JPH0463676B2 - - Google Patents
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- JPH0463676B2 JPH0463676B2 JP59190521A JP19052184A JPH0463676B2 JP H0463676 B2 JPH0463676 B2 JP H0463676B2 JP 59190521 A JP59190521 A JP 59190521A JP 19052184 A JP19052184 A JP 19052184A JP H0463676 B2 JPH0463676 B2 JP H0463676B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- culture
- pseudomonas
- methanol
- stage
- bacterial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明は、メタルノール資化性かつ菌体内にポ
リ−β−ヒドロキシ酪酸を蓄積する能力を有する
シユードモナス属細菌を用い、第１段階で高菌体
濃度に増殖せしめ、第２段階で培地の窒素を欠乏
せしめて培養を行なうポリ−β−ヒドロキシ酪酸
（以下PHBと称することがある）の製法に関す
る。 PHBは種々の細菌中に貯蔵物質として存在す
ることが知られ、かかる天然ポリエステルが酵素
により加水分解をうけることから、最近は易分解
性高分子材料としての新しい用途が期待されてい
る。たとえば、医者、農薬の製剤用添加物および
医療材料として使うことができる。 （従来の技術） 従来、メタノールを炭素源とするPHBの微生
物学的製法の研究としては、アゾトバクター・ベ
イジエリンキーおよびヒドロゲノモナス・ユウト
ロフアが特定の条件下でメタノールからPHBを
生成した報告がみられるが、それら細菌はメタノ
ールを資化できない。メタノールを資化して
PHBを生成する菌株としては、英国特許第
1370892号にハイフオミクロビウム・ヴアリアビ
レおよびシユードモナス・ロゼア種のうちの特定
の菌株が記載されている。さらに、J.Gemeral
Microbiology1977，98，265−272には、メチロ
バクテリウム・オルガノフイラムおよびシユード
モナスAM−１がそれぞれメタノールからPHB
を生成することが記載されている。しかし、上記
のメタルール資化性細菌は、いずれも充分に高い
PHB収量が得られないか、あるいは生産された
PHBの分子量が低い（40〜50000）ものしか得ら
れない欠点が認められている。その後、メタノー
ルを資化して高分子量のPHBを菌体内に蓄積す
るメチロバクテリウム・オルガノフイラムのある
特定の菌株が数種類発表されている（特開昭56−
117793）。 （発明が解決しようとする問題点） 前記メチロバクテリウム・オリガノフイラムの
菌株を使用する方法においても、高分子量の
PHBを高濃度に生成させることにおいて、未だ
充分であるとはいえないものである。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、既知のシユードモナス・ロゼア
種およびシユードモナスAM−１とは明らかに異
なるシユードモナス属細菌のいくつかの菌株が、
メタノールを資化して高分子量のPHBを高濃度
に生成することを見出した。すなわち、代表的菌
株として、シユードモナス・メタノリチカ（微工
研菌寄第2698号）、シユードモナス・メタノボラ
ンス（微工研菌寄第2695号）、シユードモナス・
メタノアルブム（微工研菌寄第2699号）、シユー
ドモナス・メチリカ（微工研菌寄第2701号）、等
が使用される。また、これら菌株を人工的に変異
処理を加えて誘導される変異株であつても、メタ
ノールを資化して高分子量のPHBを菌体内に生
成するシユードモナス属細菌も同様に使用され
る。 本発明に用いる微生物の培養条件としては、通
常の微生物培養条件と顕著に変わる点として、第
１に、メタノール濃度が0.1〜1.0g／ｌの範囲に
なるように保持しつつ培養することであり、かく
することにより、従来法たとえば特開昭56−
117793の場合、たかだか10〜30g／ｌの菌体濃度
に対して、本発明方法は40〜200g／ｌと約数倍
の菌体濃度に達する。 第２に、培地の溶存酸素濃度が１〜3ppmとな
るように、高攪拌条件下に空気または必要に応じ
