎児血清を補給されたダルベッコの
改変イーグル培地（ＤＭＥ／５）である。この培地は定
期的に更新され、及び細胞は公知の操作に従って継代培
養される。
好ましい源であるが、その他のタイプの細胞、特に網膜
細胞は脈管形成因子を産生することが知られている。特
に好ましい細胞系統はヒト腺癌細胞系統ＨＴ−２９［フ
ォグ及びトレンプ（Fogh andTrempe)、Fogh編 Human Tu
mor Cells in Vitro 、１１５−１６０、Plemun. ニュ
ーヨーク１９７５年］である。ＨＴ−２９単離体は受入
番号ＨＴＢ３８及びＣＲＬ８９０５の下にアメリカン
タイプ カルチャー コレクション（AmericanType Cul
ture Collection ）に寄託されている。これらの細胞
は公知の方法に従って、例えばダルベッコの改変イーグ
ル培地或いはその他の適当な培地内の単層培養として培
養される。好ましい培地は２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び
５％熱不活性化ウシ胎児血清を補給されたダルベッコの
改変イーグル培地（ＤＭＥ／５）である。この培地は定
期的に更新され、及び細胞は公知の操作に従って継代培
養される。
【００２１】細胞培地から脈管形成蛋白質の単離を容易
にするために、細胞をそれらが一度集密的成長に達した
ならば、血清のない維持培地に移すのが好ましい。好ま
しい維持培地は血清のない、がしかしＬ−グルタミンを
５ｍＭの濃度で含有するＤＭＥ／５である。
にするために、細胞をそれらが一度集密的成長に達した
ならば、血清のない維持培地に移すのが好ましい。好ま
しい維持培地は血清のない、がしかしＬ−グルタミンを
５ｍＭの濃度で含有するＤＭＥ／５である。
【００２２】細胞が培養され、維持された調整培地とし
て知られる培地を次いで細胞から取出し、及び好ましく
は濾過して細胞残滓を除去し、次いで処理して高分子量
蛋白質を除去する。好ましい処理方法は酸性化、例えば
氷酢酸を５％（ｖ／ｖ）の濃度に添加した後、遠心分離
を行う方法である。又、濾過し酸性化された培地を更に
精製工程にかける前に濃縮することも望ましい。
て知られる培地を次いで細胞から取出し、及び好ましく
は濾過して細胞残滓を除去し、次いで処理して高分子量
蛋白質を除去する。好ましい処理方法は酸性化、例えば
氷酢酸を５％（ｖ／ｖ）の濃度に添加した後、遠心分離
を行う方法である。又、濾過し酸性化された培地を更に
精製工程にかける前に濃縮することも望ましい。
【００２３】濾過され、処理された培地を次いでカルボ
キシメチルセルロース（ＣＭセルロース）などのカチオ
ン交換マトリックス上でクロマトグラフィーにかける。
この処理された調整培地を凍結乾燥し、０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ６．６中で戻してマトリックスに
かけるのが好ましい。その様な条件下において、脈管形
成因子はマトリックスに結合し、１ＭＮａＣｌを含有す
る同一緩衝液で溶出される。
キシメチルセルロース（ＣＭセルロース）などのカチオ
ン交換マトリックス上でクロマトグラフィーにかける。
この処理された調整培地を凍結乾燥し、０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ６．６中で戻してマトリックスに
かけるのが好ましい。その様な条件下において、脈管形
成因子はマトリックスに結合し、１ＭＮａＣｌを含有す
る同一緩衝液で溶出される。
【００２４】カチオン交換マトリックスからの溶出液は
更に逆相高性能液体クロマトグラフィーにより分別され
る。この溶出液を凍結乾燥し、適当な溶媒例えば水中
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの溶媒中で戻
し、及び第二の溶媒の勾配をカラムにかけることにより
溶出される。０．０８％ＴＦＡを含有するイソプロパノ
ール／アセトニトリル／水（５：５：４ｖ／ｖ／ｖ）の
線形勾配が好ましい。ＨＰＬＣカラムから溶出された物
質を次いで透析して溶媒を除去し、凍結乾燥し、又戻
す。
更に逆相高性能液体クロマトグラフィーにより分別され
る。この溶出液を凍結乾燥し、適当な溶媒例えば水中
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの溶媒中で戻
し、及び第二の溶媒の勾配をカラムにかけることにより
溶出される。０．０８％ＴＦＡを含有するイソプロパノ
ール／アセトニトリル／水（５：５：４ｖ／ｖ／ｖ）の
線形勾配が好ましい。ＨＰＬＣカラムから溶出された物
質を次いで透析して溶媒を除去し、凍結乾燥し、又戻
す。
【００２５】戻されたＨＰＬＣカラム溶出液を次いで脈
管形成活性のアッセイを行い、活性画分を同定する。脈
管形成活性に対する幾つかのアッセイは良く知られてお
り、ヒヨコ胚漿尿膜アッセイ［ナイトン等（Kinghton e
t al. ）Br.J.Cancer ３５：３４７−３５６、１９７７
年］及び角膜移植アッセイ［ランガー及びフォークマン
（Langer and Folkman）、Nature ２６３：７９７−８
００、１９７６年］などが挙げられる。
管形成活性のアッセイを行い、活性画分を同定する。脈
管形成活性に対する幾つかのアッセイは良く知られてお
り、ヒヨコ胚漿尿膜アッセイ［ナイトン等（Kinghton e
t al. ）Br.J.Cancer ３５：３４７−３５６、１９７７
年］及び角膜移植アッセイ［ランガー及びフォークマン
（Langer and Folkman）、Nature ２６３：７９７−８
００、１９７６年］などが挙げられる。
【００２６】ＨＴ−２９細胞が出発物質として用いられ
る場合には、二つの活性画分がＨＰＬＣカラムから得ら
れる。一つの画分はＭｒ約１６，０００の主たる蛋白質
成分とより少量のＭｒ約１４，０００種を含有する。第
二の画分はアンギオゲニンと命名されたＭｒ約１４，０
００の単一タンパク種を含有する。更に分析すると、ア
ンギオゲニンは９．５より大きい等電点及びアミノ酸配
列分析により約１４，１９３ダルトンの分子量を有する
ことが判明した。驚くべきことに、殆んどの前記脈管形
成因子と対照的に、アオギオゲニンは通常のアッセイに
おいては有糸分裂誘発性ではなかった。アンギオゲニン
のアミノ酸配列は膵臓リボヌクレアーゼに３５％相同で
あることが判明した。
る場合には、二つの活性画分がＨＰＬＣカラムから得ら
れる。一つの画分はＭｒ約１６，０００の主たる蛋白質
成分とより少量のＭｒ約１４，０００種を含有する。第
二の画分はアンギオゲニンと命名されたＭｒ約１４，０
００の単一タンパク種を含有する。更に分析すると、ア
ンギオゲニンは９．５より大きい等電点及びアミノ酸配
列分析により約１４，１９３ダルトンの分子量を有する
ことが判明した。驚くべきことに、殆んどの前記脈管形
成因子と対照的に、アオギオゲニンは通常のアッセイに
おいては有糸分裂誘発性ではなかった。アンギオゲニン
のアミノ酸配列は膵臓リボヌクレアーゼに３５％相同で
あることが判明した。
【００２７】脈管形成蛋白質が実質的に純粋な形態で得
られた場合に、そのアミノ酸配列は公知の方法、例えば
エドマン分解［エドマン及びベッグ（Edman 及び Begg
）、Eur.J.Biochem 、１：８０−９１、１９６７年］
により決定された。全アミノ酸配列を決定する必要はな
い。好ましくは、少なくとも５〜１０個のアミノ酸の配
列が決定される。
られた場合に、そのアミノ酸配列は公知の方法、例えば
エドマン分解［エドマン及びベッグ（Edman 及び Begg
）、Eur.J.Biochem 、１：８０−９１、１９６７年］
により決定された。全アミノ酸配列を決定する必要はな
い。好ましくは、少なくとも５〜１０個のアミノ酸の配
列が決定される。
【００２８】このアミノ酸配列から、ＤＮＡプローブが
設計される。一般的には、このアミノ酸配列をコードす
る全ての可能性あるＤＮＡ配列に対応するプローブのフ
ァミリーを設計する必要がある。その様なプローブはＤ
ＮＡクローンをスクリーニングする際に偽の陽性シグナ
ルを最少にするために少なくとも１４個のスクレオチド
の長さであるのが好ましい。適当なプローブは公知の方
法により合成されるか［総説としてイタクラ（Itakura
）、Trends in Biochemical Science 、Elsevier Bioc
hemical Press、１９８２年参照］或いは商業上の供給
者から購入される。
設計される。一般的には、このアミノ酸配列をコードす
る全ての可能性あるＤＮＡ配列に対応するプローブのフ
ァミリーを設計する必要がある。その様なプローブはＤ
ＮＡクローンをスクリーニングする際に偽の陽性シグナ
ルを最少にするために少なくとも１４個のスクレオチド
の長さであるのが好ましい。適当なプローブは公知の方
法により合成されるか［総説としてイタクラ（Itakura
）、Trends in Biochemical Science 、Elsevier Bioc
hemical Press、１９８２年参照］或いは商業上の供給
者から購入される。
【００２９】ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）及び／又はゲノ
ムＤＮＡライブラリーを次いで調製し、及び通常のハイ
ブリダイゼーション技術を用いてプローブを用いてスク
リーニングする。その様なライブラリーの調製技術は良
く知られている［例えば、ローン等（Lawn et al. ）Ce
ll １５：１１５７−１１７４、１９７８年；及びマイ
ケルソン等（Michelson et al.）Proc.Natl.Acad.Sci.
USA ８０：４７２−４７６、１９８３年参照］。プロー
ブにハイブリダイズするクローンを次いで選択し、配列
決定する。
ムＤＮＡライブラリーを次いで調製し、及び通常のハイ
ブリダイゼーション技術を用いてプローブを用いてスク
リーニングする。その様なライブラリーの調製技術は良
く知られている［例えば、ローン等（Lawn et al. ）Ce
ll １５：１１５７−１１７４、１９７８年；及びマイ
ケルソン等（Michelson et al.）Proc.Natl.Acad.Sci.
