JPH0466595A - 哺乳動物ｇａｐ―４３組成物および使用方法 - Google Patents
哺乳動物ｇａｐ―４３組成物および使用方法Info
- Publication number
- JPH0466595A JPH0466595A JP2290615A JP29061590A JPH0466595A JP H0466595 A JPH0466595 A JP H0466595A JP 2290615 A JP2290615 A JP 2290615A JP 29061590 A JP29061590 A JP 29061590A JP H0466595 A JPH0466595 A JP H0466595A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gap
- cells
- protein
- cell
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
（産業上の利用分野）
本発明は分子遺伝学および神経学の分野に関する。さら
に詳しくは、本発明は、哺乳動物Ｇ Ａ Ｐ４３、ニュ
ーロン成長関連蛋白のｃ Ｄ Ｎ 、Ａ配列および対応
するアミノ酸配列に関する。さらに、本発明は、ＧＡＰ
−４３の発現を調節し、それにより軸索成長を調節する
方法、および原核生物または真核生物宿主細胞または生
物においてＧ 、Ａ Ｐ４３を産生する方法に関する。 さらに詳しく述へれば、本発明は、ＧＡＰ−４３の膜結
合および成長円錐富化を調節でき、かついずれの所望の
蛋白またはポリペプチドをもニューロンまたは非ニュー
ロン細胞の膜に対して定方向化できるＧ Ａ Ｐ４３由
来の新規な膜ターゲツテイング（ｍｅｍｂｒａｎｅｔａ
ｒｇｅｔ ｉｎｇ）ペプチドに関する。また、本発明は
、ＧＡＰ−４３およびそれらから誘導された生物学的に
活性なペプチドか内部調節蛋白（ＩＲＰｓ）として機能
し、細胞機能を細胞内的に変調するように作用すること
ができる。また、本発明は、とりわけ、ヒ１〜を含めた
動物における神経学的徴候において、ＧＡＰ−４３およ
びその調節および膜ターケアティング要素の臨床的なｉ
ｎ ｖｉｖｏおよび１ｎｖｉｔｒｏての診断および治療
適用に関する。 （従来の技術） Ｇ Ａ Ｐ −４３は成長する軸索を特異的に特徴付け
る蛋白の１つである（スケ不（Ｓｋｃｎｅ）、セル（Ｃ
ｅｌ ］）３７ ： ６９７（１９８４）；メイツ（Ｍ
ｅｉｒｉ）、ビイ・ｘヌ−ｘイ・ｘス（ｉ〕ＮＡｓ）Ｕ
ＳＡ８３ ： ３５３７（１９８０））。軸索により輸
送される蛋白は全細１１’＝、２蛋白のうら小さい→ブ
セ、１−であり、こＡ１らのらち少お（か、そのレー・
ルか軸索成長を直接に媒介寸−ると乙えることかできる
ように変化するースケ不お３上びライリアー ｌ”（Ｓ
ｋｐｎｅ ａｎｄζ１ｌｌｉａｒｄ）、ンヤーナル・オ
フ・セリュラー・バイオ０／−（Ｊ、 Ｃｅ１１． Ｂ
ｉｏｌ、）８９ ： ８６（］ ９８１）：ヘノウイッ
およびリューイス（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｌｅｗ
ｉｓ）、ンヤーナル・オフ・ニューロサイエンス（Ｊ、
Ｎｅ＋）ｒ。 ５ｃｉｅｎｃｅ）３：２１５３（１９８３）；スケ不（
Ｓｋｅｎｅ）、セル（Ｃｅｌｌ）３７ ： ６９７（１
９８４）；メイツ（Ｍｅｉｒｉ）、ビイ・エヌ・エイ・
ニス（Ｐ！１ＡＳ） Ｕ Ｓ Ａ８３ ： ３５３７（
］ ９８６））。こ４１らの分子のいずれかが構造変化
を媒介する直接の証拠は欠くか、ｃ Ａ Ｐ −４３は
（ｌ￥補として特に魅力的であるＣ というのは、それ
は、第一に成長円錐膜１戊要素であり、そこでは成長円
錐膜の内表面に結合し、蛋白キナーセＣについての基質
として働くからである（アロ３（へ１ｏｙｏ）、ツヤ−
ナル・オフ・二」−ロケミスドリー（Ｊ、 Ｎｅｕｒ
ｏｃｈｅｍ、）４１ ： ６４９（１９８３） エイ
カースおよびロウテンプルク（Ａｋｅ、、ｒｓａｎｄ
Ｒｏｕｔｔｅｎ−４−＋ｅｒｇ）、フレイン・り廿−チ
（ＢｒａｉｎＲｅｓ、）３３４： １４７（＋ ９８３
））。さらに、その）六（云−Ｊ−発現のレヘルは、命
田ｌ包槁養およびｉｎ〜１〜０双方において、軸索成長
に人いに関係−４−る（′・／（ｔ３ａｓｉ）、セル（
Ｃｅｌｌ）４９ ： ４８５（１９８７）ノノーンズ（
Ｋａｒｎｓ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３６
５９７（１９８７）；不へ（Ｎｅｖｅ）、モレキュラー
・プレイン・リサーチ（Ｍｏｌｅｃ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅ
ｓ、）２ ： １７？（］ ９８７）； トウ・う・モ
ーントら（ｄｅ ＩａＭｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ）、未発
表）。 成熟したヒ１〜中枢神経系（ＣＮＳ）における修ｉ宴の
欠如は手ごわい臨床的問題である。急性虚血または外傷
の後、再生の組織病理学的証拠は最小てあり、神経学的
回復は通常存在しないかまたは不完全である。他方、末
梢神経系のニューロンは、金魚またはヒキカエルのごと
き他の種のＣＮＳニューロンかそうであるごとく、再生
することか予測できる（スケ不およびウィラート （Ｓ
ｋｅｎｅ ａｎｄＷｉｌｌｉａｒｄ） 、／ヤーナルｅ
オフ争セリュラー曽バイオｏ ノー（Ｊ、 Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、）８９ ： ８６（１９８１）へノウィッお
よびリー↓−イス（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ ａｎｄｌ、（・
ｗｉｓ）、／ヤーナル・オフ・ニューロサイエンス（１
）へ（・＋」ｒｔ）ｓｃｉｃｎｃｓ）３ ： ２１ ；
−＋ ３（１９８３））。成１（哺乳動物Ｃ入８ニュー
コンの不応件についての１の説明は、成長に重装な分子
の不可逆的抑制であろう。特に、Ｇ Ａ Ｐ −４３は
再生に対して臨界的であると示唆されている（スケ不（
Ｓｋｃｎｅ）、セル（Ｃｅｌｌ）３７ ： ６９７（１
９Ｂ ４））。これについての証拠は成長円錐における
その富化（スｒ不（Ｓｋｅｎｅ）、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ） ２３３ ： ７８３（１９８６）；メイツ
（Ｍｅｉｒｉ）、ビイ・エヌ・エイ・ニス（ＰＮＡＳ）
Ｌ；Ｓ、Ａ８３ ： ３５３７（１９８６））および周
産期ＣＮＳとは月明的な成人におけるその最小発現（ス
ケ不およびウィラーＦ（Ｓｋｅ旧！ ａｎｄＷｉｌｌｉ
ａｒｄ）、／ヤーナル・オフ・セ１ノユラー・ハイオロ
ノ（Ｊ、 Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、）８９：９６（
］ ９８１）カーノズ（Ｋａｒｎｓ）、サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ） ２３６５９７（１９ε３７））を含む
。さらに、ＧへＰ７４３は、ヒキカエルまたは分色、視
神経または哺乳動物末梢神経のごとく、再生か可能なニ
ューロノニおける負傷のｉ友、高レベルまで増力口する
か、哺乳動物Ｃ＼８ニューロンにり、１する同様の負傷
のｉ（てはそゞ）はならない（スケイ、お、上ひウィラ
ート（Ｓｋｅｎｅ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｒｄ）、ンヤ
ーナル・オフ・セリュラー・バイオロジー（Ｊ、 Ｃ
ｅ１１． Ｂｉｏｌ、）８９ ： ９６（１９８１））
。 （発明か解決しようとする課題） 本発明者らは、ヒ）ＣＮＳ機能および病気におけるＧＡ
Ｐ−４３の役割を調−２た。ヒトＧＡＰ４３ ｃ ＤＮ
Ａをクローン化し、その発育および成人分布を死後組織
のアッセイによって調へた。高い周産期発現に加え、本
発明者らは、ＧＡＰ−４３発現は成人の不連続（ｄｉｓ
ｃｒｅｔｅ）領域に残存し、予期せぬことに急性虚血負
傷は、通常それか低い領域においても、ＧＡＰ−４３の
高い発現に関係することを見い出した。 （課題を解決するための手段） 哺乳動物ＣＮＳ機能および病気におけるＧＡＰ４３の潜
在的な重要性を認識しつつ、本発明者らは、相補ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）クローニングによって、哺乳動物ＧＡＰ−
４３遺伝子の配列決定に成功した。ラットＧＡＰ−４３
をコード付けする遺伝子の完全なヌクレオチド配列およ
びアミノ酸配列を決定した。う７ トＧＡＰ−４３につ
いてのｃＤＮＡをプローブとして用いて、ヒト脳幹およ
び小脳ライブラリーからのヒトＧＡＰ−４３についての
ｃＤＮＡを同定し、クローン化した。ヒトＧ、ＡＰ−４
３についてのアミノ酸配列も決定した。 かくして、本発明の１の具体例において、実質的に純粋
な哺乳動物ＧＡＰ−４３蛋白、またはその機能的誘導体
か提供される。また、実質的に純粋な形態のラットおよ
びヒ）ＧＡＰ−４３蛋白、ならびにこれらの蛋白の機能
的誘導体か提供される。本発明の特別の具体例は、各々
、第２図および５Ａ図に示したものに対応するアミノ酸
配列を有する実質的に純粋なラットおよびヒトＧＡＰ４
３蛋白およびポリペプチド、およびそれらの機能的誘導
体よりなる。 本発明のもう１つの具体例は、第２図または５Ａ図に示
したヌクレオチド配列またはそれと実質的に同様のヌク
レオチド配列よりなるｃ Ｄ ＮＡ、またはその誘導体
を提供する。本発明のｃ Ｌ）ＮＡはプラスミドのごと
き適当な発現ベクターに組み込むことかでき、該ベクタ
ーを用いて原核生物または真核生物宿主細胞をトランス
フェクトし、次いて、該宿主細胞は、適当なｉｎ ｖｉ
ｖｏ ｉｎ ｖｉｔｒ。 またはｉｎ ５ｉｔｕ条件下で該ｃＤＮＡを発現し、こ
れらすへては、それにより産生されたＧＡＰ−４３蛋白
またはポリペプチドと一緒に本発明のさらなる具体例を
形成する。 かくして、本発明のさらにもう１つの具体例は、哺乳動
物ＧＡＰ−４３蛋白またはポリペプチドをコード付けす
るｃＤＮＡよりなるベクターて原核生物または真核生物
宿主細胞をトランスフェクトし、該哺乳動物ＧＡＰ−４
３蛋白またはポリペプチドの発現を可能とする条件下で
該宿主細胞を適当な培地中で培養し、該哺乳動物ＧＡＰ
−４３蛋白またはポリペプチド、あるいはその機能的誘
導体を該培地から分離することを特徴とする哺乳動物Ｇ
ＡＰ−４３蛋白またはポリペプチドあるいはその機能的
誘導体を産生ずる方法を提供する。 本発明の実質的に純粋なＧＡＰ−４３抗原を使用し、本
発明者らは、対ＧＡＰ−４３抗体を作り出すのに成功し
、かかる抗体ならびにその機能的および化学的誘導体は
本発明のさらなる具体例よりなる。本発明のＧＡＰ−４
３抗体はポリクローナルまたは、好ましくはモノクロー
ナル抗体とてき、種々の調製、診断および治療用途に適
し、これらはなおさらに本発明の具体例を形成すると理
解されるへきである。 さらに、本発明のＧＡＰｉ３抗原および抗体は、すへて
特定の調製、診断または治療適用か要すると判断される
、例えば検出可能な標識または治療標識に関するごとく
適当な（才識化に、および医薬上許容されるまたは許容
されなくてもよい組成物にて他の活性剤と共に使用する
のに適する。 かかる樟識化ＧＡＰ−４３抗原、抗体ならびにその機能
的および化学的誘導体、ならびにかかる釘１成物は本発
明の具体例よりなる。 その機能的および化学的誘導体と共に、本発明のＧＡＰ
−４３抗原および、特に抗体は当業者に公知の種々の診
断方法で用いることかできる。免疫細胞化学的方法およ
びイムノメトリック方法を包ａするかそれらに限定され
るものではないががる方法はさらに本発明の具体例をな
す。 従って、本発明の１の例示的具体例において、ＧＡ、Ｐ
−−４３抗原または抗体を含有することか疑われる試料
を各々検出可能に標識化したＧＡＰ４３抗体または抗原
と接触させ、ＧＡＰ−４３抗原−抗体複合体の形成を可
能とするために該試料を該抗体または抗原と共にインキ
−ベートし、かく形成された？１体を複合体を形成しな
かった抗原または抗体から分離し、標識した複合体化抗
体または抗原を検出することを特徴とする、試料におい
て哺乳動物ＧＡＰ−４３抗原または抗体を測定または検
出する方法か提供される。本発明の本具体例および他の
ものは、所望するに応して、ｎｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏまたはｉｎ ５ｉｔｕて行うことかてきる。 本発明の調製、診断または７台療力法で用いる場合、本
発明の化合物および組成物は、都合よくは、キット中に
包なさせることかでき、かかるキ、）・は本発明のも；
）１つの具体例を形［戊する。かくして、非限定的例と
して、閑した区画に１またはそれ以上の容器手段を収容
させるために打切を設けた担体手段よりなり、１または
それ以上の該容器手段か、調製、検出または治療可能に
標識化されたＧＡＰ−４３抗原または抗体、あるいはそ
の機能的または化学的誘導体よりなる、ＧＡＰ−４３抗
原または抗体の調製、精製、単離、測定または検出に、
あるいはＧ Ａ、 Ｐ −４３抗原または抗体での治療
処置に有用なキ７）か提供される。 また、本発明者らは、正常な、並ひに損傷または疾害Ｃ
ＸＳ組織においてＧ Ａ Ｐ−４３発現を評価した。ｉ
ｎ ｖｉｖｏ ＧＡＰ−４３発現は中枢組織の発育間に
変化し、ＧＡＰ ４３発現の領域による変動か存在す
ることか見い出された。さらに、ＧＡＰ−４３発現は中
枢組織に対する損傷の結束、かなりの変化を受はること
も見い出された。 さらに、本発明者らは、哺乳動物ＧＡＰ−４３発現を増
強でき、または所望ならば抑制できるノカニスムを見い
出した。、特に、ＧＡＰ４３発現は神）二￥成長囚了に
よ−・−ご増強され、これはある種のステロイド類によ
−・て抑制されることを見い出した。Ｇ Ａ Ｐ −４
３発現を変調する能力は、中枢または末梢神経系に対す
る損傷、またはその病気もしくは機能障害に罹った哺乳
動物、特にヒトを処置するにおいで太いに治療的利用か
てきのて、これらの発見の重要性は容易に理解されるで
あろう。、さらに、本発明者らは、ＧＡＰ−４３または
その機能的誘導体をコード付けするｃ Ｄ Ｎ、Ａを非
神経細胞に導入することによって、非神経細胞てあ−・
でも成長円錐−様突起を形成できるという驚くへき発見
をした。再度、この発見の潜在的治療イ凸イ直は２ＡＫ
なものである。 従って、もう１つの態様において、本発明は、疾患また
は損傷ＣＮＳ組織、ならひに正常なＣＮＳ組織における
Ｇ Ａ Ｉ）−４３活１１および発現を評価または１測
定する方法よりなる。さらに、本発明は、中枢または末
梢神経組織の損傷、疾化または機能［撞害に罹−・たヒ
トを禽めた哺乳動物を治療する方法、およびヒトを劇め
た哺乳動物において正常な（ｉ ＮＳ♀１１織ζこお（
ｆる横送再編成を変調する方ｌ去よりなる３、 かくして、１の具体例において、本発明は、細り包をｉ
ｎ ｖｉｖｏ、 ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ５ｉｔ
ｕて有髪Ｊ量の神経成長因子に暴露することを特徴とす
る該細胞においてＧＡＰ−４３の発現を誘導する方法よ
りなる。柱」包をか＜ ｉｎ ｖｉｔｒｏで暴露した場
合、もう１−）の態様において、治療効果を件いつつ、
損傷、疾患または機能障害の中枢または末梢神経細胞の
イ）処置にかかる細胞を導入し、または該位置と綿密に
同格の位置に導入することか可能であろう。 もう１つの態様においで、Ｇ Ａ Ｐ −４３をツー１
−付はするｃ Ｄ Ｎ Ａを非神経細胞または神鋒細叫
に導入することによって、Ｇ ＡＰ−４３発現を誘導ま
たは増強することかできる。これは、トランスフＪり／
ジン、杉質導入および直接的マイクロインノゴク／−３
ノを含めた種々の十トλによ−、てｉｎ ｖｉｖｏ、
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ５ｉｔｕで達成すること
かでき、これりず・＼ては本発明を限定するものではな
い意図した具体例を形Ｉ戊する。刑法として、本発明の
Ｃ’ Ｄ＼Ａは、レトロウィルスまたはウイルスベクタ
ーの手段によって導入できるか、またはいずれかの数の
細胞表面レセプターリカントに付着させ、かかるリガン
トと共に細胞中に移送することかできる。これらの方法
、ならひにＧＡＰ４３ ｃ Ｄ Ｎ Ａならびにその機
能的および化学的誘導体よりなる組成物およびベクター
のすへては本発明のさらなる具体例を形成する。 同様に、本発明のなおさらなる具体例は、構造再編成を
変調する方法、ンナプス可塑性を変調する方法、および
、神経成長因子、ステロイドおよびそれらの機能的誘導
体よりなる群から選択される１またはそれ以上の物質の
有効量に細胞を暴露することを特徴とするニューロンお
よび非ニューロン細胞を包含する細胞のミクロ環境を変
調する方法よりなる。 また、驚くへきことに、ＧＡＰ−４３は１０個のアミノ
酸アミノ末端エクソンを含有すること、およびこのペプ
チドはＧＡＰ−４３を細胞膜へ特にニューロン細胞の成
長円錐領域へ定方向化する原因となることを見い出した
。さらに、この］０個のアミノ酸膜−ターケノティング
ペプケト、およびその機能性誘導体は、所望の蛋白また
はペプチドのアミノ末端にまたはその近くに結合した場
合、該蛋白またはペプチドを細胞膜へ定方向化できるこ
とを見い出した。この驚くへき発見は、通常細胞質ツル
であり、通常は膜連結性でない蛋白類およびペプチド類
に適用される。 かくして、本発明のさらなる具体例は、いずれの所望の
蛋白またはペプチドをもニューロン細胞または非ニュー
ロン細胞の細胞膜へ定方向化できル膜−ターケ、ティン
グペプチドまたはその機能的誘導体よりなる。本発明の
膜−ターケノテイングペプケト、またはそれに結有する
所望の蛋白またはペプチドは診断または治療のため標識
化てきる。該膜−ターケ、ティノグペプケトを用いる、
ヒトを含めた動物のニューロンまたは非ニューロン細胞
の診療または治療のｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｌ ｖｉｔｒｏ
またはｉｎ ５ｉｔｕ処置は本発明のさらなる具体例を
構成する。 他の具体例において、本発明は、単離したゲノミックＧ
ＡＰ−４３ならひに配置されたそのイントロン−エクソ
ン境界ならびに転写スタート部位を提供するものである
。さらに、驚くことに、ＧＡＰ−４３プロモーターかそ
の構造において全（般的てあり、他の構造遺伝子の発現
に有用であり得ることが見いだされた。 さらに他の具体例において、本発明は、ＧＡＰ４３がＧ
。のものを含む他の細胞蛋白の結合能力を変形するよう
に細胞内的に作用するという驚くへき発見に基づくもの
である。すなわち、本発明は、そのＧＡＰ＝４３が外部
細胞レセプターと効果および利用性において一致する内
部調節蛋白（ｒｌＲＰＪ）の重要な新規クラスを提供す
るものである。また、ＧＡＰ−４３のアミノ末端アミノ
酸からなる合成ペプチドが内部調節蛋白として生物学的
活性を呈することか見いたされ、このような蛋白からな
る組成物およびその用途か本発明の他の具体例を構成す
る。 以下に、添付図面について簡単に説明する。 第１図 ＧＡ Ｐ−４３ｃ ＤＮＡのハイブリット選択
翻訳。 ツキアルティら（Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ ｅｔ ａｌ）、
ビイ・エヌ・エイ・ニス（ＰＮＡＳ）７６ ： ４９２
７（１９７９）の手法により、ＥｃｏＲＩインサート、
ＧＡＰ４３−２を用いてｍ ＲＮＡを選択した。略言す
れば、該ＧＡＰ４３−２インサート０５μｇ１または当
量の非特異的ＤＮＡ、細菌プラスミドｐＳＰ６５をニト
ロセルロース」−にスポットＬ、６５％ホルムアミド、
４００ｍＭＮａＣ（，１０ｍＭ１４−ピペラ／ンンエタ
ンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）を含む溶液、ｐＨ６，４中
、新生児ラット脳ボリアテニル化「ポリ（Ａ）゛二、Ｒ
ＮＡ ｌ ７．５μｇと４２°Ｃて１６時間ハイブリク
イズさせた。６５°Ｃて標準的なりエン酸添加生理食塩
水（Ｓ Ｓ ＣＸＸ Ｉ ）、０５％ＳＤＳ中てｔ先浄
した後、該フィルターを沸騰し、ＲＮＡをエタノールで
沈殿させ、ウサキ網状赤血球溶解物で翻訳し、蛋白を”
１３５Ｓ］メチオニンで標識化した（ペルハムら（Ｐｅ
ｌｈａｍ ｅｔ ａｌ）、ニーロビーアン・ジャーナル
・オフ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、）６７ ： ２４７（］ ９７６乃。財
訳産物、または対ＧＡＰ４３抗体て免疫沈殿させた産物
を１２％ＳＤＳ −ポリアクリルアミドゲル上で分離し
た。（Ａ）（１）外因性ＲＮＡ無し、（ｉｉ）ｐＳＰ６
５−選択ＲＮＡ、（ｉｉｉおよび１ｖ）ＧＡ Ｐ ４３
−２−選択ＲＮ Ａ 、および（Ｘ）ポリ（Ａ）゛新生
児脳ＲＮＡ（新生児）でのｉｎ ｖｉｔｒ。 翻訳産物。（Ｂ）スニペスら（Ｓｎｉｐｅｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ツク・ニューロサイ・アフストル（Ｓｏｃ、 Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉＡｂｓｔｒ、）１２ ： ５００（１９
８６）におけるごとくＡ製したＧ Ａ Ｐ−４３蛋白で
該ＧＡＰ−４３抗体を予め吸収させた後に翻訳産物の免
疫沈殿を示す４番目のレーンを除き（Ａ）について記載
したごとく、（Ａ）の翻訳産物のＧＡＰ−４３に対する
抗体による免疫沈殿。 第２図 ＧＡＰ−４３のヌクレオチド配列および予測さ
れるアミノ酸配列。胚１７〜］８日令ラットからの抜根
神経節よりのＲ：’Ｊ ＡてｃＤＮＡライフラリ−を得
た。チャーゲイン：） （Ｃｈｉｒｇ★ｉｎ ｅｔａｌ
）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ’
） ｌ ８ ： ５２９４（１９７４）の方法によって
全細胞ＲＮ 、Ａ、をｔ１５離し、ポリ（Ａ）ＲＮＡを
４リコ−ｄＴセルロスて選択した。グブラーおよびホフ
マン（Ｇｕｂｌｅｒａｎｄ Ｈｏｆｌ’ｍａｎ）、シー
ン（Ｇｅｎｅ）２５ ： ２６３（１９８３）によって
記載されているリホヌクレアーセＨ法によって二本鎖ｃ
ＤＮＡを得、ＥｃｏＲＩリンカ−に結び、ラムタファー
／クローニングベクターλｇｔ １０およびλｇｔｌｌ
のＥｃｏＲ１部位に結んだ。対ＧＡＰ−４３ウサキ抗体
、続いてアルカリホスファターセ一対つサキグロブリン
Ｇ（プロメカ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔ
ｅｃ乃連結抗体を用いることによって、イソプロピルβ
−Ｆ）チオカラクトピラ／／ト（Ｉ ＰＴＧ）での誘導
の後、同定された最長クローン、ＧＡ、Ｐ４３−２、お
よびより小さいインセードを有する２のファー／をλｇ
ｔ１１ライブラリー中の約５ｘｌＯ’プラークから同定
した。該ｃ ＤＮＡインサートをＭｌ ３ｍｐ １８の
Ｅ ｃ ｏ Ｒ１部位に継代クローンした。２のより短
いクローンの最初のＤＮＡ配列分析により、それらは最
長のものに包含されていることか明らかにされた。ンテ
オキンヌクレオケト鎖−停止法（サンカーら（Ｓａｎｇ
ｅｒ ｅｔ ａｔ）、ビイ・ニス・エイ・ニス（ＰＮＡ
Ｓ）７４ ： ５４６３（１９７″７））により、配列
の下方に示した一連の重複する制限断ＬＬを用いること
によって、インサートＧＡＰ４３−２を配列決定した。 この断片の３“末端は３の独立したλｇｉｌｌ単離体に
共通のＥｃ。 Ｒ＋部位であり、ＧＡＰ−４３遺伝子において天然に生
じるＥ ｃ ｏ ＲＩ部位と考えられる。ボリアテニル
化配列を有するインサートを含有するクローンはなかっ
たので、該ｃ Ｄ Ｎ Ａ内のＥｃｏＲ１部位はライブ
ラリー構築の間にメチル化されなかったようである。Ｇ
ＡＰ−４３についての予測される蛋白配列を該ＤＮＡ配
列の−Ｌ方に示す。イタリック体の第１のメチオニンは
後記する理由でコーティング領域のスターＩ・とじて選
択した。ここにアミノ酸５として示す他のメチオニンの
みか別に開始フトンとして働くのではないよってある。 アミノ酸７におけるアルキニン（Ｒ）からアミノ酸２０
にお（Ｉるイソロイノン（１）までの直接的な蛋白配列
決定によ−・て同定されたアミノ酸残基の」−に線を引
いた。確実性をもってアミノ酸を決定できる配列決定の
最初のサイクルはアルキニンてあ−１．た。 次のアミノ酸は確実性をもって決定できなかった。 断片化されていない蛋白を配列決定できないことは、ア
ミノ末端はブロックされているらしいことを示唆する。 Ｅ、ＥｃｏＲｌ ；ＭｌＭｓｐｌ ：ＶＰｖｕｌ；）ｌ
、Ｈａｅｌｌｌ；Ｐ、Ｐｓｔｌ；５Ｓａｕ３Ａ０ヌクレ
オチド１００および１０１間の矢印は第１および第２エ
クソン間の境界を示しヌクレオチド６６４および６６５
間の矢印は第３エクソンのスタートを示す。 第３図 ＰＣ１２細胞におけるＧ Ａ Ｐ −４３発現
の調節。 】０％ウマ血清および５％胎児ウノ血清を含有するＲＰ
ＭＩ培地中でＰＣ］２細胞を継代した。 該細胞を平板培養した４０時間後、該ｊ−Ｈ地を異なる
添加物を含むように変更した。４日後、該細胞を写真に
撮り（Ａ）、次いて、各細胞培養からＲＮＡを単離した
