JPH04636B2 - - Google Patents

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JPH04636B2
JPH04636B2 JP13175082A JP13175082A JPH04636B2 JP H04636 B2 JPH04636 B2 JP H04636B2 JP 13175082 A JP13175082 A JP 13175082A JP 13175082 A JP13175082 A JP 13175082A JP H04636 B2 JPH04636 B2 JP H04636B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は多層分析材料に関し、特に液体試料中
の過酸化水素の定量を実施する場合、または特定
の成分をオキシダーゼ酵素反応系に導入し生成し
た過酸化水素の定量により液体試料中の特定の成
分の定量を実施する場合に有効なペルオキシダー
ゼを含む過酸化水素検出呈色指示薬系を含む多層
分析材料（多層分析要素、多層分析フイルム、多
層分析素子などとも称される）の改良に関するも
のである。 オキシダーゼ酵素を用い、被検物質又はその反
応生成物を酸化すると同時に生成されるH2O2を
適当な手段により定量する定量法は、近年ますま
す重要になつてきている。その理由はペルオキシ
ダーゼを用いて色素の生成反応に導き、比色的に
H2O2を定量する方法をはじめとして、電極反応
などの手段によりH2O2を定量する方法などH2O2
の定量は確実に実施できるからである。 このような原理に基づく、比色定量法として
は、トラインダー（P.Trinder）が導入した試薬
系を用いる方法（「Ann.Clin.Biochem.」６、24
−27（1969））がよく知られている。この方法は、
オキシダーゼ酵素によつて生成するH2O2にペル
オキシダーゼを作用させ、４−アミノアンチピリ
ン（またはその類縁体）とフエノール類（または
ナフトール類）との酸化カツプリング反応を起さ
せ、生成した色素を定量するものである。この反
応系の利点は、オキシダーゼ酵素の種類を変えて
も同じ検出系を利用することができる点にあり、
広く、各種の分析項目への応用が検討されてい
る。これらのうち、臨床化学検査上特に重要なも
のは、グルコースオキシダーゼ、コレステロール
オキシダーゼ、ウリカーゼ、グリセロールオキシ
ダーゼ、フオスフオグルコースオキシダーゼなど
である。 これらのオキシダーゼ酵素と生成するH2O2の
検出系とを一体型の多層分析フイルムや、紙片
等への含浸ストリツプスの形体とした臨床検査用
分析材料も広く実用化されている。 これらの分析材料は、被検物質の検出に直接関
与する試薬類を含有する組成物が、支持体となる
紙状物や、フイルム状の支持体に、含浸あるい
は塗布された形態をしている。 一体型の多層分析フイルムは種々の構成をして
おり、必要に応じて、各種の機能層が、積層され
た形で組み込まれている。これらの機能層として
公知のものとしては、液体試料の均一展開の目的
とした展開層（特公昭53−21677、特開昭55−
164356）、反射測定の白色散乱面及び、上層にあ
る有色成分と生成された検出用色素とを光学的に
隔離する為の光遮蔽層（特公昭53−21677、特開
昭51−40191、特開昭55−26428、特開昭55−
26429、特開昭55−164356等）、物質の選択的な拡
散を目的としたバリヤー層、（特開昭52−3488）
または液体遮断層（特開昭58−77660、特開昭58
−7761）、生成色素の媒染による効率的な検出を
目的とした検出層（特開昭51−40191、特開昭53
−131089）、生成色素の他層への移動の防止を目
的としたマイグレーシヨン防止層（特開昭54−
29700）、層間の接着性改良を目的とした接着層
（特開昭55−164356等）などがある。 血液（全血、血漿、または血清）試料の保恒剤
として弗化ナトリウム（NaF）が用いられてお
り、これにより血液試料は約10日ほどの長時間に
わたり保存することができる。NaFは血液試料
１ml当り約２mgから約10mgの範囲で含有されてい
ることが多い。NaFが含有されている血液試料
を米国特許第3992158号明細書実施例３に開示の
グルコース定量用多層分析フイルムを用いて定量
したところ、血清１dl当りグルコース含有量200
mgのレベルの試料についてNaFが血清１ml当り
2.0mg添加された場合、測定されたグルコース濃
度が20mg／dlないし30mg／dl低い値になる干渉作
用の出現が見出された。このNaFによる測定値
の低下という干渉作用を解決するために特公昭57
−28277で提案されたグルコース定量用一体型多
層分析フイルムにおいては、試薬層のPHを使用条
件下において5.0ないし5.6に維持する有機酸とし
て３，３−ジメチルグルタル酸、こはく酸、また
はりんご酸をグルコースオキシダーゼ、ペルオキ
シダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび１，７
−ジヒロキシナフタレンを主成分として含有する
試薬層に配合した多層分析フイルムの具体例（実
施例１、２、６ないし11）があげられている。 本発明者らは特公昭57−28277で提案された前
述の具体例について、また提案されたPH調節され
た試薬層を織物展開層を有する特開昭55−164356
で提案されたグルコース定量用多層分析フイル
ム、および特開昭57−2089971で提案されている
織物展開層を有しグルコースオキシダーゼを接着
層または光遮蔽層に配合したグルコース定量用多
層分析フイルムに適用したものについて調べたと
ころ、血液中に保恒剤として添加されるNaFが
約４mg／ml以下の場合には前述の測定値の低下と
いう干渉作用は比較的少ないが、NaFが約５
mg／mlをこえる領域では測定値の低下という干渉
作用が相変らず著しいことを見出した。さらにこ
の多層分析フイルムにおいてはNaF無添加また
は約２mg／ml以下のNaF添加量の場合に測定値
がバラつき不安定であるという新たな問題が見出
された。さらにNaFによる測定値の低下という
干渉作用はグルコースオキシダーゼとペルオキシ
ダーゼを含むグルコース定量用多層分析フイルム
のみに生じる問題ではなく、一般にペルオキシダ
ーゼを含む多層分析フイルム全般に生じる問題で
あることも見出された。 本発明者らは血液試料に保恒剤として添加され
るNaFによる測定値の低下という干渉作用を解
消するよりよい方法を鋭意研究したところ、グル
コース定量用多層分析フイルムにおいてペルオキ
シダーゼを含む試薬層に酢酸カルシウムを添加す
ることによりNaFによる干渉作用が広範囲の
NaF添加量に対して有効に解消されることを見
出し本発明に到達した。 本発明の目的はペルオキシダーゼを含むH2O2
検出呈色試薬組成物を含む試薬層を有する多層分
析材料において、NaFによる測定値の低下とし
て現われる干渉作用がなくかつペルオキシダーゼ