USA ８０：４７２−４７６、１９８３年参照］。プロー
ブにハイブリダイズするクローンを次いで選択し、配列
決定する。
【００３０】或いは又、十分な量の純粋な脈管形成蛋白
質が得られるならば、それを用いて抗体を調製し、この
抗体を次いで用いて発現ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングしてよい［ヤング及びデービス（Young and Da
vis ）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA８０：１１９４−１１
９８、１９８３年］。
質が得られるならば、それを用いて抗体を調製し、この
抗体を次いで用いて発現ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングしてよい［ヤング及びデービス（Young and Da
vis ）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA８０：１１９４−１１
９８、１９８３年］。
【００３１】全長のｃＤＮＡクローンが得られるなら
ば、それを脈管形成蛋白質を製造するのに使用するため
に直接に発現ベクターに挿入してよい。全長のｃＤＮＡ
クローンが欠ける場合には、残りのコード配列は幾つか
の方法により得られ、及び全長のコード配列が次いで構
築される。ｃＤＮＡクローンは追加のｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングするために或いはゲノムＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするためのプローブとして
使用されてよい。蛋白質のアミノ酸配列が知られている
ならば、欠けている物質を合成し、そのｃＤＮＡ及び／
又はゲノムＤＮＡ断片に連結して完全なコード配列が構
築される。幾つかの状況下においては、コード配列は適
当な操作及び本発明により製造される脈管形成蛋白質の
分泌を容易にするために更にリーダーペプチドをコード
するのが好ましい。リーダーペプチドは脈管形成ペプチ
ド自身のそれであっても或いは特別の宿主細胞において
機能する異種リーダーペプチドであってよい。
ば、それを脈管形成蛋白質を製造するのに使用するため
に直接に発現ベクターに挿入してよい。全長のｃＤＮＡ
クローンが欠ける場合には、残りのコード配列は幾つか
の方法により得られ、及び全長のコード配列が次いで構
築される。ｃＤＮＡクローンは追加のｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングするために或いはゲノムＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするためのプローブとして
使用されてよい。蛋白質のアミノ酸配列が知られている
ならば、欠けている物質を合成し、そのｃＤＮＡ及び／
又はゲノムＤＮＡ断片に連結して完全なコード配列が構
築される。幾つかの状況下においては、コード配列は適
当な操作及び本発明により製造される脈管形成蛋白質の
分泌を容易にするために更にリーダーペプチドをコード
するのが好ましい。リーダーペプチドは脈管形成ペプチ
ド自身のそれであっても或いは特別の宿主細胞において
機能する異種リーダーペプチドであってよい。
【００３２】脈管形成蛋白質をコードする全長のＤＮＡ
配列が得られた場合には、それは次いで適当な発現ベク
ター中に挿入される。本発明を実施するのに使用される
発現ベクターは更に脈管形成蛋白質をコードするＤＮＡ
配列に操作可能に連結されたプロモーターを含んでな
る。ある場合においては発現ベクターは更に選択される
宿主細胞に応じて複製の原点並びに発現レベルを制御及
び／又は高める配列を含んでなるのが好ましい。適当な
発現ベクターはプラスミド類或いはウイルス類から得ら
れ、或いは両者の要素を含んでよい。
配列が得られた場合には、それは次いで適当な発現ベク
ター中に挿入される。本発明を実施するのに使用される
発現ベクターは更に脈管形成蛋白質をコードするＤＮＡ
配列に操作可能に連結されたプロモーターを含んでな
る。ある場合においては発現ベクターは更に選択される
宿主細胞に応じて複製の原点並びに発現レベルを制御及
び／又は高める配列を含んでなるのが好ましい。適当な
発現ベクターはプラスミド類或いはウイルス類から得ら
れ、或いは両者の要素を含んでよい。
【００３３】本発明を実施するのに用いられる好ましい
原核宿主は細菌エッシエリシア・コリ（Eschericia col
i ）の菌株であるが、しかし、バチルス（Bacillus）そ
の他の属も又有用である。これらの宿主を形質転換し、
それらにクローン化された外来遺伝子を発現するための
技術は良く知られている［例えばマニアティス等（Mani
atis et al. ）、Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual 、Cold Spring Horbor Laboratory 、１９８２年参
照］。細菌宿主中で外来遺伝子を発現するために用いら
れるベクターは一般的に抗生物質耐性のための遺伝子な
どの選択可能なマーカー及び宿主細胞内で機能するプロ
モーターを含有する。適当なプロモーターとしては、tr
p ［ニコルス及びヤノフスキー（Nichols and Yanofsk
y）Meth、in Enzymology １０１：１５５、１９８３
年］lac ［カサダバン等（Casadabanet al.）、J.Bac
t、１４３：９７１−９８０、１９８０年］及びλファ
ージプロモーター系などが挙げられる。細菌を形質転換
するために必要なプラスミド類としては、ｐＢＲ３２２
［ボリバー等（Bolivar et al.）Gene ２：９５−１１
３、１９７７年］、ｐＵＣプラスミド類［メッシング
（Messing ）、Meth.in enzymology １０１：２０−７
７、１９８３年；及びビエイラ及びメッシング（Vieira
and Messing）、Gene １９：２５９−２６８、１９８
２年］、ｐＣＱＶ２［クイーン（Queen ）、J.Mol.App
l.Genet、２：１−１０、１９８３年］及びそれらの誘
導体などが挙げられる。
原核宿主は細菌エッシエリシア・コリ（Eschericia col
i ）の菌株であるが、しかし、バチルス（Bacillus）そ
の他の属も又有用である。これらの宿主を形質転換し、
それらにクローン化された外来遺伝子を発現するための
技術は良く知られている［例えばマニアティス等（Mani
atis et al. ）、Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual 、Cold Spring Horbor Laboratory 、１９８２年参
照］。細菌宿主中で外来遺伝子を発現するために用いら
れるベクターは一般的に抗生物質耐性のための遺伝子な
どの選択可能なマーカー及び宿主細胞内で機能するプロ
モーターを含有する。適当なプロモーターとしては、tr
p ［ニコルス及びヤノフスキー（Nichols and Yanofsk
y）Meth、in Enzymology １０１：１５５、１９８３
年］lac ［カサダバン等（Casadabanet al.）、J.Bac
t、１４３：９７１−９８０、１９８０年］及びλファ
ージプロモーター系などが挙げられる。細菌を形質転換
するために必要なプラスミド類としては、ｐＢＲ３２２
［ボリバー等（Bolivar et al.）Gene ２：９５−１１
３、１９７７年］、ｐＵＣプラスミド類［メッシング
（Messing ）、Meth.in enzymology １０１：２０−７
７、１９８３年；及びビエイラ及びメッシング（Vieira
and Messing）、Gene １９：２５９−２６８、１９８
２年］、ｐＣＱＶ２［クイーン（Queen ）、J.Mol.App
l.Genet、２：１−１０、１９８３年］及びそれらの誘
導体などが挙げられる。
【００３４】酵母サッカロミセス・セレビシェー（Sacc
haromyces cerevisiae）などの真核微生物も又宿主細胞
として使用される。酵母を形質転換するための技術はベ
ッグス（Beggs ）により説明されている（Nature ２７
５：１０４−１０８、１９７８年）。酵母内に使用する
発現ベクターとしてはＹＲｐ７［ストルール等（Struhl
et al. ）、Proc.Natl.Acad.Sci. USA ７６：１０３５
−１０３９、１９７９年］、ＹＥｐ１３［ブローチ等
（Broach et al. ）、Gene ８：１２１−１３３、１９
７９年］、ｐＪＤＢ２４８及びｐＪＤＢ２１９［前記ベ
ッグス（Beggs ）］及びそれらの誘導体などが挙げられ
る。その様なベクターは一般的にtrpl変異を有する宿主
株内における選択を可能にする栄養マーカーＴＲＰなど
の選択可能なマーカーを含んでなる。酵母発現ベクター
内に用いるのに好ましいプロモーターとしては、酵母糖
分解遺伝子からのプロモーター［リッツマン等（Ritzem
an et al. ）J.Biol.Chem 、２５５：１２０７３−１２
０８０、１９８０年；アルバー及びカワサキ（Alber an
d Kawasaki）、J.Mol.Appl.Genet. １：４１９−４３
４、１９８２年］或いはアルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子［ヤング等（Younget al.）Genetic Engineering o
f Microorganisms for Chemicals 、ホランダー等（Hol
laender et al. ）編、ｐ．３３５、Plenum、ニューヨ
ーク、１９８２年；及びアンマラー（Ammerer ）、Met
h.in Enzymology １０１：１９２−２０１、１９８３
年］などが挙げられる。酵母形質転換体において産生さ
れた脈管形成蛋白質の精製を容易にし、及び適当なジス
ルフィド結合形成を得るために、シグナル配列、好まし
くは分泌蛋白質をコードする酵母遺伝子からのものを脈
管形成蛋白質のためのコード配列に連結してよい。特に
好ましいシグナル配列はＭＦα１遺伝子のプレ−プロ領
域である［カージャン及びヘルスコビッツ（Kurjan and
Herskowitz ）、Cell ３０：９３３−９４３、１９８
２年］。
haromyces cerevisiae）などの真核微生物も又宿主細胞
として使用される。酵母を形質転換するための技術はベ
ッグス（Beggs ）により説明されている（Nature ２７
５：１０４−１０８、１９７８年）。酵母内に使用する
発現ベクターとしてはＹＲｐ７［ストルール等（Struhl
et al. ）、Proc.Natl.Acad.Sci. USA ７６：１０３５
−１０３９、１９７９年］、ＹＥｐ１３［ブローチ等
（Broach et al. ）、Gene ８：１２１−１３３、１９
７９年］、ｐＪＤＢ２４８及びｐＪＤＢ２１９［前記ベ