。ＲＮＡ（試料角たり］Ｏμｇ）を変性Ｌ、１．２％了
カロースーホルムアルテヒトケル−ヒＣ泳動させ、ノー
ンスクリーン（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ）ナイロンフィ
ルターに移し、紫外線架橋によって該フィルターに結合
させ、３２ｐ−標識化ＧＡＰ４３−２でプローブした（
Ｂ）。最終の洗浄は６５°ＣにおけるＳ Ｓ Ｃ（ｘ
０．２）、０．１％ＳＤＳであった。含まれる添加物は
（１）無し、（ｉｉ）１ミリリツトル当たりＮＧＦ５０
ｎｇ、（ｉｉｉ）１０−３Ｍ シブチリルｃＡＭＰ、お
よび（ｉｖ）１ミリリツトル当たりＮＧＦ５０ｎｇおよ
び１０−３Ｍ ジブチリルｃＡＭＰであった。最後のレ
ーンは、ブロア）法およびハイブリタイモーション法に
ついての陽性対照として泳動させた新生児脳からのＲＮ
Ａｌ０Ｍｇである。 第４図 ＧＡＰ−４３遺伝子発現の発育調節および組織
特異性。チャーゲインら（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔａｌ
）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ
） １８ ：５２９４（１９７９）の手法の修飾法によ
って、全細胞ＲＮＡを、示したラット組織から単離した
。 各ＲＮＡ（１０Ｍｇ）を変性し、１．２％アカロースー
ホルムアメテヒトゲルにて電気泳動を行い、ニトロセル
ロースに移した。該フィルターを二。 クトランスレーションによって、デオキ／ンチンン５′
−［α−３ｔｐ］ｈリホスフエートで標識したλｇｔｌ
ｌ ＧＡＰ４３−２からのＥｃｏＲＩインサートと４２
６Ｃにて一晩ハイブリタイズさせた。 最終の洗浄は６５°Ｃにて５ＳＣ（ｘｏ、２）、０．１
％ＳＤＳで行った。ＲＮＡ試料＝（１）胚１３日令（Ｅ
１３）心臓（Ｈ）、（ｉｉ）Ｅ １３肝臓（Ｌ）、（
ｉｉｉ）Ｅ１３脳（Ｂ）、（ｉｖ）Ｅ−１３後根神経節
（ＤＲＧ）、（ｖ）ないしくｖｉｉ ）胚１７日令心臓
、肝臓、脳、および後板神経節；（ｉｘ）ないしく ｘ
ｉｉ ）新生児心臓、肝臓、脳、および後板神経節：（
ｘｉｉｉ）ないしくｘｖｉ）成人心臓、肝臓、脳および
後板神経節。１８Ｓおよび２８ＳリホソームＲＮＡの位
置を右に示す。下方は同フィルターとグリセルアルナヒ
ト−３−ホスフエートデヒドロケナーセ（ＧＡＰＤＨ）
をコード付けするｃ ＤＮＡプローブ（ビエンヤチクら
（Ｐｉｅｃｈａｃｙｋ ｅｔ ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ
）４２ ： ５８９（１９８５））とのハイブリタイセ
−７ヨンである。 第５図 （Ａ）ヒトＧＡＰ−４３ｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列および帰結されるアミノ酸配列。 Ｅ：ＥｃｏＲＩ ；Ｈ：ＨａｅｌＩ［；Ｍ：Ｍｓｐ１
０コーディング領域は太線で示す。規模は１００ｂｐで
ある。矢印は配列決定した重複制限断片を示す。（Ｂ）
ヒト、ラットＧＡＰ−４３およびマウスＰ−５７アミノ
酸配列の配置。垂直線は同一性を示し、コロンは保存さ
れる置換を示す。アミノ酸は、ＩＵＰＡ（、−ＩＵＢ
ＣＢＮの一文字記号によって表す。うｙトの配列は第２
図のそれてあり、マウスの配列はシムラーら（Ｃｉｍｌ
ｅｒ ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・バイオロジカ
ル・ケミストリ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２６
２ ： １２１５８（１９８７）からのものである。（
Ｃ）ツカ−およびシュタイグラ−（Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ
Ｓｔｅｉｇｌｅｒ）、ヌクレイツク・アシソズ・リサ
ーチ（Ｎｕｃ］、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ） ９ ：
１３３（１９８０のひた（ｆｏｌｄ）プログラムによ
って予測される３”−非翻訳領域におけるステム−ルー
プ構造。 第６図 成熟を伴うＧＡＰ−４３発現の領域制限を示す
ノーサンプロット。８日令、１６年令、６４年令の脳領
域からの全１０μｇＲＮＡを各レーンに負荷し、該プロ
ットを、実施例■に記載したごとく、ヒトＧＡＰ−４３
プローブＣ１ａてプローブする。１８Ｓおよび２８Ｓの
ｒＲＮＡハンドの位置を示す。 第７図 ＧＡＰ’−４３発現か虚血事故のあとに増加す
ることを示すノーサンプロット。（Ａ）野（Ａ ｒｅａ
） １７ （視覚皮質）における卒中を有する患者の異
なる脳領域からのＲＮＡｌ０Ｍｇ０野１７における発現
は脳（野１１）における最大に匹敵するレベルまで増加
した。（Ｂ）すへて泳動させ、レーン２および３聞で切
り出した関係のないハンドを有する同プロット上でプロ
、トした、３人の患者からの野３．１．２．５からのＲ
ＮＡｌ０Ｍｇ０レーン３はわずかの卒中を包含り、ＧＡ
Ｐ４３発現の増加を示すのに対し、レーン１および２は
組織学的に正常であった。 第８図 ｉｎ ｓｉ″ｔｕ・ハイブリタイセー／ヨンに
より、梗塞に隣接する領域におけるＧＡＰ−４３発現の
増加が明らかにされる。（Ａ１）脂質負荷マクロファー
ジおよび反応性星状細胞による組織の散漫な浸潤を示す
Ｂにおける梗塞領域の高倍率拡大。この領域に残存する
ニューロンはない（Ｘ１６０）。（Ａ２）豊富な組織学
的に無傷なニューロンを有する正常な隣接皮質（ｘ ３
００）。（Ｂ）１の胴回（矢印頭）および隣接胴回にお
ける無傷皮質（矢印）を含む組織化虚血梗塞（１０ない
し］４日令）を有する視覚皮質の低倍率図（ｘ１２）。 （Ｃ）暗視野調査によると、正常な視覚皮質においては
、ＧＡＰ−４３発現は少数の散在ニューロンに制限され
る（矢印頭）。（Ｄ）梗塞皮質においては、アンチセン
スＧＡＰ−４３プローブの特異的結合はない。大きな明
るい焦点はセンスブローブチ非特異的に標識する凝集率
クローンスの領域からのものである（Ｇ）。対照的に、
隣接無傷皮質においては、多数のニューロンかＧ 、Ａ
Ｐ −４３を発現する（アンチセンスプローブで標識
したＥ−明視野およびＦ−暗視野）。特Ｗ的ＧＡＰ−４
３結合の不存在を示す、センスプローブで標識した（Ｆ
（）対照明視野および（＋）暗視野（（、−１ｘ１６０
）。 第９図 重症の低血圧症および低酸素症の発作の数日後
における小脳皮質のニューロンにおけるＧＡＰ−４３発
現の増強。すべての切断面を同時に処理した。（Ａ）検
出可能なＧＡＰ−４３標識化の不存在を示す正常成人小
脳皮質。（Ｂ）ブルキニエ細胞および外部顆粒細胞層に
おけるＧＡＰ４３の発現の顕著な増加を示す虚血後生脳
皮質。 （Ｃ）対照としてのセンス鎖ブローブトハイフリタイズ
させたＢに隣接する断面図くすべてＸ３１５）。 第１０図 ＣＨＯ細胞系における突起形成に対するＧＡ
Ｐ−４３の影響。中抜き線は４のＣＤＭ８−トランスフ
ェクト系統における突起を有する細胞を表し、切れ口の
ない線はＧＡｌ”４３を発現する４の細胞系を表す。細
胞系は実施例■に記載したごとくに得た。突起を有する
細胞のパーセンテージは、ＣＨＯ細胞をポリーＤ−リシ
ンー被覆カバーカラス十に平板培養することによって検
定した。２０ミクロンより長い突起をもつ細胞を陽性と
して記録した。比較性を確実とするために、すへてのア
ッセイは、平板培養の後、３０分から４５分にわたる時
間枠内で行った。本ア、セイの重要な要素は選択した時
間枠てあった。というのは、より長い平板培養時間の後
では、あるいは細胞が密集するに従い、突起は不明確と
なるからであった。この時間枠の間に、できるたけ多く
の細胞を計数し、調へたすべての細胞を包含させた。 異なる系について計数した細胞数はＬＡ、、４０６１Ｂ
、４０８：２Ａ、２８７ ２８ ３０３５Ｅ、２３４
；４，３３３；１２，１５６；１４゜１６１゜ＧＡＰ−
４３発現細胞系で突起をもつ細胞の割合は対照における
よりもかなり高か−）だ（ｐ＜０．００１．）。 第１１図 アミノ末端エクソンかＧＡＰ−４３蛋白を細
胞膜へ定方向化させる原因であること、およびそれはク
ロラノーフユニコールアセチルトランスフェラーセの膜
ターゲツティングを指令することを証明する実験の模式
図。左欄（「構築」）は、ＣＯ５，、Ｎ ＋ ＋（３Ｔ
３、ＣＨＯまたはＰＣＩ２細胞のトランスフェクンヨン
で用いる遺伝子の構築を示す。右欄（、ｒｌｌｉｌ ）
は、発現された蛋白または断片が、骨細胞分別、続いて
のウェスタンプロ２テイング、直接免疫蛍光、またはそ
の双方によって検定して、膜一連結（＋）であったか否
か（−）を示す。エクソン２の実質的部分（Ｇ Ａ、
Ｐ （−内部））またはＧ Ａ Ｐ−４３遺伝子のカル
ボキシ末端領域（ＧＡＰタッグ）を欠＜ＧＡＰ構築物も
そうであったように、無傷Ｇ Ａ Ｐ−４３遺伝子（Ｇ
ＡＰ）はかなり膜連結性であった。しかしながら、ＧＡ
Ｐ４３の最初の４個のアミノ酸をコード付けするヌクレ
オチドを欠失した場合（ＧＡＰ（−１−４））、発現さ
れた蛋白断片は膜連結性でなかった。 第１のエクソンの３（Ｃ３）または４（Ｃ４）位におけ
る／スティンをコード付１ブする配列に点突然変異を導
入した結果、得られた蛋白でアラニンが発現された。Ｃ
３（ＧＡＰ＊Ｃ８）またｉ；ＩＣ４（ＧＡｐ＊ｃ、）い
ずれかの突然変異の結果、無傷ＧＡＰ４３と比較して膜
レヘル（＋／−）か減少１７た。 Ｃ４を変更した場合、減少は特に顕著であった。 Ｃ３およびＣ４（ＧＡＰ＊Ｃ３，、）双方の突然変異は
膜連結を全く排除（７た。 この通常は細胞質ゾルの酵素について予測されるコト＜
、クロラムフェニコールアセチルトランスフラーゼ（Ｃ
ＡＴ）をコード付けする遺伝子の一時的発現により、膜
連結蛋白は産生されなかった。 第１のＧＡＰ−４３エクソンの１０個のアミノ酸をコー
ド付けするヌクレオチド配列をＣＡＴ遺伝子のアミノ末
端に結ぶと（ＧＡＰ（１−１０）ＣＡＴ）、発現された
蛋白は膜連結性であった。 第１２図 ＣＨ○細胞にトランスフェクトした場合、通
常のＧＡＰ−４３は膜成分および細胞質ゾル成分（Ｍ＝
膜；Ｃ−細胞質ゾル）を共に有することを示すウェスタ
ンプロット。第１のＧＡＰエクソンの第３または第４シ
ステイン（Ｃ−３またはＣ−４）をコード付けするヌク
レオチド配列の突然変異は膜結合成分に干渉し、一方、
両システィン（Ｃ−３，４）の突然変異は膜結合を完全
に排除した。対照細胞（ＣＯＮ）はＧＡＰ−４３を有さ
ず：脳膜（ＢＲ）はトランスフェクトした遺伝子からの
ものと同一の分子量のＧＡＰ−４３を有していた。 第１３図 ラ、 トＧＡＰ−４３遺伝子の地図Ａ、
５°から３°への向きのＧＡＰ−４３遺伝子の直線表示
。マツピングに用いたファージインサートの表示を示す
。３個のエクソンを垂直線として表す。示した部位は制
限エントヌクレアーセＢａｍＨＩ （Ｂ） 、Ｋｐｎ
Ｉ （Ｋ） 、および５ａｃｌ（Ｓ）についてのもので
ある。 Ｂ、イントロン−エクソン境界および３′ポリアデニル
化部位。コンセンサススプライス部位に最良に適合させ
、ここに記載するごときｃ ＤＮＡ配列と比較すること
によって、エクソンおよび隣接領域を配列決定し、イン
トロン−エクソン境界を決定した（マウント（Ｍｏｕｎ
ｔ）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）１０ ： ４５９−４７２（
１９８２）。主要ポリアデニル化部位は、ＲＮＡ５ ｅ
保護によって決定した。利用したポリアデニル化ングナ
ルの直く３′側にしばしば見い出される推定ポリアデニ
ル化シグナルおよびコンセンサス・モチーフ（ｍｏｔｉ
ｆ）のタンデム対に下線を引いた（マクラウヒランら（
ＭｃＬａｕｃｈｌａｎｅｔ ａｌ）、ヌクレイツク・ア
ンノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
）１３ ： １３４７−１３６８（１９８５））。 第１４図 ＧＡＰ−４３プロモーター領域の配列。ヌク
レオチド＋１位はＧＡＰ−４３蛋白の開始ＡＴＧコドン
のＡを示す。この配列は＋３０で終わる可変サイズの第
１のエクソンを包含する。 主要な転写スタート部位は矢印によって示す。プリン残
基は星印を下に示す。コンセンサスＰｉｔ１結合部位は
上に線を引く。 第１５図 Ｈ−ＤＮＡによって誘導された制限断片にお
ける移動度シフト。制限部位および主要なホモプリン−
ホモピリミジン領域（太くし標識したＩ、 Ｉ［、およ
び■）の位置を示す−５１８ないし＋８５のＧＡＰ−４
３プロモーター領域の模式図。下方に、以下の酵素でプ
ラスミドｂｓ１．５ＲＩＸ４を消化することによって遊
離したＧＡＰ４３プロモーター断片を表示する １）Ｓ
ｓｐｌ、６０３ｂｐ；２）ＸｂａＩ／５ｓｐｌ、５６０
ｂｐ：３）ＳｍａＩ／５ｓｐＩ、４９０ｂｐ４）Ｓｓｐ
ｌ／Ｎｈｅｌ、４０９ｂｐ；５）Ｓｓｐ１／Ｎｓ ｉ
Ｉ、２８４ｂｐ（領域■を含有）、３１９ｂｐ（領域■
および■を含有）；６）Ｓｓｐｌ／Ａｃｃ＋、３１４ｂ
ｐ （領域１）、２８９ｂｐ（領域■およびＩＩ［）；
７）Ｘｂａ Ｉ／Ｎｈｅ Ｉ、３６０ｂｐ：および８
）Ｓｍａ Ｉ／Ｎｈｅ Ｉ、２９５ｂｐ。 第１６図 ｐ３４およびｐ３８についての部分的蛋白配
列。 第１７図 ＧＡＰ−４３およびＧＡＰ−４３ペプチドに
よるＧ。に対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結合の変調。特
異的なＧ。に対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結合は、１μ
Ｍ ＧＡＰ−４３の存在下、対照の３１０＋４０％（ｎ
＝７）まで刺激される（Ａ。 左）。同一濃度のＧ。不含ＧＡＰ−４３は検出可能な（
３５Ｓ）ＧＴＰｕＳを結合しない。ＧＡＰ−４３ａ度の
変化は、この効果に対する＋５０ｎＭのＥＣ６ｏを示す
（Ａ、右）。様々なＧＡＰ−４３の調製物に関して、Ｅ
Ｃ５ｏの範囲は、おそらく精製の間にＧＡＰ〜４３の部
分的な不活性化を生じる１ｌ５０−８００ｎであった（
第１７図りを比較する）。ＧＡＰ−４３由来の最初の２
４アミノ酸を含む１ｍＭペプチド、すなわぢＭＬＣＣＭ
ＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫ Ｉ ＥＱＤＧの添加に
よって、１μＭＧＡＰ−４３によると同一のレベル（２
５０％）まで結合が刺激され、ＧＡＰ−４３および１−
２４ペプチドの添加によっては、両方共、さらに刺激は
生じない（Ｂ、左）。他の３つのペプチド、すなわちＧ
ＡＰ（３５−５３）−ＡＴＫ ＩＱＡＳＦＲＧＨＩＴＲ
ＫＫＬＫＤ、、ＧＡＰ（５３６９）＝ＤＥＫＫＧＤＡＰ
ＡＡＥＡＥＡＫＥＫおよびＧＡＰ（２］、０−２２６）
＝ＡＲＱＤＥＧＫＥＤＰＥＡＤＱＥＨＡは、１ｍＭてＧ
。に対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結合への効果を有しな
い。１２４ペプチドによる結合の刺激は、２０１１Ｍの
ＥＣ５０で飽和される。ｃ Ａ Ｐ −４３の最初の１
０アミノ酸からなるペプチド、すなわちＭＬＣＣＭＲＲ
Ｔ Ｋ Ｑは、１ｍＭて８０％まてＧ。に対する（３５
Ｓ）ＧＴＰυＳ結合を抑制する（Ｃ１左）。位置３およ
び４に７ステインの代わりにトレオニンを有するペプチ
ドは、Ｇｏに対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結合への効果
を有しない。１−１０ペプチドに関するＩＣ，。は２０
μＭである（Ｃ１左）。パネルＹ）は、５０μＭ １−
１０ペプチドの存在下または非存在下でのＧＡＰ−４３
１１度の関数としてＧｏに対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ
結合を示す。ＧＡ Ｐ−４３かペプチドによる抑制を逆
転させること、ＧＡＰ−４３のＥＣ５ｏかこのベブチ！
・の濃度によって６００％Ｍから１２μＭまで上昇する
ことに注意する。これは、１−１０ペプチドとＧＡＰ−
４：３間の直接的な競合と一致する。 方法 （３５Ｓ）ＧＴＰｕＳに−−・イングランド・ヌ
クレア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）、
２０００ Ｃｉ ／ ミリモル）結合は、以前に開示さ
れたとおり（フッ・アール・エムら（Ｈｕｆｆ、Ｒ，Ｍ
、 ｅｔ ａｌ、）、ジャーナル・オフ・バイオロジカ
ル・ケミスｉ・リ−（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）
２６０ ： １０８６４−１０８７１（１９８５）；ノ
ースラップ・ンエイ・ケイら（Ｎｏｒｌ、ｈｒｕｐ、Ｊ
、に、 ｅｔ ａｌ、）、／ヤーナル・オフ・バイオロ
ンカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
） ２５７・１１４１６−１１４２３（＋９８２））
、３０°Ｃで６分間、５０ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ５−ＨＣ
Ｃ，、ｐＨ８０，１ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ 、 ６
ｍＭ ＭｇＣＱｔ、０１％ Ｌｕ ｂ ｒ ｏ Ｉ
ＰＸ、 ２００１１９７１ｆｒ＆ウン血清アルブ
ミン、ｌｎ１Ｍジチオトレイト−ルの１００ノｌ（２中
てＧ。（１ｎＭ、 １０ｒ＋９）および（３５Ｓ）Ｇ
ＴＰｕＳ（２丁１Ｍ）をインキュベートし、ニトロセル
ロースを介して濾過し、結合放射活性をンンチレーンヨ
ンカウントすることによって測定された。これらのア、
セイにおける（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳの濃度は、見掛けの
ＫＤの約１０分の１であり（）７−アール・エムら（Ｉ
ｌｕｆｆ、Ｒ，Ｍ、 ｅｔ ａｌ、）、／ヤーナル・オ
フ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、）２６０ ： １０８６４−１０８７１（
１９８５）：ノースラップ・／エイ・ケイら（Ｎｏｒｔ
ｈｒｕｐ、Ｊ、に、 ｅｔ ａｔ、）、ジャーナル・オ
フ・バイオロンカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、）２５７：１１４１６−１１４２３（１９
８２））、この結果、見掛けのＫＤとＢｍａｘの両方に
おける変化は結合のレベルを変える。結合した放射活性
の合計は全ての場合に添加されたものの１０％以下であ
った。１０μＭ非標識化ＧＴＰｕＳの存在下で非標識化
結合を測定し、これを合計結合から差し引いて、特異的
結合を決定した。全てのアッセイを２回行った。平均ア
ッセイ管は８００，０００ｃｐｍを含んており、合計結
合３０．０００ｃｐｍおよび非特異的結合１５００ｃｐ
ｍを得た。Ｇ Ａ、 Ｐ４３の添加は非特異的結合に影
響せずに特異的結合を増加した。ＧＡＰ−４３は、ｌ−
ｕ ｂ ｒ ｏ ＩＰＸから調製したＧ。および１つの
アルファ。の２つの異なる試′＃１を活性化した。しか
しながら、活性の範囲は、調製物の間で変化した。ＧＡ
Ｐ４３による活性化は、Ｇｏの精製において使用される
洗剤および結合緩衝液組成物に対して感受性であるらし
い。ＧＡＰ−４３は、ツバイア−ら（Ｚ★１ｅｒｓ ｅ
ｔ ａｌ、）ノ方法（ンヤーナル中オフ゛壷ニューロケ
ミストリー（ｌ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、）４４ ：
１０８：３−１０９０（１９８５））を変形させた方
法によって精製し、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブ
ルー染色によると純度９７％以−してあ〜た。蛋白は、
アッセイ緩衝液に対して広範囲に透析し、これを上記で
示した濃度中でのＧＴＰｕＳ−Ｇｏインキュベーション
物に添加した。ペプチドは、ノーワード・ヒユーズ・メ
ディカル・インステイチュート・ラボラトリ−（Ｈｏｗ
ａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎ５ｔｉｔ
ｕｔｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ） （マサチューセノツ・
ゼネラル・ホスピタル（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏ５ｐｉｔａｌ）、ボストン、マサ
チューセ、ツ州）で合成され、逆相ＨＰＬＣによって精
製され、構造は、アミノ酸配列決定によって確認した。 このペプチドをアッセイ緩衝液中に溶解し、指示した濃
度てＧＴＰｕＳＧ、インキュヘーション物に添加した。 第１８図 ＧＡＰ−４３アミノ末端およびＧ結合レセプ
ターの細胞質テール間の相同性。ＧＡＰ４３の最初の１
０アミノ酸を、Ｇ結合レセプターの配列と比較した。Ｇ
ＡＰ−４３の最初の７アミノ酸および多数のＧ結合レセ
プターの細胞質テールのアミノ末端セグメント間に相同
性か見られる。共通の配列、すなわち、疎水性−Ｉｅｕ
ｃｙｓ−ｃｙｓ−ｘ−塩基一塩基と一致する残基に網掛
けをする。 １／セプター中に示されたンステインは、最後の膜内外
領域に対して末端の約１３アミノ酸が配置され、これは
、β、−アドレナリン作動性レセプターのｃｙｓ３４１
と一致しており、ヒガシジマ・ティーら（Ｈｉｇａｓｈ
ｉｊｉｍａ、Ｔ、 ｅｔ ａｌ、）（ジャーナル・オ
フ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 ＢｉｏｌＣ
ｈｅｍ、）２６３：６４９１−６４９４（１９８８）中
に開示されているように一直線にされる。この示された
配列は、ヒト（第５図）およびサカナ由来のＧＡＰ−４
３、ヒトβ−アドレナリン作動性レセプター（β１−ア
ドレナリン作動性、フレル・ティーら（Ｆｒｉｅｌｌｅ
、Ｔ、 ｅｔ ａｌ、）、プロシーティングズ・オプ・
ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）Ｕ、 Ｓ、Ａ
、 ８４ ： ４６−５０（１９８７））、ヒトロドプ
シン（ロドプシン、不イサンス゛・ンエイ・ティーおよ
びホブ不ス・ティー・ニス（Ｎａｔｈａｎｓ、 Ｊ、
Ｄ、 ＆ Ｈｏｇｎｅｓｓ、 Ｄ、 Ｓ、 ）プロシー
ティングズ・オフ・ナンヨナル・アカテミー・オフ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、）Ｕ、Ｓ、Ａ、８１：４８５１−４８５５（１９８
４））、ヒトブルー−オプシン（ブルー−オプシン、ネ
イサンズ・ジェイら（Ｎａｔｈａｎｓ、Ｊ、 ｅｔ ａ
ｌ、）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３２ ： １
９３−２０２（１９８６））、ヒトαアドレナリン作動
性レセプター（α、−アドレナリン作動性、コテッチャ
・ニスら（Ｃｏｔｅｃｃｈｉａｓ、 ｅｔ ａｌ、）、
プロシーディングズ・オフ・ナンヨナル・アカテミー・
オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１ｌＡｃａｄ、
Ｓｃｉ、）Ｕ、Ｓ、Ａ、８５ ： ７１５９−７１６３
（１９８８））、ヒト血小板α、アドレナリン作動性レ
セプター（ｐα、−アドレナリン作動性、コブリカ・ビ
ー・ケイら（Ｋｏｂｌｉｋａ、Ｂ、に、 ｅｔ ａｌ、
）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３８ ： ６５０
−６５６（１９８７））、ヒトムスカリン作動性レセプ
ターサブタイプ１〜５（Ｍｕｓ−ＡＣｈ−１〜−５、ヒ
ガンジマ０ティーら（Ｈｉｇａｓｈｉｊｉｍａ、Ｔ、
ｅｔ ａｌ、）、ンヤーナル・オフ・バイオロジカル・
ケミストリー（ＪＢｉｏｌ、 Ｃｈｅｔ）２６３ ：
６４９１−６４９４（１９８８）；ペルルタ・イー・ジ
ーら（Ｐｅｒｕｌｔａ、 Ｅ、 Ｇｅｔａｌ、）、ＥＭ
Ｂ○ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、 ）６ ： ３９２３−
３９２９（１９８７））、ヒトセロトニンレセプターサ
ブタイプＩＡ（５ＨＴ−ＩＡ、コブリカ・ビー・ケイら
（Ｋｏｂｌｉｋａ、Ｂ、に、 ｅｔ ａｌ、）、不イチ
＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３２９ ： ７５−７９（１９８
７））およびラットセロトニンレセプターサブタイプＩ
Ｃおよび２（５ＨＴ−ＩＣ，シュリアス・デイ−ら（Ｊ
ｕｌｉｕｓ、Ｄ、 ｅｔ ａｌ、）、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）２４１ ： ４７３−４７９（１９８８）
および５ＨＴ２、ブリソチェット・デイ−・ビーら（Ｐ
ｒｉｔｃｈｅｔｔＤ、Ｂ、 ｅｔ ａｌ、）、ＥＭＢ○
ジャーナノ喧ＥＭＢＯＪ、）７：４１３５−４１４０（
１９８８））である。 第１９図 ＧＡＰ−４３＝刺激されたＧ。に対するＧＴ
ＰｕＳ結合のカルモジュリンによる投与量依存性減少。 両パネルの縦軸は対照の割合（％）として表したＧＴＰ
γＳ結合である。Ｇ、に対するＧＡＰ−４３の添加（線
２）は、Ｇｏたけ（線１）と比較して２００％オーバー
