JPS6293662A - 酸化型補酵素を含有する乾式分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の技術分野］ 本発明は、検出試薬系として酸化型ニコチンアミド補酵
素、電子受容性化合物および電子受容性染料形成性化合
物を有し、そして電子伝達性化合物を酸化型ニコチンア
ミド補酵素および／または電子受容性染料形成性化合物
と同一の層内に含有する乾式分析要素に関する。さらに
詳しくは本発明は、液体試料中に含まれる特定成分また
は酵素活性を上記試薬系を用いて分析するための乾式分
析要素に関する。

［従来技術］ デヒドロゲナーゼ系酵素と補酵素とを共役反応系に組合
わせた反応は臨床化学分析において広く用いられている
。例えばグリセリンデヒドロゲナーゼ、コレステロール
デヒ下ロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルコール
デヒドロゲナーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、ア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ、α−グリセロフォスフェー
トデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲ
ナーゼ等が関与する反応系が、トリグリセリド、グリセ
リン、コレステロール、乳酸、グルタメート、グリセリ
ン−３−燐酸、グルコース−６−燐酸等の基質や、アス
パラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラ
ニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、乳酸デヒド
ロゲナーゼ（ＬＤＨ）　、アミラーゼ、クレアチンキナ
ーゼ（ＣＫ）等の酵素の定量に用いられており、還元型
補酵素の増加または減少の直接測定によって定Ｈ１分析
ができる特徴がある。しかし通常用いられるＮＡＤＨに
コチンアミドアデニンジヌクレオチト）またはＮＡＤＰ
Ｈにコチンアミドアデニンンシヌクレオチドファスフェ
ート）は、吸収極大が３４０ｎｍ付近にあるため、その
光学的定量のためには、紫外域の測光装置が必要となり
１機器が高価なものになる。また紫外域では多種の化合
物が吸収を有するためにそれらの干渉を受は易い。

ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）を紫外部吸収により直接
に定量する代りに、ＮＡＤＨの存在Ｆで、電子伝達性化
合物を介して電子受容性化合物を還元し、可視領域にお
いて検出可能な化合物（染料）を形成する反応系が提案
されている。

しかし、酸化型補酵素、電子伝達性化合物、電子受容性
化合物の王者を共存させておくと、時日の経過とともに
反応の感度は著しく悪化する。特に特公昭５３−２１６
７７号公報に記載されたような乾式一体型多層分析要素
にＬ記反応系を組入れるとき、この問題に直面する。

特開昭４９−１１３９５号公報では、Ｌ記三成分のうち
電子伝達性化合物を異なる層に配置することを提案して
いる。また特開昭５９−４４６５８号公報では、電子伝
達剤と色素形成物質とを、互いに実質的に反応しえない
ように疎水性物質を親水性分散媒中に分散する方法を開
示している。

しかし、このように電子伝達性化合物を他の二要素から
分離すると、検出反応の進行は分離された試薬（０に電
子伝達性化合物）の拡散速度で支配されるため、反応速
度、したがって検出感度の低Ｆをまねく。

１−記ＮＡＤＨ（またはＮＡＩ）ＰＨ）検出組成物を乾
式一体型多層分析要素（例えば特公昭５３−２１６７７
号公報に記載の自動化学分析用多層分析素子）の試薬層
に適用すると、組成物の染料形成速度は常温の保存で数
週間以内に局以Ｆになることが見出された。この原因を
究明すると、特開昭５７−１３２０６１号公報で言及し
ているような電子受容性化合物の劣化が原因ではなく、
主たる原因は、補酵素ＮＡＤ　（またはＮＡＤＰ）の劣
化にあることがわかった。緩衝液中の補酵素の劣化を防
ぐ方法として特開昭５９−８２３９８号公報に開示され
たようなキレート化剤とアジ化物を併せて添加する方法
が知られている。しかし、爆発性および毒性を有するア
ジ化物を用いなければ効果が挙がらず、安全りおよび公
害の点から好ましくない。

［発明の要旨］ 本発明の目的は、酸化型ニコチンアミド補酵素、電子伝
達性化合物および電子受容性染料形成性化合物を含む検
出試薬系を有する乾式分析要素において、電子伝達性化
合物を他の二要素から分離することなく、充分な反応速
度を保ちつつ、酸化型ニコチンアミド補酵素の保存性を
向丘させることである。

本発明は、検出試薬系として酸化型ニコチンアミド補酵
素、電子伝達性化合物および電子受容性染料形成性化合
物を有し、そして電子伝達性化合物を酸化型ニコチンア
ミド補酵素および／または電子受容性染ネ゛１形成性化
合物と同一の層内に含有する乾式分析要素において、 上記酸化型ニコチンアミド補酵素を含有する層内にカル
ボン酸系補酵素安定剤が存在していることを特徴とする
分析要素を提供するものである。