の活性が高い、改良された多層分析材料を提供す
ることである。 本発明の他の目的はオキシダーゼおよびペルオ
キシダーゼを含むH2O2検出呈色試薬組成物を含
む試薬層を有する多層分析材料において、NaF
による測定値の低下として現われる干渉作用がな
くかつオキシダーゼおよびペルオキシダーゼの活
性が高い、改良された多層分析材料を提供するこ
とである。 本発明の他の目的はオキシダーゼおよびペルオ
キシダーゼを含むH2O2検出呈色試薬組成物を含
む試薬層を有する多層分析材料において、NaF
による測定値の低下として現われる干渉作用がな
く、測定領域が拡大され、かつオキシダーゼおよ
びペルオキシダーゼの活性が高い、改良された多
層分析材料を提供することである。 本発明の他の目的はグルコースオキシダーゼお
よびペルオキシダーゼを含むH2O2検出呈色試薬
組成物を含む試薬層を有するグルコース定量用多
層分析材料において、NaFによる測定値の低下
として現われる干渉作用がなく、測定領域が拡大
され、かつグルコースオキシダーゼおよびペルオ
キシダーゼの活性が高い、改良されたグルコース
定量用多層分析フイルムを提供することである。 本発明は、水不浸透性光透過性支持体の上に、
少なくともペルオキシダーゼおよび過酸化水素の
存在下で検出可能な変化を起こすインジケータを
含む呈色指示薬組成物を含む試薬層、および多孔
性展開層を少なくとも有し、前記二つの層がこの
順に積層されてなる多層分析材料において、前記
試薬層または試薬層より上側の層に、Ca2+また
はBa2+イオンを含む化合物が含有されているこ
とを特徴とする多層分析材料である。 本発明の多層分析材料における光透過性水不浸
透性支持体は波長約200nｍから約900nｍの範囲
の少なくともある範囲の波長領域の電磁波（紫外
線、近紫外線、可視光、または近赤外線）を約40
％以上、好ましくは約65％以上透過させることが
でき、実質的に水をその内部に浸透させることが
なく、かつその表面に設けられる後述の試薬層ま
たは下塗層に含有されるバインダーポリマーまた
は他の成分と実質的に化学反応を生じさせない素
材からなる。前述の規準にあうかぎり支持体とし
て用いることができる素材は何でもよい。支持体
としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフ
エノールＡのポリカルボネート、ポリメチルメタ
クリレート、ポリスチレン、セルロースエステル
（例、セルロースジアセテート、セルローストリ
アセテート、セルロースアセテートプロピネー
ト）などのポリマーからなる透明シートまたはフ
イルムや透明ガラス板などで厚さ約50μｍから約
２mm、好ましくは約70μｍから約0.5mmの範囲のも
のを用いることができる。 支持体の表面には試薬層（または他の機能層）
を支持体に一体に接着することを容易にする目的
で公知の下塗層を設けるか、あるいは支持体の表
面を公知の化学的処理（例、酸処理、アルカリ処
理）または物理化学的処理（例、コロナ放電処
理、グロー放電処理、紫外線照射処理、火陥処
理）を施すことができる。 本発明の多層分析材料に用いられる少なくとも
ペルオキシダーゼを含む試薬層とは少なくともペ
ルオキシダーゼを含む過酸化水素検出用呈色指示
薬組成物（以下、H2O2呈色試薬という。）を含む
試薬組成物が親水性バインダーポリマーのマトリ
クスの中に分散または溶解されてなる試薬層であ
る。 H2O2呈色試薬はペルオキシダーゼ、およびペ
ルオキシダーゼと過酸化水素の存在下で検出可能
な変化（一般に色濃度の変化または色相の変化）
を起すインジケータ（１種類の化合物または２種
以上の化合物の組合せからなるインジケータ）と
からなる。インジケータとして (1) 「Ann.Clin.Biochem.」、６、24−27（1969）、
米国特許3992158、特公昭56−45599、特開昭55
−164356、特開昭56−125373、特開昭58−
124771等に開示の、色原体として４−アミノア
ンチピリンまたはその誘導体とカプラーとして
フエノール、ナフトール、またはそれらの誘導
体の組合せ。 ４−アミノアンチピリン（４−アミノ−２，
３−ジメチル−１−フエニル−３−ピラリン−
５−オン）の誘導体の例として、４−アミノ−
２，３−ジメチル−１−（３−クロロフエニル）
−３−ピラゾリン−５−オン；４−アミノ−
２，３−ジメチル−１−（２，４，６−トリク
ロロフエニル）−３−ピラゾリン−５−オン；
４−アミノ−２−メチル−３−フエニル−１−
（２，４，６−トリクロロフエニル）−３−ピラ
ゾリン−５−オン、４−アミノ−１−（４−ア
ミノフエニル）−２，３−ジメチル−３−ピラ
ゾリン−５−オン、４−アミノ−１−〔４−（ジ
エチルアミノ）フエニル〕−２，３−ジメチル
−３−ピラゾリン−５−オン、４−アミノ−１
−（４−アセトアミドフエニル）−２，３−ジメ
チル−３−ピラゾリン−５−オン、４−アミノ
−１−（アミノ−２−エチルフエニル）−２，３
−ジメチル−３−ピラゾリン−５−オン、４−
アミノ−１−（アミノ−４−メチルフエニル）−
２，３−ジメチル−３−ピラゾリン−５−オン
をあげることができる。４−アミノアンチピリ
ンおよびその誘導体はいずれもその酸付加塩
（例、塩化水素酸塩）としても用いることがで
きる。 ナフトールとして、１−ナフトール、２−ナ
フトールをあげることができる。 フエノール誘導体としてカテコール、レゾル
シン、ピロガロール、フロログルシン、ｏ−、
ｍ−、またはｐ−クレゾール、ｏ−、ｍ−、ま
たはｐ−メトキシフエノール、ｏ−、ｍ−、ま
たはｐ−スルホフエノール、ｏ−またはｐ−ク
ロロフエノールをあげることができる。 ナフトール誘導体として、１，７−ジヒドロ
キシナフタレン、４−メトキシ−１−ナフトー
ルをあげることができる。 フエノール誘導体およびナフトール誘導体と
してこれらの他にC.E.K.Mees、T.H.James編
「The Theory of the Photographic Process」
Third Edition（Macmillan Co.，New York、
1966年発行）第387−396ページに記載の化合物
も用いることができる。 これらの組合せのうちで好ましい組合せは４
−アミノアンチピリンと１，７−ジヒドロキシ
ナフタレンの組合せ、４−アミノ−２，３−ジ
メチル−１−（２，46−トリクロロフエニル）−
３−ピラゾリン−５−オンと１，７−ジヒドロ
キシナフタレンの組合せである。 (2) 特公昭55−25840に開示の色原体として５−
ピラゾロン誘導体または４−オキサゾロン誘導
体と、カプラーとしてフエノール類、ナフトー
ル類またはその誘導体との組合せ。 (3) 特開昭49−114987に開示の色原体としての４
−アミノピラゾロン誘導体（例、１−（４−ス
ルホフエニル）−２−メチル−３−フエニル−
４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン）とカ
プラーとしてのフエノール、フエノール誘導
体、または多価フエノール（例、カテコール、