まてＧＴＰγＳ結合を増加させた。カルモジュリンの添
加は、対照レベルまで（線５）この結合を減少させた。 ＧＡＰ４３たけ（線３）またはＧＡＰ−４，１１汁カル
モジユリン（線４）を用いて、Ｇ、の非存在下ではＧＴ
ＰγＳ結合は見られなかった。右側のパネルのカルモジ
ュリン濃度（μＭ）は、Ｇ、に対−するＧＴＰγＳ結合
へのカルモジュリンの影響の投与量依存性を示す。 好ましい具体例の記載 以下の記載において、分子遺伝学および神経学の分野の
当業者に公知の種々の方法を参照する。 参照がなされるかかる公知の方法を記載する出版物およ
び他の資料を十分に記載されているごとくその全体を参
照により一体化させる。 ＤＮＡ組換え技術の一般的な原理を記載する標準的な文
献はワトソン・ジュイ・デイら（Ｗａｔｓｏｎ。 Ｊ、Ｄ、 ｅｔ ａｌ）、モレキュラー・バイオロジー
・オフ・ザ０ジーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ｏｒ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ）、 Ｉおよび■巻、す
・ベンジャミン／クミングズ・パブリノンイング・カン
パニー・インコーポレイテノド （Ｂｅｎｊａｍｉｎ／
ＣｕＣｕｍｍ１ｎ Ｐｕｂｌ ｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ。 Ｉｎｃ、 ）、出版者、メン口・パーク（Ｍｅｎｌｏ
Ｐａｒｋ）、カリフォルニア化（１９８７）；ターネル
・ジェイ・イーら（Ｄａｒｎｅｌｌ、 、１． Ｅ、
ｅｔａｌ）、モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏ
ｉｅｃｕｌａｒ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇの。サイエン
ティフック・アメリカン・ブノクス・インコーボレイテ
ノド（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏ
ｏｋｓ、 Ｉｎｃ、）、出版者、ニューヨーク、ニュー
ヨーク州（１９８６）；レーウィン・ビイーｘム（Ｌｅ
ｗｉｎ、 Ｂ、 Ｍ、 ）、ジーン（Ｇｅｎｅ） Ｈ、
ジョン・ウィリー・アンド・サンプ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ ５ｏｎｓ）、 出版者、＝、、−ヨーク、ニ
ューヨーク州（１９８５）；オールド・アール・グブリ
ューら（Ｏｌｄ、 Ｒ，Ｌ 、 ｅｔ ａｔ）、ブワン
ンブルズ・オフ・シーン・マニュビュレーションニアン
・イントロタクション・トウ・ン５．不テイノク・エン
ジニアリング（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ
Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｔ＋
ｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ）、第２版、ユニバーシイティ・オフ・カリフォ
ルニア。 プレス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａ１ｉｆｏｒ
ｎｉａ Ｐｒｅｓｓ）、出版者、バーケレイ（Ｂｅｒｋ
ｅｌｅｙ）、カリフォルニア化（１９８１，）およびマ
ニアテイス・ティら（Ｍａｎｉａｔｉｓ丁 ｅｔ ａｌ
）、 モレキュラー・クローニング ア・ラホラトリー
・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ＾
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、出版者
、コールド・スプリング・ハーバ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（１９８２）を
包含する。 「クローニング」とは、特定の遺伝子または他のＤＮＡ
配列をベクター分子に挿入するｉｌ ｖｉｔｒ。 組換技術の使用を意味する。所望の遺伝子を首尾よくク
ローン化するためには、ＤＮＡ断片を生成させる方法、
該断片をベクター分子につなく方法、該複合ＤＮＡ分子
をそれが複製可能な宿主中に導入する方法、および受容
宿主細胞の間から標的遺伝子を有するクローンを選択す
る方法を使用する必要がある。 １−ｃＤＮＡＪとは、ＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラー
ゼ（逆転写酵素）の作用によってＲＮＡ鋳型から産生さ
れた相補的ＤＮＡまたはコピーＤＮＡを意味する。かく
して、ｒｃＤＮＡクローン」はクローニングベクターに
担持された、注目するＲＮＡ分子に対しご相補的なデュ
プレックスＤＮＡ配列を意味する。 ｒｃＤＮＡライブラリー」とは、−緒になって、生物体
の全ゲノムよりなるｃ Ｌ’） Ｎ Ａインサートを含
有する組換体ＤＮＡ分子の収集を意味する。かかるｃＤ
ＮＡライブラリーは、当業者に公知であって、例えば、
マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ）、モ
レキュラー・クローニング ア・ラボラトリ−・マニュ
アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、前掲、に記載されて
いる方法によって調製できる。一般に、そのゲノムから
特定の遺伝子をクローン化することが所望される生物の
細胞からＲＮＡをまず単離する。本発明の［−１的に好
ましいのは哺乳動物、および特にヒ１〜細胞系である。 「ベクター」とは、その中へＤ Ｎ Ａ断片を挿入また
はクローン化できるプラスミドまたはバタテリオファー
ン由来ＤＮＡ分子を意味する。ベクターは１個またはそ
れ以−Ｌの唯一の制限部位を含有し、クローン化配列か
再生可能なような定義宿主またはビヒクル生物中で自律
複製か凸Ｊ能である。 かくして、「ＤＮＡ発現発現ツクターは、Ｄ Ｎ Ａの
付加配列か自律要素ゲノムに組み込まれた後、宿主染色
体から独立して、宿主中で複製できるいずれの自律要素
も意味する。かかるＤＮＡ発現ベクターは細菌プラスミ
ドおよびファージを包含する。本発明の目的で好ましい
のはラムダｇｔＩ［発現ベクターである。 「実質的に純粋」とは、各々、他の抗原または遺伝子が
実質的になく、または通常天然に見い出される可能性の
ある他の不純物が実質的になく、天然に見い出されない
形態で存在する本発明のいずれの抗原、またはいずれの
かかる抗原をコード付けするいずれの遺伝子をも意味す
る。「機能的誘導体」とは、分子の「断片」、「変異体
」、「同族体」、または「化学的誘導体」を意味する。 本発明のｃＤＮＡ配列のいずれかの断片のごとき分子の
「断片」とは、分子のいずれのヌクレオチドサブユニッ
トをもいうものとする。かかる分子の「変異体」とは、
全分子、またはその断片いずれかに実質的に同様な天然
に生しる分子をいうものとする。分子の「同族体」とは
、全分子またはその断片いずれかに実質的に同様な非天
然分子をいうものとする。 両分子においてアミノ酸の配列が実質的に同一であれば
、分子は他の分子に「実質的に同様」であるという。実
質的に同様なアミノ酸分子は同様な生物学的活性を有す
る。かくして、２の分子か同様な活性を有するならば、
分子の一方が他方で見い出されない付加アミノ酸残基を
含有したり、またはアミノ酸残基の配列が同一でない場
合にもその用語を用いるごとく、それらは変異体である
と考えられる。本明細書中で用いるごとく、分子が通常
は当該分子の一部ではない付加化学部位を含有する場合
、該分子はもう１つの分子の「化学的誘導体」であると
言われる。かかる部位は分子の溶解性、吸収、生物学的
半減期等を改良する。 また、該部位は分子の毒性を減少させ、分子の望ましく
ない副作用を排除しまたは減衰させるなどする。かかる
効果を媒介できる部位は、例えば、レミントンズ・ファ
ルマンユーティカル・サイエンス（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ５ｃｉｅｎｃｅ
）、第１６版、マノク・パブリッシング・カンパニ（Ｍ
ａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、）、イーストン
（Ｅａｓｔｏｎ）、ペニシルハニア州（１９８０）に開
示されている。 同様に、本発明の抗原のいずれかの遺伝子の「機能的誘
導体」とは、ヌクレオチド配列が「実質的に同様であり
」、同様の活性を有する分子をコード付けする遺伝子の
「断片」、「変異体」、または「同族体」を包含させる
意図である。 ＧＡＰ−４３をコード付けするＤＮＡまたはその機能的
誘導体、あるいは膜−ターゲツティングペプチドまたは
その機能的誘導体は、結ぶための平滑末端またはスタガ
ード（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適当な末端を供給す
るための制限酵素消化、適当に粘着性末端を満たすこと
、望まない結合を回避するためのアルカリホスファター
セ処理、および適当なリガーセで結ぶことを含めた通常
の技術でベクターＤＮＡと組み合わせることかできる。 かかる操作についての技術はマニアティス・ティら（Ｍ
ａｎｉａｔ ｉｓ、 Ｔ、 、 ｅｔ ａｌ）、前掲、
によって開示されており、かつ当該分野でよく知られて
いる。 ＤＮＡのごとき核酸分子は、転写および翻訳調節情報を
含有するときはポリペプチドを「発現することができる
」と言われ、かかる配列は該ポリペプチドをコード付け
するヌクレオチド配列に「作動可能に結合」している。 作動可能な連鎖は、調節ＤＮＡ配列および発現が求めら
れるＤＮＡ配列が遺伝子発現を可能とするように連結し
た連鎖である。遺伝子発現に要する調節領域の正確な性
質は生物間で変わり得るが、それは、一般に、原核生物
においては、（ＲＮＡ転写の開始を指令する）プロモー
ターならびに、ＲＮＡに転写されたときに蛋白合成の開
始を指令するＤＮＡ配列を共に含有するプロモーター領
域を包含する。かかる領域は、通常、ＴＡＴＡホ、クス
、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列等のごとき、転写および
翻訳の開始に関与するそれらの５゛ −非コーディング
配列を。 包含する。 所望ならば、蛋白についてコード付けする遺伝子配列よ
り３°側の非コーディング領域は前記方法によって得る
ことかできる。この領域は、終始およびポリアデニル化
のごとき、その転写終始調節配列のために保持すること
かできる。かくして、蛋白についてコード付けするＤＮ
Ａ配列に本来隣接する３°−領域を保持することによっ
て、転写終始シグナルを供することができる。転写終始
シグナルが発現宿主細胞で満足に機能しない場合、該宿
主細胞において機能する３”領域を置き換えることかで
きる。 （プロモーター領域配列およびＧＡＰ−４３をコード付
けする配列のごとき）２のＤＮＡ配列は、２のＤＮＡ配
列間の連鎖の性質の結果、（１）フレーム−ソフト突然
変異の導入が起こらず、（２）ＧＡＰ−４３遺伝子配列
の転写を指令するプロモーター領域配列の能力に干渉せ
ず、または（３）プロモーター領域配列によって転写さ
れるべきＧＡＰ−４３遺伝子配列の能力に干渉しない七
きは、作動可能に連結していると言われる。かくして、
プロモーター領域は、該プロモーターかＤＮＡ配列の転
写を行うことかできるならば、その■）ＮＡ配列に作動
可能に連結していることになろう。 かくして、蛋白を発現させるには、適当な宿主によって
認識される転写および翻訳／グナルを要する。 本発明は、原核生物または真核生物細胞いずれかにおけ
るＧＡＰ−４３蛋白（またはその機能性誘導体）の発現
を含む。好ましい宿主はイー・コリ （Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレフトミセ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、／ニードモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） 、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔ ｉａ）等を包含
する。最も好ましい原核生物宿主はイー・コリである。 サルモ不う・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア喘マルセス
センス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｅｅｎｃ）、
および種々のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）種のごとき他の腸内細菌を利用することもてきる。か
かる条件下では、ＧＡＰ−４３はグリコ／ル化されない
であろう。原核生物宿主は発現プラスミドにおいでレプ
リコンおよび制御配列に適有するものでなければならな
い。 （例えば、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）、ビイ・スブチ
リス（Ｂ、 ５ｕｌ）ｔ ｉ Ｉ ｉｓ）、ンユードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等のごとき）原核生物細胞
でＧＡＰ−４３蛋白（またはその機能的誘導体）を発現
させるには、ＧＡＰ〜４３をコード付けする配列を機能
的原核生物プロモーターに作動可能に連結させなければ
ならない。かかるプロモーターは構成的または、より好
ましくは、調節可能（例えば、誘導可能または脱抑制可
能）いずれかであってよい。構成的プロモーターの例は
バクテリオファージλの１ｎｔプロモーターｐＢＲ３２
２のβ−ラクタマーセ遺伝子の＋：＋ ｌ ａプロモー
ター、およびｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーセ遺伝子のＣＡ Ｔプロモーター
等を包含する。誘導可能な原核生物プロモーターの例は
バクテリオファー／λの主要な右側および左側プロモー
ター（ＰＬおよびｐａ）、イー−ｒす（Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ）のｔｒｐ、、ｒｅｃＡ。 １ａｃＺ、１ａｃｌ、およびｇａｌプロモーターバチラ
ス・スブチリス（Ｂ、 ５ｂｔｉｌｉｓ）のα−アミラ
ーセ（ウルマ不ン・アイら（Ｕｌｍａｎｅｎ、１． ｅ
ｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・バタテリオロノ−（Ｊ
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１６２： １７６−１８２
（１９８５）およびσ−２８−ＭＸ的プロモーター（グ
リマン・ユム・七／Ｆら（ＧＩｉｍａｎ、Ｍ、Ｚ、、
ｅｔ ａｌ）、／−ン（Ｇｅｎｅ） ３２ ：１１〜
２０（１９８４））、バチルス属のハクテリオファーン
のプロモーター（グリソアン・ティ・ジエイ （Ｇｒｙ
ｃｚａｎ、 Ｔ、 Ｊ、 ）、す・モレキュラー・ノ＼
イオロジー・オフ・ザ・バチリ（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ
）、アカテミノク・プレス・インコーポレイテノド（Ａ
ｃａｄｅｍｅｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｉｎｃ、 ）、ニュ
ーヨーク化（１９８２））、およびストレプＩ・ミセス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロモーター（ワード・
／エイーｘムら（Ｗａｒｄ、 Ｊ、 Ｍ、 、 ｅｔ
ａｔ）、モレキュラー・アンド・／１不うル・シェ不テ
ィノクス（Ｍｏ１． ＧｅｎＧｅｎｅｔ、 ） ２０３
４６８−４７８（＋９８６））を包含する。原核生物
プロモーターはグリツク・ビイ・アール（Ｇｉｉｃｋ、
Ｂ、 Ｒ，）（／＋−ナル・オフ・インティアン秦マ
イクロバイオｏ ’； −（Ｊ、 ｌｎｄ、 Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、 ）１２７７〜２８２（１９８７））；セ
ナティエンボ・ワイ（Ｃｅｎａｔ ｉｅｍｐｏ、 Ｙ、
）（ビオ／ミー（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ）６８ ： ５
０５〜５１６（１９８６））；およびコテスマン・ニス
（Ｇｏｔｔｅｓｅｓｍａｎ、 Ｓ、 （アヌ・レブ・ジ
ェネ ト （Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、）１ ８
： ４ １ Ｅ＋−４４２（１９８４））によっ
て総括されている。 原核生物細胞での適当な発現には、遺伝子−コーディン
グ配列の上流のリポソーム結合部位の存在も必要である
。かかるリポソーム結合部位は、例えば、ボルド・エル
ら（Ｇｏｌｄ、 Ｌ、 、 ｅｔ ａｌ）（アヌ・レブ
ーフイクロバイオル（Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、 ）旦支： ３６５−４０４（１９８］、）
）によって開示されている。 もっとも好ましい宿主は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、または組
織培養いずれかにおける、酵母、昆虫、菌類、哺乳動物
細胞（特にヒト細胞）を含めた真核生物宿主である。哺
乳動物細胞は、正しい部位における正しい折り畳み（ｆ
ｏｌｄｉｎｇ）またはグリコ／ル化を包含する蛋白分子
に対する翻訳後修飾を提供する。 宿主として有用である得る哺乳動物細胞はＶＥＲＯまた
はＣＨＯ−ＫＩのごとき線維芽細胞起源の細胞、または
ハイブリドーマ５Ｐ２１０−ＡＧＩ４のごときリンパ系
起源の細胞または骨髄腫Ｐ３ｘ６３Ｓｇ８、およびその
誘導体を包含する。好ましい哺乳動物宿主細胞は、正し
い翻訳後ブロモ。 シンクについて良好な能力を提供するＳ Ｐ ２１０お
よびＪ ５５８Ｌ、ならひに１ＭＲ３２２のごとき神経
芽細胞腫細胞系を包含する。また、ＣＯ８細胞は、ＧＡ
Ｐ−４３発現、ならひにＧＡＰ−４３発現の調節の研究
について都合よい真核生物宿主であって、本目的につい
ては好ましい。 哺乳動物宿主については、多くの可能なベクター系がＧ
ＡＰ−４３の発現に利用できる。宿主の性質に応じ、多
くの種類の転写および翻訳調節配列を使用できる。調節
シグナルか高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連
するとき、転写および翻訳調節シグナルは、アデノウィ
ルス、ウシ乳頭腫ウィルス、７ミアンウイルス等のごと
きウィルス源に由来するものであってもよい。別法とし
て、アクチン、コラ−ケン、ミオンン等のごとき哺乳動
物発現産物からのプロモーターを用いることもてきる。 遺伝子の発現を調節できるように、抑制または活性化を
可能とする転写開始調節シグナルを選択できる。注目す
べきものは、温度を変化させることによって発現を抑制
または開始することができように温度感受性である調節
シグナル、あるいは化学調節、例えば、代謝物に付され
る調節シグナルである。 酵母はグリコジル化を含めた翻訳後ペプチド修飾も行う
ことができる点で実質的な利点を提供する。酵母での所
望の蛋白の産生に使用することができる強力なプロモー
ター配列および高コピー数のプラスミドを用いる多数の
組換えＤＮＡ技術か存在する。酵母はクローン化哺乳動
物遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、リーダー配列
を担持するペプチド（例えば、プレーペプチド）を分泌
する。 グルコースか豊富な培地で酵母を増殖させる場合に大量
に産生される解糖酵素についてコード付けし、活発に発
現される遺伝子からのプロモーターおよび終始要素を一
体化する一連の酵母遺伝子発現系のいずれを利用するこ
ともできる。また、公知の解糖遺伝子は非常に効果的な
転写制御シグナルを提供できる。例えば、ホスホグリセ
レートキナーセ遺伝子のプロモーターおよびターミネー
タ−シグナルを利用することができる。 ＧＡＰ−４３またはその機能的誘導体の昆虫での産生は
、例えば、当業者に公知の方法によって、昆虫宿主をＧ
ＡＰ−４３を発現するよう設計したバクロウィルスに感
染させることにより達成できる。かくして、１の具体例
において、ＧＡＰ−４３をコード付けする配列をウィル
ス多角体蛋白の調節領域に作動可能に連結することかで
きる（７ヤスニイ（Ｊａｓｎｙ）、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ） ２３８ ： １６５３（１９８７））。組
換体バクロウィルスで感染させ、培養した昆虫細胞、ま
たは生きた昆虫それ自体は、全蛋白生産の２０ないし５
０％もの量てＧＡＰ−４３蛋白を生産できる。生きた昆
虫を用いるべき場合、現在のところ、本発明による大規
模なＧＡＰ−４３生産用に毛虫か好ましい宿主である。 前記したごとく、真核生物宿主でのＧＡＰ−４３の発現
には真核生物調節領域を必要とする。かかる領域は、一
般に、ＲＮＡ合成の開始を指令するのに十分なプロモー
ター領域を包含する。好ましい真核生物プロモーターは
マウス・メタロチオネイン■遺伝子（ヘイマー・ティら
（ｌａｍｅｒ、 Ｄ、 、 ｅｔａｌ）、ジャーナル・
オフ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェ不ティ
ノクス（Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎ、 ）１
：２７３〜２８８（１９８２））；ヘルペスウィルスの
Ｔ Ｋ フロモーター（マノフナイト・ニス（ＭｃＫｎ
ｉｇｈｔ、 Ｓ、 ）、セル（Ｃｅｌｌ）３１ ： ３
５５〜３６５（１９８２））； ＳＶ４０初期プロモー
ター（ヘノイスト・シイら（Ｂｅｎｏｉｓｔ、 Ｃ，、
ｅｔ ａｌ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） （Ｌｏｎ
ｄｏｎ） ２９０ ： ３０４〜２１０（１９８１）；
酵母ｇａ１４遺伝子プロモーター（ンヨンストン・ニス
・エイら（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、 Ｓ、 Ａ、 、 ｅｔ
ａｌ）、プロ／−ティングズ・オフ・ナンヨナル・ア
カテミー・オフ・サイエン／ズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
１． Ａｃａｄ、 Ｓｃ ｉ、 ）（ＵＳＡ）７９ ：
６９７ ］〜］ ９７５（１９８２）：／ルバー・ビ
イ・エイ（Ｓｉ １ｖｅｒ、 Ｐ、 Ａ、 、 ｅｔ
ａｌ）、プロンーティングズ・オフ・す／ヨナル・アカ
テミ−・オフ・サイユンンズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、）（ＩＪＳＡ）８１ ： ５９５１
〜１９５５（１９８４））を包含する。 広く知られているごとく、真核生物ｍＲＮＡの翻訳は最
初のメチオニンをコード付けするコドンで開始される。 この理由により、真核生物プロモーターとＧＡＰ−４３
蛋白（またはその機能的誘導体）をコード付けするＤＮ
Ａ配列との間の連鎖か、メチオニンをコード付けてきる
いずれの介在コドン（すなわぢＡＵＧ）も含有しないこ
とを確認するのか好ましい。かかるコドンの存在の結果
、（ＡｔＪＧフドンかＧＡＰ−４３をコード付けするＤ
ＮＡ配列と同一のリーティングフレームにあれば）融合
蛋白を形成するか、または（Ａ Ｕ ＧコドンかＧ Ａ
、 Ｐ −４３をコード付けする配列と同一のリーティ
ングフレームにない場合は）フレームソフト突然変胃か
起こる。 ＧＡＰ４３をコード付けする配列および作動可能に連結
したプロモーターを、線状分子または、より好ましくは
閉環状分子いずれかであり得る非複製ＤＮＡ（またはＲ
ＮＡ）分子として、受容体原核生物または真核生物細胞
に導入することかできる。かかる分子は自律複製ができ
ないので、ＧＡＰ−４３蛋白の発現は導入された配列の
一時的発現を通じて起こり得る。別法として、永久的な
発現は、導入された配列の宿主染色体への組込を通じて
起こり得る。 １の具体例において、所望の遺伝子配列を宿主細胞染色
体に組み込むことができるベクターを使用する。導入さ
れたＤＮＡをそれらの染色体に安定に組み込んた細胞は
、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする
１またはそれ以上のマーカーも導入することによって選
択できる。該マーカーは、栄養素要求性宿主に対する原
栄養性、生物殺傷耐性、例えば抗生物質、または銅のご
とき重金属等を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子
は発現されるへきＩ） Ｎ Ａ遺伝子配列に直接連結す
るか、または共トランスフェクションによって同細抱に
導入することかてきる。また、−・本鎖結合蛋臼ｒｎ
ＲＮ Ａの最適合成には、さらなる要素か必要となり得
る。これらの要素はスプライスノブナル、ならびに転写