て酸素ガスを供給しつつ培養することであり、そ
の溶存酸素濃度が1ppm未満では、培養時間が著
しく増加して好ましくない。 第３に、微生物の増殖に充分量の窒素源を、た
とえばNH+ 4として0.05〜0.2g／ｌの濃度となる
ように保持しつつ培養する第１段階の培養行程
と、次いで、培地の遊離窒素源が飢餓の状態、つ
まり事実上NH+ 4の供給を中止して培養する第２
段階の培養行程からなることであり、かかる第１
段階において、微生物は少なくとも30〜150g／
ｌの菌体濃度まで成育し、この時の菌体内の
PHBは約10〜30％に過ぎないが、第２段階の増
殖（菌体増加率として20〜30％増が望ましい）で
40〜200g／ｌの菌体濃度まで成育した菌体内
PHB含量が40〜70％に達し、したがつて、培養
液あたりのPHBの生産量としては、従来法たと
えば前記特開昭56−117793の場合が約７〜21g／
ｌであるのに対し、本発明方法においては約30〜
130g／ｌが得られる。 培養の第１段階におけるメタノールの供給は、
窒素源たとえばNH+ 4の供給を一定の割合、たえ
ばメタノール対33％アンモニア水が１対４の割合
で連動して供給すると、極めて安定した培養管理
ができる。培養の第１段階と第２段階では、メタ
ノールの供給の他に菌体増殖に必要な栄養源を供
給する。 それら栄養源としては、通常の発酵に用いられ
る無機物、たとえば、リン酸カリウム、リン酸ナ
トリウム、硫酸、硫酸マグネシウムの他に、鉄、
マンガン、亜鉛、カルシウム、銅、コバルト等の
塩類の添加が有効である。また、必要に応じて有
機栄養源、たとえば、大豆蛋白加水分解液、廃糖
蜜、コーン・スチープ・リカー、酵母エキス等を
添加することも有効である。 次いで、培養温度は25〜40℃で、最も好ましく
は30℃である。培養液のpHは６〜８、好ましく
は6.5〜7.5の範囲に保つべく苛性アルカリによつ
て調整する。培養時間は菌体生成濃度により変化
するが、たとえば、培養の第２段階で約150g／
ｌの菌体濃度を達成する場合３日程度であり、第
２段階で約200g／ｌの菌体濃度を得る場合さら
に２日程度である。 かくして、PHBは微生物菌体内に顆粒として
生成されているから、培養後に遠心分離法等の公
知の分離方法により菌体を分離する。次いで、水
洗後、クリーム状菌体のまま菌体破壊処理する
か、もしくは菌体の水性懸濁液を噴霧乾燥処理し
て、これから適当な溶媒でPHBを抽出すること
ができる。PHB抽出溶媒の例としては、クロロ
ホルム等のハロゲン化炭化水素が適当である。ま
た、必要に応じてクロロホルム−メタノール混液
（２：１）にてPHBを抽出することもできる。次
に抽出液を蒸発乾固した後、再びクロロホルム等
のハロゲン化炭化水素に溶解し、残査を濾別して
得られる濾液から蒸発乾固することにより、糖製
PHBを収得する。 （発明の効果） 本発明によれば、得られるPHBの純度は98.5
〜99％を示し、高分子量のPHBを高濃度に製造
することができる。 （実施例） 以下、本発明を実施例により説明する。 実施例 １ スラント培地〔リン酸１カリウム3g／ｌ、リ
ン酸２カリウム4g／ｌ、塩化アンモニウム0.8g／
ｌ、硫酸マグネシウム（７水塩）0.2g／ｌ、メタ
ノール10ml／ｌ、チアミン塩酸塩0.1mg／ｌ、リ
ボフラビン0.2mg／ｌ、パントテン酸カルシウム
0.2mg／ｌ、ピチオン0.01mg／ｌ、パラアミノ安
息香酸0.1mg／ｌ、ニコチン酸0.2mg／ｌ、寒天
20g／ｌ、pH7.0〕にシユードモナス・メタノリ
チカ（微工研菌寄第2698号）を接種し、24時間、
30℃で培養し、保存用スラントとした。つぎに、
第１表の前培養培地を500ml容の揺盪フラスコに
100ml入れ、120℃、15分間殺菌した。なお、メ
タノールは別に準備し、培養開始前に添加した。
この培地に、先に培養した保存用スラントから接
種し、30℃、３日間振盪培養して種培養とした。
種培養液約1lを集め、無菌的に遠心集菌した。
リ−β−ヒドロキシ酪酸を蓄積する能力を有する
シユードモナス属細菌を用い、第１段階で高菌体
濃度に増殖せしめ、第２段階で培地の窒素を欠乏
せしめて培養を行なうポリ−β−ヒドロキシ酪酸
（以下PHBと称することがある）の製法に関す
る。 PHBは種々の細菌中に貯蔵物質として存在す
ることが知られ、かかる天然ポリエステルが酵素
により加水分解をうけることから、最近は易分解
性高分子材料としての新しい用途が期待されてい
る。たとえば、医者、農薬の製剤用添加物および