レゾルシン、ヒドロキノン、クレゾール、グア
ヤコール、ピロガロール、オルシノール、没食
子酸）との組合せ。 (4) 特公昭57−5519に開示の染料形成物質として
ｐ−トルエンスルホニルヒドラジノ−ベンゾチ
アゾリウム、キノリウム、またはピリジニウム
誘導体と、カプラーとしてフエノール類、ナフ
トール類、それらの誘導体、芳香族アミン類ま
たは反応性メチレン化合物との組合せ、または
染料前駆体としてトリアリールイミダゾール誘
導体（単独で用いられる）。 (5) 特開昭57−142562に開示の水素供与体（色原
体）として４−アミノアンチピリン類、４−置
換アンチピリン類、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ｏ−また
はｐ−フエニレンジアミン類、２−ヒドラゾノ
ペンゾチアゾリン類またはｐ−ハロゲノフエノ
ールと、カプラーとしてＮ，Ｎ−ジ置換アニリ
ン類との組合せ。 (6) 特開昭57−94653、特開昭57−94654、特開昭
57−94655、特開昭57−94646に開示のｏ−また
はｐ−アミノフエノール化合物またはｏ−また
はｐ−フエニレンジアミン化合物と耐拡散性フ
エノール化合物、耐拡散性ナフトール化合物、
耐拡散性アシルアセトアミド化合物または耐拡
散性ピラゾロン化合物との組合せ。 (7) 特公昭56−45599に開示のペルオキシダーゼ
の呈色基質（color−forming substrate）（必
要な場合カプラーも含む）。などがあげられる。
これらのインジケータのうちでは、４−アミノ
アンチピリンまたはその誘導体とナフトールま
たはその誘導体の組合せが好ましく、そのうち
で４−アミノアンチピリンと１，７−ジヒドロ
キシナフタレンの組合せ、４−アミノ−２，３
−ジメチル−１−（２，４，６−トリクロロフ
エニル）−３−ピラゾリン−５−オンと１，７
−ジヒドロキシナフタレンの組合せが最も好ま
しい。 ペルオキシダーゼとして特公昭56−45599、特
公昭57−5520等に開示の植物起源および動物起源
のペルオキシダーゼ（EC、1.11.7）、および特開
昭57−99192等に開示の微生物起源のペルオキシ
ダーゼ（EC1.11.7）のうちから適宜に１種または
２種以上を組合せて用いることができる。 植物起源のペルオキシダーゼの例として、西洋
わさび、じやがいも、いちじく樹液、かぶ、だい
こんから抽出されたペルオキシダーゼを、動物起
源のペルオキシダーゼの例として、牛乳から抽出
されたラクトペルオキシダーゼ、白血球から抽出
されたベルドペルオキシダーゼを、微生物起源の
ペルオキシダーゼとしてAlternaria属、
Cochliobolus属、Curvularia属、Pellicularia属
に属し非特異的ペルオキシダーゼ生産能を有する
微生物起源のペルオキシダーゼを、それぞれあげ
ることができる。 その他に特公昭56−45599、特公昭57−5520等
に開示のチオシアン酸鉄、タンニン酸鉄、フエロ
シアン化鉄（いずれも鉄（＋２）化合物）、クロ
ム硫酸カリウム、沃化ナトリウム、沃化カリウ
ム、モリブデン酸アンモニウム、モリブデン酸カ
リウム等のペルオキシダーゼ活性を有する無機化
合物を用いることもできる。 これらのうちで植物起源または微生物起源の非
特異的ペリオキシダーゼが好ましい。 本発明の多層分析材料においては、少なくとも
ペルオキシダーゼを含む試薬層はペルオキシダー
ゼおよびインジケータが親水性ポリマーバインダ
ーの中に溶解または分散されてなるものである。
バインダーとして用いることができる親水性ポリ
マーはペルオキシダーゼおよびインジケータと実
質的に相互作用を生ずることがなく、被膜形成能
を有するものであれば何でもよい。親水性ポリマ
ーの例としてゼラチン、酸処理ゼラチン、脱イオ
ン化ゼラチン、ゼラチン誘導体（例、アシル化ゼ
ラチン）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピ
ロリドン、ポリビニルベンゼンスルホン酸ナトリ
ウム、カルボキシメチルセルロース、ナトリウム
カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチル
セルロース、メチルセルロース、プルラン、プル
ラン誘導体、ポリアクリルアミド、アクリルアミ
ドコポリマー（例、アクリルアミド−Ｎ−ビニル
ピロリドンコポリマー、アクリルアミド−２−ヒ
ドロキシエチルアクリルアミドコポリマー）、を
あげることができる。試薬層の厚さ（乾燥厚さ）
は約5μｍから約100μｍ、好ましくは約10μｍから
約50μｍの範囲である。 試薬層におけるペルオキシダーゼの含有量は約
５千Ｕ／m2から約10万Ｕ／m2、好ましくは約１万
Ｕ／m2から約６万Ｕ／m2（以下Ｕは国際単位を意
味する。）の範囲である。インジケータの含有量
は液体試料に含有されると予想される被検成分の
最大含有量に対応する化学量論による量またはそ
れより多い量が必要であり、この量は当業者が実
験により決めることができる。 ペルオキシダーゼを含むH2O2呈色試薬ととも
に用いられるＦ イオンとの間に25℃における水
100ｇに対する溶解度が0.2ｇ以下の水に難溶性の
塩（以下、難溶性Ｆ塩という。）を形成しうる陽
イオンを含む化合物（以下、難溶性Ｆ塩形成性化
合物という。）について説明する。難溶性Ｆ塩形
成性化合物は本発明の多層分析材料の支持体以外
の少なくとも一つの層に含有されていればよく、
親水性バインダーポリマーを含む層の中に含有さ
れている場合には親水性バインダーに溶解または
分散して含まれていることが好ましい。また難溶
性Ｆ塩形成性化合物を親水性バインダーポリマー
を含む層の中に含有させるには多くの場合親水性
バインダーポリマーを含む水性塗布液に難溶性Ｆ
塩形成性化合物を溶解または分散させた塗布液を
塗布することによるので、難溶性Ｆ塩形成性化合
物は水に溶解または分散するものが好ましい。 難溶性Ｆ塩形成性化合物中に含まれる陽イオン
としては、ペルオキシダーゼ、および必要に応じ
て多層分析材料のいずれの層に含有されるオキシ
ダーゼ、それぞれの酵素を実質的に阻害または著
しく減少させない陽イオンが選択される。陽イオ
ンの例としてアルカリ土類金属の２価陽イオン、
例えば、Mg２ 、Ca２ 、Sr２ 、Ba２ ；
他の金属の２価またはそれ以上の価数の陽イオ
ン、例えばPb２ 、Fe２ 、Cu２ 、Bi３ 、
Fe３ 、Ｖ３ ；多原子多価陽イオン、例えば
Na3Al６ 、K2Si６ 、CaSi６ 、BaSi６ を
あげることができる。陽イオンは水和した陽イオ
ンであつてもよい。これらの陽イオンのうちで、
Ca２ 、Mg２ イオンはペルオキシダーゼやオ
キシダーゼ等の酵素の安定化作用を有するので好
ましい陽イオンである。 難溶性Ｆ塩形成性化合物に含まれる対陰イオン
としては前記の陽イオンと結合した化合物が水に
不溶性または水に難溶性でなく、かつ多層分析材
料に含有されるペルオキシダーゼ、および必要に
応じて含有されるオキシダーゼ、それぞれの酵素
活性を実質的に阻害または著しく減少させない陰