プロモーター、エンハンサ、および終始ングナルを包含
し得る。かかる要素を一体化するｃＤＮＡ発現ベクター
はオカヤマ・エイチ（Ｏｋａｙａｍａ、 Ｈ，）、モレ
キュラー・アント・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏ１
．Ｃｅ１．Ｂｉｏｌ、）３ ： ２８０（１９８３）に
よって記載されているものを包含する。 好ましい具体例において、導入された配列は受容体宿主
中で自律複製できるプラスミドまたはウィルスベクター
に組み込まれる。広範な種類のへフタ−いずれもこの目
的で使用することかできる。 特定のプラスミドまｆ：はウィルスベクターの選択で重
要な因子は ベクターを含有する受容体細胞かそれによ
り認識され、当該ベクターを含有しない受容体細胞から
選択される容４さ、特定の宿１：中で所望されるベクタ
ーのコピー数、および異なる種の宿主細胞間をベクター
を往来させることかできるのか望ましいか占かを包含す
る。好ましい原核生物ベクターは、（例えば、ｐＢＲ３
２２、Ｃｏ１Ｅ］、ｐｓｃ １０１、ｐＡＣＹＣ１８４
、πＶＸごとく）イー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌ ｉ）中で
複製できるもののごときプラスミドを包含する。かかる
プラスミドは、例えば、マニアティス・ティら（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ、 Ｔ、 、 ｅｔ ａｌ）（モレキュラー
・クローニング、ア・ラホラトリー・マニュアル（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド０スプリング・ハーバ
−・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＰ
ｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（１
９８２））によって開示されている。バチラス（Ｂａｃ
ｉ ｌ １ｕｓ）プラスミドはｐｃ１９４、ｐＣ２２１
、ｐＴ１２７等を包含する。かかるプラスミドはタリノ
ァン・ティ（Ｇｒｙｃｚａｎ、 Ｔ、 ） （す・モレ
キュラー・バイオロジー・オン０ザ０ハチリ（Ｔｈｅ
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆｔｈｅ Ｂ
ａｃｉｌｌｉ）、アカデミアイ・プレス（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃＰｒｅｓｓ）、ニューヨーク州（１９８２）、３０
７〜３２９頁）によって開示されている。適当なストレ
プトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プラスミドは
、ｐｌＪｌｏｌ（ケンタル・ケイ・ジェイら（Ｋｅｎｄ
ａｌ ｌ、 Ｋ、 Ｊ、 。 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オン・バクテリオロジ−（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１６９ ： ４１７７〜４
１８３（１９８７））、およびφＣ３１のごときストレ
プトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）バクテリオフ
ァージ（チャタ−・ケイ・エフら（Ｃｈａｔｅｒ、 Ｋ
、 Ｆ、 、 ｅｔ ａｌ） （シックスス・インター
ナショナル・シンポジウム・オン・アクチ／ミセテイル
ズ・バイオロジー（ＳｉｘｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔａｌｅｓＢｉｏｌｏｇｙ）、アカデミアイ・カイト
（ＡｋａｄｅｍｉａｉＫａｉｄｏ）、ブダペスト、ハン
ガリー（１９８６）、４５〜５４頁）を包含する。シュ
ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）プラスミドはジ
ョン・ジェイ・エフら（Ｊｏｈｎ、 Ｊ、 Ｆ、 、
ｅｔ ａｌ）（レビューズ・オン・ンンフエクシャス・
デイシーズ（Ｒｅｖ、 Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｄｉｓ、 ）
８： ６９３−７０４（１９８６））、およびイザキ・
ケイ（ｌｚａｋｉ、 Ｋ、 Ｘジャパニーズ・ンヤーナ
ル・オフ・パイテリオロジ−（Ｊｐｎ、 Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、 ） ３３： ７２９−７４２（１９７
８））によって総括されている。 好ましい真核生物プラスミドはＢＰＶ、ツクシニア、Ｓ
Ｖ４０，２−ミクロンサークル（ｃｉｒｃｌｅ）等、ま
たはその誘導体を包含する。かかるプラスミドは当該分
野でよく知られている（ホードスティン・ティら（Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎ、 Ｄ、 、 ｅｔ ａｌ）、マイアミラ
ントル・ンンボ（Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ、Ｓｙｍｐ、）
１９ ： ２６５〜２７４（１９８２）、ブローチ・ジ
エイ・アール（Ｂｒｏａｃｈ、 Ｊ、 Ｒ，） ：ザ・
モレキュラー・バイオロジー・オン・ザ・イースト・サ
ツカロミセス・ライフ・サイクル・アンド・インへりタ
ンス（ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
： Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎｈｅｒｉｔａ
ｎｃｅ）、コールド０スプリング・バーバー・ラボラト
リ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ）１ａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨー
ク州、４４５〜４７０頁（１９８１）；ブローチ・シェ
イ・アール（Ｂｒｏａｃｈ、 Ｊ、 Ｒ，）、セル（Ｃ
ｅｌｌ）２８ ： ２０３２０４（１９８２）；ポロン
・デイ・ビイら（Ｂｏｌ Ｊｏｎ、 Ｄ、 Ｐ、 、
ｅｔ ａｔ）、ジャーナル・オン・タリノ・ヘマトル・
オンフル（Ｊ、 ＣＩ ｉｎ、 Ｈｅｍａｔｏｌ、 ０
ｎｃｏ１． ）１０：３９〜４８（１９８０）；マニア
ティス・ティ（Ｍａｎｉａｔ ｉｓ、 Ｔ、 ）、セル
・バイオロジーニア・コンブリヘンンブ・トリーティズ
（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ： ＡＣｏｍｐｒｅｈｅ
ｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ）、３巻、ジーン９イク
スブレ７ヨン（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ア
カデミツク０ブレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）
、ニューヨーク州、５６３〜６０Ｂ（１９８０））。 一旦構築体を含有するベクターまたはＤＮＡ配列を発現
用に調製したならば、形質転換、トランスフエクンヨン
、接合、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿の
ごとき生化学的手段、およびジメチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）テキストランのごときポリカチオンの適用、お
よび電気穿孔、直接マイクロイン／ヱクンヨン、および
マイクロブロンエフティール（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃ
ｔｉｌｅ） （ハイオリスティック （ｂｉｏｌｉｓｔ
ｉｃ）ホンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）
（ジョンストンら（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ）、
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４０（４８５８）：
１５３８（１９８８）等を包含する種々の適当な手段の
うちいずれかによって、該ベクターまたはＤＮＡ構築体
を適当な宿主細胞に導入することができる。 ベクターの導入の後、含ベクター細胞の増殖について選
択する選択培地中で受容体細胞を増殖させる。クローン
化遺伝子配列の発現の結果、ＧＡＰ−４３蛋白が産生さ
れるか、またはこの蛋白の断片が産生される。これは、
形質転換細胞中で、あるいはく例えば、ブロモチオキン
ウラシルを神経芽細胞腫細胞等に投与することによって
）これらの細胞を分化するよう誘導した後、起こり得る
。 発現された蛋白は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動等のごとき
常法に従って単離し精製できる。 また、本発明は、ＧＡＰ−４３またはその断片およびヘ
ーターガラクトンターセのごとき検出可能な酵素、ある
いはいずれかの所望の同種または異種蛋白またはペプチ
ドよりなる融合蛋白をコード付けするクローン化遺伝子
に関する。かかる融合蛋白を産生ずる方法は教示されて
いる。例えば、ハイ・ティ・エイチら（Ｂａｉ、 Ｄ、
ｔｌ、 、 ｅｔ ａｌ）、／ヤーナル・オン・バイ
オロジカル・ケミストリー（ＪＢｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）
２６ ］ ： ］ ２３９５−１２３９９（１９８６）
、またはフィン・ティ・ニーら（Ｈｕｙｎｈ、 ＴＩＪ
、 ｅｔ ａｌ）、ティ・エヌ・エイ・クローニング・
テクニックス、ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮ
Ａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）中のｒｌｇｔｌｏ
およびλｇｔｌｌにおける構築およびスクリーニングｃ
Ｄ Ｎ Ａライブラリーズ（ＣｏｎＳｔｒｕｃｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｃＤＮＡ １−ｉｂ
ｒａｒｉｅｓ）、ティ・グロハー（Ｄ、 Ｇｌｏｖｅｒ
）ｆｔｍ、アイ・アール・エル・プレス（ＩＲＬ Ｐｒ
ｅｓｓ）、オノクスフォ−１’、１９８５．４９〜７７
頁。 ＧＡＰ−４３、その機能的誘導体、またはＧＡＰ−４３
またはその断片および検出可能な酵素または所望の蛋白
もしくはペプチドよりなる融合蛋白は当業者に公知の常
法によって単離できる。例えば、細胞を遠心によって収
集し、または適当な緩衝液で溶解でき、蛋白は、例えば
Ｄ Ｅ Ａ、 Ｅ−セルロース、ホスホセルロース、ポ
リリポ／チ／ル酸−アカロース、ヒトロキ／アパタイト
上のカラムクロマトグラフィーまたは電気泳動もしくは
免疫沈殿によって単離できる。別法として、ＧＡＰ４３
またはその機能性誘導体、またはＧＡＰ４３および検出
可能な酵素または所望の蛋白もしくはペプチドよりなる
融合蛋白は抗−ＧＡＰ−４３抗体の使用によって、また
は検出可能な酵素または所望の蛋白もしくはペプチドに
対する抗体の使用によって単離することかできる。かか
る抗体は、よく知られた方法によって得ることかでき、
そのうちいくつかを後記する。かくして、例えば、ポリ
クローナルウサキ抗−ＧＡＰ−４３血清の調製は本明細
書の実施例部分に開示されている。 本発明のもう１つの具体例は、対Ｇ Ａ Ｐ −４，３
蛋白抗体よりなる。本明細書中で用いる［抗体］（Ａｂ
）または［モノクローナル抗体Ｊ（Ｍａｂ）とは、抗原
を結合できる（例えば、ＦａｂおよびＦ （ａｂ’ ）
。 断片のごとき）無傷分子ならびにその断片を包含するも
のとする。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）、断片は無傷抗体
のＦｃ断片を欠き、循環から急速に消失し、無傷抗体の
低い非特異的組織結合を有し得る（ウオールら（Ｗａｈ
ｌ ｃｔ ａｔ）、ジャーナル・オン・ヌクレイツク・
メティシン（Ｊ、 Ｎｕｃｌ、 Ｍｅｃｌ、 ）２４３
１６〜３２５（１９８３））。 本発明の抗体は種々の方法のうちいずれによっても調製
できる。例えば、ＧＡＰ−４３蛋白、またはその機能性
誘導体を発現する細胞は、ＧＡＰ４３を結合できるポリ
クローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために
動物に投与できる。 最も好ましい方法では、本発明の抗体はモノクローナル
抗体である。かかるモノクローナル抗体はハイブリドー
マ技術を用いて調製できる（コーラ−ら（Ｋｏｈｌ、ｅ
ｒ ｅｔ ａｌ）、不イチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ） ２
５６：４９５（１９７５）；コーラ−ら（Ｋｏｈｌｅｒ
ｅｔ ａｌ）、ニーロビーアン・ツヤ−ナル・オン・
イミュノロ、／’−（Ｅｕｒ、Ｊ、 １ｍｍｕｎｏＬ）
６ ：５１１ （１９７６）：コーラーら（Ｋｏｈｌｅ
ｒ ｅｔ ａｌ）、ニーロビーアン・／ヤーナル・オン
・イミュノロ／−（Ｅｕｒｌ、 １ｍｍｕｎｏ１．）６
２９２（１９７６）、ハマーリングら（Ｈａｍｍｅｒｌ
ｉｎｇ６ｔ ａｌ、）、モノクローナル・アンティホ
ティズ・アンド・ティーセル・ハイブリトーマズ（Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ＴＣｅ
ｌｌ ｔｌｙｂｒｉｄｏｍａｓ）、エルセビエ・エヌ・
ワイ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、 Ｎ、 Ｙ、 ）、５６３〜
６８１頁（１９８１））。一般に、かかる手法はＧＡＰ
４３抗原での動物の免疫化を含む。かかる動物の肺臓細
胞を抽出し、適当な骨髄腫細胞系と融合させる。いずれ
の適当な骨髄腫細胞系も本発明で用いることができる。 融合の後、得られたハイフリトーマ細胞をＨＡＴ培地中
て選択的に維持し、次いて、ワンズ・ンエイ・アールら
（Ｗａｎｄｓ、 Ｊ、 Ｒ，、ｅｔａｌ）（カストロエ
ンテロロン−（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）８
０ ： ２２５〜２３２（１９８１）によって記載され
ているごとき限界希釈法によってクローン化する。次い
て、かかる選択により得られたハイブリドーマ細胞を検
定してＧＡＰ−４３抗原を結合できる抗体を分泌するク
ローンを同定する。 ハイブリトーマ細胞系の寄託 本発明の好ましいモノクローナル抗体はＭＡｂ抗−ＧＡ
Ｐ−４３（ＨＢ）と名付けたモノクローナル抗体の特異
性を有するものである。さらなる具体例として、本発明
は、本発明のモノクローナル抗体を産生ずるハイプリド
ーマ株よりなる。本発明による好ましいハイブリトーマ
細胞系はＨＢと名付け、ＭＡｂ抗−ＧＡＰ−４３（ＨＢ
）と命名したモノクローナル抗体を産生ずる。該Ｈ５細
胞系は、１９８９年１２別２１日に米国、メリーランド
州２０５８１、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、パ
ークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ
） １２３０１、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に寄託し、
受託番号ＡＴＣＣＨＢ １０３１６が与えられた。 本発明の抗体は、フォーワード（ｆｏｒｗａｒｄ）サン
ドイッチ、リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）サンドイッチ、
ンマルテイニアス（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）サンド
イッチアッセイのごときイムノメトリ、クアッセイまた
は「サンドイッチ」アッセイを包含する当該分野で公知
の標準的な免疫診断アッセイで用いるのによく適有する
。本発明の抗体は、当業者か、ＧＡＰ４３抗原またはそ
の同等物についての許容される特異性、感受性、および
正確性の免疫アッセイを行ために不都合な実験を行うこ
となく決定できるごとく、いずれの数の組み合わせで用
いることもできる。 免疫学の一般的原理に関する標準的な文献は、クライン
・ジェイ（Ｋｌｅｉｎ 、 Ｊ、 ）、イミュノロンー
ザ・サイエンス・オン・セルフ−ノンセルフ・ディスク
リミネーンヨン（１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ ５
ｃｉｅｎｃｅｏｆ ５ｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓ
ｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）、ジオン・ウィリー・アンド
・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ）、出
版者、ニューヨーク（１９８２）；ケネノト・アールら
（Ｋｅｎｎｅｔｔ、 Ｒ，、ｅｔ ａｌ）編、モノクロ
ーナル・アンティホディズ、ハイブリドーマニア・二ニ
ー・ティメンンヨン・イン・バイオロジカル・アナリン
ーズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：＾Ｎｅｂ Ｄｉｍｅｎｓｉｏ
ｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＡｎａｌｙＳｅｓ）
、ブレナム−プレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、出
版者、ニューヨーク（１９８０）；ブルドン・アールら
（ＢｕｒｄｏｎＲ，、ｅｔ ａｌ）［、ラホラトリー・
テクニックス・イン・バイオケミストリー・アンド・モ
レキュラー・ハイオロ／−（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉ。 ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ）、１３巻、エルセビエ（Ｅｌｓｅｖｉｅ
ｒ）、出版者、アムステルダム（１９８４）、中のカン
ペル・エイ（Ｃａｍｐｂｅｌ ］、 Ａ、 ）、［モノ
クローナル・アンティホディ・テクノロジー（Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ）を包含する。 「検出する」とは、物質の存在または不存在を測定する
こと、および物質の量を定量することを包含するものと
する。かくして、該語は、定量的および定性的測定につ
いての本発明の物質、組成物、および方法の使用をいう
。 本明細書中に記載したのと同一の特異性のモノクローナ
ル抗体を分ｉ・する他のハイブリトーマの単離は、抗−
イディオタイプスクリーニングの技術によって達成でき
る。ポトスミャ、りら（Ｐｏｔｏｃｍｊａｋ、 ｅｔ
ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２１５： １
６３７（１９８２）。簡単に言えば、抗−イディオタイ
プ抗体は注目するクローンによって産・生された抗体上
に存在する唯一の決定基を認識する抗体である。該抗−
イディオタイプ抗体は、モノクローナル抗体の源として
用いるのと同一の株の動物を注目するモノクローナル抗
体で免疫化することによって調製される。免疫化された
動物は、これらのイディオタイプ決定基（抗−イテイオ
タイプ抗体）に対する抗体を産生ずることによって、免
疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、それに応答
するであろう。単一クローンによって産生されたモノク
ローナル抗体について特異的な、第２の動物の抗−イテ
イオタイプ抗体を用いることによって、免疫化に用いた
他のクローンを同定することができる。２のクローンの
産物のイテイオタイプの同一性は、２のクローンか同一
のエピトープ決定基のそれらの認識に関して同一である
ことを示す。また、抗−イテイオタイプ抗体を「免疫原
」として用いてさらにもう１つの動物において免疫応答
を誘導し、元のＭＡｂに対してエピトープ的に同一であ
る、いわゆる抵−イテイオタイプ抗体を産生させること
かできる。かくして、モノクローナル抗体のエピトープ
決定基に対する抗体を用いることによって、同一のエピ
トープ特異性の抗体を発現する他のクローンを同定する
ことかできる。抗体において、イディオタイプ決定基は
所与のエピトープに結有する超可変領域に存在する。 従、って、本発明のモノクローナル抗体を用いてＢ Ａ
、 Ｌ Ｂ ／ ｃマウスのごとき適当な動物において
抗−イディオタイプＡｂｓを誘導することができる。こ
れらの動物からの牌臓細胞を用いて抗−イディオタイプ
ハイブリドーマ細胞系を産生ずる。 Ｋ Ｌ Ｈにカップリングしたモノクローナル抗−イテ
ィオタイプＡｂｓを「免疫原」として用いてＢＡＬＢ／
ｃマウスを免疫化する。これらのマウスからの血清は、
占められたエピトープについて特異的な元のＡｂの結合
特性を有する抗抗−イテイオタイプＡｂｓを含有するで
あろう。かくして、抗〜イティオタイプＭＡｂｓは評価
されるべきエピトープと構造的に同様なイテイオタイプ
抗原決定基を有する。 複製については、ノ＼イブリット細胞をｉｎνｉｔｒ。 およびｉｎ ｖｉｖｏ双方にて培養することかできる。 高ｉｎ ｖｉｖｏ産生はこれを現在液も好ましい培養方
法とする。略Ｌ′すれば、個々のノ＼イブリット株から
の細胞をプリスタンで初回抗原攻撃を受けたＢＡ Ｌ
Ｂ ／ ｃマウスに腹腔内投与して、高ａ度の所望のモ
ノクローナル抗体を含有する腹水液を産生させる。アイ
ソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのモノクローナル抗体は当
業者によく知られたカラムクロマトグラフィー法を用い
、培養上？登みから精製することかできる。 本発明の抗体は、それを液相で用いることかできるか、
または固相担体に結合させることかできる免疫アッセイ
で用いるのに特に適している。加えて、これらの免疫ア
ッセイにおける抗体は種々の方法で検出可能に標識する
ことかできる。 当該分野では、多くの異なる標識および標識法かある。 本発明で用いることができる標識のタイプ例は、酵素、
放射性同位元素、蛍光化合物、ケミルミネッセンス化合
物、生物ルミネッセンス化合物および金属キレ−１・を
包含するか、それらに限定されるものではない。当業者
ならば、抗体に結合させる他の適当な標識を知っている
であろうし、ルーチン的な実験の使用によってそれを確
認することかできるであろう。さらに、これらの標識の
抗体への結合は当業者に通常知られた標準的な技術を用
いて達成できる。 本発明の抗体を検出可能に標識できる方法の１つは、抗
体を酵素に結合させることによる。後でその基質に暴露
した場合、この酵素は、例えば、分光的または蛍光光度
的手段によって検出てきる化学基を生しるように基質と
反応するであろう。 本発明の抗体を検出可能に標識できる酵素の例はリンコ
酸デヒドロゲナーセ、スタフィロコノカスーヌクレアー
セ、チルターＶ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコ
ールデヒドロケナーセ、アルファグリセリンリン酸テヒ
トロケナーゼ、トリオースリン酸イソメラーセ、ビオチ
ン−アビノンベルオキ／ター上、ホースラティノユペル
オキンターセ、アルカリホスファターセ、アスパラキナ
ーセ、グルコースオキ／ター上、ヘーターカラクト／タ
ーセ、リホヌクレアーセ、ウレアー七、カタラーゼ、グ
ルコース−Ｖｌ−ホスフェ−トチヒドロゲナーゼ、グル
コアミラーセおよびアセチルコリンエステラーセを包含
する。 また、本発明の検出可能に標識した抗体の存在は、ガン
マカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用
のごとき手段によって測定できる放射能活性アイソトー
プで抗体を標識することによって検出できる。本発明の
目的に特に有用なアイソトープは、３）（Ｘ＋２５Ｉ、
３２ｐ、 ３５Ｓ、 ＋４Ｃ１”Ｃｒ、 ３８ＣＱ
、 ”Ｃｏ、”Ｃｏ、”Ｆｅおよび７５Ｓｅである。 また、抗体を蛍光化合物で標識することによって、本発
明の検出可能に標識した抗体の結合を検出することがで
きる。蛍光的に標識した抗体を適当な波長の光に暴露す
ると、染料の蛍光のため、その存在が検出てきる。最も
普通に使用される蛍光標識化合物の中には、フルオロセ
イン、イソチオシアネート、ロータミン、紅藻素、藻青
紫、アロフィコシアニン、０−フタロアルテヒトおよび
フルオレスカミンかある。 また、本発明の抗体はｌ＋２Ｅｕ１または他のランタノ
イド系列のごとき蛍光を発する金属を用いて、検出可能
に標識することもてきる。これらの金属は、ンエチレン
トリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミノ
四酢酸（ＥＤＴＡ）のごとき金属キレート基を用いて抗
体分子に結合させることができる。 また、本発明の抗体は、それをケミルミネッセンス化合
物にカップリングさせることによって検出可能に標識す
ることかできる。次いて、ケミルミネッセンス−標識抗
体の存在は、化学反応の間に生じるルミネッセンスの存
在を検出することによって決定できる。特に有用なケミ
ルミネッセンス標識化合物の例は、ルミナール、イソル
ミナール、セロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔ ｉｃ）ア
クリジニウムエステル、イミダゾール、アクリンニウム
塩およびオキサレートエステルである。 同様に、生物ルミネッセンス化合物を用いて本発明の抗
体を標識することができる。生物ルミネッセンスは、触
媒蛋白かケミルミネッセンス反応の効率を増加させる生
物学系で見い出されるタイプのケミルミネッセンスであ
る。生物ルミネッセンス抗体の存在はルミネッセンスの
存在を検出することによって決定される。標識の目的の
ための重要な生物ルミネッセンス化合物はルシフェリン
、ルンフェラーセおよびエクオリンを包含する。 本発明の抗体および実質的に精製された抗原は、理想的
には、キットの調製に適する。かかる牛。 トは、バイアル、試験官等のごとき１個またはそれ以上
の容器手段を閉じた区画に収容するように仕切った担体
手段よりなり、該容器手段の各々は用いるべきアッセイ
の別々の要素よりなる。 キット形態に一体化できるアッセイのタイプは多くあり
、例えば、競合アッセイおよび非競合ア。 セイを包含する。本発明の抗体を利用できるアッセイの
典型的な例はラジオイムノア、セイ（ＲＩＡ）、酵素イ
ムノアッセイ（ＥＩＡ）、免疫酵素法（ＥＬＩＳＡ）、
イムノメトリック、またはサンドイッチ、イムノアッセ
イである。 「イムノメトリックアッセイ」または［サンドイッチイ
ムノア、セイ」なる語とは、７マルテイニアス（ｓｉｍ
ｕｌｔａｎｅｏｕｓ）サンドイッチ、フォーワード（ｆ
ｏｒｗａｒｄ）サンドイッチおよびリバース（ｒｅｖｅ
ｒｓｅ）サンドイッチイムノアソセイを包含するものと
する。これらの語は当業者に十分理解されるであろう。 また、当業者ならば、本発明の抗体は他の変法および現
在公知であるまたは将来開発されるであろうアッセイ形
態において有用てあことを理解するであろう。これらは
本発明の範囲内に包含されるものとする。 フォーワード・サンドイッチ・アッセイは、例えば、米
国特許第３８６７５１７号、第４０１２２９４号および
第４３７６１１０号に記載されている。リバース・サン
トイ、チ・アッセイは、例えば、米国特許第４０９８８
７６号および第４３７６１１０号に記載されている。 当該アッセイを実行する好ましい態様においては、ある
種の「遮断薬（ｂｌｏｃｋｅｒ） Ｊをインキュヘーシ
ョン媒質に存在させることか重要である（通常、標識し
た可溶抗体と共に添加する）。該こ遮断薬」を添加して
、非特異的蛋白類、プロテアー七、または実験試料中に
存在するマウス免疫グロブリンに対するヒト抗体か、同
相支持体上の抗体、または放射能標識した抗体を架橋さ
せたりそれを破壊して誤った陽性結果または誤った陰性
結果を生じないことを確認する。従って、「遮断薬」の
選択は、本発明で記載したアッセイの特異性を実質的に
増加させる。 アッセイで用いるものと同一のクラスまたはサブクラス
（アイソタイプ）の多数の無関係ないくすなわち、非特
異的）抗体（例えば、Ｉ ｇ Ｇ ＋、１ｇＧ２．、Ｉ
ｇＭ等）を１遮断薬」として用いることかできる。適当
な感度を維持し、ヒト血清中で交差反応性蛋白を相互に
生じることによる望まない干渉を抑制するには、「遮断
薬」の濃度（通常１〜１００マイクログラム／マイクロ
リツトル）か重要である。加えて、「遮断薬」を含有す
る緩衝液系は最適化されることを要する。好ましい緩衝
液は、生理学的ｐ Ｈ範囲におけるイミタゾール、ＨＥ
ＰＰＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ト（Ｅ
ＰＥＳ、Ｐ Ｉ ＰＥＳ、ＴＲＩ Ｓ等のごとき弱有機
酸をヘースとするものである。幾分かは好ましくない緩
衝液は、リン酸塩、ホウ酸塩または炭酸塩のごとき無機
緩衝液である。最終的には、公知のプロテアーセ阻害剤
を、「遮断薬」を含有する緩衝液に（通常０．０１〜１
０マイクログラム／ｍＱで）添加すべきである。 これまでに使用されてきた、および本発明で用いること
かできる多くの固相免疫吸着剤かある。 よく知られた公知の免疫吸着剤は、チューフ、ビーズの
形態のガラス、ポリスチレン、ポリフロピレン、テキス
トラン、ナイロンおよび他の材料、およびかかる材料か
ら形成したまたはそれて被覆したマイクロタイタープレ
ートを包含する。固定化抗体は、アミドまたはエステル
結合を介する共有結合のごとき技術、あるいは吸着によ
って、同相免疫吸着剤に共有結合によりまたは物理的に
結合させることができる。当業者ならば、多くの適当な
固相免疫吸着剤およびその上に抗体を固定化する方法を
知っているであろうし、ルーチン的な実験を用いるたけ
て、それを確認することかできるであろう。 ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ５ｉｔ
ｕ診断については、放射性核種のごとき標識を、直接的
にまたは媒介官能基を用いることによって、本発明の抗
体に結合させることができる。金属カチオンとして存在
する放射性同位元素を抗体に結合させるのにしばしば用
いる媒介基は／エチレントリアミノ四酢酸（ＤＴＰＡ）
である。このようにして結合される金属チオンの典型的
な例は： ９９ ｍ Ｔ ｃ、１２３■、■１１ Ｎ、
＋３１）、 ９’ｌＲｕ、 ８７ＣｕＳｌ１７Ｇａお
よび”Ｇ ａである。また、本発明の抗体は診断目的の
非放射性同位元素で標識することもてきる。この方法で
特に有用な元素は＋５７Ｇｃｌ、”Ｍｎ、＋８２Ｄｙ、
”Ｃｒおよび５６Ｆｅである。 また、本発明の抗体は、本発明の抗体と反応性のエピト
ープを件うＧＡＰ−４３抗原を発現する良性または癌性
新形成のごとき障害を有するヒトを包含する動物におい
て免疫療法で用いることかできる。 免疫療法で用いる場合、本発明の抗体は治療剤で標識し
なくても標識してもよい。免疫療法て本発明の抗体にカ
ップリングできる治療剤の例は、放射性同位元素、レク
チンおよびトキ／ンである。 レクチンは特異的糖部値に結有する、通常、植物材料か
ら単離した蛋白である。また、多くのレクチンは細胞を
凝集させ、リンパ球を刺激することかてきる。す／ンは
免疫治療で用いられてきた毒性レクチンである。この使
用はく毒性の原因とナルリンンのアルファーペプチド鎖
を抗体分子に結合させて毒性欠損の部位特異的デリバリ
を可能とすることによって達成される。これは、例えば
、ビテノタら（Ｖｉｔｃｔｔａ ｅｔ ａｌｌｆイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３８ ： ］ ０９８（１９８
７）、およびパスタノら（Ｐｓａｔａｎ ｅｔ ａｌ）
、アトハ＋アレルキー（ＡｄｖΔｌｌｅｒｇｙ）４７
： ６４１ （］ ９８６）に記載されている。 トキノン類は、十分な用量であるとしばしば死に至らし
める、植物、動物または微生物によって産生される有毒
性物質である。例えば、ンフテリア）・キノンはコリ不
ハクテリウｊトンフチリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｅｔｅｒ
ｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）によって産生される蛋
白である。このトキシンは適当な条件下で分離できるア
ルファおよびベータサブユニットよりなる。該トキシン
のアルファ成分は抗体に結合し、部位特異的デリバリに
用いることができる。 免疫療法で用いる本発明の抗体に結合できる放射性同位
元素の例は： ”’Ｕｍ、 ＋３’Ｉ、”Ｙ、＠’ＴＣ
ｕ、！＋７Ｂｉ、を目Ａ ｔ 、 ””Ｐ ｂ、 ４７
Ｓ ｃおよび１０”Ｐｄである。 勿論、発現されたＧＡＰ−４３は、通常、細胞膜内に閉
じ込められている。従って、当業者ならば、本発明の抗
体を用いるｉｎ ｖｉｖｏ診断法および治療法は、かか
る抗体か細胞内膜上のＧＡＰ−４３を検出できるメカニ
ズムをいくらか必要とすることを理解するであろう。１
のかかる方法は、抗体またはその断片を細胞膜に導入す
るか、または細胞膜を通過させて細胞自体の中へ導入す
ることである。これは、例えば、標的細胞がそれに対し
てレセプタ一部位′を含有するりカントに抗体を結合さ
せることによって達成できる。かくして、当該抗体は、
リカントと共に細胞膜内に輸送されるか、または細胞膜
を通過することができる。 担体リガンドの選択は、当業者に理解されるごとく、い
くつかの因子に依存する。これらは、例えばリガンドお
よびそのレセプターの、および受動または能動を含む全
輸送の速度論を含み、活性化されて輸送されるリガンド
か好ましい。また、抗体をリガントに結合させる手段は
制限内で変化し、例えば、共有結合またはイオン結合と
することができるか、かかる結合はりガント−レセプタ
ーの親和性を許容されない程度に変化させるべきでない
ことを銘記すべきである。 かかる適用に適したレセプターの例はレセプターの飲食
作用について必要な情報をすべて含有することが示され
ている（デイビスら（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ）、ジャ
ーナル・サブ・セリュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１
ｌ Ｂｉｏｌ、） １０７ （６／ ３） 、アブスト
ラクト番号３１１２（１９８８）低密度リポ蛋白（ＬＤ
Ｌ）に対するレセプター、ならびにドーパミンについて
のもののごとき公知の脳−特異的レセプターを包含する
。この点に関し、リカンドはそれ自体で、本発明の抗体
かそれに対して結合し得るレセプターに特異的な抗体ま
たは断片となり得ることか理解されるであろう。 更に、当業者ならば、リガンド−レセプター相互作用に
干渉しないようであり、かつ容易に細胞膜を通過し得る
（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片のごとき）本
発明の抗体断片を使用するのが特に望ましいことを見い
出すであろう。当業者に理解されるであろうごとく、−
車路抗体がこれらのおよび他の理由で好ましいであろう
。 抗体が前記したごとく細胞膜内にまたは細胞内に輸送さ
れるべき場合、抗体がＧＡＰ’−４３蛋白上のその抗原
部位に結有するときに標識が比較的より効果的となるよ
うに診断または治療に際して抗体を標識するのが好まし
いであろう。これは、例えば、抗原−抗体コンプレック
スの形成の結果、活性または検出可能となる標識を使用
することによって達成できる。別法として、抗原−抗体
コンプレックスの形成か抗体のフンフォメーションの変
化を誘導してまた暴露されていないまたは十分には暴露
されていない標識を暴露したりまたは十分に暴露するよ
うに抗体自体を標識することかできる。前記基準および
その他のすべては本発明のこれらの態様を実施するに際
し当業者に明らかであろう。 また、本発明の抗体を有するリポソームをそれらの膜内
で利用して当該抗体を標的領域に特異的に輸送すること
もできる。これらのリポソームは、それらが、当該抗体
以外に、標的部位で放出されるであろう薬剤、放射性同
位元素、レクチンおよびトキシンのごとき免疫療法剤を
含有するように製造することができる。 抗体、および好ましくはＧＡＰ−４３をコード付けする
ヌクレオチド配列（およびその機能的および化学的誘導
体）を診断または治療目的で神経細胞に導入するもう１
つの好ましい方法は、レトロウィルスを包含するウイル
スベクターの使用ニよる。適当なウィルスの例として、
種々のヘルペスウィルスを挙げることかできる。適当な
ウィルスは、ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）を包含
する。他の適当なウィルスおよびレトロウィルスは当業
者によく知られている。哺乳動物細胞に遺伝子を導入す
るためにウィルスベクターを使用することは、例えば、
ハルマス（Ｖａｒｍｕｓ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）２４０（４８５８）： １４２７（１９８８）：エ
グリティスら（Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ）、バイオ
テクニックス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）６． ７
： ６０８ （１９８８）：ジェーニソンーＬ （Ｊ
ａｅｎｉｓｃｈ）サンエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４０
（４８５８）： １４６８（１９８８）：およびヘルン
／ユタインら（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ、 ａり、シ
ェ不テノクス・エンジニアリング・ニューズ（Ｇｅｎｅ
ｔ、Ｅｎｇ、ＸＮ、Ｙ、）７ ： ２３５（１９８５）
で総括されている。 本発明の目的では、弱毒化したウィルスまたはレトロウ
ィルス株を使用するのか好ましいでろう。 かくして、例えば、本発明の抗体またはＤＮＡ配列のた
めのベクターとして、ＣＤ４−依存メカニズム（フンケ
ら（Ｆｕｎｋｅ ｅｔ ａｌ）、ンヤーナル・オン・エ
クスベリメンタル・メティンン（Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅ
ｄ、 ） １６５ ： １２３０（１９８７））によっ
て神経細胞に侵入するＨＩＶ−２ＳＴ（コンブら（Ｋｏ
ｎｇ ｅｔ ａｌ）づンエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４
０（４８５８）： １５２５（１９８８乃またはＨＩＶ
−２ｕｃ、（エバンズら（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ）、
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４０ （４８５８）
： １５２３（１９８８））のごとき弱毒化細胞変性（
ｃｙｔｏｐａｔｈｉｅｉｔｙ）を有するレトロウィルス
を用いることかてきる。ＨＩＶ感染の神経生物学は、例
えば、ジョンメンら（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ）、
エフ・エイ・ニス・イー・ビイ・ジャーナル（ＦＡＳＥ
ＢＪ、）、 ２（１４）： ２９７０（１９８８）に
記載されている。当業者ならば、ルーチン的技量の努力
によって、ウィルスに対し公知の感受性を有する異なる
神経集団を標的とすることかできるであろう。 例えば、ＣＤ４はヒト脳において変異転写体を有するこ
とか知られており、前脳で含有量か最大である（マトン
ら（Ｍａｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ）、セル（Ｃｅｌ ｌ）
４７ ：３３３（１９８６）。 理想的には、遺伝子プリン＼り系の選択は、Ｍｉ織に適
した方法により、遺伝子の発現が適当なレベルであって
いずれの逆効果もなく、効果的かつ安定な遺伝子移送の
目的を銘記しつつ、当業者によってなされるであろう。 例えば、ウオルフら（Ｗｏｌｆｆｅｔ ａｌ）、リコー
ム・ディス・クリソ・ノース・アム（Ｒｈｅｕｍ、Ｄｉ
ｓ、Ｃｌ１ｎ、Ｎｏｒｔｈ Ａｍ、） １４ （２）
： ４５９（１９８３）参照。中枢神経系標的へのプリ
ン＼りに関しては、ＨＩ Ｖを包含する多くのウィルス
ベクターか血液脳関門を通過できる利点を提供する（ジ
ョンメンら（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ）、エフ・エ
イ・ニス・イー・ビイ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ Ｊ、
）２ （１４）： ２９７０（１９８８））。 標識したプローブを用いるラットＧＡＰ−４３の単離に
ついて前記した方法に従い、ＧＡＰ−４３をコード付け
するＤＮＡ配列、ま１こはその断片をＤＮＡプローブと
して用いて、ヒトにおける対応抗原を単離することがで
きる。次いて、ヒト抗原遺伝子をクローン化し、宿主で
発現させてヒト抗原を得ることかできる。次いで、この
ヒト抗原を、対応する自己抗体についての、およびヒト
を包含する動物の治療処置についての診断アッセイで用
いることかできる。 本発明者らは、Ｇ Ａ Ｐ−４３遺伝子の発現を制御す
る調節メカニズムを明らかにすへく設計１７た実験を行
った。ＧＡＰ−４３発現の変調は、中枢神経または末梢
神経組織の損傷、疾患または機能障害に罹ったヒトを包
含する哺乳動物を治療処置てきる便利で効果的な方法を
提供する。さらに、本発明による、ヒトを包含する哺乳
動物における通常の中枢または末梢神経組織で構造再編
成を変調する方法は、ニューロンの構造および機能のメ
カニズムをさらに明らかにする点て当業者にとって太い
に役立ってあろう。 神経学的病気または障害の治療における本発明の前臨床
治療的使用または臨床治療的使用は、診断および処置の
許容される原理を用いて、当業者により最善に達成され
るであろう。かかる原理は当該分野で公知であり、例え
ば、ビーターストルフ・アール・ンイら（Ｐｅｔｅｒｓ
ｄｏｒｆ、Ｒ，Ｇ、 ｅｔ ａｌ）ｍ、ハリスンズ・プ
リン／プル・オン・インターナル・メテインン（ｔｌａ
ｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ ｏｒ Ｉｎ
ｔｅｒｎａＭｅｄｉｃｉｎｅ）、第１０版、マグロ−ヒ
ル（ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ）、出版者、ニューヨーク、
ニューヨーク州（１９８３）、特にその文献のパートＡ
、セクション１１の「中枢神経系の障害（Ｄｉｓｏｒｄ
ｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅＣｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ
Ｓｙｓｔｅｍ）Ｊなる標題の部分に記載されている。 本発明の抗原、抗体および組成物、またはそれらの機能
的誘導体は医薬組成物の調製によく適有する。本発明の
医薬組成物は、本発明の化合物の有用な効果を享受でき
るいずれの動物に投与することもできる。かかる動物の
中で第１にはヒトであるか、本発明はそのように限定さ
れるものではない。 本発明の医薬組成物はその意図する目的を達成するいず
れの手段によって投与することもできる。 例えば、投与は非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内
、経皮、またはバッカル経路によって投与できる。別法
として、または同時に、投与は経口経路によって行うこ
とができる。投与すべき用量は受容者の年令、健康、お
よび体重、同時治療の種類、もしあれば、治療の頻度、
および所望する効果の性質に依存する。 薬理学的に活性な化合物に加え、新しい医薬製剤には、
活性化合物を医薬に使用できる製剤中に入れて加工する
のを容易とする賦形剤および添加剤よりなる適当な医薬
上許容される担体を含有させることができる。好ましく
は、製剤、特に錠剤、糖衣錠、およびカプセル剤のごと
き経口投与できる製剤および好ましい投与タイプで用い
ることができる製剤、および生薬のごとき直腸投与でき
る製剤、ならびに注射による投与に適した液剤には、賦
形剤と共に、活性化合物約０．００１ないし約９９パー
ント、好ましくは約０．０１ないし約９５パーセントを
含有させる。 本発明の組成物投与ための用量範囲は所望の効果を生じ
るのに十分な程犬であり、それにより、例えば、腫瘍性
組織は減少するか排除されあるいは改善される。用量は
、望まない交差反応、アナフィラキシ−反応等の逆効果
を引き起こすほど大であってはならない。一般に、用量
は患者の年令、状態、性及び病気の程度により変化する
。逆兆候（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）、も
しあれば、免疫寛容および他の変数もまた適切な用量に
影響するであろう。抗体は注射または時間をかけての徐
々に行う大量注入（ｐｒｏｆ ｕｓ １ｏｎ）によって
非経口投与できる。 また、本発明の抗体は静脈内、イントラバレントラリ（
ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌの、筋肉内または皮
下投与できる。 本発明の医薬製剤は、それ自体公知の方法、例えば、通
常の混合、顆粒化、糖衣作成、溶解、凍結乾燥工程によ
って製造できる。かくして、経口使用のための医薬製剤
は、活性化合物を固体賦形剤と合し、所望により、得ら
れた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工し、所望によ
りまたは要すれば、適当な添加剤の添加の後に錠剤また
は糖衣錠のコアを得る。 適当な賦形剤は、特に、糖類のごとき充填剤、例えばラ
クトースまたはスクロース、マンニトールまたはソルビ
トール調製物および／またはリン酸カルンウム、例えば
リン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム、なら
びに、例えばトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジ
ャガイモ澱粉、セラチン、トラガカント、メチルセルロ
ース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキ
シメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビ
ニルピロリドンを用いる澱粉ペーストのごき結合剤であ
る。所望ならば、前記澱粉およびカルボキシメチル−澱
粉、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン
酸またはアルギン酸ナトリウムのごときその塩のような
崩壊剤を添加することができる。添加剤は、前記したち
のすべて、流動調節剤および滑沢剤、例えば、シリカ、
タルク、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム
もしくはステアリン酸カルシウムのごときその塩、およ
び／またはポリエチレングリコールである。 糖衣錠コアには、所望ならば、胃液に対して耐性の適当
なコーティング剤を施す。この目的には、所望により、
アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエ
チレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカ
ー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含有さ
せてもよい濃い糖溶液を用いることができる。胃液に対
して耐性のコーチインク剤を得るには、アセチルセルロ
ースフタレートまたはヒドロキンフロビルメチルセルロ
ースフタレートのごとき適当なセルロース調製物の溶液
を用いる。染料または色素を、例えば、同一性のため、
または活性化合物用量の組み合わせを特徴付けるために
錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる
。 経口的に用いることができる他の医薬製剤は、ゼラチン
でつくったブノンユ フィツト（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カ
プセル剤、ならひにセラチンおよびグリセロールまたは
ソルビトールのごとき可塑剤でつくった柔軟で密封した
カプセル剤を包含する。該プラン。 フィ、トカプセル剤には、ラクトースのごとき充填剤、
澱粉のごとき結合剤、および７／またはタルクまたはス
テアリン酸マグネシウムのごとき滑沢剤、および所望に
より安定剤と混合できる顆粒形態の活性化合物を含有さ
Ｕることかできる。ソフトカプセル剤においては、活性
化合物は、好ましくは、脂肪油または流動パラフィンの
ごとき適当な液体に溶解または懸濁できる。加えて、安
定剤を添加することもてきる。 経直腸的に使用できる可能な医薬製剤は、例えば、１種
またはそれ以上の活性化合物と生薬基剤との組み合わせ
よりなる生薬を包含する。適当な生薬基剤は、例えば、
天然または合成トリグリセリド、パラフィン炭化水素で
ある。加えて、活性化合物と基剤との組み合わせよりな
るセラチン直腸カプセル剤を用いることもできる。５Ｊ
能な基剤は、例えば、液状トリグリセリｉ・、ポリエチ
レングリコール、またはパラフィン炭化水素を包含する
。 非経口投与用の適当な処方は、水溶性形態、例えば水溶
性塩である活性化合物の水性溶液を包含する。加えて、