本発明において、カルボン酸系補酵素安定化剤とは、乾
燥状ＩＥの酸化型ニコチンアミド補酵素に添加すること
により酸化型ニコチンアミド補酵素の保存性を向上させ
る機能を有するカルボン酸を意味する。

［発明の詳細な記述］ 本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することがで
きる。特にデヒドロゲナーゼ酵素系と還元型補酵素検出
系と被検液体がいずれも浸透し得る固体担体を含む要素
に適用することができる。

要素は中一層で構成されてもよく。また試薬層、反射層
、多孔質展開層、光遮蔽層、纏過層、係留（ｒｅｆｉｓ
ｔｒａｔｉｏｎ）層、吸水層、支持体、下塗層および業
界公知のその他の層を含む多重層であったもよい、かよ
うな分析要素には米国特許第３９９２１５８号および同
４０４２３３５号各明細書に開示のものがある。

支持体を用いる場合、実用的に好ましい構成は、 （１）支持体４ｍに試薬層を兼ねる展開層を有するもの （２）支持体Ｆに吸水層、そのヒに試薬層を兼ねる展開
層を有するもの （３）支持体りに試薬層と展開層を有するもの（４）支
持体りに吸水層、試薬層、展開層をこの順に有するもの （５）支持体上に試薬層、反射層または吐過層、展開層
をこの順に有するもの （６）支持体上に吸水層、試薬層、濾過層、展開層をこ
の順に有するもの などである。しかし、光透過性・水不透過性支持体、吸
水層および検出試薬系とカルボン酸系補酵素安定剤を含
有する展開層を順次積層一体化してなる一体型多層分析
要素とすることが好ましい。

本発明の乾式分析要素において少なくとも一層の試薬層
に含まれる検出試薬系には、酸化型ニコチンアミド補酵
素が含まれる０ｍ化型ニコチンアミド補酵素とは、具体
的には、ＮＡＤ・　にコチンアミド・アデニンジヌクレ
オチド酸化型）またはＮＡＤＰｏ　にコチンアミド・ア
デニンジヌクレオチド・ホスフェート酸化型）を意味す
る。

ＮＡＤ＝　およびＮＡＤＰ゛のうちどちらを使用するか
は１分析対象として、あるいは検出試薬として検出反応
に関テする酸化二元酵素の種類に応じて決定される。

本発明の乾式分析要素において少なくとも一層の試薬層
に含まれる検出試薬系には、電子伝達性化合物を含む。

本発明において電子伝達性化合物とは、被検物質の反応
により生成した還元型ニコチンアミド補酵素（電子共学
体）から電子を受は取って、後述する電子受容性染料形
成性化合物を還元する機能を有する化合物を意味する。

上記電子伝達性化合物の具体例としては、５−メチルツ
ェナジニウム・メチルスルフェートあるいは１−メトキ
シ−５−メチルツェナジニウム争メチルスルフェート等
のＮ−メチルフェナジン・メトサルフェート類およびジ
アホラーゼ（ジヒドロリボアミドレタクターゼ、Ｅ　Ｃ
１，６，４，３，）等を挙げることができる。

本発明の乾式分析要素に用いられる検出試薬系には、さ
らに電子受容性染料形成性化合物が含まれる。電子受容
性染料形成性化合物は、上記電子伝達性化合物により還
元され、長波長領域において検出可能な化合物（染料）
を形成する物質である０本発明の乾式分析要素において
、電子受容性染料形成性化合物は、テトラゾリウム塩を
用いることが好ましい。テトラゾリウム塩の具体例とし
ては、 ３．３°−（３，３°−ジメトキシ−４゜４′−ビフェ
ニレン）−ビス［２−（Ｐ−ニトロフェニル−２Ｈ−テ
トラゾリウムクライト］（＝ＮＢＴ）。

３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニ
ル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライＦ
’　（＝　Ｉ　ＮＴ）　　；３−（４，５−ジメチル−
２−チアゾリル）−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド（
＝ＭＴＴ）；３．３”−（４、４’−ビフェニレン）−
ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロ
ライド； ３．３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４′−ビフエ
ニレン）−どス（２、５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾ
リウムクロライド；および３．３°−（３，３”−ジメ
トキシ−４，４゜−ビフェニレン）−ビス［２，５−ビ
ス（ｐ−二トロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロ
ライドを挙げることができる。

なお、Ｌ記酸化型ニコチンアミド補酵素、電子伝達性化
合物および電子受容性染料形成性化合物を含む反応系の
詳細については、 Ａ、　Ｌ、　Ｂａｂｓｏｎ等によるクリニカ・キミカ・
アクタ［０ＬＩＮＩＣＡ　Ｃ）ＩＩＭＩＣＡ　ＡＣＴＡ
］　１２巻（１８６５）２１０−２１５頁： Ｒ，Ｊ、　Ｇａ７等によるクリニカルｅケミストリー［
ＣＬＩＮＩＣＡＬ　　Ｃ）ＩＥＭＩＳＴＲＹ］　　Ｖｏ
ｌ、１４、Ｎｏ、　　８　．１９８８゜７４０−７５３
頁：および。