医療材料として使うことができる。 （従来の技術） 従来、メタノールを炭素源とするPHBの微生
物学的製法の研究としては、アゾトバクター・ベ
イジエリンキーおよびヒドロゲノモナス・ユウト
ロフアが特定の条件下でメタノールからPHBを
生成した報告がみられるが、それら細菌はメタノ
ールを資化できない。メタノールを資化して
PHBを生成する菌株としては、英国特許第
1370892号にハイフオミクロビウム・ヴアリアビ
レおよびシユードモナス・ロゼア種のうちの特定
の菌株が記載されている。さらに、J.Gemeral
Microbiology1977，98，265−272には、メチロ
バクテリウム・オルガノフイラムおよびシユード
モナスAM−１がそれぞれメタノールからPHB
を生成することが記載されている。しかし、上記
のメタルール資化性細菌は、いずれも充分に高い
PHB収量が得られないか、あるいは生産された
PHBの分子量が低い（40〜50000）ものしか得ら
れない欠点が認められている。その後、メタノー
ルを資化して高分子量のPHBを菌体内に蓄積す
るメチロバクテリウム・オルガノフイラムのある
特定の菌株が数種類発表されている（特開昭56−
117793）。 （発明が解決しようとする問題点） 前記メチロバクテリウム・オリガノフイラムの
菌株を使用する方法においても、高分子量の
PHBを高濃度に生成させることにおいて、未だ
充分であるとはいえないものである。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、既知のシユードモナス・ロゼア
種およびシユードモナスAM−１とは明らかに異
なるシユードモナス属細菌のいくつかの菌株が、
メタノールを資化して高分子量のPHBを高濃度
に生成することを見出した。すなわち、代表的菌
株として、シユードモナス・メタノリチカ（微工
研菌寄第2698号）、シユードモナス・メタノボラ
ンス（微工研菌寄第2695号）、シユードモナス・
メタノアルブム（微工研菌寄第2699号）、シユー
ドモナス・メチリカ（微工研菌寄第2701号）、等
が使用される。また、これら菌株を人工的に変異
処理を加えて誘導される変異株であつても、メタ
ノールを資化して高分子量のPHBを菌体内に生
成するシユードモナス属細菌も同様に使用され
る。 本発明に用いる微生物の培養条件としては、通
常の微生物培養条件と顕著に変わる点として、第
１に、メタノール濃度が0.1〜1.0g／ｌの範囲に
なるように保持しつつ培養することであり、かく
することにより、従来法たとえば特開昭56−
117793の場合、たかだか10〜30g／ｌの菌体濃度
に対して、本発明方法は40〜200g／ｌと約数倍
の菌体濃度に達する。 第２に、培地の溶存酸素濃度が１〜3ppmとな
るように、高攪拌条件下に空気または必要に応じ
て酸素ガスを供給しつつ培養することであり、そ
の溶存酸素濃度が1ppm未満では、培養時間が著
しく増加して好ましくない。 第３に、微生物の増殖に充分量の窒素源を、た
とえばNH+ 4として0.05〜0.2g／ｌの濃度となる
ように保持しつつ培養する第１段階の培養行程
と、次いで、培地の遊離窒素源が飢餓の状態、つ
まり事実上NH+ 4の供給を中止して培養する第２
段階の培養行程からなることであり、かかる第１
段階において、微生物は少なくとも30〜150g／
ｌの菌体濃度まで成育し、この時の菌体内の
PHBは約10〜30％に過ぎないが、第２段階の増
殖（菌体増加率として20〜30％増が望ましい）で
40〜200g／ｌの菌体濃度まで成育した菌体内
PHB含量が40〜70％に達し、したがつて、培養
液あたりのPHBの生産量としては、従来法たと
えば前記特開昭56−117793の場合が約７〜21g／
ｌであるのに対し、本発明方法においては約30〜
130g／ｌが得られる。 培養の第１段階におけるメタノールの供給は、
窒素源たとえばNH+ 4の供給を一定の割合、たえ
ばメタノール対33％アンモニア水が１対４の割合
で連動して供給すると、極めて安定した培養管理
ができる。培養の第１段階と第２段階では、メタ
ノールの供給の他に菌体増殖に必要な栄養源を供
給する。 それら栄養源としては、通常の発酵に用いられ
る無機物、たとえば、リン酸カリウム、リン酸ナ
トリウム、硫酸、硫酸マグネシウムの他に、鉄、
マンガン、亜鉛、カルシウム、銅、コバルト等の
塩類の添加が有効である。また、必要に応じて有
機栄養源、たとえば、大豆蛋白加水分解液、廃糖
蜜、コーン・スチープ・リカー、酵母エキス等を