適当な油性注射懸濁剤としての活性化合物の懸濁剤を投
与することかできる。適当な脂肪親和性溶媒またはビヒ
クルは脂肪１１１］、例えばコマ油、または合成脂肪酸
エステル、例えばオしイン酸エチルまたはトリグリセリ
ドを包含する。 水性注射懸濁剤には、懸濁剤の粘度を増加させる物質、
例えばカルホキジメチルセルロースナトリウム、ソルビ
トール、および／またはテキストランを含有させること
ができる。所望により、該懸濁剤には安定剤を含有させ
ることもてきる。 本発明のＧＡＰ−４３抗原はニューロン細胞に対してユ
ニークであり、かくして、便利で有用なマーカーを提供
する。従って、ＧＡＰ−４３に定方向化された抗体は当
業者によく知られた種々の技術で用いてニューロン細胞
を同定することかできる。さらに、本発明の抗体は新形
成およびニューロン起源の他の障害の検出、測定および
治療処置を可能とし、ヒトを包含する動物において癌お
よび他の障害の前臨床および臨床評価および治療のため
の、便利で有用なｉｎ ｖｌｖｏ、、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
またはｉｎ ５ｉｔｕ診断および治療方法を提供する。 本発明の抗原は、本発明の抗体を使用して、実質的に純
粋な形態て単離できる。かくして、本発明の具体例は実
質的に純粋な抗原ＧＡＰ−４３を提供し、該抗原は本発
明の抗体によって認識されかつそれに結有する点で特徴
付けられる。もう１一つの具体例において、本発明は、
ＧＡＰ−４３に定方向化された１種またはそれ以上の抗
体と該抗原とてコンプレックスを形成することによって
、ＧＡＰ−４３抗厚を単離しまたは精製する方法を提供
する。 本発明の実質的に純粋な抗原ＧＡＰ−４３は、脳を髄液
、血清または尿のごとき試料において対ＧＡＰ−４３抗
体を検出しまたは測定するのに用いることかできる。か
くして、本発明の１の具体例は、ＧＡＰ−４３抗原に対
する抗体を含有する試料と検出可能に標識されたＧＡＰ
−４３とを接触させ、次いて該標識を検出することを特
徴とする該試料中のＧ Ａ Ｐ−４３抗原に対する抗体
の存在またはその爪を測定する方法よりなる。Ｇ Ａ、
Ｐ４３の免疫反応性画分およびＧＡＰ−４３の免疫反
応性同族体も用いることかできることか理解されるであ
ろう。「免疫反応性画分−・なる詔は、ＧＡＰ−４３に
定方向化された抗体に対し同等の免疫応答を示すＧ Ａ
、 Ｐ −４３抗原のいずれの部分もいうものとする。 ［免疫反応性同族体、′なる語は、１個またはそれ以上
のアミノ酸だけＧＡＰ〜４３蛋白とは異なるか、本発明
の抗体に対し同等の免疫応答を示す蛋白をいうものとす
る。 本発明のなおさらにもう１つの態様において、ＧＡＰ−
４３蛋白は、ＧＡＰ−４３蛋白を細胞膜へ、特にニュー
ロン細胞の成長円錐の領域へ定方向化する新規な膜−タ
ーゲノティングペプチドドメインを含有することか判明
した。この膜−ターゲソティングドメインの構造を決定
し、該ペプチドは（通常は膜連結でない）通常は細胞質
ゾルの蛋白を細胞膜へ定方向化するのに効果的なことが
示された。本発明の詳細な説明する実験は明細書の実施
例■に詳細に記載する。 本発明の本態様の組成物および方法により、とりわけ、
通常は膜連結でない蛋白を含むいずれの所望の蛋白も細
胞膜へ定方向化することかできる。 更に、本発明の本態様の組成物および方法は、動物にお
ける、神経学的損傷および障害のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉ
ｎ ｖｉｖｏ、およびｉｎ ５ｉｔｕ冶療処置て利用で
きることは明らかである。当業者ならば、診断および治
療方法のこれまでの記載は本発明の本具体例に等しく適
用されることを理解するであろう。さらに、本発明の膜
−ターゲツティングペプチドはいずれの所望の蛋白また
はペプチドを細胞膜へ定方向化することにも使用され、
かくして、同様に、非神経学的指標において診断および
治療で使用されることも明らかである。かかる指標の例
は、細胞の膜か免疫学的指標のごとき重要な役割を演じ
るいずれの適用も包含するが、それらに限定されるもの
ではない。 本発明を実施する態様および方法は以下の実施例を参照
して当業者に十分に理解されるだろうか、これらの実施
例は、断して、本発明の範囲または請求の範囲を限定す
るものではない。 （実施例） 実施例Ｉ ラットＧＡＰ−４３についてのｃＤＮＡのクロニング １７日令胎由来のう・７ト後根神経節のＲＮＡからｃＤ
ＮＡライブラリーを得、λｇｉｌ１発現へフタ−中にク
ローニングした［ヒュインフ（Ｈｕｙｎｈ）ら、「ディ
ーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプ
ローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌＡｐｐｒｏａｃｈ） Ｊ、デイ・エム・クローンゞ
−（Ｄ、 Ｍ、 Ｇｌｏｖｅｒ）編（アイアールエル・
プレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、ワシントン・デイ−・
シー、１９８５）ｐｐ、 ４９−７８］。３つの推定Ｇ
ＡＰ−４３クローンを、スナイプス（Ｓｎｉｐｅｓ）ら
のＳｏｃ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ａｂｓｔｒ、 １２：
５００ （１９８６）によって記載されたＧＡＰ−４３
に対する抗体を用いて同定した。最長クローン、ＧＡＰ
４３−２の同定を、ハイブリッド選択翻訳法によって確
実とした（第１図）。ＧＡＰ４３−２は、ハイブリダイ
ゼーションによって、天然ＧＡｌ”４３、すなわち約４
３ｋＤの分子サイズの予測される移動度で５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドケル中を移動するポリペプチドの翻訳を
方向付けるメ、センンヤーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を選択し
た。このｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物をＧＡＰ−４３に対
する抗体によって選択的に免疫沈降させた。免疫沈降の
特異性は、非標識化精製ＧＡＰ−４３との競合によって
証明した。さらに確認のために、精製したＧＡＰ−４３
の臭化／アン分解によって調製したペプチドを配列化し
た。 該配列、Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ
４．ｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−ＧｌｕＡｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｙｓ−１ｉｅは、ＧＡＰ４３−２の予想されたオーフン
リーティングフレームの範囲内に完全に含まれている（
該Ｘは、アミノ酸の同一性か確実に決定され得ない配列
決定のサイクルを表す）。 ＧＡＰ４３−２の完全なヌクレオチド配列および予測さ
れるアミノ酸配列を第２図に示す。ｌ／−ディングフレ
ームは、配列決定されたベプケトフラグメ／トを含んて
おり、λｇｉｌｌのβ−カラクト／ターセ遺伝子と同一
のリーディングフレーム中にある。［ラットＧＡＰ−４
３に関するｃＤＮＡは、スキｍ＝（Ｊ、 ）ｉ、 Ｐ、
５ｋｅｎｅ）および彼の同僚（ハ／（Ｇ、Ｂａ５ｉ）
、ヤコブソン（Ｒ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ）、ビラグ（ＩＶ
ｉｒａｇ）、スキｍ＝＜Ｊ、 Ｈ，Ｐ、 ５ｋｅｎｅ）
、私信）によって独立して得られた。該配列のコピーを
交換した。 本発明の予測されるアミノ酸配列は、スキｍ＝（ＪＨ，
Ｐ、 ５ｋｅｎｅンによって提供さねたちのと完全に一
致し、ヌクレオチド配＋ｌｊは、３′非針訳領域におけ
る１っの位置たけ相異する。］オーブンリーディングフ
レームの開始と一致するメチオニンは、ヌクレオチド位
置１３のイン・フレーム（ｉｎ（ｒａｍｅ）停止コドン
（ＴＡＡ）の後の最初のメチオニンであり、真核生物の
翻訳を開始するのに最も有利な前後関係とするためにコ
サツク（Ｋｏｚａｋ）のセル（Ｃｅｌｌ）４４：２８３
（１，９８６）によって示唆された９つのヌク１／オ
チトコンセンサス配列のうちの８つによって囲まれてい
る。これは、ＧＡＰ−４３コーデイング領域の最初の残
基であることを示唆する。しかし、該情報は、この帰属
を明確とするには不十分てあり、従って、第２のメチオ
ニン（アミノ酸５）は、この役割を果す可能性かある。 Ｇ Ａ Ｐ−４３の予測される組成は、高極性であり、
明白な膜内外ドメインまたは可能なＮ−結合グリコンル
化部位を有していない。この組成は、Ｇ Ａ Ｐ−４，
３か膜連結性であるか、膜浸透化なしては抗体認識に達
しにくいという観察と一致しており「メイツ（Ｍｅｉｒ
ｉ）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３：３５３７ （１９８
６）］ ｉかくして、これは膜の内部表面に連結してい
るかもしれない。 オープンリーディングフレームからのＧＡＰ）４３蛋白
の予測される分子サイズは２４ｋＤであり、これは、５
ＤＳ−ボ１ノアク１フルアミドケル中の分子の見掛の分
子サイズとしてスキｍ＝（Ｓｋｅｎｅ）およびライリア
ーＦ Ｑｉｌｌｉａｒｄ）によって最初に観察された４
３ｋＤより小さい［スキｍ＝（Ｓｋｅｎｅ）およびウイ
リアート（Ｗｉｌｌｉａｒｄ）、ンヤーナル・イン・セ
ル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）８９：
８６ （１９８１）、同上、ｐ、 ９Ｂ］。ＧＡＰ−４
３の見掛の分子サイズはポリアクリルアミド１１度に依
存するので、該分子サイズは不確かであり［ヤコブソン
（Ｊ ａｃｏｂｓｏｎ）ら、ジャーナル・イン・ニュー
ロサイエンス（ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ） ６：１８４３
（１９８Ｂ）］、この蛋白か、ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル上で変則的に移動する蛋白の範鴫に入ることを示
唆するＬノーンカー（Ｂａｎｋｅｒ）ら、／ヤーナル・
イン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ
、 Ｃｈｅｍ、 ）、２４７：５８５６（１９７２）バ
ーフン（Ｐｅｒｓｓｏｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ） ２２５６８７ （１９８４） ；スマート（Ｓ
ｍａｒｔ）ら、）＜イロロシー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）
１１２ニア０３ （１９８１）］。この特性は、１ｎｖ
ｉｔｒｏ翻訳産物か天然ＧＡＰ−４３の移動度と同様の
移動度を有するので、翻訳後の修飾によるとは思われな
い（第１図）。 推定上のオープンリーディングフレームの範囲内てコー
ド付けされる蛋白の５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル移
動特性に関する情報を収集するために、ノルトン（Ｍｅ
ｌ ｔｏｎ）らのＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５
１２ニア０３５ （１９ｇ４）の方法によって、ハタテ
リオファ−ンＳＰ６ プロモーターを用いて、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写系においてｃＤＮＡからＧＡＰ−４３Ｒ
ＮＡを合成した。５ａｕ３Ａ部位、すなわち予測される
オープンリーディングフレームの端部の６５塩基３“側
で切断したｃＤＮＡを転写することによって８００＝塩
基ＲＮ Ａを得（第２図）、ｃＤＮＡの３′末端のポリ
リンカー領域におけるＨｉｎｄＴ１１部位で切断するこ
とによって１１００−塩基ＲＮＡを得た。８００−塩基
ＲＮＡおよび１１００１塩基ＲＮＡの両者は、網状赤血
球溶解産物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏて關訳し、１５％
５ＤＳ−ポリアクノルアミドケル上で分析すると見掛分
子サイズか４０ｋＤであるポリペプチドの合成を指令し
た。 両方の場合の４Ｃ１−ｋＤ翻訳産物を、対ＧＡＰ４３抗
体を用いて免疫沈降した。新生児ラット脳ＲＮＡからｉ
ｌ ｖｉｔｒｏ合成したＧＡＰ−４３は、これらの翻訳
産物と一緒に移動した。 ＧＡＰ−４３か成長円錐の機能に対して重要であるとい
う確信に関する証拠としては、成長円錐膜中の蛋白の豊
富さ［メイツ（Ｍｅｉｒｉ）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８３
：３５３７ （１９８６） ；スキｍ＝（Ｓｋｅｎｅ）
ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３３ニア８３
（１９８６）］、および発育および再生する神経におけ
る蛋白の輸送の増大［スキニ（Ｓｋｅｎｅ）およびウイ
リアート（Ｗｉｌｌｉａｒｄ）、ジャーナル・イン・セ
ル・バイオロン−（Ｊ、 Ｃｅｌ ］。Ｂｉｏ１． ）
８９・８６ （１９８１）、同書、ｐ、 ９６１か挙げ
られる。ＧＡＰ−４３遺伝子発現か神経突起の伸長と協
同して調整されるか否かを調へるために、その発現をＰ
Ｃ１２細胞において試験したか、そこでは神経突起の突
出は神経発育因子（ＮＧＦ）によって促進され、アテノ
ンン３’、 ５’〜モノホスフエート（ｃＡＭＰ）によ
ってはそれ程ではなかった。これらの薬物は神経突起の
突出を誘導する際に異なった機構によって作用する［カ
ニング（Ｇｕｎｎｉｎｇ）ら、ンヤーナル・イソ・セル
＋バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、） ８９：
２４０ （１９８１）］。いずれかの薬物によって誘導
される神経突起成長には、ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡレベル
の増加が伴い、両薬物に暴露された細胞で増加が最大で
ある（第３図）。 通常の成長期間のＧＡＰ−４３遺伝子の発現のパターン
を決定するために、全細胞性ＲＮＡを、１３日令胎、１
７日令胎、新生児、および成体ラットの脳、抜根神経節
、心臓、および肝臓から単離した。神経−特異的方法で
、ＧＡＰ−４３を発現させた（第４図）。全ての年令で
、約１５００ヌクレオチドの主要なハイブリタイズする
バンドは、ニューロン組織中たけで見える。本発明者ら
はケノミソクＧＡＰ’−４３遺伝子かイントロン配列を
含有していることを見い出したので、かすかな、大きい
分子サイズのハンドは、スブラインングしていない前駆
体分子に対応し得る。ＧＡＰ−４３はニューロン中に位
置するのて［メイツ（Ｍｅｉｒｉ）ら、ＰＮＡＳ ’Ｊ
ＳＡ ８３：３５３７ （１９８６）コ、ニューロン組
織におけるＧＡＰ−４３ｍＲＮＡは、神経膠（ダリア）
の起源よりもおそらく神経の起源てあり、ＧＡＰ−４３
ＲＮＡは、神経膠原（グリオーム）細胞系Ｃ６中では検
出されなかった。 神経組織において、ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡの量は、発育
段階によって変化する。ピーク濃度は、周産期に生じ、
末梢神経系に対し中枢神経系では若干遅延する。発現の
タイミングは、軸索成長のｌに一致する［ヤコブソン（
Ｊａｃｏｂｓｏｎ）、ティへローフメンタル・ニューロ
バソロノー（Ｄｅｖｅｌｏｐ−ｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒ
ｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）（プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、
ニュー・ヨーク、１９７ｇ）］。しかし、成体神経組織
中の有意な量のＧＡＰ−４３ＲＮＡは、周産期間よりも
有意に少量ではあるが、ＧＡＰ−４３蛋白か成体ラット
皮質中に存続するという観察と一致している［ヤコブソ
ン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）ら、／ヤーナル・イソ・ニュー
ロサイエンス（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ）、６１８
４３ （１９８６）］。ＧＡＰ−４３発現の持続は、成
体神経系における進行役を示唆している。ＧＡＰ−４３
から電気泳動的および抗原的に識別不可能なリン蛋白で
あるＢ−５０およびＦｌの特性は、成体神経組織におい
て評価されてきた。これらの蛋白は、プロティンキナー
ゼＣ様酵素に対する基質として働き、そのリン酸化は、
神経ペプチド、神経伝達物質、および長期相乗作用期間
によって調節される［ヤコブソン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）
ら、ンヤーナル・イソ・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉ、） ６：１８４３（１９８６） ；アロ
ヨ（Ａｌｏｙｏ）ら、ジャーナル・イソ・ニューロケミ
ストリー（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、 ） ４１ ：
６４９（１９８３） 、ツハイヤーズ（Ｚｗｅｉｅｒ
ｓ）ら、ｐｒｏｇｒ、 ＢｒａｉｎＲｅｓ、 ５６：４
０５ （１９８２）］。成体のＧＡ−１”４３調節か遺
伝子発現における変化によっても生じるか否かは知られ
ていない。成熟動物におけるＧＡＰ４３の機能に関する
１つのモデルとして、ンナブス交替［コツトマン（Ｃｏ
ｔｍａｎ） ラ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２２
５：１２８７ （＋９８４）］、および神経末端での構
造成長によって伴われる学習のような他の神経系の「形
成性の（ｐｌａｓｔｉｃ）Ｊ変化［ヘイリー（Ｂａｉｌ
ｅｙ）およびチェノ（Ｃｈｅｎ） 、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ） ２２０：９１ （１９８３）］における
進行役か挙げられる。 実施例■ ヒトＧＡＰ−４３についてのｃＤＮＡのクローニング 試験方法 組織入手 剖検時および死後１０時間以内のヒト脳組織を新しく入
手した。特定領域から得た２Ｘ２Ｘ０５ｃｚ以下の脳の
細片を、トライアイスで冷却したイソペンタン（２〜メ
チルブタン）中でスナップ凍結し、次いて、−９０°Ｃ
て貯蔵した。これらの標本は、ｉｎ ５ｉｔｕハイブリ
タイセーノヨンおよび免疫細胞化学のために用いた。さ
らに、新しく、または該凍結試料から得た同一領域から
の組織の小さい部分を、ノーサンプロット分析のために
用いた。凍結ブロックと直接隣接しているホルマリン固
定化、パラフィン−包埋した組織において、通常の組織
学を行った。 １日令の脳幹および７日令の小脳のｃ Ｉ） Ｎ Ａラ
イブラリー［両ライブラリー共に、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクンヨン（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐ
ｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）からのも
のであった］から］ヒ１−ＧＡＰ−４３ｃＤＮＡを単離
した。これらのライブラリーを、３２Ｐ−手票識化ラッ
トＧ Ａ Ｉ）４３ｃＤＮＡプローブてスクリーニング
した１カーンズ（Ｋａｒｎｓ）ら、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ） ２３６：５９７ （１９８７）］。ハイブ
リタイセー／ヨンは、４×標準ク工ン酸添加生理食塩水
（ＳＳＣ）、０８×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）、
１０％硫酸デキス［・ラン、４０％ホルトアミド、Ｉｎ
（ｌ当たりニシン精工ＤＮＡ２０μ７．７ｇＭｈリス（
Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７、６）、１％ＳＤＳ、および１０６
ｃｐｍ／ ｒｎＱのプローブ中、４２°Ｃて１６時間で
行った。フィルターを、オートう／オグラフィー前に、
室温て２ＸＳＳＣ１５３°ＣでｌＸ５ＳＣ１次に、再度
６０°Ｃて１×８ＳＣ中で、充分に洗浄した。陽性クロ
ーンをｐＧｅｍ３Ｚ［プロメカ・バイオチク（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）１およびＭ１３ｍｐ１８の両方
の中て継代クローンし、鎖成長停止反応方法Ｅサンガー
（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロ／−ティンゲス・イン・す／
ヨナル・アカテミー・イン・サイエンス・ニーニスニー
（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｊｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ） ７４：５４６
３ （１９７７）Ｉによって配列決定した。ｕｗｃｃｃ
ｒユニバージティー・イン・ウィスフンンン・ジェネテ
ィクス・コンピューター１グループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ％’１ｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）］ソフトウエアバノケー
／によってＤＮＡ配列を分析した。 ノーサンプロット分析 チオシアン酸グアニジン法［チャーブウィン（Ｃｈ ｉ
ｒｇｗ ｉ ｎ）ら、バイオケミストリー（ＢｉＯｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）１８：５２９４ （１９７９）］によ
って剖検したヒト組織から全細胞ＲＮＡを単離した。ノ
ーサンフロノドのために、各組織からの全ＲＮＡｌ０μ
？を変性し、１．２％アガロース−ホルムアルテヒ！−
ケルで泳動させ、ｌ ０ＸＳＳＣ中、ンーンスクリーン
（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ） ｌニュー・イングランド・
ニュークノア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ）ｌまたはナイトラン（Ｎｙｔｒａｎ）ｌニュ・アン
ト・ニス（Ｓ ｉ ｓ）’ｌに移し、紫外線架橋させ、
任意に準備した［ファインノ＼−グ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ
）およびホーケルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｉｅｉｎ）、
アナソテイカル・ノ１イオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、） １３２：６ （１９８３）１ヒ１−
ＧＡＰ−４３ｃ １．：） Ｎ ＡクローンＣ１ａと一
緒に４２°Ｃて一晩ノ＼イブリタイズした。最後にフィ
ルターを、６０°Ｃて、０１％ＳＤＳて１ｘＳＳＣに洗
浄した。Ｃ１ａてプローブした後、フィルターを細片化
し、対照とし、てラノトグリセルアルテヒドー３−ホス
フｙ−−１〜−テヒトロケナーセ（ＧＡＰＤＨ）ｃＤＮ
Ａ クローン［ビーチャフライク（Ｐｉｅｃｈａｃｚｙ
ｋ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）４２：５８９ （１９８５）
ｌて再プローブした。 ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセーシヨンヒト脳糺織の低
を品槽切片標本を４％パラホルｔ・アルデヒ）・中で固
定し、０３％トリトンＸ−１００で処理し、次いて１μ
ｙ／ ＭＱブロテイナーセにで処理し、アセチル化し、
５０％ポルムアミド／２ＸＳＳＣ中−Ｃブレハイブリダ
イス（−だ。５０’Ｃて５時間、湿気のあるチャンノ＼
−中、スライド当たり２ Ｘ Ｉ Ｏ’ｃｐｍの３Ｌ′
Ｓ−標識化ア゛／チセンスまたはセンスリホブローブ［
ノルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｃｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ． １２ニア０３５（１９８４）］を用
いてハイブリタイセーンヨンを行った。次いて、組織切
片標本を、最初に５０％ホルムアミドを含有しており、
次いて５０％ホルｔ・アミド＋０１％（・リドン（Ｔｒ
ｉｔｏｎ）Ｘ Ｘ ］ Ｏ Ｏを含有している１０ｍＭ
／チオトレイ）・−ルを有する２ＸＳＳＣ中で洗浄した
。５ ０ １１’ｉ／ｍＱ Ｒ Ｎ Ａａｓｅ Ａて処