Ｒ，Ｄ、　Ｃａｐｐｓ　ＩＩ　”９によるクリニカルφ
ケミストリー、Ｖｏｌ、１２、Ｎｏ、　７　、　１９８
８．　４０６−４１３頁；等の文献に記載されている。

本発明の乾式分析要素に用いられる検出試薬系は、液体
試料中における様々な種類の酸化還元酵素活性の測定に
使用することができる。すなわち、本発明の乾式分析要
素は、＃化型ニコチンアミド補酵素が電子受容体となる
全ての酸化還元酵素（脱水素酵素）の測定が回部である
。上記のように本発明の乾式分析要素を酸化還元酵素の
活性の測定に使用する場合には、と記検出試薬系には、
さらに酸化還元酵素が触媒する酸化反応（脱水素反応）
の２！ｌｉ質が加えられる６例えば、本発明の乾式分析
要素を乳酸デヒドロゲナーゼ活性測定用として用いる場
合には、上記検出試薬系にさらに乳酸が含まれる。グル
コース−６−燐酸デヒドロゲナーゼの場合には、基質と
してグルコース−６−燐酸が添加される。

本発明の乾式分析要素を上記酸化還元酵素が触媒する酸
化反応の基質の液体試料中における濃度を測定する目的
に用いることもできる。この場合には、この酸化還元酵
素が上記検出試薬系に含まれる。

さらに、本発明の乾式分析要素は、他の化学反応をＬ記
検出反応と共役させることにより、と記以外の酵素活性
あるいは物質濃度の測定に用いることも可能である。こ
の場合においても、共役させる化学反応に必要な試薬類
が、上記検出試薬系に含まれる０例えば、酵素共役反応
にて脱水素酵素に共役できるクレアチンキナーゼ活性測
定の場合には、クレアチン燐酸、グルコース、ヘキソキ
ナーゼ等が添加される。

本発明の乾式分析要素は、カルボン酸系補酵素安定剤を
、酸化型ニコチンアミド補酵素と同一の層内に含有する
。前述したように、本発明において、カルボン醜系補酵
素安定化剤とは、少なくとも酸化型ニコチンアミド補酵
素および電子伝達性化合物が接触した状態において、添
加することにより酸化型ニコチンアミド補酵素の保存性
を向トさせる機能を有するカルボン酸を意味する。上記
カルボン酸としては、上記検出反応（他の化学反応を検
出反応と共役させる場合には、この共役反応を含む）に
は、実質的に影響をｔえることのないカルボン酸を用い
ることが好ましい。

本発明の乾式分析要素のカルボン酸系補酵素安定化剤と
して好ましく用いられるカルボン酸の例としては、アミ
ン性窒素原子を有するカルボン酸およびヒドロキシカル
ボン酸を挙げることができる。上記アミン性窒素原子を
有するカルボン酸の具体例としては、エチレンジアミン
四酢酸、Ｎ。

Ｎ−ジヒドロキシエチルグリシン、Ｎ−ヒドロキシエチ
ルエチレンジアミン−Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−’Ｅ酢酸および
酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）を
挙げることができる。またヒドロキシカルボン酸の具体
例としては、クエン酸、リンゴ酸、トリス（ヒドロキシ
メチル）−メチルグリシン、Ｎ、Ｎ−ビス（２−とドロ
キシエチル）−グリシンおよびアルドン酸（例、グルコ
ン酸）を挙げることができる。これらの中では酸性アミ
ノ酸が特に好ましい。

本発明の乾式分析要素の検出試薬系とカルボン酸を含有
する層には、親木性ポリマー、緩衝剤あるいは光遮蔽性
微粒子等を必要に応じて含有させることができる。

本発明の乾式分析要素の検出試薬系とカルボン酸系補酵
素安定化剤を含有する層にさらに含有させることができ
る親木性ポリマーの例としては。

澱粉、セルロース、アガロース、ゼラチンおよびこれら
の誘導体（例、ヒドロキシメチル化およびヒドロキシプ
ロピル化笠）、アクリルアミド正合体、アクリルアミド
と各種ビニル性モノマーとの共重合体、ビニルピロリド
ン重合体、ビニルピロリドンと各種ビニル性モノマーと
の共重合体、アクリレート重合体およびアクリレートと
各種ビニル性モノマーとの共重合体等を挙げることがで
きる。上記親水性ポリマーのうちではビニルピロリドン
重合体、アクリルアミド重合体またはセルロース誘導体
が好ましい。

上記親木性ポリマーを、乾式分析要素の検出試薬系とカ
ルボン酸系補酵素安定化剤を含有する展開層に含有させ
る場合には、約２ｇ／ｄから約１５ｇ／ｍ′の範囲で含
有させることが好ましい。