ッグス（Beggs ）］及びそれらの誘導体などが挙げられ
る。その様なベクターは一般的にtrpl変異を有する宿主
株内における選択を可能にする栄養マーカーＴＲＰなど
の選択可能なマーカーを含んでなる。酵母発現ベクター
内に用いるのに好ましいプロモーターとしては、酵母糖
分解遺伝子からのプロモーター［リッツマン等（Ritzem
an et al. ）J.Biol.Chem 、２５５：１２０７３−１２
０８０、１９８０年；アルバー及びカワサキ（Alber an
d Kawasaki）、J.Mol.Appl.Genet. １：４１９−４３
４、１９８２年］或いはアルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子［ヤング等（Younget al.）Genetic Engineering o
f Microorganisms for Chemicals 、ホランダー等（Hol
laender et al. ）編、ｐ．３３５、Plenum、ニューヨ
ーク、１９８２年；及びアンマラー（Ammerer ）、Met
h.in Enzymology １０１：１９２−２０１、１９８３
年］などが挙げられる。酵母形質転換体において産生さ
れた脈管形成蛋白質の精製を容易にし、及び適当なジス
ルフィド結合形成を得るために、シグナル配列、好まし
くは分泌蛋白質をコードする酵母遺伝子からのものを脈
管形成蛋白質のためのコード配列に連結してよい。特に
好ましいシグナル配列はＭＦα１遺伝子のプレ−プロ領
域である［カージャン及びヘルスコビッツ（Kurjan and
Herskowitz ）、Cell ３０：９３３−９４３、１９８
２年］。
【００３５】より高等な真核細胞も又本発明を実施する
際の宿主細胞として役立つ。培養された哺乳動物細胞が
好ましい。哺乳動物細胞に用いるための発現ベクターは
哺乳動物細胞に導入された外来遺伝子の転写を指示する
ことのできるプロモーターを含んでなる。特に好ましい
プロモーターはマウスメタロチオネイン−１（ＭＴ−
１）プロモーターである［パルミター等（Palmiter et
al. ）Science ２２２：８０９−８１４、１９８３
年］。この発現ベクター内には又挿入部位の下流に位置
したポリアデニル化シグナルが含有されている。このポ
リアデニル化シグナルはクローン化された脈管形成蛋白
質遺伝子のそれであるか或いは異種遺伝子から由来して
よい。
際の宿主細胞として役立つ。培養された哺乳動物細胞が
好ましい。哺乳動物細胞に用いるための発現ベクターは
哺乳動物細胞に導入された外来遺伝子の転写を指示する
ことのできるプロモーターを含んでなる。特に好ましい
プロモーターはマウスメタロチオネイン−１（ＭＴ−
１）プロモーターである［パルミター等（Palmiter et
al. ）Science ２２２：８０９−８１４、１９８３
年］。この発現ベクター内には又挿入部位の下流に位置
したポリアデニル化シグナルが含有されている。このポ
リアデニル化シグナルはクローン化された脈管形成蛋白
質遺伝子のそれであるか或いは異種遺伝子から由来して
よい。
【００３６】クローン化された遺伝子配列は次いで例え
ばリン酸カルシウム−媒介トランスフェクション［ウィ
グラー等(Wigler et al.) 、Cell: ７２５、１９７８
年；コラロ及びピアソン(Coraro and Pearson)、Somati
c Cell Genetics ７：６０３、１９８１年；グラハム及
びファン・デル・エブ(Graham and Van der Eb) 、Viro
logy５２：４５６、１９７３年］により培養された哺乳
動物細胞中に導入される。ＤＮＡ及びリン酸カルシウム
よりなる沈殿が形成され、この沈殿を細胞に適用する。
細胞の幾つかはＤＮＡを吸収し、それを細胞内部に数日
間維持する。これらの細胞の小部分（典型的に１０-4）
がこのＤＮＡをゲノム中に組み込む。これらの組込み物
を同定するために、選択可能な表現型（選択可能なマー
カー）を与える遺伝子が一般的に対象遺伝子と共に細胞
中に導入される。好ましい選択可能なマーカーとして
は、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキ
セートなどの薬品に耐性を付与する遺伝子が挙げられ
る。選択可能なマーカーは別個のプラスミドで対象遺伝
子と同時に細胞中に導入されるか、或いはそれらは同一
のプラスミドで導入されてよい。
ばリン酸カルシウム−媒介トランスフェクション［ウィ
グラー等(Wigler et al.) 、Cell: ７２５、１９７８
年；コラロ及びピアソン(Coraro and Pearson)、Somati
c Cell Genetics ７：６０３、１９８１年；グラハム及
びファン・デル・エブ(Graham and Van der Eb) 、Viro
logy５２：４５６、１９７３年］により培養された哺乳
動物細胞中に導入される。ＤＮＡ及びリン酸カルシウム
よりなる沈殿が形成され、この沈殿を細胞に適用する。
細胞の幾つかはＤＮＡを吸収し、それを細胞内部に数日
間維持する。これらの細胞の小部分（典型的に１０-4）
がこのＤＮＡをゲノム中に組み込む。これらの組込み物
を同定するために、選択可能な表現型（選択可能なマー
カー）を与える遺伝子が一般的に対象遺伝子と共に細胞
中に導入される。好ましい選択可能なマーカーとして
は、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキ
セートなどの薬品に耐性を付与する遺伝子が挙げられ
る。選択可能なマーカーは別個のプラスミドで対象遺伝
子と同時に細胞中に導入されるか、或いはそれらは同一
のプラスミドで導入されてよい。
【００３７】組み込まれた遺伝子配列のコピー数はある
種の選択可能なマーカー（例、メトトレキセートに耐性
を付与するジハイドロホレートレダクターゼ）を用いる
増幅により増大される。この選択可能なマーカーは対象
遺伝子と共に細胞中に導入され、及び薬物選択が適用さ
れる。薬物濃度を次いで各工程において耐性細胞を選択
しながら段階的に増大する。増大したコピー数のクロー
ン化配列について選択することにより、発現レベルが実
質的に増大される。
種の選択可能なマーカー（例、メトトレキセートに耐性
を付与するジハイドロホレートレダクターゼ）を用いる
増幅により増大される。この選択可能なマーカーは対象
遺伝子と共に細胞中に導入され、及び薬物選択が適用さ
れる。薬物濃度を次いで各工程において耐性細胞を選択
しながら段階的に増大する。増大したコピー数のクロー
ン化配列について選択することにより、発現レベルが実
質的に増大される。
【００３８】本発明により製造された脈管形成蛋白質は
前記の如く宿主細胞或いは細胞培地からカチオン交換ク
ロマトグラフィー及び高性能液体クロマトグラフィーに
より精製される。
前記の如く宿主細胞或いは細胞培地からカチオン交換ク
ロマトグラフィー及び高性能液体クロマトグラフィーに
より精製される。
【００３９】その他の脈管形成蛋白質が上記方法により
単離される。異った細胞系統は異った物性を有する脈管
形成蛋白質を産生することが期待される。加えて、遺伝
的多型性或いは蛋白質若しくはそれらの前駆体の細胞−
媒介修飾（cell-mediated modification）による変化物
が存在することがある。更に、ある脈管形成蛋白質のア
ミノ酸配列は変更された生物学的活性を有する蛋白質を
製造するために遺伝子技術により改変される。例えば、
アンギオゲニンとリボヌクレアーゼの間の相同性に基き
位置２６、３９、５７、８１、９２及び１０７における
ｃｙｓ残基、位置１３及び１４におけるヒスチジン、及
び位置４０におけるリジンは部位特異性突然変異誘発に
よる他のアミノ酸による置換に好ましい部位である［ゾ
ラー等(Zoller et al.) Manual for Advanced Techniqu
e in Molecular Cloning Course、Cold Spring Harbor L
aboratories、１９８３年］。得られたＤＮＡ配列はアン
ギオゲニンと実質的に同一のアミノ酸配列を有するが、
しかし、より高い或いはより低いレベルの脈管形成活性
を示す蛋白質をコードするものである。生物学的活性の
増大はより低い投与量レベルの使用を許容することを可
能にする。減少された脈管形成活性を有するか或いは全
く脈管形成活性を有さないが、しかしある種の構造的特
徴を保持する分子は内皮その他の細胞上のレセプターに
なお結合することが可能であり、及び、作用部位を閉塞
することにより天然蛋白質の作用に対する拮抗剤を形成
し、その結果、脈管形成−関連病態の治療への接近を与
える。その様な蛋白質は本発明の範囲内のものである。
単離される。異った細胞系統は異った物性を有する脈管
形成蛋白質を産生することが期待される。加えて、遺伝
的多型性或いは蛋白質若しくはそれらの前駆体の細胞−
媒介修飾（cell-mediated modification）による変化物
が存在することがある。更に、ある脈管形成蛋白質のア
ミノ酸配列は変更された生物学的活性を有する蛋白質を
製造するために遺伝子技術により改変される。例えば、
アンギオゲニンとリボヌクレアーゼの間の相同性に基き
位置２６、３９、５７、８１、９２及び１０７における
ｃｙｓ残基、位置１３及び１４におけるヒスチジン、及
び位置４０におけるリジンは部位特異性突然変異誘発に
よる他のアミノ酸による置換に好ましい部位である［ゾ
ラー等(Zoller et al.) Manual for Advanced Techniqu
e in Molecular Cloning Course、Cold Spring Harbor L
aboratories、１９８３年］。得られたＤＮＡ配列はアン
ギオゲニンと実質的に同一のアミノ酸配列を有するが、
しかし、より高い或いはより低いレベルの脈管形成活性
を示す蛋白質をコードするものである。生物学的活性の
増大はより低い投与量レベルの使用を許容することを可
能にする。減少された脈管形成活性を有するか或いは全
く脈管形成活性を有さないが、しかしある種の構造的特
徴を保持する分子は内皮その他の細胞上のレセプターに
なお結合することが可能であり、及び、作用部位を閉塞
することにより天然蛋白質の作用に対する拮抗剤を形成
し、その結果、脈管形成−関連病態の治療への接近を与
える。その様な蛋白質は本発明の範囲内のものである。
【００４０】本発明に従って製造された脈管形成蛋白質
を用いて、それらを適当な担体と組合わせることにより
治療或いは診断組成物が製造される。これらの治療組成
物を用いて哺乳動物における血管網目の発達が促進さ
れ、例えば心臓発作に引続く副行循環を誘発するか或い
は例えば関節その他の位置における傷の治癒は促進す
る。好ましくは、本発明による治療組成物は静脈内に投
与するか或いは傷の部位に直接局所適用により投与され
る。例えば、良くスポーツに関連した傷或いは変形性関
節症において起こるようにひざ或いは肩の半月に傷が生
ずる場合には、傷の箇所における脈管形成蛋白質の注射
が引裂かれた或いは外傷を受けた繊維軟膏物質の治癒を