理することによって、−重鎖ＲＮＡを取り出した。 該切片標本を、さらに２時間、ｌｘＭＤＴＴを有する２
ＸＳＳＣ中で洗浄し、次いて、０．３Ｍ酢酸アンモニウ
ムを含有する楼準アルコール（ｇｒａｄｅｄ ａｌｃｏ
ｈｏｌｓ）によって脱水した。Ｎ Ｔ Ｆ３ ２コタノ
ク（Ｋｏｄａｋ）エマルノヨンを用いて、放射能活性信
号を検出した。エマル／−３ン塗布したスライドをー＼
マトキ／リンで対比染色した。 結果 ヒｌ− Ｇ Ａ Ｐ − ４ ３はマウスカルモノニリ
ン結合タンパクと相同である 実施例１に記載のとおり、うｙ ｈ Ｇ Ａ Ｐ −
４ ３に関するｃＤＮＡをクローンし、プローブとして
用いて、ヒト脳幹および小脳ライブラリー由来の関連す
るｃＤＮＡ クローンを同定した。各ライブラリーから
重複しているクローンか得られ、これらは重複領域中で
一致していた。最長クローンの配列（小脳ライブラリー
由来Ｃ１ａ）を第５図Ａに示し、第５図Ｂにおいてラッ
トＧＡＰ−４３との比較を示した。Ｐ−５７と称する神
経特異性マウスカルモンユリン結合タンパクとＧＡＰ−
４３との同一性は、シムシー（Ｃｉｍｌｅｒ）らのジャ
ーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）２６２・１２１５８ （１
９８７）によって開示されたので、第５図Ｂにおいて配
列を示す。Ｐ−５７は、カルシウムレベルか上がるとカ
ルモゾュリンを結有するよりもむしろ放出するという例
外的な特性を有する神経特異性力ルモンーリン結合蛋白
として開示されている［アントリーセン（Ａｎｄｒｅａ
ｓｅｎ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ） ２２：４６１５ （１９８３）’、。 該蛋白は、ヒト、ラットおよびマウスの間でかなり維持
されている。例えば、ヒトおよびマウス間のアミノ酸の
同一性は８９％である。さらに、第５図Ｃに示す２つの
効果的に望ましいステム−ループ構造を含む３゛−非翻
訳領域間の維持は異常に高く（８０％）、これは、他の
遺伝子との類似性によって、メツセンジャーＲＮＡ安定
性を調節するのに役立つＵｊＪ−ヘス（Ｒｅｅｖｅｓ）
ら、プロシーティンゲス・イン・ナショナル・アカテミ
ー・イン・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔ １． Ａｃａｄ、 Ｓｃ １ＵＳＡ） ８３：３
２２ｇ （１９８６） ； ンヨ（Ｓｈａｗ）およびカ
メン（Ｋａｍｅｎ）、セル（Ｃｅ１１） ４６：６５９
（１９８６）］。 ＧＡＰ−４３発現は成人ヒト脳の孤立性領域において持
続する ＲＮＡ分解を最小にするために、死後１０時間以下の患
者から脳組織を得た。隣接する切片標本を組織病理学的
に試験した。８日令および７力月令の２乳児において、
ノーサーンブロノトによって評価すると、脳の至る所て
ＧＡＰ−４３か均一に健全に発現されていた。試験した
領域は、小脳、側頭皮質、側頭連合皮質、前頭皮質、眼
窩前頭皮質［野（Ａｒｅａ） １１ ］、海馬、視覚皮
質（野１７／１８）、およびを髄を含んでおり、幾つか
の例を第６図に示す。これらの令では、脳に対して、を
髄のレベルは低く、これは、この領域の早期成熟に関連
し得る［アナンド（Ａｎａｎｄ）およびヒキ（Ｈｉｋｅ
ｙ）、ニュー・イングランド・／ヤーナル・イン・メデ
イアン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、） ３１７：
１３２１ （１９８７）］。ＧＡＰ−４３は、新生児ま
たは成人のいずれにおいても試験された如何なる非ニュ
ーロン組織（腎臓、肺、肝臓および副腎を含む）におい
ても発現されなかった。正常な成人部において、ＧＡＰ
−４３発現は、様々な領域間で顕著に変化した。例えば
、３つの脳において、ブロードマン野１１（ｌ］ｆｆｌ
！前頭回）ては、新生児に匹敵するレベルか見られ、視
覚皮質（野１７／１８）では非常に低いレベルで発現し
た。海馬ては、一致して低いレベルてあった。ｌｆｆ１
体ラット海馬は、ＧＡＰ−４３に富んでいるので、後者
は興味深いものである。同様の分布か不ヘイ（Ｎｅｖｅ
）のＭｏ１ｅｃ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、 ２：１７７
（１９８７）によって近年報告された。 虚血性損傷後、再開されたＧＡＰ−４３発現死前ｌＯ〜
１４日に生じた小さい臨床的無症状梗塞（ｓｍａｌｌ
ｃｌｉｎｊｃａ］ｌｙ ５ｉｌｅｎｔ ｊｎｆａｒｃｉ
ｓ）を有する２人の患者からの脳組織を試験した。これ
らの亜急性梗塞を特徴付ける組織病理学的特徴としては
、以下のものか挙げられる ［１］梗塞形成組織と無傷
組織との間の鮮明なデリニエー／ヨン［２］ニユーロン
の喪失：［３］単核炎症細胞とリン１！マクロフアージ
による壊死組織の浸潤、および［４〕梗塞の縁にｔＱっ
だ線維性星状細胞の活性化。ある−人の患者は、視覚皮
質（野１７）に梗塞かあり、他の患者には、頭頂葉（野
３．１．２．５）に梗塞があった。該組織をノーサーン
分析に用い、ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセー／ヨンは
、梗塞形成組織および同一のブロードマン野からの周囲
の正常な脳の両方を含んだ。第７図Ａは、野１７におけ
る発作の後、ＧＡＰ−４３発現か、成人においてＧＡＰ
−４３か通常最も富んでいる領域である野］１に匹敵す
るレベルまて増加することを示す。第７図Ｂは、２つの
正常な脳からの野３、１．２．５におけるＧ Ａ Ｐ
−、−４３レベル（レーン１および２）かその場所で小
さな発作を有する別の患者（レーン３）と比較して低か
ったことを示す。 これらの観察は、Ｇ Ａ ｐ−４３か虚血性梗塞後、数
日以内増加することを示唆する。 上述のとおり、ＧＡＰ−４３は、その発現において二、
ニーロン制限され、ニューロンは梗塞した領域には存在
しないので（第８図Ａ１、Ｂ）、おそらく、ＧＡＰ４３
発現の増加は形態学的に無傷のニューロンから誘導され
たのであろう。この仮説を試験するために、ｉｎ ５ｉ
ｔｕハイブリタイセー／・フンを用いて、梗塞形成領域
におけるＧＡＰ４３発現の分布を研究した。、ＧＡＰ−
４３発現の詳細な細胞解剖学を実施例３に記載する。ノ
ー叶−ン分析から予想されるように、視覚皮質（野１７
）を含んでいる成人大脳皮質のはとんとの領域の全体に
わたって、ＧＡＰ−４３を発現した細胞かほんの少した
け散乱していた（第８図Ｃ）。率直に島って、壊死領域
はアンチセンスおよびセンスプローブの両方と非特異的
に結合したか、視覚皮質の梗塞領域において、特胃的な
ＧＡＰ４３発現は見られなかった（第８図Ｄ、第８図Ｇ
）。他方、隣接する形態学的に正常な野１７（第８図Ａ
２）において、本質的に、全てのニューロンかＧＡＰ４
３発現を明示しく第８図Ｅ、第８図Ｆ）、梗塞した組織
と隣接する領域か増加したＧＡＰ−４３発現の起源であ
ることを確認した。 Ｇ Ａ Ｐ −４，３発現による梗塞を伴わない一時的
虚血の影響も吟味した。大脳皮質および海馬のツマ−セ
クター（Ｓｏｍｍｅｒ’ｓ ５ｅｃｔｏｒ）のような脳
のある領域におけるニューロンは、特に層流低下による
場合、虚血性および低酸素発作に対して選択的に傷つき
易いことを証明する１ブリアーリー（Ｂｒｉｅｒｌｅｙ
）およびグラハム（Ｇｒａｈａｍ）、グリーンフィール
ズ・ニューロパソロンー（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｓＮ
ｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、第４版、アタムス（Ｊ
、 Ｈ，Ａｄａｍｓ）、コーセリス（Ｃｏｒｓｅｌ ｌ
ｉｓ、 Ｊ、 Ａ、 Ｎ、 ）、およびタデエン（１
）ｕｃｈｅｎ、 Ｌ、 Ｌ ）、Ｅｄｓ、 、 ニドワ
ード・アーノルト（Ｅｄｗａｒｄ Ａｒｎｏｌｄ）、ロ
ンドン、１９８４、ｐｐ、 １２５−１５６１゜このタ
イプの損傷は一時的なものであり、数週間以内て完全な
回復か起こり得る。ｌｎ ５ｉｔｕ ／・イブＪタイセ
ーン１ンを用いて、全無酸素症を付随した心拍停山をし
ブ計−人の患者の大脳皮質を試験した。該但者は数日後
に死亡し、剖検て、梗塞を伴わない無酸素性脳障害の形
跡かあった。これは、散乱した多数の核ｌ農縮（賭く縮
んだ）ニューロンまたは水ｌｉ＠ｉ（膨張した）ニー□
−ロンの存在ならひに大脳皮質、海馬および小脳におけ
る神経網の空り包形成によって証明された。小脳におい
て、虚血性プシ牛ンエ細胞は、水腫性であり、無色であ
った。 第ε〕図Ｂに示すとおり、小脳において、主に、正瓦な
成人においてｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセーノヨンに
よ−）て検出［１Ｊ能なＧ Ａ Ｐ −４３発現を伴わ
ないことかわかった領域であるプルキンゴ細飽層におい
て、ＧＡＰ４３発現の著しい増強かあった（第９図Ａ）
。 考察 成長内照は、？１１２杆を発育および再生させることに
３）−・で１ｆｒｔｈ）れた神経木端構造である［例え
ば、レイモン・イ・力／トル（Ｒａｍｏｎ ｙ Ｃａｊ
ａｌ）、］−テ／、ｘ不レしンヨン・アンド・リンエ不
し−ノヨン・Ａブ０す１ナーバス０システム（Ｄｅｇｅ
ｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ）へオノ
クスフォード・ユニバーンティー・プレス（Ｏｘｆｏｒ
ｄしｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ ＰｒｅｓＳ）、ロントノ（＋
９８２） 、ケイタ（Ｋａｔｅｒ７およびレトウアノイ
（１，ｅｔｏｕｒｎｅａｕ）、 ハイオロノー・イン・
す・ナーブ・グロース・コーン（Ｂｉｏｉｏｇｙ ｏｒ
ｔｈｅ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｅ）ｊ
、アラン１アール・リス・インフーヂレイテｙ ）”（
Ａｌａｎ Ｒ１、ｉｓｓ、 Ｉｎｃ、 ）、ニューヨー
ク （１９８５）ｌ。これらは、局部情報の連動性およ
び変換に関するＲ械装置を含んでおり、体細胞からの運
搬によって決定されたタンパク成分を有する。Ｇ Ａ
Ｐ −４３は、迅速に運搬されたタンパクの１つてあり
、これは、神経を発育および再生させる際に、軸木運搬
における明確な質の同士かＳＪ３’ｌである。再生ずる
へき哺乳動物ＣＮＳ二４ユーロノの欠損は、成人脳にお
ける低く誘導できないレベルのＧＡＰ−１４３と結びつ
け、：、れた］スキ一二（Ｓｋｅｎｅ）、セル（Ｃｅｌ
ｌ） ３７：６９７ （１９８４）ｌ。すなわち、もち
ろん、ＣＮＳ損傷および発作の治療において遭遇する問
題のために、ヒトにおいてこのタンパクの調節を研究す
るのは、特に興味深いものである。 ＧＡＰ−４３および成長円錐 ＧＡＰ−４３は、ラットとヒトの間で非常に保存持され
、周囲のカル７ウムが増加するとカルモジュリンを放出
する異常な特性を有するカルモジュリン−結合タンパク
として近年同定されたマウスタンパクに明らかに匹敵す
る［アンドリーセン（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ）ら、バイオ
ケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ２２：４
６１５ （１９８３） ；シムシー（Ｃｉｍｌｅｒ）ら
、ジャーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（
ＪＢｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） ２６０：１０７８４ （１
９８５） ；アレキサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）ら
、ジャーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） ２９２：６１０８ （１
９８７）］。上記著者らによって示唆されたように、成
長円錐におけるその役割に関する概念は、カルモジュリ
ン活性を調節すること、および局所的細胞ドメインにお
いてそれを放出することによってそのようにすることで
ある。すなわち、カルモジュリンに対するＧＡＰ−４３
の結合性は、例えば、活動電位の後、カルシウムか上昇
すると減少するであろう［ビラーデティ（Ｂｅｌａｒｄ
ｅｔｔｉ）ら、プロシーティンゲス・イン・ナショナル
・アカデミ−・イン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、５ｃｉ） ８３ニア０９４（１９８６）］
。そのために、成長円錐のカルモジュリン依存活性は、
カルシウム入口のすく近所の範囲内で調節することがで
きる。 成人におけるＧＡＰ−４３ ＧＡＰ−４３発現は、発育の間に非常に調節される。一
般に、最高レベルは、軸索伸ひ率のピークの期間とよく
相互関係をもつ。しかし、成熟脳の個々の領域における
高いレベルの発現は、ＧＡＰ−４３かいくつかの成体ニ
ューロンにおける進行役を有することを示唆している。 １つの可能性は、ＧＡＰ−４３発現か、特に神経末端で
、それらの構造を改造する際に活発に従事した細胞を示
すことである。これに関する証拠は、ラットにおいて、
ＧＡＰ−４３を発現する成体ニューロンか海馬ニューロ
ンおよび嗅球の僧帽状細胞を最も顕著に含んでおり、実
際に、該ニューロンは、成体においてそれらの末端を改
造することである。ヒト海馬は、低いレベルでのみＧＡ
Ｐ−４３を発現し、ＧＡＰ−４３が実際にこのような構
造上の改造の標識であるとすれば、ヒト脳の様々な領域
かこの機能を保持していたことを示唆している。ＧＡＰ
−４３について提案された他の機能は、そのホスホリル
化状態が長期相乗作用の結果として変化するので、学習
である［ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）およびルッテンバー
グ（Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅｒｇ）、イクスペリメンタル・
ニューロロシー（Ｅｘｐ、Ｎｅｕｒｏｌ、） ８９：２
Ｆ（１９８５）〕。実際に、構造上の改造は、長期学習
の一面てあり［チャン（Ｃｈａｎｇ）およびグリーナフ
（Ｇｒｅｅｎｏｕｇｈ）、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、 ３０
９：３５ （１９８４） ；ゲレ。 ト （Ｇｏｅｌｅｔ） ら、不イーチャ（Ｎａｔｕｒ
ｅ） ３２２：４１９（１９８３）Ｊ、神経末端領域の
成長は、アプリシア（Ａｐｌｙｓｉａ）において長期学
習を伴うことが立証された［ヘイリ（Ｂａｉｌｅｙ）お
よびチャン（Ｃｈａｎ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
） ２２０：９１ （１９８３）］。すなわち、１つの
興味をいたかせる可能性は、長期学習に関する構造上の
形成性を使用する成人脳のニューロンがＧＡＰ−４３を
発現するものであるということである。この可能性は、
不ルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）およびル、テンバーグ（Ｒｏ
ｕｔｔｅｎｂｅｒｇ）のイクスペリメンタル・ニューロ
ロシー（Ｅｘｐ、 Ｎｅｕｒｏｌ、） ８９：２１３
（１９８５）、ヤコブソン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）らのジ
ャーナル・イン・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ、） ６：１８４３ （１９８６）、および不ペ
イ（Ｎｅｖｅ）らのＭｏ１ｅｃ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ。 ２：１７７ （１９８７）を含む焼入かの研究者らによ
って検討されており、本研究は、これらの示唆と一致す
る。この提案は、種々の疾患状態とＧＡＰ−４３発現と
の密な相互関係を必要とするであろう。 成体ＣＮＳにおけるＧＡＰ−４３および修復ＣＮＳ損傷
からの回復による抑制は、あまり理解されていない。哺
乳動物の末梢神経または両生動物の中枢神経てさえ、切
断の後、完全に回復するか、これに反して、哺乳動物の
中枢神経におけるこのような損傷は回復しない。中枢神
経は、カイトとしてそれらか末梢神経鞘を有する限り、
軸索切断の後、長い距離伸びるので、成体ニューロンは
、成長する能力を維持−・Ｖる［ヘンフェイ（Ｂｅｒ＋
ｆｅｙ）およびアグア３ （Ａｇｕａｙｏ）、ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ） ２９６：１５０ （１９８２）Ｉ
ｏ修復の失敗は、末梢神経系とは反対に、中枢神経系に
おいては、軸索運搬タンパクのグループにお（′Ｉる異
なる調節抑制に起因していた。特に、ＧＡＰ−４３か関
係しているのは、そのレベルか正常な成長および回復力
に非常に匹敵しているからである［スキーニ（Ｓｋｅｎ
ｅ）、セル（Ｃｅｌｌ） ３７：６９７（１９８４）］
。本発明者らは、あるタイプの刺激の後で、成熟ニュー
ロンか高いレベルてＧ Ａ Ｐ −４３を発現すること
かできるということを示した。 一時的な虚血性および大脳梗塞のような疾患は、軸索切
断の後、障害か永久であるか、これに反して、臨床学的
回復かこのような病変の後にしばしば生じ、るので興味
深いものである。神経学的回復か損傷１１１１ ＩＩ包
の修（Ｕによって誘導されるかまたは近隣の無傷Ｉ’ｌ
ｌ胞の発生に、ｋ ７＋で誘導されるかは、臨床病理的
＋ＨＬＩ関係によって識別することはできない。高し△
、ルのＧＡＰ−４３を発現するニューロンど細胞死領域
との間の距離は、発芽を色味し得ることを示唆する。他
方、これらの場合に観察されるＧＡＰ−４３の増加は、
体幹の虚血性影響から誘導され、該影響は、軸索切断の
間にはあまり生しないらしい。例えば、これらは、興奮
性アミノ酸の放出および結果として起こる＼□−メチル
Ｄ−アスパラギン酸ｉｆＫ（ＮＭＤＡ）レセプター興奮
を含む［オル不イ（Ｏｌｎｅの、イクスベリメンタル・
アンド・クリニカル・ニューロＩ・キノコロ／−（Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｎ
ｅｕｒｏｔｏｘｉｅｏｌｏｇｙ）、スゝン！ −（Ｐ、
Ｓ、 ５ｐｅｎｃｅｒ）およびンヤウンノ＼−グ（Ｈ
，Ｈ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ）、ｅｄｓ、 （ハルテ
ィモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、ＭＤ ウィリアムズ
（！ｉｌｌｉａｍｓ）およびウィルキンズ（Ｗｉ １ｋ
ｉｎｓ）、ｐｐ、 ２７２−２９４ （１９８０） ；
ａスマン（Ｒｏｔｈｍａｎ）、ツヤ−ナル・オフ・ニ
ューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ４：１
８８４ （１９８４）Ｉ。 宋−数例１− 精製したＧ Ａ Ｐ −４３タンパクに対して指向する
抗体を用いるＧＡＰ−４３Ｒ現の検出光の免疫組織化学
研究は、特に成長し２ている神経系において、Ｇ Ａ、
Ｐ −４３か神経突起に限定されることを示唆してい
た１へ／つ゛イ２・ノ（Ｂｅｎｏ★１ｔｚ）う、Ｅ／ヤ
ーナル・オフ゛・二−ユーロ→ナイエンス（１゜Ｎｐｕ
ｒｏｓｃｉ、） ８：３３９−３５２ （１９８８）：
ノスペ７ （Ｇｉｓｐｅｎ）ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、
３２８：３８］−３８５（１９８５） ：メイツ（Ｖ
ｌｅｉｒｉ）ら、ブロン−ティンゲス・インφナノヨナ
ル・アカテミー・オフ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ） ８３
：３５３７−３５４１ （１９８６） ：スヰ一二（Ｓ
ｋｅｎｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３ニ
ア８３−７８６ （１９８６）］。本実施例において、
ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセーンヨンおよび神経細胞
形質染色（ｐｅｒｉｋａｒｙａｌ ｓｔ、ａｉｎｉｎｇ
）を示すＧＡＰ４３にｌ＝１する新規な抗体を用いて、
本発明各らは、Ｇ Ａ Ｐ −４３を発現する細胞個体
８Ｔを同定し、成体脳において、広＜？−’ｉき渡った
Ｇ Ａ Ｐ −４３免疫反応性軸索か；ニーロンの比較
的小さい個体群から発散され、このほとんとか局部的に
制限されることを小す。 方法 ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセー／３ンおよび免疫細胞
化学のために用いる組織を新しく入手し、トライアイス
によって冷却された２−メチルブタン中てスナップ凍結
した。使用直前に、適当な固定液を用いて低温槽切片標
本を固定した。胎芽うノｔ□（Ｅ）（１２，１５，１８
および２０日令）、生後発育しているラット（Ｐ）（１
，７および１４日令）および成体ラット由来の脳とを髄
を同時に研究した。 該組織を４％バラホルムアルテヒ）・中で［固定し、０
．３％トリトンＸＩＯ○て処理し、次いて１μ９／ｖ＝
Ｑプロテイナーセにで処理し、アセチル化し、５０％ホ
ルムアミ］／２Ｘ標準クエン酸添加生理食塩水（ＳＳＣ
）中でブレハイブリタイズした。 プローブは、」−記のとおり、ｃ Ａｐ −４３アンチ
センスＲＮ Ａの１１２１塩基てあ、った。５０°Ｃて
５時間、ｉｆｆ気のある千ヤンハー中、スライド当たり
２ Ｘ ］ ００６ｃｍの″Ｓ−標識化アンチセンスま
たはセンスリホプロ・−ブを用いてハイブリタイゼージ
ョンを行った。次いて、組織切片に本を、最初に５０％
ホルムアミドを含有しており、次いて、５０％ホルムア
ミド＋０１％トリトン−Ｘ１００を含有している１１０
ｌ１１ンチオトレイトールを有する２ＸＳＳＣ中で洗浄
した。５０μ９／ ｘ（ＩＲＮＡａｓｅＡで処理するこ
とによって、−重鎖ＲＮＡを取り出した。該切片標本を
、さらに２時間、１ｍＭＤＴＴを有する２ＸＳＳＣ中で
洗浄し、次いて、０．３Ｍ酢酸アンモニウムを含有する
標準アルコール（ｇｒａｄｅｄ ａｌｃｏｈｏｌｓ）に
よって脱水した。 ＮＴＢ２ コタノク（Ｋ ｏｄａｋ）エマルジョンヲ
用いて、放射能活性信号を検出した。エマルジョン塗布
したスライドをヘマトキシリンおよびエオシンで対比染
色した。 ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセーンヨンのために用いた
ものと隣接する組織切片標本を免疫組織化学のために用
いた。λｇｔｌｌ中で発生したキメラＧＡＰ４３−β−
カラクト／ターセ融合タンパクを注射したウサキにおい
て、ポリクローナル抗血清か高められた１カーンズ（Ｋ
ａｒｎｓ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３６
：５９７−６００ （１９８７） ：ヤング（Ｙｏｕｎ
ｇ）ら、プロソーティンゲス・オプ・ナショナル・アカ
テミー・イン・サイエンス・ニーニスニー（ＰｒｏｃＮ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ） ８０：１１９
４−１１９８ （１９８３）］。硫酸アンモニウム分画
法オよびＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーによっ
て、粗血清を処理した［ホロウ゛イソツ（Ｈｏｒｏｗｉ
ｔｚ）ら、ファンクメンタル・テクニクス・イン・ハイ
ロロシー（ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、ｐｐ、 ２９７−３１
５１゜新生児ラット脳から調製した成長円錐膜粒子を用
いて［フェニンカー（Ｍｅｎｎｉｎｇｅｒ）ら、セル（
Ｃｅｌｌ） ３５：５７８５８４ （１９８３）］、ウ
ウェスターンプロト９析法［メイツ（Ｍｅｉｒｉ）ら、
ブロン−ティ／ゲス・イン・す／ヨナル・アカデミ−・
イン・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｉＳＡ） ８３：３５３７−３
５４１ （１９８６）］によって該抗体を検査した。ウ
ェスターンプロ、トは、アルカリホスファターセ／ＢＣ
Ｉ Ｐ／ＮＢＴ キット「プロメカ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
］を用いて展開させた。ウェスターンプロ、ト検査法
において結有する抗体の特異性は、新生児う、ト脳から
精製されたＧＡＰ−４３タンパクによる予備吸収によっ
て示された［チャン（Ｃｈａｎ）ら、ンヤーナル・オプ
・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ６
：３６１８３６２７ （１９８６）］。ＧＡＰ−４３タ
ンパクは、クロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）として３
−３°ジアミノベンジジンおよび対比染色としてヘマト