イオンであれば何であつてもよい。 対陰イオンの例として、低級脂肪族モノカルボ
ン酸陰イオン（例、蟻酸イオン、酢酸イオン、プ
ロピオン酸イオン、酪酸イオン、イソ酪酸イオ
ン、吉草酸イオン、イソ吉草酸イオン、ピバル酸
イオン、フエニル酢酸イオン、低級脂肪族ジカル
ボン酸陰イオン（例、蓚酸イオン、マロン酸イオ
ン、こはく酸イオン、メチルこはく酸イオン、グ
ルタル酸イオン、α−メチルグルタル酸イオン、
β−メチルグルタル酸イオン、α，α′−ジメチル
グルタル酸イオン、３，３−ジメチルグルタル酸
イオン、アジピン酸イオン、ピメリン酸イオン）、
脂肪族ポリカルボン酸陰イオン（例、カンホロン
酸イオン、プロパン−１，２，３−トリカルボン
酸イオン）、炭素環式カルボン酸陰イオン（しよ
うのう酸イオン、カンホ酸イオン、安息香酸イオ
ン、フタル酸イオン、イソフタル酸イオン、テレ
フタル酸イオン）、ヒドロキシカルボン酸陰イオ
ン（例、グルコール酸イオン、乳酸イオン、グリ
セリン酸イオン、タルトロン酸イオン、りんご酸
イオン、酒石酸イオン、くえん酸イオン、ペンジ
ル酸イオン、サリチル酸イオン）、ハロゲン陰イ
オン（塩素イオン、臭素イオン）、硼酸イオン、
硝酸イオン、燐酸イオン、硫酸イオン、チオ硫酸
イオン、亜硝酸イオン、アジド陰イオン（N3 ）
をあげることができる。これらのうちで、低級脂
肪族モノカルボン酸陰イオン、低級脂肪族ジカル
ボン酸陰イオン、ヒドロキシカルボン酸陰イオ
ン、ハロゲン陰イオン、燐酸イオン、硝酸イオ
ン、硫酸イオンが好ましく、酢酸イオン、プロピ
オン酸イオン、グルタル酸イオン、α−メチルダ
ルタル酸イオン、β−メチルグルタル酸イオン、
α，α′−ジメチルグルタル酸イオン、３，３−ジ
メチルグルタル酸イオン、りんご酸イオン、酒石
酸イオン、くえん酸イオン、塩素陰イオン、燐酸
陰イオンが最も好ましい。多価の対陰イオンはす
べてのプロトンが存在しない多価陰イオンおよび
プロトンが１個またはそれ以上残存している酸性
陰イオンのいずれをも用いることができる。 難溶性Ｆ塩形成性化合物は前記の陽イオンと対
陰イオンが結合した化合物またはさらに結晶水ま
たは結晶アルコールを含む化合物であり、そのう
ちで好ましい化合物は、蟻酸カルシウム、酢酸カ
ルシウム、プロピオン酸カルシウム、こはく酸カ
ルシウム、メチルこはく酸カルシウム、グルタル
酸カルシウム、α−メチルグルタル酸カルシウ
ム、β−メチルグルタル酸カルシウム、α，α′−
ジメチルグルタル酸カルシウム、３，３−ジメチ
ルグルタル酸カルシウム、安息香酸カルシウム、
りんご酸カルシウム、酒石酸カルシウム、くえん
酸カルシウム、塩化カルシウム、燐酸二水素カル
シウム、硝酸カルシウム、蟻酸マグネシウム、酢
酸マグネシウム、プロピオン酸マグネシウム、こ
はく酸マグネシウム、メチルこはく酸マグネシウ
ム、グルタル酸マグネシウム、α−メチルグルタ
ル酸マグネシウム、β−メチルグルタル酸マグネ
シウム、α，α′−ジメチルグルタル酸マグネシウ
ム、３，３−ジメチルグルタル酸マグネシウム、
りんご酸マグネシウム、酒石酸マグネシウム、く
えん酸マグネシウム、サリチル酸マグネシウム、
塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、燐酸二水
素マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸バリウ
ム、酢酸銅（２＋）、酢酸鉄（２＋）である。 難溶性Ｆ塩形成性化合物は使用条件において、
ペルオキシダーゼが触媒するインジケータの呈色
反応が進行するときに、ペルオキシダーゼが作用
する場にＦ イオンが実質的に存在しないように
Ｆ イオンとともに水に難溶性の塩を形成しうる
ように多層分析材料に含有されればよい。すなわ
ち、難溶性Ｆ塩形成性化合物は少なくともペルオ
キシダーゼを含む試薬層に含有されてもよく、あ
るいは少なくともペルオキシダーゼを含む試薬層
よりも上側の（すなわち、少なくともペルオキシ
ダーゼを含む試薬層に関して支持体と逆の側の）
いずれかの層または多孔性展開層のいずれかに含
有されてもよく、あるいはさらに少なくともペル
オキシダーゼを含む試薬層とそれよりも上側の層
または展開層とに含有されてもよい。難溶性Ｆ塩
形成性化合物の陽イオンまたは陰イオンがペルオ
キシダーゼまたはオキシダーゼの活性を阻害する
場合には、難溶性Ｆ塩形成性化合物をペルオキシ
ダーゼまたはオキシダーゼを含む層と別の層に含
有させ、間に中間層を介在させて用いることがで
きる場合がある。 難溶性Ｆ塩形成性化合物の多層分析材料中にお
ける含有量は液体試料中に添加されるNaFの量
比および多層分析材料の展開層に定量分析操作の
際に点着される液体試料の量に依存し、多層分析
材料に点着される液量中に含有されると予想され
るNaF量の最大値に対応する化学量論による量
またはそれより多い量が、液体試料が展開され浸
透する領域に存在する必要があることが理解され
よう。前述の化学量論による量は推定可能である
が、余裕を見て実用的には難溶性Ｆ塩形成化合物
の含有量は多層分析材料１m2につき0.1meqから
1eq、好ましくは0.2meqから0.5eqの範囲である。 被検物質が過酸化水素でなく、化学反応により
過酸化水素を生成する反応系に組みこむことがで
きる場合には、被検物質が酸素と相互作用して過
酸化水素を生成するための触媒としてオキシダー
ゼを試薬層または他の層に含有させておくことが
できる。オキシダーゼは被検物質に応じて選択さ
れる必要がある。オキシダーゼとしては１種のオ
キシダーゼを用いられることはもちろん、一連の
連続反応を進行させる複数種の酵素の組合せ（そ
の中の１種はオキシダーゼである。）を用いるこ
ともできる。さらに必要な場合にはオキシダーゼ
とともにそのオキシダーゼの補因子および／また
は補酵素を組合せて用いることはいうまでもな
い。 オキシダーゼ（必要な場合には補酵素もとも
に）はペルオキシダーゼおよびインジケータを含
む試薬層に含有させるか、あるいは試薬層よりも
上側の層に含有させるか、さらにはペルオキシダ
ーゼおよびインジケータを含む試薬とそれよりも
上側の層（１層または複数の層）の両方（または
合計３層以上）に含有させることができる。ここ
で試薬層より上側の層という表現には多孔性展開
層をも含めることができる。オキシターゼが触媒
する基質の反応には酵素の存在が必須であり、多
層分析材料においては酵素は空気中から展開層を
経て他の層内へ拡散するので、オキシダーゼが触
媒する酸化反応の効率的な進行にとつては酸素の
層中への拡散の効率的な達成を目的とした特開昭
57−208997に開示した、オキシダーゼをペルオキ
シダーゼおよびインジケータを含む試薬層より上
側の層、ことに多孔性展開層または多孔性展開層
に隣接する層に含有させた構成の多層分析材料と
することが好ましい。またコレステロールエステ
ルのように親油性物質が被検物質である場合に
は、親水性バインダーポリマーを有する層へは被
検物質が浸透しにくいので、ことに多孔性展開層
の内部にオキシダーゼを含有させることが好まし