上記含有量のうち特に好ましいのは、約２ｇ／ｒｒ＋′
から約１０ｇ／ｍ′の範囲である。

本発明の乾式分析要素の検出試薬系とカルボン酸系補酵
素安定化剤を含有する層にさらに含有させることができ
る緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やグ
ツド（Ｇｏｏｄ　）の緩衝剤などの公知の緩衝剤を挙げ
ることができる。これらの緩衝剤はｒ蛋白質・酵素の基
礎実験法Ｊ　（掘尾武・、他著、南江堂、＋９８１）等
の公知文献を参考にして選択し、使用することができる
。

本発明の乾式分析要素の検出試薬系を含有する層には、
さらに後述する光遮蔽層に用いられる光遮蔽性微粒子を
含有させることもできる。

検出試薬系を含有する層に上記の検出試薬系、カルボン
酸系補酵素安定化剤および必要に応じて加えられる親木
性ポリマー、緩衝剤あるいは光遮蔽性微粒子等を含有さ
せるに際しては、上記試薬等を含有する塗布液を展開層
のＬから塗布または噴霧し乾燥する方法を用いることが
できる。

また検出試薬系とカルボン酸系補酵素安定化剤を含有す
る層が織物、編物、癌紙、不Ｊｌ’Ｓ布およびガラス繊
維鑓紙等からなる展開層である場合には、上記試薬等を
含有する溶液に展開層を浸漬したのち乾燥する方法を用
いることができる。また、　・体型多層分析要素とする
ため、上記のような展開層をラミネートによりａ層する
場合には、上記のように浸漬した展開層を乾燥または半
乾燥状態で他の層に桔層し一体化する方法を用いること
もできる。

塗布により形成される層１例えばプラッシュポリマ一層
やミクロビーズ三次元格子状粒子構造体等からなる層の
場合には、この層の塗布液と試薬等の塗布液を混合して
塗布してもよい。

なお、展開層に試薬等を含有させる場合に、いくつかの
試薬毎に異なる方法を用いることもできる。また、いく
つかの試薬毎に数回に分けて行なうこともできる。

本発明において、検出試薬系を含む層は、一つ以」−の
層から成ってもよい。この場合に、ニコチンアミド補酵
素、電ｆ伝達性化合物および電ｆ受容性染料形成性化合
物は、全ての層に均一に含有されてよい。特に補酵素は
支持体から遠い層に、電子−受容性染料形成性化合物は
支持体に近い層に多く分布させることが好ましい。

本発明の乾式分析要素に用いることができる光透過性・
水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリス
チレン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテ
ート、セルローストリアセテート、セルロースアセテー
トプロピオネート”Ｊ）’Ｖのポリマーからなる厚さ約
５０ＪＬｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０ｇｍから約
３００ｇｍの範囲のフィルム、もしくはシート状の透明
支持体を挙げることができる。

本発明の乾式分析要素に用いることができる光不透過性
または光反射性支持体としては、Ｌ記ポリマー中に光反
射性色材を含有させることにより容易に作成することが
できる。また、上記ポリマー等からなる透明支持体表面
に光反射性色材を塗布する、または光反射性色材をから
なる粘着テープを貼る等によっても容易に作成すること
ができる。

これら支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支
持体のＬに設けられる吸水層あるいは検出試薬系とカル
ボン酸系補酵素安定剤を含有する層と支持体との接着を
強固なものにすることができる。また、ド塗層の代りに
、支持体の表面に物理的あるいは化学的な活性化処理を
施して接着力の向りを図ってもよい。

本発明の乾式分析要素が一体型多層分析要素である場合
には、光透過性・水不透過性支持体のＬに（場合によっ
ては下塗層等の他の層を介して）吸水層が設けられる。

本発明の乾式分析要素に備えられる吸水層は親木性結合
剤よりなる層、すなわち水を吸収して膨潤する親木性ポ
リマーを層形成成分として利用している層であることが
好ましい。

吸水層の製造に用いることができる親木性ポリマーは１
−競″には水吸収時のＷ調率が３０℃で約１５０％から
約２０００％、好ましくは約２５０％から約１５００％
の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。そのよ
うな親木性ポリマーの例としては、ゼラチン（例、酸処
理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（
例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフ
トゼラチン等）、アガロース、プルラン、プルラン誘導
体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ
ビニルピロリドン等をあげることができる。

吸水層の乾煙時の厚さは約１ｇｍから約１００ｇｍの範
囲であることが好ましく、より好ましくは約３ルｍから
約３０μｍの範囲である。また吸水層は実質的に透明で
あることが好ましい。さらに吸水層には、必要に応じて
界面活性剤や緩衝剤を含有させることもできる。

に記吸水層のＬには、必要に応じて光遮蔽層を設けるこ
とができる。光遮蔽層は、光ｇ蔽性、または光遮蔽性と
光反射性とを兼ね備えた微粒子または微粉末（以ド、巾
に微粒子という）が少量の皮膜形成能を有する親木性ポ
リマーパインターに分Ｉ牧保持されている水透過性また
は水浸透性の層である。光遮蔽層は吸水層にて発生した
検出可能な変化（色変化１発色等）を光透過性を有する
支持体側から反射測光する際に、検出試薬系とカルボン
酸を含有する展開層に点着供給された水性液体の色、特
に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等を遮蔽
するとともに光反射層または背景層としても機能する。