促進する。有効投与量は病態の重さ及び標的組織に応じ
て異る。更に、脈管形成蛋白質は、抗体の存在を測定す
るために或いは免疫診断試薬として用いるための抗体を
産生するためにこの蛋白質を利用することにより悪性の
存在のスクリーニングにおける診断用途を有する。この
蛋白質を含有する診断組成物は抗原−抗体複合体の形成
に適した条件下において生物学的試料とインキュベート
される。複合体の形成（即ち試料中における抗体の存
在）が次いで検出される。その様なアッセイの技術は良
く知られており、例えば酵素結合免疫吸着剤アッセイ
［ホラー等(Voller et al.)、The Enzyme Linked Immuno
sorbent Assay、Dynatech Laboratories Inc.１９７９
年］或いはウエスタンブロットアッセイ［例えば、タウ
ビン等 (Towbin et al.)、Proc.Natl Acad,Sci. ＵＳＡ
７６：４３５０、１９７９年］などがある。同様に、あ
る脈管形成蛋白質に対する抗体を含んでなる診断組成物
を用いて生物学的試料内におけるその蛋白質の存在を測
定することができる。これらの脈管形成蛋白質は又脈管
形成に関連する障害の治療に有用である脈管形成阻害剤
を開発するために用いられてもよい。組換えＤＮＡはこ
れらの用途に必要とされる量でこれらの蛋白質を製造す
るための優れた方法を提供する。
を用いて、それらを適当な担体と組合わせることにより
治療或いは診断組成物が製造される。これらの治療組成
物を用いて哺乳動物における血管網目の発達が促進さ
れ、例えば心臓発作に引続く副行循環を誘発するか或い
は例えば関節その他の位置における傷の治癒は促進す
る。好ましくは、本発明による治療組成物は静脈内に投
与するか或いは傷の部位に直接局所適用により投与され
る。例えば、良くスポーツに関連した傷或いは変形性関
節症において起こるようにひざ或いは肩の半月に傷が生
ずる場合には、傷の箇所における脈管形成蛋白質の注射
が引裂かれた或いは外傷を受けた繊維軟膏物質の治癒を
促進する。有効投与量は病態の重さ及び標的組織に応じ
て異る。更に、脈管形成蛋白質は、抗体の存在を測定す
るために或いは免疫診断試薬として用いるための抗体を
産生するためにこの蛋白質を利用することにより悪性の
存在のスクリーニングにおける診断用途を有する。この
蛋白質を含有する診断組成物は抗原−抗体複合体の形成
に適した条件下において生物学的試料とインキュベート
される。複合体の形成（即ち試料中における抗体の存
在）が次いで検出される。その様なアッセイの技術は良
く知られており、例えば酵素結合免疫吸着剤アッセイ
［ホラー等(Voller et al.)、The Enzyme Linked Immuno
sorbent Assay、Dynatech Laboratories Inc.１９７９
年］或いはウエスタンブロットアッセイ［例えば、タウ
ビン等 (Towbin et al.)、Proc.Natl Acad,Sci. ＵＳＡ
７６：４３５０、１９７９年］などがある。同様に、あ
る脈管形成蛋白質に対する抗体を含んでなる診断組成物
を用いて生物学的試料内におけるその蛋白質の存在を測
定することができる。これらの脈管形成蛋白質は又脈管
形成に関連する障害の治療に有用である脈管形成阻害剤
を開発するために用いられてもよい。組換えＤＮＡはこ
れらの用途に必要とされる量でこれらの蛋白質を製造す
るための優れた方法を提供する。
【００４１】
実験材料及び方法 制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４キナーゼ、アルカ
リホスファターゼ、エンドヌクレアーゼBal ３１及びＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（Ｅ．coli）のクレノウ断片はBeth
esda Research Loboratories或いはNew England Biolab
s から購入した。逆転写酵素（トリ骨髄腫ウイルス）
は、Seikagaku U. S. A. Inc. から得た。ジデオキシヌ
クレオチドトリホスフェート、デオキシヌクレオシドト
リホスフェート。ｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１３はＰ−Ｌ
Biochemicals から購入した。ジデオキシ配列決定のた
めの万能プライマー（ヘプタデカマー）は New England
Biolabsから購入し、及び［α−32Ｐ］ｄＡＴＰ、［γ
−32Ｐ］ＡＴＰ及び［35Ｓ］ｄＡＴＰαＳは Amersham
から得た。 実施例１：アンギオゲニンをコードするｃＤＮＡ及びゲ
ノム配列の単離
リホスファターゼ、エンドヌクレアーゼBal ３１及びＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（Ｅ．coli）のクレノウ断片はBeth
esda Research Loboratories或いはNew England Biolab
s から購入した。逆転写酵素（トリ骨髄腫ウイルス）
は、Seikagaku U. S. A. Inc. から得た。ジデオキシヌ
クレオチドトリホスフェート、デオキシヌクレオシドト
リホスフェート。ｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１３はＰ−Ｌ
Biochemicals から購入した。ジデオキシ配列決定のた
めの万能プライマー（ヘプタデカマー）は New England
Biolabsから購入し、及び［α−32Ｐ］ｄＡＴＰ、［γ
−32Ｐ］ＡＴＰ及び［35Ｓ］ｄＡＴＰαＳは Amersham
から得た。 実施例１：アンギオゲニンをコードするｃＤＮＡ及びゲ
ノム配列の単離
【００４２】ヒトｃＤＮＡライブラリーをプラスミドｐ
ＵＣ１３をクローニングベクター（前記マニアティス
等）を用いてヒト肝臓ポリ（Ａ）−ｍＲＮＡから調製し
た。このプラスミドは予めそのPst Ｉ部位においてＧで
尾部を付されたものであった［マイケルソン及びオーキ
ン(Michelson & Orkin) １９８２年］。２６個の合成オ
リゴヌクレオチド類［ＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＴＡＧＣ
（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＴＡ（Ａ／Ｇ）ＴＧ（Ｃ／
Ｔ）ＴＧ］の混合物をＰ−Ｌ Biochemicals から購入
し、ハイブリダイゼーションプローブとして用いた。こ
のヌクレオチド混合物はGln-His-Tyr-Asp-Ala-Lys-Pro-
Gln-Glyをコードするヌクレオチド配列と相補的であ
る。この配列は大腸腺癌細胞系統ＨＴ−２９から単離さ
れたヒトアンギオゲニンのアミノ−末端領域に存在する
（図１参照）。このヌクレオチド混合物をＴ４キナーゼ
及び［32Ｐ］ＡＴＰで約３×１０8 cpm/μg の比活性に
放射性標識し、ワラス等(Wallace et al.)の方法(Nucle
ic Acids Res. ９：８７９−８９４、１９８１年）によ
る肝臓ライブラリーからの３５０，０００個の形質転換
体のスクリーニングに用いた。プローブと強くハイブリ
ダイズした７個の組換えプラスミドを単離し、セシウム
クロライド勾配遠心分離により精製した。陽性クローン
の各々のＤＮＡインサートを各種制限酵素で消化し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。それら
の配列はマクサム及びギルバート(Maxam & Gilbert) の
化学分解法(Meth.in Enzymology ６５：４９９−５６
０、１９８０年）により決定した。各配列は２回以上決
定され、８５％を越える配列が両方の鎖について決定さ
れた。
ＵＣ１３をクローニングベクター（前記マニアティス
等）を用いてヒト肝臓ポリ（Ａ）−ｍＲＮＡから調製し
た。このプラスミドは予めそのPst Ｉ部位においてＧで
尾部を付されたものであった［マイケルソン及びオーキ
ン(Michelson & Orkin) １９８２年］。２６個の合成オ
リゴヌクレオチド類［ＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＴＡＧＣ
（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＴＡ（Ａ／Ｇ）ＴＧ（Ｃ／
Ｔ）ＴＧ］の混合物をＰ−Ｌ Biochemicals から購入
し、ハイブリダイゼーションプローブとして用いた。こ
のヌクレオチド混合物はGln-His-Tyr-Asp-Ala-Lys-Pro-
Gln-Glyをコードするヌクレオチド配列と相補的であ
る。この配列は大腸腺癌細胞系統ＨＴ−２９から単離さ
れたヒトアンギオゲニンのアミノ−末端領域に存在する
（図１参照）。このヌクレオチド混合物をＴ４キナーゼ
及び［32Ｐ］ＡＴＰで約３×１０8 cpm/μg の比活性に
放射性標識し、ワラス等(Wallace et al.)の方法(Nucle
ic Acids Res. ９：８７９−８９４、１９８１年）によ
る肝臓ライブラリーからの３５０，０００個の形質転換
体のスクリーニングに用いた。プローブと強くハイブリ
ダイズした７個の組換えプラスミドを単離し、セシウム
クロライド勾配遠心分離により精製した。陽性クローン
の各々のＤＮＡインサートを各種制限酵素で消化し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。それら
の配列はマクサム及びギルバート(Maxam & Gilbert) の
化学分解法(Meth.in Enzymology ６５：４９９−５６
０、１９８０年）により決定した。各配列は２回以上決
定され、８５％を越える配列が両方の鎖について決定さ
れた。
【００４３】最も大きいｃＤＮＡインサートを含有する
プラスミド（ｐＨＡＧ１）を次いで図２の頂部に示され
る計画に従ってマクサム及びギルバートの方法（前記）
に従って配列決定した。このｃＤＮＡインサートは６９
７個のヌクレオチドを含有し、及び５’末端に１２個の
Ｇ、短い非コード配列、２４個（或いは２２個）のアミ
ノ酸のシグナルペプチドをコードするリーダー配列、１
２３個のアミノ酸の成熟蛋白質をコードする３６９個の
ヌクレオチド、停止コドン、３’非コード配列の１７５
個のヌクレオチド、３６個のヌクレオチドのポリ（Ａ）
テール、及び３’末端上の２３個のＣを含むものであっ
た。このｃＤＮＡインサートは図３に示したゲノムＤＮ
Ａ配列のヌクレオチド１０６〜７３１に対応するが、ヌ
クレオチド２５２の置換（残基２３においてGly をコー
ドする）を有する。プラスミドｐＨＡＧ１は受入れ番号
４０１９２としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(Americann Type Culture Collection) に寄
託されている。
プラスミド（ｐＨＡＧ１）を次いで図２の頂部に示され