い。 本発明の多層分析材料に含有させることができ
るオキシダーゼとして酸素（O2）をアクセプタ
とするオキシダーゼがあげられ、その例として次
の酵素をあげることができる。（ ）内はEC
Numberを表わす。 グリコレートオキシダーゼ （1.1.3.1） メレートオキシダーゼ （1.1.3.3） グルコースオキシダーゼ （1.1.3.4） ヘキソースオキシダーゼ （1.1.3.5） コレステロールオキシダーゼ （1.1.3.6） アリールアルコールオキシダーゼ （1.1.3.7） Ｌ−グルコノラクトンオキシダーゼ （1.1.3.8） ガラクトースオキシダーゼ （1.1.3.9） アルコールオキシダーゼ （1.1.3.13） Ｌ−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ（1.1.3.15） アルデヒドオキシダーゼ （1.2.3.1） キサンチンオキシダーゼ （1.2.3.2） ピルベートオキシダーゼ （1.2.3.3） ピルベートオキシダーゼ（CoAアセチル化）
（1.2.3.6） ラトステロールオキシダーゼ （1.3.3.2） Ｄ−アスパルテートオキシダーゼ （1.4.3.1） Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ （1.4.3.2） Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ （1.4.3.3） アミンオキシダーゼ（フラビン含有） （1.4.3.4） ピリドキサミンホスフエートオキシダーゼ
（1.4.3.5） アミンオキシダーゼ（銅含有） （1.4.3.6） Ｄ−グルタメートオキシダーゼ （1.4.3.7） サルコシンオキシダーゼ （1.5.3.1） Ｎ−メチルアミノ酸オキシダーゼ （1.5.3.2） N6−メチル−Ｌ−リシンオキシダーゼ
（1.5.3.4） ウリカーゼ（ウレートオキシダーゼ） （1.7.3.3） スルフイトオキシダーゼ （1.8.3.1） アスコルベートオキシダーゼ （1.10.3.3） ３−ヒドロキシアントラニレートオキシダーゼ
（1.10.3.5） アルギニン−２−モノオキシゲナーゼ
（1.13.12.1） リシン２−モノオキシゲナーゼ （1.13.12.2） トリプトフアン２−モノオキシゲナーゼ
（1.13.12.3） ラクテートオキシダーゼ（ラクテート２−モノオ
キシゲナーゼ） （1.13.12.4） ジメチルアニリンモノオキシゲナーゼ）
（1.14.13.8） コレステロール7α−モノオキシゲナーゼ
（1.14.13.17） Flavoprotein−linked monooxygenate
（1.14.14.1） フエニルアラニンモノオキシゲナーゼ
（1.14.16.1） グリセロールオキシダーゼ（東洋醸造から販売） グリシンオキシダーゼ （化学大辞典第３巻
（1960年９月発行）に記
載） オキシダーゼを含む複数種の酵素の組合せの例
として以下のものがある。 グリセロールキナーゼ（2.7.1.30）およびＬ−
α−グリセロ燐酸オキシダーゼ（1.1.99.5；また
は特開昭53−72892、特開昭53−24893に開示）の
組合せ（特開昭53−24893に開示） トリグリセリド加水分解活性をもつリパーゼ、
グリセロールキナーゼ（2.7.1.30）およびＬ−α
−グリセロ燐酸オキシダーゼ（1.1.99.5；または
特開昭53−72892、特開昭53−24893に開示）の組
合せ（特開昭53−24893に開示） エステラーゼ作用をもつリパーゼ、プロテアーゼ
およびコレステロールオキシダーゼ（1.1.3.6）の
組合せ（特開昭50−137192に開示） グルタミルピルベートトランスアミナーゼ（ア
ラニンアミノトランスフエラーゼと同じ。
2.6.1.2）およびピルベートオキシダーゼ
（1.2.3.3）の組合せ（特開昭57−208998に開示） グルタミルオキシサロアセテートトランスアミ
ナーゼ（グルタミン−オキソ酸アミノトランスフ
エラーゼと同じ。2.6.1.15）、オキサロアセテート
デカルボキシラーゼ（4.1.1.3）およびピルベート
オキシダーゼ（1.2.3.3）の組合せ（特開昭57−
208998に開示） これらのオキシダーゼのうちで、本発明の多層
分析材料において好ましいのは、グリコレートオ
キシダーゼ、マレートオキシダーゼ、グルコース
オキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、コレス
テロールオキシダーゼ、Ｌ−グルコノラクトンオ
キシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、キサン
テンオキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼ、ウ
リカーゼ、アスコルベートオキシダーゼ、ラクテ
ートオキシターゼ、グリシンオキシダーゼ、グリ
セロールオキシダーゼなど、およびオキシダーゼ
を含む複数種の酵素の組合せとして例示した組合
せがあげられる。 オキシダーゼの多層分析材料中における含有量
は、主として液体試料に含有される過酸化水素を
生成する被検物質の予想される最大量とオキシダ
ーゼおよびペルオキシダーゼの活性値の比により
決めることができ、これは当業者が実験により決
めることができるが、おおよその含有量として約
１千Ｕ／m2から約10万Ｕ／m2、好ましくは約３千
Ｕ／m2から約５万Ｕ／m2の範囲である。オキシダ
ーゼがクルコースオキシダーゼの場合には、その
含有量は約２千Ｕ／m2から約４万Ｕ／m2、好まし
くは約４千Ｕ／m2から約２万Ｕ／m2の範囲であ
る。 ペルオキシダーゼ、およびオキシダーゼはそれ
ぞれの活性が最大になる最適PH値があり、さらに
はそれぞれの活性はイオン強度や近傍に共存する
陽イオンや陰イオンの種類による影響をもうけ
る。従つて多層分析材料においては、第一にペル
オキシダーゼを含む試薬層、オキシダーゼを含む
層、またはペルオキシダーゼとオキシダーゼをと
もに含む試層それぞれのPH値を、ついで必要に応
じてイオン強度や共存するイオン種などの因子を
最適に設定することが、よい分析結果（定量精
度、くりかえし再現性などについて）を得るため
にはきわめて重要である。かかる目的の為に多孔
性展開層、試薬層、光遮蔽層その他の機能層中に
酸、アルカリ、塩、緩衝剤、解離剤、界面活性剤
などを含有させておくことは本発明の実施に当つ
て特に重要なことである。これら反応条件設定の
為の試薬類の種類、量などは、分析の目的その他
によつて大きく変化するので、目的に従つて適
宜、選択する必要がある。 ペルオキシダーゼおよびインジケーターを含む
試薬層に酸、アルカリまたは緩衝剤を含有させて
過酸化水素の存在下で検出可能な変化を起させる
には、ペルオキシダーゼの最適PH値であるPH7.0
を中心にしてPH約5.0から約9.0、好ましくは約6.0
から8.0の範囲のPH値範囲の下で変化を生じさせ
ることが好ましい。 オキシダーゼはその最適PH値は酵素の種類によ
り異なるが、例示すれば、グルコースオキシダー