光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子の例としては
、二酸化チタン微粒′ｆ−（ルチル型、アナターゼ型ま
たはプルカイト型の粒子径が約０．１ｐｍから約１．２
ルｍの微結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アルミニ
ウム微粒子または微小フレーク等を挙げることができ、
光遮蔽性微粒子の例としては、カーボンブラック、カス
ブラック、カーボンミクロビーズ等を挙げることができ
、これらのうちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム
微粒子が好ましい。特に好ましいのは、アナターゼ型二
酸化チタン微粒子である。

皮膜形成能を有する親木性ポリマーバインダーの例とし
ては、前述の吸水層の製造に用いられる親水性ポリマー
と同様の親水性ポリマーのほかに、弱親水性の再生セル
ロース、セルロースアセテート等を挙げることができ、
これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアク
リルアミド等が好ましい。なお、ゼラチン、ゼラチン誘
導体は公知の硬化剤（架橋剤）を添加することができる
。

光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親木性ポリマーとの水性
分散液を公知の方法により吸水層のトに塗布し乾燥する
ことにより設けることができる。

また、光遮蔽層を設ける代りに、後述するように検出試
薬系とカルボン酸系補酵素安定剤を含有する展開層中に
光遮蔽性微粒子を含有させてもよい。

なお、吸水層の」二に、場合によっては光遮蔽層等の層
を介して、展開層を接着し積層するために接着層を設け
てもよい、接着層は水で湿潤しているとき、または水を
含んで膨潤しているときに展開層を接着することができ
、これにより各層を一体化できるような親木性ポリマー
からなることが好ましい。接着層の製造に用いることが
できる親水性ポリマーの例としては、吸水層の製造に用
いられる親木性ポリマーと同様な親木性ポリマーがあげ
られる。これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、
ポリアクリルアミド等が好ましい。接着層の乾燥膜厚は
一般に約０．５ｐｍから約２０ｇｍ、好ましくは約１ｇ
ｍから約１０ｇｍの範囲である。なお、接着層は吸水層
北以外にも、他の層間の接着力を向丘させるため所望の
層−にに設けてもよい、接着層は親木性ポリマーと、必
要によって加えられる界面活性剤等を含む水溶液を公知
の方法で、支持体や吸水層等のＬに塗布する方法などに
より設けることができる。

展開層は、液体計量作用を有する展開層であることが特
に好ましい。液体試料計量作用を有する展開層とは、そ
の表面に点着供給された液体試料を、その中に含有して
いる成分を実質的に偏在させることなく、横（水平）方
向に単位面積当りほぼ一定かの２１合で広げる作用を有
するものである。

展開層のマトリックスを構成する材料としては、油紙、
不織布、織物生地（例、ブロード、ボブリン等のモ織等
）、編物生地（例、トリコット編、ダブルトリコット編
、ミラニーズ編等）、ガラス繊維濾紙、プラッシュポリ
マーより形成されるメンブランフィルタ−１あるいはポ
リマーミクロビーズ等からなる三次元格Ｉ状構造物等を
用いることが好ましい。これらのうちでは、試薬類の保
持性の点で、織物生地および編物生地に代表される繊維
質層を用いることが特に好ましい。

本発明の乾式分析要素に用いることができる織物生地ま
たは編物生地は水洗等の脱脂処理により少なくとも糸製
造時、織物製造時あるいは編物編成時に供給または付着
した油脂類を実質的に除去した品物または編物生地が好
ましい。

Ｌ記織物または編物生地を一体型多層分析要素の展開層
として用いる場合には、さらにその織物または編物生地
に特開昭５７−６６３５９号公報に開示の物理的活性化
処理（好ましくはグロー放電処理またはコロナ放電処理
等）を生地の少なくとも片面に施すか、あるいは特開昭
５５−１６４３５６号、特開昭５７−６６３５９号公報
等に開示の親水性ポリマー含浸処理等の親木化処理また
はこれらの処理■程を逐次実施することにより織物また
は編物を親水化し、Ｆ側（支持体に近い側）の層との接
着力を強化することができる。

織物または編物生地からなる・体型多層分析要素の展開
層を前述した吸水層または接着層に接着、積層するには
、特開昭５５−１６４３５６号および特開昭５７−６６
３５９号各公報等に開示の方法に従って作成することが
できる。すなわち、吸水層または接着層の塗布後未乾燥
のうちに、または乾燥後の層に水（または界面活性剤を
少か含む水）を実質的に均一に供給して層を膨潤させ、
ついで織物または編物生地を湿潤または膨潤している層
のＬに実質的に均一に軽く圧力をかけながら接着、ｖｉ
層し一体化する。