る計画に従ってマクサム及びギルバートの方法（前記）
に従って配列決定した。このｃＤＮＡインサートは６９
７個のヌクレオチドを含有し、及び５’末端に１２個の
Ｇ、短い非コード配列、２４個（或いは２２個）のアミ
ノ酸のシグナルペプチドをコードするリーダー配列、１
２３個のアミノ酸の成熟蛋白質をコードする３６９個の
ヌクレオチド、停止コドン、３’非コード配列の１７５
個のヌクレオチド、３６個のヌクレオチドのポリ（Ａ）
テール、及び３’末端上の２３個のＣを含むものであっ
た。このｃＤＮＡインサートは図３に示したゲノムＤＮ
Ａ配列のヌクレオチド１０６〜７３１に対応するが、ヌ
クレオチド２５２の置換（残基２３においてGly をコー
ドする）を有する。プラスミドｐＨＡＧ１は受入れ番号
４０１９２としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(Americann Type Culture Collection) に寄
託されている。
【００４４】約３×１０6 個のλ Charon ４Ａバクテリ
オファージよりなるヒトゲノムライブラリー［マニアテ
ィス等 (Maniatis et al.)、 Cell １５：６８７−７０
２、１９７８年］をニックトランスレーションにより放
射性標識したクローンｐＨＡＧ１のｃＤＮＡ挿入でスク
リーニングを行った［リグビー等 (Rigby et al.)、J.Mo
l.Biol. １１３：２３７−２５１、１９７７年］。ベン
トン及びデービス(Benton & Davis)の方法 (Science １
９６：１８１−１８２、１９７７年）により同定された
λＨＡＧ１と称される一つの強くハイブリダイズするフ
ァージクローンをプラーク精製し、このファージＤＮＡ
をプレートリシス（plate lysis ）法（マニアティス
等、１９８２年、前記）により単離した。このゲノムイ
ンサートを各種制限酵素で消化して分析した。このイン
サートを Pvu II で消化して生成したＤＮＡ断片は大き
さが約５キロ塩基であり、ｃＤＮＡプローブに強くハイ
ブリダイズした。この断片をプラスミドｐＢＲ３２２中
にサブクローニングし、Amershamのクローニング及び配
列決定マニュアルに説明されているような［35Ｓ］ｄＡ
ＴＰαＳを用いてジデオキシ法によりＤＮＡ配列決定に
付した［メッシング等(Messing et al.)、 Nucleic Acid
s Res.９：３０９−３２１、１９８１年；ノランダー等
(Norrander et al.)、 Gene２６：１０１−１０６、１９
８３年］。このプローブに強くハイブリダイズしたファ
ージゲノムインサートを Kpn Iで消化することにより生
成した約３kbのＤＮＡ断片をＭ１３mp１８ファージベク
ター中にサブクローニングし、合成オリゴヌクレオチド
プローブをプライマーとして用いてＤＮＡ配列決定に付
した。ゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼ Bal３１によ
る系統的削除はポンツ等(Poncz et al.)(Proc.Natl.Aca
d.Sci.ＵＳＡ７９：４２９８−４３０２、１９８２
年）、グオ及びウー(Guo & Wu)(Meth.in Enzymology １
００：６０−９６，１９８３年）により説明されている
のと実質的に同様にして行った。約９５％のゲノムＤＮ
Ａ配列は２回以上決定され、５０％を越えるゲノム配列
は両方の鎖について決定された。この配列の一部はアン
ギオゲニンのコード配列に対応した。ベクターλＨＡＧ
１は受入番号４０１９３としてアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに寄託されている。
オファージよりなるヒトゲノムライブラリー［マニアテ
ィス等 (Maniatis et al.)、 Cell １５：６８７−７０
２、１９７８年］をニックトランスレーションにより放
射性標識したクローンｐＨＡＧ１のｃＤＮＡ挿入でスク
リーニングを行った［リグビー等 (Rigby et al.)、J.Mo
l.Biol. １１３：２３７−２５１、１９７７年］。ベン
トン及びデービス(Benton & Davis)の方法 (Science １
９６：１８１−１８２、１９７７年）により同定された
λＨＡＧ１と称される一つの強くハイブリダイズするフ
ァージクローンをプラーク精製し、このファージＤＮＡ
をプレートリシス（plate lysis ）法（マニアティス
等、１９８２年、前記）により単離した。このゲノムイ
ンサートを各種制限酵素で消化して分析した。このイン
サートを Pvu II で消化して生成したＤＮＡ断片は大き
さが約５キロ塩基であり、ｃＤＮＡプローブに強くハイ
ブリダイズした。この断片をプラスミドｐＢＲ３２２中
にサブクローニングし、Amershamのクローニング及び配
列決定マニュアルに説明されているような［35Ｓ］ｄＡ
ＴＰαＳを用いてジデオキシ法によりＤＮＡ配列決定に
付した［メッシング等(Messing et al.)、 Nucleic Acid
s Res.９：３０９−３２１、１９８１年；ノランダー等
(Norrander et al.)、 Gene２６：１０１−１０６、１９
８３年］。このプローブに強くハイブリダイズしたファ
ージゲノムインサートを Kpn Iで消化することにより生
成した約３kbのＤＮＡ断片をＭ１３mp１８ファージベク
ター中にサブクローニングし、合成オリゴヌクレオチド
プローブをプライマーとして用いてＤＮＡ配列決定に付
した。ゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼ Bal３１によ
る系統的削除はポンツ等(Poncz et al.)(Proc.Natl.Aca
d.Sci.ＵＳＡ７９：４２９８−４３０２、１９８２
年）、グオ及びウー(Guo & Wu)(Meth.in Enzymology １
００：６０−９６，１９８３年）により説明されている
のと実質的に同様にして行った。約９５％のゲノムＤＮ
Ａ配列は２回以上決定され、５０％を越えるゲノム配列
は両方の鎖について決定された。この配列の一部はアン
ギオゲニンのコード配列に対応した。ベクターλＨＡＧ
１は受入番号４０１９３としてアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに寄託されている。
【００４５】アンギオゲニンに対する遺伝子は又λＨＡ
Ｇ１を Pvu II で消化することにより生成した約５キロ
ベースのＤＮＡ断片中にも見出された。このＤＮＡ断片
はｐＢＲ３２２中にサブクローニングされ、図２の底部
に示される計画を用いてジデオキシ鎖停止方法によりＤ
ＮＡ配列決定に付された。ヒトアンギオゲニンに対する
完全な遺伝子の配列（図３）はこの遺伝子が約８００個
のヌクレオチドを含有し、遺伝子のコード及び３’非コ
ード領域において介在配列がないことを示した。しかし
ながら、５’フランキング領域におけるイントロンの可
能性は最も大きいｃＤＮＡさえこの領域に達しなかった
ので排除することはできない。
Ｇ１を Pvu II で消化することにより生成した約５キロ
ベースのＤＮＡ断片中にも見出された。このＤＮＡ断片
はｐＢＲ３２２中にサブクローニングされ、図２の底部
に示される計画を用いてジデオキシ鎖停止方法によりＤ
ＮＡ配列決定に付された。ヒトアンギオゲニンに対する
完全な遺伝子の配列（図３）はこの遺伝子が約８００個
のヌクレオチドを含有し、遺伝子のコード及び３’非コ
ード領域において介在配列がないことを示した。しかし
ながら、５’フランキング領域におけるイントロンの可
能性は最も大きいｃＤＮＡさえこの領域に達しなかった
ので排除することはできない。
【００４６】アンギオゲニンに対する遺伝子はそのフラ
ンキング領域に、３個のＡｌｕ反復配列［シュミット及
びジェリネック（Schmid & Jelinek）、Science ２１
６：１０６５−１０７０、１９８２年］を含有する（図
２及び図３）。第一番目のＡｌｕ反復は遺伝子の隣接
５’フランキング領域に位置しているのに対し、第二番
目は隣接３’フランキング領域に存在した。これらの二
つのＡｌｕ反復は同様の逆方向の配置であった。第三番
目のＡｌｕ反復は遺伝子の３’フランキング領域におい
て第二のＡｌｕ配列から約５００ヌクレオチド下流に位
置し、３００ヌクレオチドの配列の３’末端にポリ
（Ａ）を有する典型的な配置であった。更に、各Ａｌｕ
反復は一対の短い直接反復配列がフランキング配置され
ていた。これらの３個のＡｌｕ反復に対するヌクレオチ
ド配列はシュミット及びジュリネック（前記）のコンセ
ンサスＡｌｕ配列に約８７％相同であった。
ンキング領域に、３個のＡｌｕ反復配列［シュミット及
びジェリネック（Schmid & Jelinek）、Science ２１
６：１０６５−１０７０、１９８２年］を含有する（図
２及び図３）。第一番目のＡｌｕ反復は遺伝子の隣接
５’フランキング領域に位置しているのに対し、第二番
目は隣接３’フランキング領域に存在した。これらの二
つのＡｌｕ反復は同様の逆方向の配置であった。第三番
目のＡｌｕ反復は遺伝子の３’フランキング領域におい
て第二のＡｌｕ配列から約５００ヌクレオチド下流に位
置し、３００ヌクレオチドの配列の３’末端にポリ
（Ａ）を有する典型的な配置であった。更に、各Ａｌｕ
反復は一対の短い直接反復配列がフランキング配置され
ていた。これらの３個のＡｌｕ反復に対するヌクレオチ
ド配列はシュミット及びジュリネック（前記）のコンセ
ンサスＡｌｕ配列に約８７％相同であった。
【００４７】仮のＴＡＴＡボックス［ゴールドバーグ、
Ｍ．Ｌ．（Gold-berg 、Ｍ．Ｌ．）、博士論文、スタン
フォード大学、１９７９年］及び転写開始部位はそれぞ
れ−３２及び＋１のヌクレオチドにおいて同定された
が、しかし、隣接部においては潜在的ＣＡＡＴボックス
は見出されなかった。しかしながら、ＴＣＡＡＴの配列
は提案されたＴＡＴＡボックスから約１９０ｂｐ上流で
あるヌクレオチド−２２５において同定された。３’末
端におけるポリアデニル化即ちメッセンジャーＲＮＡの
プロセッシングに含まれる２個のＡＡＴＡＡＡ配列［プ
ラウドフット及びブラウンリー（Proudfoot & Brownle
e）Nature ２６３：２１１−２１４、１９７６年］は
ヌクレオチド７０３及び７０７において同定された。ｍ
ＲＮＡのポリアデニル化は第二のＡＡＴＡＡＡ配列の末
端から２０ヌクレオチド下流であるヌクレオチド７３１
において生ずる。３’末端におけるｍＲＮＡのポリアデ
ニル化或いは切断にも含まれる［バーゲット（Berget）
Nature ３０９：１７９−１８２、１９８４年］ＣＡＣ
ＴＧのコンセンサス配列はヌクレオチド７４７から出発
して存在した。交互のプリン及びピリミジンを有する３
２個のヌクレオチドの伸長はヌクレオチド１４１６から
出発して見出された。この配列は遺伝子における左手方
向ヘリックス構造即ちＺ−ＤＮＡに対する潜在的領域を
与える［リッチ等（Rich et al. ）Ann. Rev. Biochem.