ゼ：PH約5.6；ヘキソースオキシダーゼ：PH約
6.3；コレステロールオキシダーゼ：PH約5.8；ガ
ラクトースオキシダーゼ：PH約7.0；アルコール
オキシダーゼ：PH約7.5；ウリカーゼ：PH7.5〜
8.5；アスコルスベートオキシダーゼ：PH約5.6；
Ｌ−α−グリセロ燐酸オキシダーゼ：PH7.5〜7.7
である。 オキシダーゼを含む層はオキシダーゼの種類に
よりそれぞれの最適PH値またはその近傍のPH値範
囲に調整することが好ましい。ペルオキシダーゼ
の最適PH値と異なる最適PH値をもつオキシダーゼ
はそれ故に別々の層に含有させることが好まし
い。例えばグルコースオキシダーゼを多孔性展開
層または後述する接着層に含有させる場合には、
多孔性展開層または接着層に使用条件下において
グルコースオキシダーゼの最適PH値であるPH5.6
を中心としてPH3.6からPH7.6、好ましくはPH4.0か
らPH7.0の範囲に維持することができる酸または
緩衝剤を加えることができる。 試薬層、他の層、または多孔性展開層に含有さ
せることができる酸、アルカリまたは緩衝剤とし
て脂肪族ヒドロキシカルボン酸（例、グリコール
酸、乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、グリセリン酸、
タルトロン酸、りんご酸、酒石酸、くえん酸）、
脂肪族ジカルボン酸（例、マロン酸、こはく酸、
グルタル酸、α−メチルグルタル酸、β−メチル
グルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、α，
α′−ジメチルグルタル酸）、脂肪族モノカルボン
酸（例、酢酸、プロピオン酸、酪酸）、水酸化リ
チウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、日
本化学会編「化学便覧 基礎編」（東京、丸善(株)、
1966年発行）1312−1320ページに記載の緩衝剤
（例、くえん酸水素カリウム−くえん酸、燐酸二
水素カリウム−燐酸水素二ナトリウム）、
「Biochemistry」、５(2)、467−477（1966）の
Norman E.Goodら著「Hydrogen Ion Buffers
for Biological Research」R.M.C.Dawson et
al編「Date for Biochemical Research」第２版
（Oxford at the Clarendon Press、1969年発行）
476−508ページ、「Analytical Biochemistry」、
104、300−310（1980）等に記載の緩衝剤（例、２
−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−２−ヒド
ロキシプロパン−３−スルホン酸（Heppso）ナ
トリウム塩またはカリウム塩、Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−N′−３−プロパンスルホ
ン酸（Epps）ナトリウム塩またはカリウム塩）、
その他の緩衝剤（例、マレイン酸モノナナトリウ
ムまたはモノカリウム塩、３，３−ジメチルグル
タル酸モノナトリウムまたはモノカリウム塩）、
無機酸（硫酸、燐酸）がある。これらのうちでは
くえん酸、酒石酸、りんご酸、グルタル酸、α−
メチルグルタル酸、β−メチルグルタル酸、α，
α′−ジメチルグルタル酸、３，３−ジメチルグル
タル酸、水酸化リチウム、Heppso Na塩または
Ｋ塩、Epps Na塩またはＫ塩が好ましい。 本発明の多層分析材料においては、ペルオキシ
ダーゼを含む試薬層を使用条件においてペルオキ
シダーゼの最適PH値5.6近傍に、オキシダーゼを
含む層はそれぞれのオキシダーゼの最適PH値近傍
になるようにPH調節し、調節されたPH値とは無関
係に難溶性Ｆ塩形成性化合物をペルオキシダーゼ
を含む試薬層またはそれより上側の層に含有させ
ることにより、被検成分の比色測定または螢光測
定するための反応が最も短時間に高効率で進行さ
せる条件下で被検試料に添加されたNaFによる
測定値の低下として現れる干渉作用を解消できる
という著しい効果が達成される。 本発明の多層分析材料における多孔性展開層
（以下、展開層ということがある。）は分析材料の
最外面に位置し（すなわち、分析材料において試
薬層に関して支持体と反対側の最外面に位置す
る。）て、被検体液が点着される面であり、その
作用は点着された被検体液が被検体を含んだまま
液体の容量には無関係に単位面積当りほぼ一定容
量の被検体液を試薬層に供給する機能を果すこと
である。この作用（展開作用）により少なくとも
ペルオキシダーゼを含む試薬層（以下、試薬層と
いうことがある。）に供給される被検体液の容量、
さらには被検体液に含まれる被検体の容量は単位
面積当りほぼ等しいことになり、またこの作用が
存在するゆえに、定量分析に際して被検体液を正
確に秤取しなくても定量分析が実施できることを
意味する。当然のことであるが被検体液を正確に
秤取して定量分析を実施することを排除するもの
でもないし、被検体液を正確に秤取することによ
り定量の精度が高まる場合がある。 本発明の分析材料における多孔性展開層とし
て、特開昭49−53888（特公昭53−21677）、米国特
許第3992158号に開示されている非繊維等方的多
孔性層（例、メンブランフイルターまたはブラツ
シユポリマー層、微小球体または粒子を接着剤で
結合することにより製造された球体または粒子間
の相互結合空間により等方的多孔性が形成されて
いる層）、特開昭55−90859に開示されている微小
球状ビーズが水により膨潤しない接着剤により点
接触状に接着されて形成された三次元格子構造物
からなる連続空隙含有等方的多孔性構造物層、特
開昭55−164356に開示されている水洗された織物
または親水性化処理織物からなる繊維質異方性多
孔性展開層、特開昭57−66359に開示されている
物理的活性化処理された表面を有する織物からな
る繊維質異方性多孔性展開層、特開昭57−148250
に開示されている合成ポリマー繊維パルプを含む
抄造紙、抄造紙または不織布からなる繊維質異
方性多孔性展開層を用いることができ、かつこれ
らの展開層はここにあげた特許明細書に開示の方
法により設けることができる。また特開昭49−
53888に開示されているごとく、二酸化チタン、
酸化亜鉛、または硫酸バリウムの微粉末を含有す
るメンブランフイルターまたはブラツシユポリマ
ー層は後述する光遮蔽層（輻射線ブロツキング
層、白色背景層または光反射層）をかねる展開層
として本発明において用いることができる。さら
にカーボンブラツクを含有するメンブランフイル
ターまたはブラツシユポリマー層を後述する光遮
蔽層をかねる展開層として用いることができる。
被検体液が全血の場合、好ましい展開層として前
述の三次元格子構造物からなる連続空隙含有等方
的多孔性構造物層および前述の繊維質異方性多孔
性展開層があげられる。 本発明の多層分析材料においては試薬層と展開