また展開層がプラッシュポリマーまたはメンブランフィ
ルタ−からなる場合には特公昭５３−２１６７７号公報
等、ポリマーミクロビーズからなる三次元格ｆ状構造物
である場合には特開昭５５−９０８５９号公報等、濾紙
または不織布からなる場合には特開昭５７−１４８２５
０号公報等にそれぞれ記載の方法に従って設けることが
できる。

前述した吸水層または接着層の親木性ポリマーパインタ
ーがゼラチンまたはゼラチン誘導体の場合には、層の塗
布後ゼラチン（または誘導体）が未乾燥のゲル状態の間
にＬ記展開層を構成する材料（織物または編物生地等）
を接着、積層し一体化する方法を採用することができる
。

本発明の乾式分析要素は、検出試薬系とカルボン酸系補
酵素安定化剤を含有する層よりなる単一のシートから構
成することも可能である。

本発明の乾式分析要素は、一体型多層分析要素とした場
合には、・通約１５ｍ＋ｎから約３０ｍｍの正方形また
はほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特開昭５７−
６３４５２号、特開昭５４−１５６０７９号、実開昭５
６−１４２４５４号。

実開昭５８−３２３５０号および特開昭５８−５０１１
４４号各公報等に開示のスライド枠等に納めて分析スラ
イドとして用いるのが製造、包装、輸送、保存および測
定操作等の全ての観点で好ましい。

本発明の乾式分析要素は、約５ル文から約３０Ｗ文、好
ましくは約８ｐ文から約１５．文の水性液体試料を展開
層に点着供給し、必要に応じて約２０℃から約４５℃の
範囲の実質的に−・定の温度でインクベーションする。

その後、一方の側から（一体型多層分析要素においては
光透過性支持体側から）乾式分析要素内の色変化、発色
等の検出可能な変化を反射測光し比色法の原理により液
体試料中の測定対象成分を分析する。

［発明の効果］ 本発明の乾式分析要素において、カルボン酸系補酵素安
定剤が、酸化型ニコチンアミド補酵素。

と同“−の層内に存在することにより、酸化型ニコチン
アミド補酵素の保存性が著しく向トする。

また本発明の乾式分析要素は、酸化型ニコチンアミド補
酵素、電子伝達性化合物および電子受容性染料形成性化
合物を含む検出試薬系を同一の層内に含有することを実
用的に可能にするものであるため、検出反応の円滑な進
行が妨げられることかなく、検出精度が優れている。

以ドに本発明の実施例及び比較例を示す。

［実施例１］ 透明ポリエチレンテレフタレート支持体（厚さ：１８０
ｐｍ）の表面を親水化処理し、その処理表面りに”ド記
の組成の塗布液を１２０牌交／ｒｎ′となるように塗布
、乾燥して乾燥膜厚１０ルｍの吸水層を形成した。

吸水層形成用塗布液： ゼラチン　　　　　　　　　　　１０ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２７００ｇオクチルフェ
ノキシ壷 ポリエトキシエタノール　０．５ｇ 次に、Ｌ２吸水層のトに、ポリエステル撚糸トリコット
編み展開層（厚さ＝２５０ルｍ）を湿式ラミネート法に
より接着した。

Ｌ記展開層に下記の組成の試薬塗布液を塗布乾燥した。

試薬塗布液の調製ニ ドリス（ヒドロキシメチル） アミ／メタン　　　０．３０３ｇ 乳酸リチウム　　　　　０．２２５ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　１０．０００ｇ１０
％ポリビニルピロリドン １２．５００ｇ ＮＡＤ・　　　　　　　　０．０７５ｇジアホラーゼ　
　　　１０００ユニツトグルタミン酸　　　　　　０．
３５０ｇＬ記組成液に、ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液を
加え、塗布液のｐＨを８．５に調製し、塗布液鼠２５ｃ
ｃとして用いた。

次いで、３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（Ｐ−ニト
ロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムク
ロライド（＝　Ｉ　ＮＴ）８ｍＭを含む２％ポリビニル
ピロリドン溶液をＬ記展開層に塗４１後、乾燥して本発
明に従うＬＤＨ（乳酸デエヒドロゲナーゼ）活性測定用
乾式分析要素を作成した。

［比較例１］ 実施例１において用いた試薬塗布液の代りにＦ記の組成
の試薬塗布液を用いた以外は、実施例１と同様にして比
較用ＬＤＨ活性測定用乾式分析要、＋：を作成した。

試薬塗布液の調製ニ トリス（ヒドロキシメチル） アミノメタン　　　０．９０９ｇ 乳酸リチウム　　　　　０．２２５ｇ。

水　　　　　　　　　　　　　　　１０．０００ｇ１Ｏ
％ポリビニルピロリドン １２．５００ｇ ＮＡＩＩ　　　　　　　　　０．０７５ｇジアホラーゼ
　　　　１０００ユニツトヒ記組成液に、６Ｎ塩酸を加
え、塗布液のＰＨを８．５に調製し、塗布液量２５ｃｃ
として用いた。