５３：７９１−８４６、１９８４年］。アンギオゲニ
ンに対する遺伝子のフランキング領域並びに相補的領域
におけるコンピュータサーチはオープンリーディングフ
レームを示さなかった。
Ｍ．Ｌ．（Gold-berg 、Ｍ．Ｌ．）、博士論文、スタン
フォード大学、１９７９年］及び転写開始部位はそれぞ
れ−３２及び＋１のヌクレオチドにおいて同定された
が、しかし、隣接部においては潜在的ＣＡＡＴボックス
は見出されなかった。しかしながら、ＴＣＡＡＴの配列
は提案されたＴＡＴＡボックスから約１９０ｂｐ上流で
あるヌクレオチド−２２５において同定された。３’末
端におけるポリアデニル化即ちメッセンジャーＲＮＡの
プロセッシングに含まれる２個のＡＡＴＡＡＡ配列［プ
ラウドフット及びブラウンリー（Proudfoot & Brownle
e）Nature ２６３：２１１−２１４、１９７６年］は
ヌクレオチド７０３及び７０７において同定された。ｍ
ＲＮＡのポリアデニル化は第二のＡＡＴＡＡＡ配列の末
端から２０ヌクレオチド下流であるヌクレオチド７３１
において生ずる。３’末端におけるｍＲＮＡのポリアデ
ニル化或いは切断にも含まれる［バーゲット（Berget）
Nature ３０９：１７９−１８２、１９８４年］ＣＡＣ
ＴＧのコンセンサス配列はヌクレオチド７４７から出発
して存在した。交互のプリン及びピリミジンを有する３
２個のヌクレオチドの伸長はヌクレオチド１４１６から
出発して見出された。この配列は遺伝子における左手方
向ヘリックス構造即ちＺ−ＤＮＡに対する潜在的領域を
与える［リッチ等（Rich et al. ）Ann. Rev. Biochem.
５３：７９１−８４６、１９８４年］。アンギオゲニ
ンに対する遺伝子のフランキング領域並びに相補的領域
におけるコンピュータサーチはオープンリーディングフ
レームを示さなかった。
【００４８】ヒトアンギオゲニンのアミノ酸配列はヒト
リボヌクレアーゼと約３５％相同である。これらの二つ
の蛋白質の構造は図４において比較され、そこで共通残
基は丸で囲んである。直接蛋白質配列分析により決定さ
れたジスルフィド結合の位置は更にリボヌクレアーゼと
の相同性を強調する。 実施例２：トランスフェクションされた哺乳動物細胞に
おけるアンギオゲニンの製造
リボヌクレアーゼと約３５％相同である。これらの二つ
の蛋白質の構造は図４において比較され、そこで共通残
基は丸で囲んである。直接蛋白質配列分析により決定さ
れたジスルフィド結合の位置は更にリボヌクレアーゼと
の相同性を強調する。 実施例２：トランスフェクションされた哺乳動物細胞に
おけるアンギオゲニンの製造
【００４９】トランスフェクションされた哺乳動物細胞
において、アンギオゲニンを発現するためにアンギオゲ
ニンゲノムコード配列（ＨＡＧＦ）、マウスメタロチオ
ネイン−１（ＭＴ−１）プロモーター、及びＳＶ４０プ
ロモーターに連結したＤＨＦＲ選択可能マーカーを含ん
でなる発現ベクターｐＨＡＧＦ−ＭＴ−ＤＨＦＲを構築
した。
において、アンギオゲニンを発現するためにアンギオゲ
ニンゲノムコード配列（ＨＡＧＦ）、マウスメタロチオ
ネイン−１（ＭＴ−１）プロモーター、及びＳＶ４０プ
ロモーターに連結したＤＨＦＲ選択可能マーカーを含ん
でなる発現ベクターｐＨＡＧＦ−ＭＴ−ＤＨＦＲを構築
した。
【００５０】図４に示す如く、ＨＡＧＦインサートはＰ
ｖｕII断片としてλＨＡＧ１から単離され、ＳｍａＩと
線形化されたｐＢＲ３２２中に挿入された。得られたプ
ラスミドを次いでＨＡＧＦ配列の５’未翻訳領域におい
て切断するＢｇｌIIで消化した。このＤＮＡを次いでＢ
ａｌ３１で消化して、転写開始部位からヌクレオチド＋
７における５’末端を有するＨＡＧＦ配列を生成した。
このＤＮＡを次いでＢａｍＨＩで消化した。得られた断
片末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を用い
て平滑化し、ｐＢＲ３２２及びＨＡＧＦコード配列より
なる断片を０．７％アガロースゲル上の電気泳動により
精製した。このＤＮＡをゲルから抽出し、再環化した。
得られたｐＢＲ３２２−ＨＡＧＦと称されるプラスミド
をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、アンギオゲニン
配列よりなる−３ｋｂ断片を０．７％アガロースゲル上
で電気泳動により精製した。
ｖｕII断片としてλＨＡＧ１から単離され、ＳｍａＩと
線形化されたｐＢＲ３２２中に挿入された。得られたプ
ラスミドを次いでＨＡＧＦ配列の５’未翻訳領域におい
て切断するＢｇｌIIで消化した。このＤＮＡを次いでＢ
ａｌ３１で消化して、転写開始部位からヌクレオチド＋
７における５’末端を有するＨＡＧＦ配列を生成した。
このＤＮＡを次いでＢａｍＨＩで消化した。得られた断
片末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を用い
て平滑化し、ｐＢＲ３２２及びＨＡＧＦコード配列より
なる断片を０．７％アガロースゲル上の電気泳動により
精製した。このＤＮＡをゲルから抽出し、再環化した。
得られたｐＢＲ３２２−ＨＡＧＦと称されるプラスミド
をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、アンギオゲニン
配列よりなる−３ｋｂ断片を０．７％アガロースゲル上
で電気泳動により精製した。
【００５１】最終発現ベクターを次いで次の様にして構
築した。マウスメタロチオネイン（ＭＴ−１）プロモー
ター、ヒト第IX因子コード配列、ＳＶ４０プロモータ
ー、及び修飾ＤＨＦＲ遺伝子［レビンソン等（Levinson
et al. ）、ヨーロッパ特許公開公報１１７，０６０
号］を含んでなるｐＭＴＦIX［クラチ及びパルミータ
（Kurachi and Polmiter）、Thrombosis and Hemostasi
s ５４：２８２、１９８５年］をＢａｍＨＩ及びＥｃｏ
ＲＩで消化した（図４）。ｐＵＣ１３配列及びＳＶ４０
−ＤＨＦＲ発現単位を含んでなる断片をゲル精製した。
この断片を次いでＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ＨＡＧＦ断
片に連結した。得られたベクターをｐＨＡＧＦ−ＭＴ−
ＤＨＦＲと命名した（図４）。
築した。マウスメタロチオネイン（ＭＴ−１）プロモー
ター、ヒト第IX因子コード配列、ＳＶ４０プロモータ
ー、及び修飾ＤＨＦＲ遺伝子［レビンソン等（Levinson
et al. ）、ヨーロッパ特許公開公報１１７，０６０
号］を含んでなるｐＭＴＦIX［クラチ及びパルミータ
（Kurachi and Polmiter）、Thrombosis and Hemostasi
s ５４：２８２、１９８５年］をＢａｍＨＩ及びＥｃｏ
ＲＩで消化した（図４）。ｐＵＣ１３配列及びＳＶ４０
−ＤＨＦＲ発現単位を含んでなる断片をゲル精製した。
この断片を次いでＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ＨＡＧＦ断
片に連結した。得られたベクターをｐＨＡＧＦ−ＭＴ−
ＤＨＦＲと命名した（図４）。
【００５２】プラスミドｐＨＡＧＦ−ＭＴ−ＤＨＦＲを
次いで乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞中に標準的リ
ン酸カルシウム−媒介トランスフェクション操作により
移した。ベクターを含有する細胞を３．７ｇ／ｌ Ｎａ
ＨＣＯ3 、１０％熱不活性化ウシ胎児血清及び抗生物質
を補給したグルコース及びグルタミンを含有するダルベ
ッコの改変イーグル培地（Gibco ）中において５％ＣＯ
2 中で３７℃において増殖させた。プラスミドを含有す
る細胞を次いで培養培地内においてＭＴＸの濃度を逐次
増大させることによりメトトレキセート（ＭＴＸ）耐性
について選択した。用いられたＭＴＸ濃度は１μＭ、１
０μＭ、１００μＭ及び１ｍＭであった。１ｍＭ ＭＴ
Ｘの存在下において生残った細胞を次いで８０μＭＺｎ
ＳＯ4 、２μＭＣｄＳＯ4 、或いはこれらの二つの塩の
混合物を培養培地に添加することにより誘導した。
次いで乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞中に標準的リ
ン酸カルシウム−媒介トランスフェクション操作により
移した。ベクターを含有する細胞を３．７ｇ／ｌ Ｎａ
ＨＣＯ3 、１０％熱不活性化ウシ胎児血清及び抗生物質
を補給したグルコース及びグルタミンを含有するダルベ
ッコの改変イーグル培地（Gibco ）中において５％ＣＯ
2 中で３７℃において増殖させた。プラスミドを含有す
る細胞を次いで培養培地内においてＭＴＸの濃度を逐次
増大させることによりメトトレキセート（ＭＴＸ）耐性
について選択した。用いられたＭＴＸ濃度は１μＭ、１
０μＭ、１００μＭ及び１ｍＭであった。１ｍＭ ＭＴ
Ｘの存在下において生残った細胞を次いで８０μＭＺｎ
ＳＯ4 、２μＭＣｄＳＯ4 、或いはこれらの二つの塩の
混合物を培養培地に添加することにより誘導した。
【００５３】アンギオゲニンｍＲＮＡはダーナム及びパ
ルミター（Durnam and Palmiter ）により説明されたの
と実質的に同様にしてアッセイを行った（Analyt. Bioc
hem.１３１：３８５−３９３、１９８３年）。約２．９
ｋｂインサート中の全アンギオゲニン遺伝子を含有する
Ｍ１３ｍｐ１８クローンからのセンス鎖ＤＮＡを用いて
標準曲線を作成した。アンギオゲニンのアミノ酸３５〜
４１に対するコード配列に相補的なドデカオリゴヌクレ
オチドをその５’末端において32Ｐで標識し、溶液ハイ
ブリダイゼーションにおけるプローブとして用いた。
ルミター（Durnam and Palmiter ）により説明されたの
と実質的に同様にしてアッセイを行った（Analyt. Bioc
hem.１３１：３８５−３９３、１９８３年）。約２．９
ｋｂインサート中の全アンギオゲニン遺伝子を含有する
Ｍ１３ｍｐ１８クローンからのセンス鎖ＤＮＡを用いて
標準曲線を作成した。アンギオゲニンのアミノ酸３５〜
４１に対するコード配列に相補的なドデカオリゴヌクレ
オチドをその５’末端において32Ｐで標識し、溶液ハイ
ブリダイゼーションにおけるプローブとして用いた。
【００５４】メッセンジャーＲＮＡレベルはＣｄ++誘導
を用いると２０倍を越えて上昇し、及びＺｎ++誘導に対
しては１５倍を越えた。
を用いると２０倍を越えて上昇し、及びＺｎ++誘導に対
しては１５倍を越えた。
【００５５】アンギオゲニンの存在を測定するために、
誘導された調整培地を酸性化し、凍結及び解凍し、遠心
分離し、及び上澄液を水に対して透析して凍結乾燥し
た。凍結乾燥された物質を次いで０．１Ｍナトリウムリ
ン酸緩衝液ｐＨ６．６中に溶解し、及びそれに対して透
析し、担体としてリゾチームを補給した。透析された試
料をＣＭ−５２セルロースカラムにかけ、部分的に精製
されたアンギオゲニンを１Ｍ ＮａＣｌを含有する同一
緩衝液で溶出した。溶出液をＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム
にかけ、上記と同様にして分別した。腫瘍−由来アンギ
オゲニンのクロマトグラフィー及び電気泳動特性を有す
る蛋白質が得られた。
誘導された調整培地を酸性化し、凍結及び解凍し、遠心
分離し、及び上澄液を水に対して透析して凍結乾燥し
た。凍結乾燥された物質を次いで０．１Ｍナトリウムリ
ン酸緩衝液ｐＨ６．６中に溶解し、及びそれに対して透
析し、担体としてリゾチームを補給した。透析された試
料をＣＭ−５２セルロースカラムにかけ、部分的に精製