層の間に水および被検体透過性の光遮蔽層（色遮
蔽層、輻射線ブロツキング層、背景層または光反
射層ともいう。）を設けることができる。光遮蔽
層は、たとえば、赤血球を含む全血の如く、被検
体液が着色粒子を含む場合に有用な層である。即
ち光遮蔽層の片側にある着色粒子の色はこの層に
よつてさえぎられて反対側、すなわち透明支持体
側からは着色粒子の色は全く見えず、従つて比色
定量または螢光測光定量に当つて着色粒子が定量
の妨害をしない。光遮蔽層は、二酸化チタン微粉
末、硫酸バリウム微粉末、酸化亜鉛微粉末、アル
ミニウム微粉末またはカーボンブラツクの如き微
粉体を水および被検体透過性の親水性ポリマーバ
インダー中に分散した層で、5μｍから100μｍ、
好ましくは5μｍから30μｍの範囲の厚さがあり、
被検体液および被検体は通過しうるものである。
光遮蔽層のポリマーバインダーとしては試薬層に
用いたのと同じ種類の親水性ポリマーの中から適
宜に選択して用いることができる。 光遮蔽層としては二酸化チタン微粉末酸化亜鉛
微粉、硫酸バリウム微粉末またはカーボンブラツ
クなどの光遮蔽能を有する微粒子を含んだメンブ
ランフイルター（ブラツユポリマー層）を多孔質
光遮蔽層として用いることができる。多孔質光遮
蔽層は特開昭49−53888（特公昭53−21677）また
は特開昭54−29700に開示の方法により設けるこ
とができる。 本発明の多層分析材料においては展開層を試薬
層、光遮蔽層、または必要により設けられる他の
層の上に接着し積層して一体化するための接着を
強化する目的で接着層を設けることができる。こ
とに展開層として多孔性のシート状、フイルム状
または膜状の素材を用いる場合には接着層を設け
ることが好ましい。 接着層としては試薬層のバインダーとして用い
られている水および被検体透過性親水性ポリマー
を用いることができ、この場合には接着層の親水
性ポリマーが半乾きの状態のとき、または親水性
ポリマーを水または界面活性剤を含む水で湿潤さ
せておいて、展開層として用いる多孔性のシート
状、フイルム状または膜状の素材を適当な圧力を
かけて接着層に接着することができる。接着層の
厚さは0.5μｍから15μｍ、好ましくは0.5μｍから
5μｍの範囲である。 本発明の多層分析材料には前記の諸層のほかに
必要に応じて、特開昭52−3488、特開昭58−
77660、特開昭58−77661に開示のバイヤー層また
は液体遮断層、特開昭51−40191、特開昭53−
131089等に開示の検出層または媒染層、特開昭54
−29700に開示のマイグレーシヨン阻止層、特開
昭54−26793（特公昭57−28277）、特開昭51−
40191等に開示の中間層、特開昭53−131089、特
開昭57−40649、特開昭57−50660、特開昭58−
179359等に開示の蛋白質を通過させることができ
る親水性バインダーポリマーを用いた層、特開昭
56−8549に開示の試薬含有微粒子分散層、実開昭
57−42951に開示の一定面積の液体試料点着供給
溶ポーラス体（パツチ）、特開昭57−208998に開
示の酵素等の試薬を含む定面積多孔性層を設ける
ことができる。 本発明の多層分析材料はここまでの説明から明
らかなとおり、透明支持体の上に順にペルオキシ
ダーゼを含む試薬層および展開層が設けられた構
成を有するが、好ましい実施態様として、透明支
持体の上に順にペルオキシダーゼを含む試薬層、
光遮蔽層および展開層が設けられた構成を有する
もの、透明支持体の上に順にペルオキシダーゼを
含む試薬層、光遮蔽層、接着層および展開層が設
けられた構成を有するもの、透明支持体の上に順
にペルオキシダーゼを含む試薬層、オキシダーゼ
を含む光遮蔽層および展開層が設けられた構成を
有するもの、透明支持体の上に順にペルオキシダ
ーゼを含む試薬層、光遮蔽層、オキシダーゼを含
む接着層、および展開層が設けられた構成を有す
るもの、透明支持体の上に順にペルオキシダーゼ
を含む試薬層、光遮蔽層、オキシダーゼを含む接
着層、およびオキシダーゼを含む展開層が設けら
れた構成を有するもの、透明支持体の上に順にペ
ルオキシダーゼを含む試薬層、オキシダーゼを含
む光遮蔽層、オキシダーゼを含む接着層、および
展開層が設けられた構成を有するもの、透明支持
体の上に順にペルオキシダーゼおよびオキシダー
ゼを含む試薬層、光遮蔽層、および展開層が設け
られた構成を有するもの、透明支持体の上に順に
ペルオキシダーゼおよびオキシダーゼを含む試薬
層、オキシダーゼを含む光遮蔽層、接着層、およ
び展開層が設けられた構成を有するもの、透明支
持体の上に順にペルオキシダーゼおよびオキシダ
ーゼを含む試薬層、光遮蔽層、オキシダーゼを含
む試薬層、および展開層が設けられた構成を有す
るもの、さらにこれらの層構成のバリエーシヨ
ン、などがある。 本発明の多層分析材料は前述の特許明細書に開
示の方法に従つて製造することができ、その具体
例は後記する実施例に詳細に説明されている。ま
た本発明の多層分析材料は前述の特許明細書に開
示の操作手順と同様にして被検体液中の被検物質
を定量することができる。本発明の多層分析材料
は実開昭54−162294、特開昭54−156079、実開昭
56−142454、特開昭57−63452に開示のスライド
枠に収めて化学分析スライドまたは特開昭57−
182648に開示の液体試料展開補助材を多孔性展開
層の上に設けた構造の化学分析スライドとして用
いるのが製造、輸送、保管、測定操作などの全て
の面で好ましい。 実施例 １ ゼラチン下塗りが施されてある厚さ185μｍの
透明ポリエチレンテレフタレート（PET）フイ
ルム上に、下記組成から成る血中グルコース濃度
定量用の試薬層を乾燥後の膜厚がおよそ15μｍに
なるように塗布、乾燥した。 ペルオキシダーゼ 25000IU １，７−ジヒドロキシナフタレン ５ｇ ４−アミノアンチピリン ５ｇ ゼラチン 200ｇ ノニオンHS210（日本油脂(株)製活面活性剤；ポリ
オキシエチレンノニルフエニルエーテル） ２ｇ この上に、0.2ｇのノニオンHS210及びグルコ
ースオキシダーゼ50000IUを含む二酸化チタン粉
末８ｇをゼラチン１ｇに混合分散したものより成
る光遮蔽層を乾燥膜厚がおよそ15μｍになるよう
に塗布、乾燥した。 この上に水100ml中にゼラチン４ｇと酢酸カル
シウム２ｇの割合で溶解し、更にこれにノニオン
HS210を0.2ｇを加えて、塗布液とした。これを、
光遮蔽層の上に乾燥膜圧が4μｍ（酢酸カルシウ
ム含有量33meq／m2）となるように塗布、乾燥し
接着層を形成させた。次に、接着層に30ｇ／m2の
割合で水を湿し水として供給、湿潤させたのち、
綿100％のブロード（東洋紡製100双子ブロード）
を圧着ラミネートし、乾燥させて多孔性展開層を
設け、グルコース定量用の多層分析材料を完成さ
せた。 この材料を1.5cm×1.5cmの正方形のチツプとし
たのち、特開昭57−63452に開示のプラスチツク
マウントに収めてグルコース定量用化学分析スラ
イドとした。このスライドを用いて、NaFの干
渉作用に対する緩和効果を調べた。ヘパリン採血