［実施例２１ 実施例１における試薬塗布液中のグルタミン酸の量を０
．７００ｇに変更した以外は、実施例１と同様にして本
発明に従うＬＤＨ活性測定用乾式分析要素を作晟した。

［実施例３］ 実施例１における試薬塗布液中のトリス（ヒドロキシメ
チル）アミンメタンの量を０．９０９ｇに、グルタミン
酸の量を２．１００ｇにそれぞれ変更した以外は、実施
例１と同様にして本発明に従うＬＤＨ活性測定用乾式分
析要素を作成した。

［実施例４コ 実施例１における試薬塗布液中のトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタンの量を０．９０９ｇに変更し、グル
タミン酸の代りにクエン酸を１゜３２０ｇ用いた以外は
、実施例１と同様にして本発明に従うＬＤＨ活性測定用
乾式分析要素を作成した。

［実施例５］ 実施例１において用いた試薬塗布液の代りに下記の組成
の試薬塗布液を用いた以外は、実施例１と同様にして本
発明に従うＬＤＨ活性測定用乾式分析要素を作成した。

試薬塗布液の調製ニ トリス（ヒドロキシメチル） アミノメタン　　　１．５１５ｇ 乳酸リチウム　　　　　０．２２５ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　１０．０００ｇ１０
％ポリビニルピロリドン １２．５００ｇ ＮＡＤ・　　　　　　　　０．０７５ｇジアホラーゼ　
　　　１ｏｏｏユニツトＥＤＴＡ・２Ｎａ１１！　　２
．７９０ｇＬ記組成液に、６Ｎ塩酸を加え、塗布液のｐ
Ｈを８．５に調製し、塗布液ｑ　２５　ｃ　ｃとして用
いた。

［実施例６］ 実施例１における試薬塗布液中のグルタミン酸の代りに
アスパラギン酸を１．３２０ｇ用いた以外は、実施例１
と同様にして本発明に従うＬＤＨ活性測定用乾式分析要
素を作成した。

［実施例７］ 実施例１における試薬塗布液中のグルタミン酸の代りに
グルコン酸を１．３２０ｇ用いた以外は、実施例１と同
様にして本発明に従うＬＤＨ活性測定用乾式分析要素を
作成した。

ＮＡＤ・残存量の測定 上記実施例１〜７および比較例のＬＤＨ活性測定用乾式
分析要素におけるＮＡＤ゛の保存性を比較するために、
それぞれの分析要素について、ＩＮＴ８ｍＭを含む２％
ポリビニルピロリドン溶液の塗布を行なわないものを準
備した。これらの分析要素を減圧乾燥後、４５℃の５ｉ
０２　を用いた乾燥条件下で４日間保存した。

Ｌ記保存後の分析要素についてＮＡＤ°歿存訃の測定を
行なった。Ｌ記残存賃は、分析要素中のＮＡＤｏ　を基
質緩衝液（０，２Ｍ）ＩＪス、０．１Ｍ乳酸リチウム、
ｐＨ８，５）に抽出し、３７℃で、ＬＤＨ液を添加する
ことにより、ＮＡＤ・をＮＡＤＨに変換し、３４０ｎｍ
における吸光度で測定した。測定結果を用いて、ＮＡＤ
・の残存量を百分率により算出した。結果をド記第１表
に示す。

以ド余白 第１表 乾式分析要素　　　　　　ＮＡＤ　　残存賃実施例１　
　　　　　　　８０　％ 比較例１　　　　　　　　２９　％ 実施例２　　　　　　　　１００　　％実施例３　　　
　　　　　９１　％ 実施例４　　　　　　　　８６　％ 実施例５　　　　　　　　９５　％ 実施例６　　　　　　　　９７　％ 実施例７　　　　　　　　８７　％ ［実−例８および比較例２コ ゼラチンＦ塗りが施された厚さ１８０　ｇｍのポリエチ
レンテレフタレートＣＰＥＴ）Ｊ二にＦ記の処方の塗布
液を塗布、乾燥した。

ゼラチン　　　　　　　　　　５ｇ／ｍ′ニトロテトラ
ゾリウムブルー ０　、２　ｇ／ｒＩ′Ｔ′ ポリオキシエチレンノニル フェニルエーテル　　　０．１ｇ／ゴ 次に、ド記処方で酵素＋補酵素系の塗布を上記塗布層の
Ｌに施した。