添加することも有効である。 次いで、培養温度は25〜40℃で、最も好ましく
は30℃である。培養液のpHは６〜８、好ましく
は6.5〜7.5の範囲に保つべく苛性アルカリによつ
て調整する。培養時間は菌体生成濃度により変化
するが、たとえば、培養の第２段階で約150g／
ｌの菌体濃度を達成する場合３日程度であり、第
２段階で約200g／ｌの菌体濃度を得る場合さら
に２日程度である。 かくして、PHBは微生物菌体内に顆粒として
生成されているから、培養後に遠心分離法等の公
知の分離方法により菌体を分離する。次いで、水
洗後、クリーム状菌体のまま菌体破壊処理する
か、もしくは菌体の水性懸濁液を噴霧乾燥処理し
て、これから適当な溶媒でPHBを抽出すること
ができる。PHB抽出溶媒の例としては、クロロ
ホルム等のハロゲン化炭化水素が適当である。ま
た、必要に応じてクロロホルム−メタノール混液
（２：１）にてPHBを抽出することもできる。次
に抽出液を蒸発乾固した後、再びクロロホルム等
のハロゲン化炭化水素に溶解し、残査を濾別して
得られる濾液から蒸発乾固することにより、糖製
PHBを収得する。 （発明の効果） 本発明によれば、得られるPHBの純度は98.5
〜99％を示し、高分子量のPHBを高濃度に製造
することができる。 （実施例） 以下、本発明を実施例により説明する。 実施例 １ スラント培地〔リン酸１カリウム3g／ｌ、リ
ン酸２カリウム4g／ｌ、塩化アンモニウム0.8g／
ｌ、硫酸マグネシウム（７水塩）0.2g／ｌ、メタ
ノール10ml／ｌ、チアミン塩酸塩0.1mg／ｌ、リ
ボフラビン0.2mg／ｌ、パントテン酸カルシウム
0.2mg／ｌ、ピチオン0.01mg／ｌ、パラアミノ安
息香酸0.1mg／ｌ、ニコチン酸0.2mg／ｌ、寒天
20g／ｌ、pH7.0〕にシユードモナス・メタノリ
チカ（微工研菌寄第2698号）を接種し、24時間、
30℃で培養し、保存用スラントとした。つぎに、
第１表の前培養培地を500ml容の揺盪フラスコに
100ml入れ、120℃、15分間殺菌した。なお、メ
タノールは別に準備し、培養開始前に添加した。
この培地に、先に培養した保存用スラントから接
種し、30℃、３日間振盪培養して種培養とした。
種培養液約1lを集め、無菌的に遠心集菌した。
【表】
一方、2l容量のジヤー培養槽に、第１表の殺菌
した基本培地750ml仕込み、上記種菌体を全量添
加して、30℃に保温しつつ通気攪拌培養を開始し
た。この培養開始と共に、培養液中のメタノーを
定期的に測定して、メタノール濃度が約0.5g／ｌ
となるようにメタノールを常時添加し、同期に33
％アンモニア水および第２表の無機塩溶液をそれ
ぞれ液量比0.25（33％アンモニア水ml／メタノー
ルml）および0.063（無機塩溶液ml／メタノール
ml）となるように添加した。培地のpHは、常時
7.0となるように水酸化カリウムを用いて調節し
た。培養液中の溶存酸素（DO）は、２〜3ppm
となるように最初攪拌機の回転数を500rpmに調
節し、その後、逐次回転数を上げ、最終的（培養
約60〜120時間）に1500rpmまで増大させた。さ
らにこの間、空気および純酸素を供給することに
よりDOレベルを保持した。培養開始後約75時間
において、33％アンモニア水の添加のみを中止し
て培養を継続し、培地中の遊離アンモニアがほぼ
完全に消費されたことを確認して培養を終了とし
た（全培養時間144時間）。培養液中の菌体濃度は
80.5g／ｌ、菌体中のPHB含有量は52％であつ
た。
した基本培地750ml仕込み、上記種菌体を全量添
加して、30℃に保温しつつ通気攪拌培養を開始し
た。この培養開始と共に、培養液中のメタノーを
定期的に測定して、メタノール濃度が約0.5g／ｌ
となるようにメタノールを常時添加し、同期に33
％アンモニア水および第２表の無機塩溶液をそれ
ぞれ液量比0.25（33％アンモニア水ml／メタノー
ルml）および0.063（無機塩溶液ml／メタノール
ml）となるように添加した。培地のpHは、常時
7.0となるように水酸化カリウムを用いて調節し
た。培養液中の溶存酸素（DO）は、２〜3ppm
となるように最初攪拌機の回転数を500rpmに調
節し、その後、逐次回転数を上げ、最終的（培養
約60〜120時間）に1500rpmまで増大させた。さ
らにこの間、空気および純酸素を供給することに
よりDOレベルを保持した。培養開始後約75時間
において、33％アンモニア水の添加のみを中止し