されたアンギオゲニンを１Ｍ ＮａＣｌを含有する同一
緩衝液で溶出した。溶出液をＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム
にかけ、上記と同様にして分別した。腫瘍−由来アンギ
オゲニンのクロマトグラフィー及び電気泳動特性を有す
る蛋白質が得られた。
【００５６】得られた蛋白質について、刊行された操作
を用いてＣＡＭ法により、脈管形成活性を測定した。 実施例３：酵母におけるアンギオゲニンの製造
を用いてＣＡＭ法により、脈管形成活性を測定した。 実施例３：酵母におけるアンギオゲニンの製造
【００５７】形質転換された酵母内でアンギオゲニンを
発現するベクターは図６に図示される。それは、酵母Ａ
ＤＨIIプロモーター［ヤング等（Young et al.）Geneti
c Engineering of Microorganisms for Chemicals 、Ho
llaeneler 等編ｐ．３３５、Plenum、ニューヨーク、１
９８２年］、ＭＦα１プレ−プロ配列の部分［カージャ
ン及びヘルスコビッツ（Kurjan and Herskowitz ）、Ce
ll ３０：９３３−９４３、１９８２年］、及びＨＡＧ
Ｆ配列よりなる発現単位を含有する。
発現するベクターは図６に図示される。それは、酵母Ａ
ＤＨIIプロモーター［ヤング等（Young et al.）Geneti
c Engineering of Microorganisms for Chemicals 、Ho
llaeneler 等編ｐ．３３５、Plenum、ニューヨーク、１
９８２年］、ＭＦα１プレ−プロ配列の部分［カージャ
ン及びヘルスコビッツ（Kurjan and Herskowitz ）、Ce
ll ３０：９３３−９４３、１９８２年］、及びＨＡＧ
Ｆ配列よりなる発現単位を含有する。
【００５８】ＡＤＨII遺伝子の一部は約１５３０ｂｐの
ＳｐｈＩ断片としてプラスミドｐＡＤＲ２から得られる
［バイヤー及びヤング（Beier and Young ）、Nature
３００：７２４−７２８、１９８２年］。この断面をＭ
１３ファージベクター中にサブクローニングし、配列Ｇ
ＴＡ ＡＴＡ ＣＡＣ ＡＧＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＣ
Ｃ ＡＧＡ ＡＡを有する突然変異誘発性プライマーを
用いてゾラー等（Zoller et al. ）（Manual for Advan
ced Technigues in Molecular Cloning Course、Cold S
pring Harbor Laboratories 、１９８３年）により説明
されるのと実質的に同様して突然変異誘発を行った。突
然変異誘発ファージの複製形態はＳｐｈＩおよびＥｃｏ
ＲＩで消化し、及び約１７６ｂｐの部分的ＡＤＨIIにプ
ロモーター断片を精製した。プロモーターの上流部分を
次いで約１７６ｂｐ断片、ＡＤＨII( ｐＡＤＲ２から）
の約１ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片及びＢａｍＨＩ
＋ＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ１３を連結することにより修復
した。得られたプラスミドをｐＵＣＡＤＨ２と命名した
（図６）。
ＳｐｈＩ断片としてプラスミドｐＡＤＲ２から得られる
［バイヤー及びヤング（Beier and Young ）、Nature
３００：７２４−７２８、１９８２年］。この断面をＭ
１３ファージベクター中にサブクローニングし、配列Ｇ
ＴＡ ＡＴＡ ＣＡＣ ＡＧＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＣ
Ｃ ＡＧＡ ＡＡを有する突然変異誘発性プライマーを
用いてゾラー等（Zoller et al. ）（Manual for Advan
ced Technigues in Molecular Cloning Course、Cold S
pring Harbor Laboratories 、１９８３年）により説明
されるのと実質的に同様して突然変異誘発を行った。突
然変異誘発ファージの複製形態はＳｐｈＩおよびＥｃｏ
ＲＩで消化し、及び約１７６ｂｐの部分的ＡＤＨIIにプ
ロモーター断片を精製した。プロモーターの上流部分を
次いで約１７６ｂｐ断片、ＡＤＨII( ｐＡＤＲ２から）
の約１ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片及びＢａｍＨＩ
＋ＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ１３を連結することにより修復
した。得られたプラスミドをｐＵＣＡＤＨ２と命名した
（図６）。
【００５９】図５を参照すると、ＭＦα１遺伝子をＹＥ
ｐ１３［ナスミス及びタッチェル（Nasmyth and Tatche
ll）Cell １９：７５３−７６４、１９８０年］のＢａ
ｍＨＩ部位にクローン化されｍａｔα2 突然変異の相補
により同定された部分的Ｓａｕ３Ａ断片の酵母ゲノムラ
イブラリーから得られた。一つのその様なクローンをｐ
ＺＡ２と命名する。ＭＦα’配列を−７１の位置におい
てＨｉｎｆＩで切断し、末端をＤＮＡポリメラーゼＩ
（クレノウ断片）を用いて充填し、ＥｃｏＲＩリンカー
を付加する。シグナル配列を次いでＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄIII 断片として単離し、ｐＵＣ１２中にサブクローニ
ングしてプラスミドｐＵＣＰＰαＦを構築する。
ｐ１３［ナスミス及びタッチェル（Nasmyth and Tatche
ll）Cell １９：７５３−７６４、１９８０年］のＢａ
ｍＨＩ部位にクローン化されｍａｔα2 突然変異の相補
により同定された部分的Ｓａｕ３Ａ断片の酵母ゲノムラ
イブラリーから得られた。一つのその様なクローンをｐ
ＺＡ２と命名する。ＭＦα’配列を−７１の位置におい
てＨｉｎｆＩで切断し、末端をＤＮＡポリメラーゼＩ
（クレノウ断片）を用いて充填し、ＥｃｏＲＩリンカー
を付加する。シグナル配列を次いでＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄIII 断片として単離し、ｐＵＣ１２中にサブクローニ
ングしてプラスミドｐＵＣＰＰαＦを構築する。
【００６０】ＨＡＧＦコード配列をλＨＡＧ１から１１
１５ｂｐＡｃｃＩ断片として単離する。この断片末端を
ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を用いて平滑化
し、ＨｉｎｄIII リンカーを末端に付加する。得られた
断片をＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＶで消化し、約６６６
ｂｐ断片をゲル精製する。ＳａｌＩリンカーをＥｃｏＲ
Ｖ末端に連結し、断片をＳａｌＩにより切断し、約６７
４ｂｐの断片をゲル精製する。
１５ｂｐＡｃｃＩ断片として単離する。この断片末端を
ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を用いて平滑化
し、ＨｉｎｄIII リンカーを末端に付加する。得られた
断片をＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＶで消化し、約６６６
ｂｐ断片をゲル精製する。ＳａｌＩリンカーをＥｃｏＲ
Ｖ末端に連結し、断片をＳａｌＩにより切断し、約６７
４ｂｐの断片をゲル精製する。
【００６１】このＨＡＧＦ配列を次いでＭＦα１シグナ
ル配列の一部に連結する。プラスミドｐＵＣＰＰαＦを
ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄIII で消化し、２３７ｂｐ断片を
単離する。この約６７４ｂｐ ＨＡＧＦ断片及び２３７
ｂｐ ＭＦα１断片をＰｓｔＩ＋ＳａｌＩ切断ｐＵＣ１
３に連結する。得られた組換えプラスミドをＰｓｔＩ及
びＳａｌＩで消化し、約９１１ｂｐ ＭＦα１−ＨＡＧ
Ｆ断片をゲル精製し、ＰｓｔＩ＋ＳａｌＩ切断Ｍ１３ｍ
ｐ１０に挿入する（複製形態）。ＭＦα１のLys-Arg プ
ロセス部位とアンギオゲニンの第一アミノ酸の間の正確
な連結は突然変異誘発性プライマーＴＧＧ ＡＴＡ Ａ
ＡＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＡＴＡ ＡＣＴＣを用いて得ら
れた組換えファージin vitroの突然変異誘発により達成
される。突然変異誘発ファージの複製形態はＰｓｔＩ及
びＳａｌＩで切断され約８８０ｂｐのＭＦα１−ＨＡＧ
Ｆ断片をゲル精製する。
ル配列の一部に連結する。プラスミドｐＵＣＰＰαＦを
ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄIII で消化し、２３７ｂｐ断片を
単離する。この約６７４ｂｐ ＨＡＧＦ断片及び２３７
ｂｐ ＭＦα１断片をＰｓｔＩ＋ＳａｌＩ切断ｐＵＣ１
３に連結する。得られた組換えプラスミドをＰｓｔＩ及
びＳａｌＩで消化し、約９１１ｂｐ ＭＦα１−ＨＡＧ
Ｆ断片をゲル精製し、ＰｓｔＩ＋ＳａｌＩ切断Ｍ１３ｍ
ｐ１０に挿入する（複製形態）。ＭＦα１のLys-Arg プ
ロセス部位とアンギオゲニンの第一アミノ酸の間の正確
な連結は突然変異誘発性プライマーＴＧＧ ＡＴＡ Ａ
ＡＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＡＴＡ ＡＣＴＣを用いて得ら
れた組換えファージin vitroの突然変異誘発により達成
される。突然変異誘発ファージの複製形態はＰｓｔＩ及
びＳａｌＩで切断され約８８０ｂｐのＭＦα１−ＨＡＧ
Ｆ断片をゲル精製する。
【００６２】図６を参照すると、ＡＤＨII−ＭＦα１−
ＨＡＧＦ発現単位が次いで組立てられる。プラスミドｐ
ＵＣＡＤＨ２をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、約
１２００ｂｐのＡＤＨII断片がゲル精製される。プラス
ミドｐＵＣＰＰαＦをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII で切
断し、約３４０ｂｐ ＭＦα１断片をゲル精製する。こ
れらの二つの断片をＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄIII 切断ｐＵ
Ｃ１２に連結してｐＵＣＡＤＨＰＰを構築する。このプ
ラスミドをＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化し、約１３０
０ｂｐＡＤＨII−ＭＦα１断片を精製する。この断片及
び約８８０ｂｐのＭＦα１−ＨＡＧＦ断片を次いで三重
連結でＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩ切断ｐＵＣ１２に連結す
る。得られたプラスミドをｐＵＣＡＭＡと命名する。
ＨＡＧＦ発現単位が次いで組立てられる。プラスミドｐ
ＵＣＡＤＨ２をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、約
１２００ｂｐのＡＤＨII断片がゲル精製される。プラス
ミドｐＵＣＰＰαＦをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII で切
断し、約３４０ｂｐ ＭＦα１断片をゲル精製する。こ