したのち遠心分離によつて調製したヒト血漿（グ
ルコース含有量236mg／dl中に異なる量のNaFを
添加し、検査用検体とした。その10μを上記の
分析スライドの展開層の上に点着し、37℃で６分
間インクベーシヨンしたのち、500nｍの測定光
で反射光学濃度を測定した。 結果は第１表に示した。NaF量が０〜10mg／
dlの範囲にわたつて、発色光学濃度がほぼ一定に
保たれていることが明らかである。 比較例 １ 接着層中に酢酸カルシウムを含有させない他は
実施例１と全く同じ方法により比較用の化学分析
スライドを作製した。実施例１と同様にNaFの
含有量が異なるヒト血漿を点着、発色光学濃度を
測定した。結果を第１表に比較例として示した。 NaFの添加に伴いNaF低濃度域では光学濃度
が上昇し、ついでNaF濃度が大きくなるに従い
光学濃度が低下する傾向が強く見られる。なお、
発色光学濃度値は測定値からカブリ光学濃度値
（被検液としてヒト血漿を点着しインクベーシヨ
ン後の発色光学濃度値）をさしひいた値である。 【表】 数値は発色光学濃度値
実施例 ２ 実施例１の酢酸カルシウムのかわりに塩化カル
シウム２ｇをゼラチン４ｇに対して加えたほかは
実施例１と同様にして（従つてCa２ イオンの
含有量は47meq／m2）グルコース定量用多層分析
材料を調整した。 実施例１と同様の方法で測定した結果、第２表
のような結果を得た。NaFの干渉はよく緩和さ
れている。 比較例 ２ 実施例２と同様の実験において接着層中に塩化
カルシウムを添加しないで作製した。この比較用
の分析スライドを用いた測定結果を第２表に比較
例として示した。比較例１と同様顕著なNaFの
干渉作用が見られる。 【表】 実施例 ３ 実施例１の酢酸カルシウムにかえて、塩化バリ
ウムを用いたほかは実施例１と同様にして（従つ
てBa２ イオン含有量30meq／m2）グルコース
定量用多層分析材料を調製した。実施例１と同様
にして測定したところ、実施例１と同様のNaF
の干渉作用の緩和が観測された。 実施例 ４ 酢酸カルシウムを接着層のかわりに光遮蔽層に
1.5ｇ／m2割合（酢酸カルシウム含有量19meq／
m2）で含有させたほかは実施例１と同様にしてグ
ルコース定量用多層分析材料を調製した。実施例
１と同様にしてNaFの干渉作用の緩和効果を調
べたところ、実施例１と同様の良好な結果を得
た。 実施例 ５ 酢酸カルシウムを接着層中に添加するかわりに
酢酸カルシウムの10％水溶液を湿し水として用い
て（酢酸カルシウム含有量38meq／m2）グルコー
ス定量用多層分析材料を調製した。実施例１と同
様にして測定したところ、実施例１と同様の
NaFの干渉作用の緩和効果が観測された。 実施例 ６ グルコースオキシダーゼのかわりにコレステロ
ールオキシダーゼを同じ単位用いて光遮蔽層に含
有させたほかは実施例１と同様にしてコレステロ
ール定量用多層分析材料を調製し、スライド枠に
収めてコレステロール定量用化学分析スライドを
作製した。このもののNaFの干渉作用を実施例
１と同様の方法により調べた。また比較例１と同
様にして、酢酸カルシウムを含まないスライドを
作製してその緩和効果を調べた。酢酸カルシウム
を含むステイドでは明瞭な緩和効果（NaF の
干渉作用が現れない）がみられた。 実施例 ７ 実施例１及び比較例１で作製したスライドにつ
いて、以下の実験を行い反応中のPHを測定した。
PH測定には東亜電波社製PHメーターHM15に、表
面PH測定用電極GS−165Fを接続した測定器を用
いた。グルコース分析スライドに10μの蒸溜
水、管理血清新鮮ヒト血漿などの検液を点着し、
検液が展開された後に多層分析材料の多孔性展開
層を剥離除去し、接着層側からPH電極を表面にあ
てて展開層除去後１分後から９分後にわたつて１
分ごとにPHを測定した。なお、電極の校正には、
PH4.01及び6.86の燐酸標準液（25℃）を、PETフ
イルム上に10μを採取し、電極を直接フイルム
に密着させる方法により測定した。新鮮ヒト血漿
Ａおよび蒸留水Ｂをそれぞれ検液として用いた場
合の反応中のPH値測定結果を第１図に示す。 いずれの場合もPHは２〜３分で平衡値に到達す
ることが明らかである。 実施例 ９ 接着層中に加える酢酸カルシウムの量を1.0
ｇ／m2（酢酸カルシウム含有量12meq／m2）に保
つておきこれに３，３−ジメチルグルタル酸を加
えてPHを種々の値に変化させたほかは実施例１と
同様にしてグルコース定量用多層分析材料を調製
し、スライド枠に収めて分析スライドを調製し
た。接着層のPH値の測定は実施例７と同様の方法
により、点着液としてはヒト血漿10μを用い
た。 あらかじめ、NaF含有量が異なる試験管中に、
ヘパリン採血し直ちに遠心分離して得たヒト血漿
を採取、血漿中のNaF濃度がそれぞれ０（含有せ
ず）；1.0；3.0mg／mlであるような検液を調製し
た。このような血漿の各10μを前記のスライド
の多孔性展開層に点着し、37℃で６分間インキユ
ベーシヨンしたのちの発色光学濃を500nｍの波
長で反射測光したところ、結果は第３表の通りで
あつた。NaFによる干渉作用に対する酢酸カル
シウムの緩和効果はPHに殆んど依存しないことが
明らかである。 【表】
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例７における時間の経過とともに
接着層側からPH測定電極をあてて測定した反応中
のPH値の変化を示すグラフである。Ａはヒト新鮮
血漿、Ｂは蒸留水をそれぞれ検液として用いた場
合のPH値変化曲線である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 水不浸透性光透過性支持体の上に、少なくと
    もペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存在下で
    検出可能な変化を起こすインジケータを含む呈色
    指示薬組成物を含む試薬層、および多孔性展開層
    を少なくとも有し、前記二つの層がこの順に積層
    されてなる多層分析材料において、前記試薬層ま
    たは試薬層より上側の層に、Ca2+またはBa2+イ
    オンを含む化合物が含有されていることを特徴と
    する多層分析材料。 ２ 前記インジケータが色原体としての４−アミ
    ノアンチピリンまたはその誘導体とカプラーとし
    てのフエノール、ナフトールまたはそれらの誘導
    体との組合せである特許請求の範囲１に記載の多
    層分析材料。 ３ 前記試薬層または試薬層より上側の層にオキ
    シダーゼが含有されている特許請求の範囲１また
    は２に記載の多層分析材料。 ４ 前記オキシダーゼがグルコースオキシダーゼ
    である特許請求の範囲３に記載の多層分析材料。 ５ 前記オキシダーゼがコレステロールオキシダ
    ーゼである特許請求の範囲３に記載の多層分析材
    料。
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