て培養を継続し、培地中の遊離アンモニアがほぼ
完全に消費されたことを確認して培養を終了とし
た（全培養時間144時間）。培養液中の菌体濃度は
80.5g／ｌ、菌体中のPHB含有量は52％であつ
た。
【表】
実施例 ２
シユードモナス・メタノボランス（微工研菌寄
第2695号）、シユードモナス・メタノアルブム
（微工研菌寄第2699号）、シユードモナス・メチリ
カ（微工研菌寄第2701号）を用いた他は、実施例
１とまつたく同様にして培養した。各微生物の培
養終了液中の菌体濃度ならびに菌体中のPHB含
有量を測定した結果をまとめて第３表に示した。
第2695号）、シユードモナス・メタノアルブム
（微工研菌寄第2699号）、シユードモナス・メチリ
カ（微工研菌寄第2701号）を用いた他は、実施例
１とまつたく同様にして培養した。各微生物の培
養終了液中の菌体濃度ならびに菌体中のPHB含
有量を測定した結果をまとめて第３表に示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ メタノールを炭素源とし、微生物菌体内にポ
リーβ−ヒドロキシ酪酸を蓄積する能力を有する
シユードモナス属に属する細菌を、第１段階にお
いて30〜150g／ｌの菌体を含むようになるまで
培養し、次いで、第２段階において窒素飢餓条件
下で培養を継続することを特徴とするポリ−β−
ヒドロキシ酪酸の製法。 ２ 細菌の培養に供給される主炭素源であるメタ
ノールを、培地中に0.1〜1.0g／ｌ濃度の範囲に
保持しつつ培養を行なう特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ３ 細菌の培養液中の溶存酸素濃度を１〜3ppm
の範囲に保持しつつ培養を行なう特許請求の範囲
第１請記載の方法。 ４ 細菌の培養の第１段階における培地上清中、
窒素の量が菌体の生成に十分な濃度として、
NH4 +を0.05〜0.2g／ｌに常時保持し、第２段階
における培地の窒素の量は第１段階より少ない量
に事実上NH4 +の欠乏下に保持して培養を行なう
特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに
記載の方法。 ５ 細菌がシユードモナス・メタノリチカ
（Pseudomonas methanolytica）、シユードモナ
ス・メタノボランス（Pseudomonas
methanovorans）、シユードモナス・メタノアル
ブム（Pseudomonas methanoalbum）、シユー
ドモナス・メチリカ（Pseudomonas methylica）
からなる群より選択されるシユードモナス属細菌
である特許請求の範囲第１項ないし第４項のいず
れかに記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59190521A JPS6170991A (ja) | 1984-09-13 | 1984-09-13 | 微生物によるポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59190521A JPS6170991A (ja) | 1984-09-13 | 1984-09-13 | 微生物によるポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6170991A JPS6170991A (ja) | 1986-04-11 |
| JPH0463676B2 true JPH0463676B2 (ja) | 1992-10-12 |
Family
ID=16259472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59190521A Granted JPS6170991A (ja) | 1984-09-13 | 1984-09-13 | 微生物によるポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6170991A (ja) |
-
1984
- 1984-09-13 JP JP59190521A patent/JPS6170991A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6170991A (ja) | 1986-04-11 |
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