れらの二つの断片をＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄIII 切断ｐＵ
Ｃ１２に連結してｐＵＣＡＤＨＰＰを構築する。このプ
ラスミドをＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化し、約１３０
０ｂｐＡＤＨII−ＭＦα１断片を精製する。この断片及
び約８８０ｂｐのＭＦα１−ＨＡＧＦ断片を次いで三重
連結でＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩ切断ｐＵＣ１２に連結す
る。得られたプラスミドをｐＵＣＡＭＡと命名する。
【００６３】この酵母発現ベクターｐＹＡＧＦはｐＵＣ
ＡＭＡからのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 発現単位断片を
ＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄIII 消化ＹＥｐ１３に連結するこ
とにより構築した。
ＡＭＡからのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 発現単位断片を
ＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄIII 消化ＹＥｐ１３に連結するこ
とにより構築した。
【００６４】酵母細胞はｐＹＡＧＦにより形質転換さ
れ、常法により培養された。アンギオゲニンは実質的に
上記と同様にして細胞抽出物或いは培養培地から精製し
た。
れ、常法により培養された。アンギオゲニンは実質的に
上記と同様にして細胞抽出物或いは培養培地から精製し
た。
【００６５】以上の説明から、本発明の特別の実施態様
が例示を目的として説明されたが、各種修正が本発明の
趣旨及び範囲から離れることなくなされることが了解さ
れるであろう。従って、本発明は特許請求の範囲以外に
は限定されるものではない。
が例示を目的として説明されたが、各種修正が本発明の
趣旨及び範囲から離れることなくなされることが了解さ
れるであろう。従って、本発明は特許請求の範囲以外に
は限定されるものではない。
【図１】ヒト腺癌ＨＴ−２９細胞から精製されたアンギ
オゲニンのアミノ酸配列の図示である。
オゲニンのアミノ酸配列の図示である。
【図２】アンギオゲニンｃＤＮＡ及びゲノムクローンの
配列決定のために用いられる計画を図示するものであ
る。頂部部分はｃＤＮＡを指し、及び底部部分はゲノム
ＤＮＡを指す。実線の棒はコード領域を示し、矢印は配
列決定された断片を示す。三つのＡｌｕ配列の位置及び
方向は大きな斜線を付した矢印により示される。
配列決定のために用いられる計画を図示するものであ
る。頂部部分はｃＤＮＡを指し、及び底部部分はゲノム
ＤＮＡを指す。実線の棒はコード領域を示し、矢印は配
列決定された断片を示す。三つのＡｌｕ配列の位置及び
方向は大きな斜線を付した矢印により示される。
【図３】λＨＡＧ１におけるゲノムＤＮＡインサートの
配列の一部の図示である。ｐＨＡＧ１のｃＤＮＡインサ
ートはヌクレオチド２５２において置換を有し、ゲノム
ＤＮＡのヌクレオチド１０６〜７３１に対応する。
配列の一部の図示である。ｐＨＡＧ１のｃＤＮＡインサ
ートはヌクレオチド２５２において置換を有し、ゲノム
ＤＮＡのヌクレオチド１０６〜７３１に対応する。
【図４】哺乳動物細胞発現ベクターｐＨＡＧＦ−ＭＴ−
ＤＨＦＲの構築の図示である。
ＤＨＦＲの構築の図示である。
【図５】酵母発現ベクターｐＹＡＧＦの構築の図示であ
る。
る。
【図６】酵母発現ベクターｐＹＡＧＦの構築の図示であ
る。
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (2)
- 【請求項１】 下記に示すアミノ酸配列を有する蛋白質
を製造する方法であって、哺乳動物細胞又は酵母細胞内
に該蛋白質をコードするＤＮＡ配列及び該ＤＮＡ配列の
上流に操作可能に連結されたプロモーター配列を含んで
なるＤＮＡ構築物を導入する工程、該細胞を適当な培地
中で増殖させる工程、及びその蛋白質を該細胞から分離
する工程を含んでなることを特徴とする方法： - 【請求項２】 該プロモーターがメタロチオネイン遺伝
子プロモーターである、請求項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US77065785A | 1985-08-28 | 1985-08-28 | |
| US770657 | 1985-09-20 | ||
| US06/778,547 US4721672A (en) | 1985-08-28 | 1985-09-20 | CDNA and gene for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression |
| US778547 | 2010-05-12 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50244786A Division JPH0638749B2 (ja) | 1985-08-28 | 1986-04-16 | ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃｄｎａ及び遺伝子及び発現方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0686687A JPH0686687A (ja) | 1994-03-29 |
| JPH0755156B2 true JPH0755156B2 (ja) | 1995-06-14 |
Family
ID=27118341
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50244786A Expired - Lifetime JPH0638749B2 (ja) | 1985-08-28 | 1986-04-16 | ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃｄｎａ及び遺伝子及び発現方法 |
| JP5098330A Expired - Lifetime JPH0755156B2 (ja) | 1985-08-28 | 1993-04-02 | ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃＤＮＡ及び遺伝子及び発現方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50244786A Expired - Lifetime JPH0638749B2 (ja) | 1985-08-28 | 1986-04-16 | ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃｄｎａ及び遺伝子及び発現方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4721672A (ja) |
| EP (1) | EP0235162B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0638749B2 (ja) |
| AT (1) | ATE71632T1 (ja) |
| CA (1) | CA1316132C (ja) |
| DE (1) | DE3683482D1 (ja) |
| DK (1) | DK215287D0 (ja) |
| WO (1) | WO1987001372A1 (ja) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4721672A (en) * | 1985-08-28 | 1988-01-26 | President And Fellows Of Harvard College | CDNA and gene for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression |
| US4966849A (en) * | 1985-09-20 | 1990-10-30 | President And Fellows Of Harvard College | CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression |
| FR2610324A1 (fr) * | 1987-01-29 | 1988-08-05 | Genetica Sa | Preparation par voie microbiologique de l'angiogenine humaine et conversion de l'enzyme ainsi obtenue en sa forme active |
| US4808402A (en) * | 1987-05-29 | 1989-02-28 | Northwestern University | Method and compositions for modulating neovascularization |
| US5008196A (en) * | 1987-08-21 | 1991-04-16 | Monsanto Company | Stimulation of endothelial cell growth |
| FR2623509B1 (fr) * | 1987-11-19 | 1990-04-20 | Centre Nat Rech Scient | Proteine de 17 kd a action angiogenique, son procede d'isolement a partir de lait de mammiferes, compositions therapeutiques la contenant, procede de detection et/ou de dosage et reactifs immunologiques de detection et de dosage des angiogenines de mammiferes, de leurs homologues et de leurs fragments |
| US4900673A (en) * | 1988-03-28 | 1990-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Mutant human angiogenin (angiogenesis factor with superior angiogenin activity) genes therefor and methods of expression |
| EP0422104A4 (en) * | 1988-06-22 | 1991-11-21 | Synergen, Inc. | Angiogenic potentiating peptides which potentiate angiogenic factors |
| US6899882B1 (en) * | 1989-03-24 | 2005-05-31 | The Regents Of The University Of California | Endothelial cell growth factor methods of isolation and expression |
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