ゼラチン　　　　　　　　　２０ｇ／ゴＴＲＩＴＯＮ　
　Ｘ１００ （ローム・アンド・ハースｌｌＪ［） ０　、２　ｇ／ｒｒｆ ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　２ｇ／ｒｎ’リンゴ酸
　　　　　　　　　１　、８　ｇ／ＩＴｒ′トリス（ヒ
ドロキシメチル） アミノメタン　　　　　３　、２　ｇ／ｒｒＩ′ＡＴＰ
　　　　　　　　　　１．１ｇ／ｍ？ＭｇＳＯ４０，１
ｇ／ｒｎ’ ジアホラーゼ　　　　　４０００Ｕ／ｒｒｒ’グリセリ
ン−３燐酸 デヒドロゲナーゼ　　５０００　Ｕ／ｍ’グリセリンキ
ナーゼ　　２８００Ｕ／ｒｎ’次にこの二層積層された
ゼラチン層に湿し水として３０ｇ／ｒｎ’の割合で水を
供給、湿潤させたのち、グロー放電で予め親水化したポ
リエチレンテレフタレート紡績糸（５０デニール）から
なるトリコット編物生地（モ均厚さ２５０Ｉｉ、ｍ）を
あっち壱〈ラミネートして展開層を設けた。ついで展開
層中でｒ記の成分被覆量になるようにして、編物展開層
の上から加水分解酵素水溶液を塗布により含浸し乾燥し
てトリグリセライド（中性脂肪）定量用一体型多層分析
要素を完成した。

加水分解酵素塗布組成物の成分 リポプロティンリパーゼ １０００Ｕ／ｒｎ’ ポリオキシエチレン オクチルフェニルエーテル　２　ｇ　／　ｍ’比較例２
としてリンゴ酸を塩酸に変更して同モル添加した以外は
全て同処方、同工程で分析要素を作成した。完成した要
素を１　、５ｍｍＸ　１　、５ｍｍの正方形チップに裁
断し、特開昭５７−６３４５２号公報に開示のプラスチ
ックマウントに収めて中性脂肪定量用化学分析スライド
を完成した。

このスライドを乾燥状態で一２５°Ｃと４５℃に一週間
放置した後、中性脂肪濃度の異なるヒト血清をり、０Ａ
Ｌ１点着し、３７℃で６分間インキュベーションしたの
ち、５４０ｎｍの測定光でＰＥＴ支持体側から反射光学
濃度を４ＩＩＩ定した。

前記血清について別にグリセロール−３−燐酸オキシダ
ーゼ法で中性脂肪濃度を決定し、検量線を作成し、比較
例と比較した。

中性脂肪濃度Ｏに対しては７％ヒトアルブミン溶液を点
着して光学濃度を測定した。

第１図は、実施例８により得られた検量線、第２図は比
較例２により得られた検量線である。本発明の実施例８
では５分析要素を４５℃に放こしても低温保存したもの
とほとんど差がないのに対し、比較例では４５℃に放置
すると背景濃度が丘昇し中性脂肪濃度に対する感度が低
くなったことがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、それぞれ実施例８および比較例
２で得られた検量線を示す。 特許出願人　　富士写真フィルム株式会社代　　理　　
人　　　弁理上　　　柳　　川　　泰　　実弟１図 中性脂肪濃度（ｍｇ／ｄｉ　） 中性脂肪濃度（ｍｇ／ｄｌ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、検出試薬系として酸化型ニコチンアミド補酵素、電
   子伝達性化合物および電子受容性染料形成性化合物を有
   し、そして電子伝達性化合物を酸化型ニコチンアミド補
   酵素および／または電子受容性染料形成性化合物と同一
   の層内に含有する乾式分析要素において、 上記酸化型ニコチンアミド補酵素を含有する層内にカル
   ボン酸系補酵素安定剤が存在していることを特徴とする
   分析要素。 ２、上記乾式分析要素が、酸化型ニコチンアミド補酵素
   および電子伝達性化合物を同一の層内に含有しているこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の分析要素。 ３、上記乾式分析要素が、酸化型ニコチンアミド補酵素
   、電子伝達性化合物および電子受容性染料形成性化合物
   を含む検出試薬系を同一の層内に含有していることを特
   徴とする特許請求の範囲第２項記載の分析要素。 ４、上記カルボン酸系補酵素安定剤が、アミン性窒素原
   子を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の分析要素。 ５、上記カルボン酸系補酵素安定剤が、酸性アミノ酸で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の分析
   要素。 ６、上記カルボン酸系補酵素安定剤が、ヒドロキシカル
   ボン酸であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の分析要素。 ７、上記カルボン酸系補酵素安定剤が、ヒドロキシポリ
   カルボン酸であることを特徴とする特許請求の範囲第６
   項記載の分析要素。 ８、上記カルボン酸系補酵素安定剤が、アルドン酸であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の分析要
   素。 ９、上記酸化型ニコチンアミド補酵素が、 ＮＡＤ′であることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の分析要素。 １０、上記乾式分析要素が、光透過性・水不透過性支持
   体、吸水層および上記検出試薬系を含有する展開層を順
   次積層一体化してなる一体型多層分析要素であることを
   特徴とする特許請求の範囲第３項記載の分析要素。 １１、上記乾式分析要素が、光透過性・水不透過性支持
   体、上記電子受容性染料形成性化合物を含有する試薬層
   および上記電子受容性染料形成性化合物を除く検出試薬
   系を含有する展開層を順次積層一体化してなる一体型多
   層分析要素であることを特徴とする特許請求の範囲第２
   項記載の分析要素。