キンリンを用いて、アビジン−ビオチン西洋ワサビペル
オキンターセ複合法［フス（Ｈｓｕ）ら、ジャーナル・
イン・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリ
ー（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）
２９：５７７−５８０ （１９８１）］を使用する免疫
組織化学染色によってＣＮＳ組織において示された。標
識化の特異性は、新生児う。 ト脳由来の精製した天然ＧＡＰ−４３タンパクと一緒に
第１抗体をブレインキュベートすることによって確認さ
れた。 糀果 １２および１５日令の胎芽て、ＣＮＳにおけるＧＡＰ−
４３ｍＲＮＡ発現は低いか、抜根神経節のニューロンは
、その軸索成長のピーク期間に応じて極度な標識化を呈
した。Ｅ２０で、ＧＡＰ４３レベルは、脳の全体に渡っ
て均一に、かつ著しく高かった。出生後生活期間第１週
の間、高レベルの発現か維持されたか、Ｅ２０およびＰ
ｌで観察された拡散した標識化に対照して、Ｐ７ラノト
の脳において、個々のニューロン上での別々の標識化は
、神経網の広がりおよび神経膠素子の成長によって、正
しく評価することかできた。最もよく試験することがで
きるように、全てのニューロンをこの年令で標識化した
。Ｐｌ４ては、ＧＡＰ ４３ｍＲＮＡ発現は、−船釣
な／グナルの強さか低く、皮質ニューロンの５０〜７５
％だけか標識された。 成体ＣＮＳにおいて、ＧＡＰ−４３は、はとんとの大脳
皮質の全体にわたって、拡散された細胞だけか標識化さ
れる程度の比較的少ないニューロンにおいて発現され、
標識化の強度かＰｌ４脳と比較して顕著に低下した。し
かし、内側嗅皮質（ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ ｃｏｒｔｅ
ｘ）は、適度に高い密度のＧＡＰ−４３−発現ニューロ
ンヲ有シタ。ニューロンの濃い局所的標識化は、Ｐ１４
ラットのを髄、脳幹、および小脳においてまた存在して
いるが、成体においては、ＧＡＰ〜４３−発現ニューロ
ンか、これらの領域において存在しないかまたは非常に
低い密度で存在するかのいずれかであった。しかし、成
体において、はとんとのニューロンの極度の標識化か海
馬および四球の２つの領域に維持された。海馬における
標識化のパターンは、歯状間、ＣＡＩおよびＣＡ３の全
体にわたって、ニューロンかＧＡＰ−４３ｍＲＮＡを発
現したことを示した。四球において、主に、高レベルの
ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡを含有する僧帽状細胞領域てあ−
った。 免疫組織化学によるＧ Ａ Ｐ−４３−発現の観察λｇ
ｔｌ］中て生りるキメラＧ Ａ Ｐ −４３−β−カラ
ク１−ンターセＥＡ合タンパクにＸ＝ｊするウカーキボ
リク
に詳しくは、本発明は、哺乳動物Ｇ Ａ Ｐ４３、ニュ
ーロン成長関連蛋白のｃ Ｄ Ｎ 、Ａ配列および対応
するアミノ酸配列に関する。さらに、本発明は、ＧＡＰ
−４３の発現を調節し、それにより軸索成長を調節する
方法、および原核生物または真核生物宿主細胞または生
物においてＧ 、Ａ Ｐ４３を産生する方法に関する。 さらに詳しく述へれば、本発明は、ＧＡＰ−４３の膜結
合および成長円錐富化を調節でき、かついずれの所望の
蛋白またはポリペプチドをもニューロンまたは非ニュー
ロン細胞の膜に対して定方向化できるＧ Ａ Ｐ４３由
来の新規な膜ターゲツテイング（ｍｅｍｂｒａｎｅｔａ
ｒｇｅｔ ｉｎｇ）ペプチドに関する。また、本発明は
、ＧＡＰ−４３およびそれらから誘導された生物学的に
活性なペプチドか内部調節蛋白（ＩＲＰｓ）として機能
し、細胞機能を細胞内的に変調するように作用すること
ができる。また、本発明は、とりわけ、ヒ１〜を含めた
動物における神経学的徴候において、ＧＡＰ−４３およ
びその調節および膜ターケアティング要素の臨床的なｉ
ｎ ｖｉｖｏおよび１ｎｖｉｔｒｏての診断および治療
適用に関する。 （従来の技術） Ｇ Ａ Ｐ −４３は成長する軸索を特異的に特徴付け
る蛋白の１つである（スケ不（Ｓｋｃｎｅ）、セル（Ｃ
ｅｌ ］）３７ ： ６９７（１９８４）；メイツ（Ｍ
ｅｉｒｉ）、ビイ・ｘヌ−ｘイ・ｘス（ｉ〕ＮＡｓ）Ｕ
ＳＡ８３ ： ３５３７（１９８０））。軸索により輸
送される蛋白は全細１１’＝、２蛋白のうら小さい→ブ
セ、１−であり、こＡ１らのらち少お（か、そのレー・
ルか軸索成長を直接に媒介寸−ると乙えることかできる
ように変化するースケ不お３上びライリアー ｌ”（Ｓ
ｋｐｎｅ ａｎｄζ１ｌｌｉａｒｄ）、ンヤーナル・オ
フ・セリュラー・バイオ０／−（Ｊ、 Ｃｅ１１． Ｂ
ｉｏｌ、）８９ ： ８６（］ ９８１）：ヘノウイッ
およびリューイス（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｌｅｗ
ｉｓ）、ンヤーナル・オフ・ニューロサイエンス（Ｊ、
Ｎｅ＋）ｒ。 ５ｃｉｅｎｃｅ）３：２１５３（１９８３）；スケ不（
Ｓｋｅｎｅ）、セル（Ｃｅｌｌ）３７ ： ６９７（１
９８４）；メイツ（Ｍｅｉｒｉ）、ビイ・エヌ・エイ・
ニス（Ｐ！１ＡＳ） Ｕ Ｓ Ａ８３ ： ３５３７（
］ ９８６））。こ４１らの分子のいずれかが構造変化
を媒介する直接の証拠は欠くか、ｃ Ａ Ｐ −４３は
（ｌ￥補として特に魅力的であるＣ というのは、それ
は、第一に成長円錐膜１戊要素であり、そこでは成長円
錐膜の内表面に結合し、蛋白キナーセＣについての基質
として働くからである（アロ３（へ１ｏｙｏ）、ツヤ−
ナル・オフ・二」−ロケミスドリー（Ｊ、 Ｎｅｕｒ
ｏｃｈｅｍ、）４１ ： ６４９（１９８３） エイ
カースおよびロウテンプルク（Ａｋｅ、、ｒｓａｎｄ
Ｒｏｕｔｔｅｎ−４−＋ｅｒｇ）、フレイン・り廿−チ
（ＢｒａｉｎＲｅｓ、）３３４： １４７（＋ ９８３
））。さらに、その）六（云−Ｊ−発現のレヘルは、命
田ｌ包槁養およびｉｎ〜１〜０双方において、軸索成長
に人いに関係−４−る（′・／（ｔ３ａｓｉ）、セル（
Ｃｅｌｌ）４９ ： ４８５（１９８７）ノノーンズ（
Ｋａｒｎｓ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３６
５９７（１９８７）；不へ（Ｎｅｖｅ）、モレキュラー
・プレイン・リサーチ（Ｍｏｌｅｃ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅ
ｓ、）２ ： １７？（］ ９８７）； トウ・う・モ
ーントら（ｄｅ ＩａＭｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ）、未発
表）。 成熟したヒ１〜中枢神経系（ＣＮＳ）における修ｉ宴の
欠如は手ごわい臨床的問題である。急性虚血または外傷
の後、再生の組織病理学的証拠は最小てあり、神経学的
回復は通常存在しないかまたは不完全である。他方、末
梢神経系のニューロンは、金魚またはヒキカエルのごと
き他の種のＣＮＳニューロンかそうであるごとく、再生
することか予測できる（スケ不およびウィラート （Ｓ
ｋｅｎｅ ａｎｄＷｉｌｌｉａｒｄ） 、／ヤーナルｅ
オフ争セリュラー曽バイオｏ ノー（Ｊ、 Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、）８９ ： ８６（１９８１）へノウィッお
よびリー↓−イス（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ ａｎｄｌ、（・
ｗｉｓ）、／ヤーナル・オフ・ニューロサイエンス（１
）へ（・＋」ｒｔ）ｓｃｉｃｎｃｓ）３ ： ２１ ；
−＋ ３（１９８３））。成１（哺乳動物Ｃ入８ニュー
コンの不応件についての１の説明は、成長に重装な分子
の不可逆的抑制であろう。特に、Ｇ Ａ Ｐ −４３は
再生に対して臨界的であると示唆されている（スケ不（
Ｓｋｃｎｅ）、セル（Ｃｅｌｌ）３７ ： ６９７（１
９Ｂ ４））。これについての証拠は成長円錐における
その富化（スｒ不（Ｓｋｅｎｅ）、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ） ２３３ ： ７８３（１９８６）；メイツ
（Ｍｅｉｒｉ）、ビイ・エヌ・エイ・ニス（ＰＮＡＳ）
Ｌ；Ｓ、Ａ８３ ： ３５３７（１９８６））および周
産期ＣＮＳとは月明的な成人におけるその最小発現（ス
ケ不およびウィラーＦ（Ｓｋｅ旧！ ａｎｄＷｉｌｌｉ
ａｒｄ）、／ヤーナル・オフ・セ１ノユラー・ハイオロ
ノ（Ｊ、 Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、）８９：９６（
］ ９８１）カーノズ（Ｋａｒｎｓ）、サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ） ２３６５９７（１９ε３７））を含む
。さらに、ＧへＰ７４３は、ヒキカエルまたは分色、視
神経または哺乳動物末梢神経のごとく、再生か可能なニ
ューロノニおける負傷のｉ友、高レベルまで増力口する
か、哺乳動物Ｃ＼８ニューロンにり、１する同様の負傷
のｉ（てはそゞ）はならない（スケイ、お、上ひウィラ
ート（Ｓｋｅｎｅ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｒｄ）、ンヤ
ーナル・オフ・セリュラー・バイオロジー（Ｊ、 Ｃ
ｅ１１． Ｂｉｏｌ、）８９ ： ９６（１９８１））
。 （発明か解決しようとする課題） 本発明者らは、ヒ）ＣＮＳ機能および病気におけるＧＡ
Ｐ−４３の役割を調−２た。ヒトＧＡＰ４３ ｃ ＤＮ
Ａをクローン化し、その発育および成人分布を死後組織
のアッセイによって調へた。高い周産期発現に加え、本
発明者らは、ＧＡＰ−４３発現は成人の不連続（ｄｉｓ
ｃｒｅｔｅ）領域に残存し、予期せぬことに急性虚血負
傷は、通常それか低い領域においても、ＧＡＰ−４３の
高い発現に関係することを見い出した。 （課題を解決するための手段） 哺乳動物ＣＮＳ機能および病気におけるＧＡＰ４３の潜
在的な重要性を認識しつつ、本発明者らは、相補ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）クローニングによって、哺乳動物ＧＡＰ−
４３遺伝子の配列決定に成功した。ラットＧＡＰ−４３
をコード付けする遺伝子の完全なヌクレオチド配列およ
びアミノ酸配列を決定した。う７ トＧＡＰ−４３につ
いてのｃＤＮＡをプローブとして用いて、ヒト脳幹およ
び小脳ライブラリーからのヒトＧＡＰ−４３についての
ｃＤＮＡを同定し、クローン化した。ヒトＧ、ＡＰ−４
３についてのアミノ酸配列も決定した。 かくして、本発明の１の具体例において、実質的に純粋
な哺乳動物ＧＡＰ−４３蛋白、またはその機能的誘導体
か提供される。また、実質的に純粋な形態のラットおよ
びヒ）ＧＡＰ−４３蛋白、ならびにこれらの蛋白の機能
的誘導体か提供される。本発明の特別の具体例は、各々
、第２図および５Ａ図に示したものに対応するアミノ酸
配列を有する実質的に純粋なラットおよびヒトＧＡＰ４
３蛋白およびポリペプチド、およびそれらの機能的誘導
体よりなる。 本発明のもう１つの具体例は、第２図または５Ａ図に示
したヌクレオチド配列またはそれと実質的に同様のヌク
レオチド配列よりなるｃ Ｄ ＮＡ、またはその誘導体
を提供する。本発明のｃ Ｌ）ＮＡはプラスミドのごと
き適当な発現ベクターに組み込むことかでき、該ベクタ
ーを用いて原核生物または真核生物宿主細胞をトランス
フェクトし、次いて、該宿主細胞は、適当なｉｎ ｖｉ
ｖｏ ｉｎ ｖｉｔｒ。 またはｉｎ ５ｉｔｕ条件下で該ｃＤＮＡを発現し、こ
れらすへては、それにより産生されたＧＡＰ−４３蛋白
またはポリペプチドと一緒に本発明のさらなる具体例を
形成する。 かくして、本発明のさらにもう１つの具体例は、哺乳動
物ＧＡＰ−４３蛋白またはポリペプチドをコード付けす
るｃＤＮＡよりなるベクターて原核生物または真核生物
宿主細胞をトランスフェクトし、該哺乳動物ＧＡＰ−４
３蛋白またはポリペプチドの発現を可能とする条件下で
該宿主細胞を適当な培地中で培養し、該哺乳動物ＧＡＰ
−４３蛋白またはポリペプチド、あるいはその機能的誘
導体を該培地から分離することを特徴とする哺乳動物Ｇ
ＡＰ−４３蛋白またはポリペプチドあるいはその機能的
誘導体を産生ずる方法を提供する。 本発明の実質的に純粋なＧＡＰ−４３抗原を使用し、本
発明者らは、対ＧＡＰ−４３抗体を作り出すのに成功し
、かかる抗体ならびにその機能的および化学的誘導体は
本発明のさらなる具体例よりなる。本発明のＧＡＰ−４
３抗体はポリクローナルまたは、好ましくはモノクロー
ナル抗体とてき、種々の調製、診断および治療用途に適
し、これらはなおさらに本発明の具体例を形成すると理
解されるへきである。 さらに、本発明のＧＡＰｉ３抗原および抗体は、すへて
特定の調製、診断または治療適用か要すると判断される
、例えば検出可能な標識または治療標識に関するごとく
適当な（才識化に、および医薬上許容されるまたは許容
されなくてもよい組成物にて他の活性剤と共に使用する
のに適する。 かかる樟識化ＧＡＰ−４３抗原、抗体ならびにその機能
的および化学的誘導体、ならびにかかる釘１成物は本発
明の具体例よりなる。 その機能的および化学的誘導体と共に、本発明のＧＡＰ
−４３抗原および、特に抗体は当業者に公知の種々の診
断方法で用いることかできる。免疫細胞化学的方法およ
びイムノメトリック方法を包ａするかそれらに限定され
るものではないががる方法はさらに本発明の具体例をな
す。 従って、本発明の１の例示的具体例において、ＧＡ、Ｐ
−−４３抗原または抗体を含有することか疑われる試料
を各々検出可能に標識化したＧＡＰ４３抗体または抗原
と接触させ、ＧＡＰ−４３抗原−抗体複合体の形成を可
能とするために該試料を該抗体または抗原と共にインキ
−ベートし、かく形成された？１体を複合体を形成しな
かった抗原または抗体から分離し、標識した複合体化抗
体または抗原を検出することを特徴とする、試料におい
て哺乳動物ＧＡＰ−４３抗原または抗体を測定または検
出する方法か提供される。本発明の本具体例および他の
ものは、所望するに応して、ｎｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏまたはｉｎ ５ｉｔｕて行うことかてきる。 本発明の調製、診断または７台療力法で用いる場合、本
発明の化合物および組成物は、都合よくは、キット中に
包なさせることかでき、かかるキ、）・は本発明のも；
）１つの具体例を形［戊する。かくして、非限定的例と
して、閑した区画に１またはそれ以上の容器手段を収容
させるために打切を設けた担体手段よりなり、１または
それ以上の該容器手段か、調製、検出または治療可能に
標識化されたＧＡＰ−４３抗原または抗体、あるいはそ
の機能的または化学的誘導体よりなる、ＧＡＰ−４３抗
原または抗体の調製、精製、単離、測定または検出に、
あるいはＧ Ａ、 Ｐ −４３抗原または抗体での治療
処置に有用なキ７）か提供される。 また、本発明者らは、正常な、並ひに損傷または疾害Ｃ
ＸＳ組織においてＧ Ａ Ｐ−４３発現を評価した。ｉ
ｎ ｖｉｖｏ ＧＡＰ−４３発現は中枢組織の発育間に
変化し、ＧＡＰ ４３発現の領域による変動か存在す
ることか見い出された。さらに、ＧＡＰ−４３発現は中
枢組織に対する損傷の結束、かなりの変化を受はること
も見い出された。 さらに、本発明者らは、哺乳動物ＧＡＰ−４３発現を増
強でき、または所望ならば抑制できるノカニスムを見い
出した。、特に、ＧＡＰ４３発現は神）二￥成長囚了に
よ−・−ご増強され、これはある種のステロイド類によ
−・て抑制されることを見い出した。Ｇ Ａ Ｐ −４
３発現を変調する能力は、中枢または末梢神経系に対す
る損傷、またはその病気もしくは機能障害に罹った哺乳
動物、特にヒトを処置するにおいで太いに治療的利用か
てきのて、これらの発見の重要性は容易に理解されるで
あろう。、さらに、本発明者らは、ＧＡＰ−４３または
その機能的誘導体をコード付けするｃ Ｄ Ｎ、Ａを非
神経細胞に導入することによって、非神経細胞てあ−・
でも成長円錐−様突起を形成できるという驚くへき発見
をした。再度、この発見の潜在的治療イ凸イ直は２ＡＫ
なものである。 従って、もう１つの態様において、本発明は、疾患また
は損傷ＣＮＳ組織、ならひに正常なＣＮＳ組織における
Ｇ Ａ Ｉ）−４３活１１および発現を評価または１測
定する方法よりなる。さらに、本発明は、中枢または末
梢神経組織の損傷、疾化または機能［撞害に罹−・たヒ
トを禽めた哺乳動物を治療する方法、およびヒトを劇め
た哺乳動物において正常な（ｉ ＮＳ♀１１織ζこお（
ｆる横送再編成を変調する方ｌ去よりなる３、 かくして、１の具体例において、本発明は、細り包をｉ
ｎ ｖｉｖｏ、 ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ５ｉｔ
ｕて有髪Ｊ量の神経成長因子に暴露することを特徴とす
る該細胞においてＧＡＰ−４３の発現を誘導する方法よ
りなる。柱」包をか＜ ｉｎ ｖｉｔｒｏで暴露した場
合、もう１−）の態様において、治療効果を件いつつ、
損傷、疾患または機能障害の中枢または末梢神経細胞の
イ）処置にかかる細胞を導入し、または該位置と綿密に
同格の位置に導入することか可能であろう。 もう１つの態様においで、Ｇ Ａ Ｐ −４３をツー１
−付はするｃ Ｄ Ｎ Ａを非神経細胞または神鋒細叫
に導入することによって、Ｇ ＡＰ−４３発現を誘導ま
たは増強することかできる。これは、トランスフＪり／
ジン、杉質導入および直接的マイクロインノゴク／−３
ノを含めた種々の十トλによ−、てｉｎ ｖｉｖｏ、
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ５ｉｔｕで達成すること
かでき、これりず・＼ては本発明を限定するものではな
い意図した具体例を形Ｉ戊する。刑法として、本発明の
Ｃ’ Ｄ＼Ａは、レトロウィルスまたはウイルスベクタ
ーの手段によって導入できるか、またはいずれかの数の
細胞表面レセプターリカントに付着させ、かかるリガン
トと共に細胞中に移送することかできる。これらの方法
、ならひにＧＡＰ４３ ｃ Ｄ Ｎ Ａならびにその機
能的および化学的誘導体よりなる組成物およびベクター
のすへては本発明のさらなる具体例を形成する。 同様に、本発明のなおさらなる具体例は、構造再編成を
変調する方法、ンナプス可塑性を変調する方法、および
、神経成長因子、ステロイドおよびそれらの機能的誘導
体よりなる群から選択される１またはそれ以上の物質の
有効量に細胞を暴露することを特徴とするニューロンお
よび非ニューロン細胞を包含する細胞のミクロ環境を変
調する方法よりなる。 また、驚くへきことに、ＧＡＰ−４３は１０個のアミノ
酸アミノ末端エクソンを含有すること、およびこのペプ
チドはＧＡＰ−４３を細胞膜へ特にニューロン細胞の成
長円錐領域へ定方向化する原因となることを見い出した
。さらに、この］０個のアミノ酸膜−ターケノティング
ペプケト、およびその機能性誘導体は、所望の蛋白また
はペプチドのアミノ末端にまたはその近くに結合した場
合、該蛋白またはペプチドを細胞膜へ定方向化できるこ
とを見い出した。この驚くへき発見は、通常細胞質ツル
であり、通常は膜連結性でない蛋白類およびペプチド類
に適用される。 かくして、本発明のさらなる具体例は、いずれの所望の
蛋白またはペプチドをもニューロン細胞または非ニュー
ロン細胞の細胞膜へ定方向化できル膜−ターケ、ティン
グペプチドまたはその機能的誘導体よりなる。本発明の
膜−ターケノテイングペプケト、またはそれに結有する
所望の蛋白またはペプチドは診断または治療のため標識
化てきる。該膜−ターケ、ティノグペプケトを用いる、
ヒトを含めた動物のニューロンまたは非ニューロン細胞
の診療または治療のｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｌ ｖｉｔｒｏ
またはｉｎ ５ｉｔｕ処置は本発明のさらなる具体例を
構成する。 他の具体例において、本発明は、単離したゲノミックＧ
ＡＰ−４３ならひに配置されたそのイントロン−エクソ
ン境界ならびに転写スタート部位を提供するものである
。さらに、驚くことに、ＧＡＰ−４３プロモーターかそ
の構造において全（般的てあり、他の構造遺伝子の発現
に有用であり得ることが見いだされた。 さらに他の具体例において、本発明は、ＧＡＰ４３がＧ
。のものを含む他の細胞蛋白の結合能力を変形するよう
に細胞内的に作用するという驚くへき発見に基づくもの
である。すなわち、本発明は、そのＧＡＰ＝４３が外部
細胞レセプターと効果および利用性において一致する内
部調節蛋白（ｒｌＲＰＪ）の重要な新規クラスを提供す
るものである。また、ＧＡＰ−４３のアミノ末端アミノ
酸からなる合成ペプチドが内部調節蛋白として生物学的
活性を呈することか見いたされ、このような蛋白からな
る組成物およびその用途か本発明の他の具体例を構成す
る。 以下に、添付図面について簡単に説明する。 第１図 ＧＡ Ｐ−４３ｃ ＤＮＡのハイブリット選択
翻訳。 ツキアルティら（Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ ｅｔ ａｌ）、
ビイ・エヌ・エイ・ニス（ＰＮＡＳ）７６ ： ４９２
７（１９７９）の手法により、ＥｃｏＲＩインサート、
ＧＡＰ４３−２を用いてｍ ＲＮＡを選択した。略言す
れば、該ＧＡＰ４３−２インサート０５μｇ１または当
量の非特異的ＤＮＡ、細菌プラスミドｐＳＰ６５をニト
ロセルロース」−にスポットＬ、６５％ホルムアミド、
４００ｍＭＮａＣ（，１０ｍＭ１４−ピペラ／ンンエタ
ンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）を含む溶液、ｐＨ６，４中
、新生児ラット脳ボリアテニル化「ポリ（Ａ）゛二、Ｒ
ＮＡ ｌ ７．５μｇと４２°Ｃて１６時間ハイブリク
イズさせた。６５°Ｃて標準的なりエン酸添加生理食塩
水（Ｓ Ｓ ＣＸＸ Ｉ ）、０５％ＳＤＳ中てｔ先浄
した後、該フィルターを沸騰し、ＲＮＡをエタノールで
沈殿させ、ウサキ網状赤血球溶解物で翻訳し、蛋白を”
１３５Ｓ］メチオニンで標識化した（ペルハムら（Ｐｅ
ｌｈａｍ ｅｔ ａｌ）、ニーロビーアン・ジャーナル
・オフ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、）６７ ： ２４７（］ ９７６乃。財
訳産物、または対ＧＡＰ４３抗体て免疫沈殿させた産物
を１２％ＳＤＳ −ポリアクリルアミドゲル上で分離し
た。（Ａ）（１）外因性ＲＮＡ無し、（ｉｉ）ｐＳＰ６
５−選択ＲＮＡ、（ｉｉｉおよび１ｖ）ＧＡ Ｐ ４３
−２−選択ＲＮ Ａ 、および（Ｘ）ポリ（Ａ）゛新生
児脳ＲＮＡ（新生児）でのｉｎ ｖｉｔｒ。 翻訳産物。（Ｂ）スニペスら（Ｓｎｉｐｅｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ツク・ニューロサイ・アフストル（Ｓｏｃ、 Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉＡｂｓｔｒ、）１２ ： ５００（１９
８６）におけるごとくＡ製したＧ Ａ Ｐ−４３蛋白で
該ＧＡＰ−４３抗体を予め吸収させた後に翻訳産物の免
疫沈殿を示す４番目のレーンを除き（Ａ）について記載
したごとく、（Ａ）の翻訳産物のＧＡＰ−４３に対する
抗体による免疫沈殿。 第２図 ＧＡＰ−４３のヌクレオチド配列および予測さ
れるアミノ酸配列。胚１７〜］８日令ラットからの抜根
神経節よりのＲ：’Ｊ ＡてｃＤＮＡライフラリ−を得
た。チャーゲイン：） （Ｃｈｉｒｇ★ｉｎ ｅｔａｌ
）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ’
） ｌ ８ ： ５２９４（１９７４）の方法によって
全細胞ＲＮ 、Ａ、をｔ１５離し、ポリ（Ａ）ＲＮＡを
４リコ−ｄＴセルロスて選択した。グブラーおよびホフ
マン（Ｇｕｂｌｅｒａｎｄ Ｈｏｆｌ’ｍａｎ）、シー
ン（Ｇｅｎｅ）２５ ： ２６３（１９８３）によって
記載されているリホヌクレアーセＨ法によって二本鎖ｃ
ＤＮＡを得、ＥｃｏＲＩリンカ−に結び、ラムタファー
／クローニングベクターλｇｔ １０およびλｇｔｌｌ
のＥｃｏＲ１部位に結んだ。対ＧＡＰ−４３ウサキ抗体
、続いてアルカリホスファターセ一対つサキグロブリン
Ｇ（プロメカ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔ
ｅｃ乃連結抗体を用いることによって、イソプロピルβ
−Ｆ）チオカラクトピラ／／ト（Ｉ ＰＴＧ）での誘導
の後、同定された最長クローン、ＧＡ、Ｐ４３−２、お
よびより小さいインセードを有する２のファー／をλｇ
ｔ１１ライブラリー中の約５ｘｌＯ’プラークから同定
した。該ｃ ＤＮＡインサートをＭｌ ３ｍｐ １８の
Ｅ ｃ ｏ Ｒ１部位に継代クローンした。２のより短
いクローンの最初のＤＮＡ配列分析により、それらは最
長のものに包含されていることか明らかにされた。ンテ
オキンヌクレオケト鎖−停止法（サンカーら（Ｓａｎｇ
ｅｒ ｅｔ ａｔ）、ビイ・ニス・エイ・ニス（ＰＮＡ
Ｓ）７４ ： ５４６３（１９７″７））により、配列
の下方に示した一連の重複する制限断ＬＬを用いること
によって、インサートＧＡＰ４３−２を配列決定した。 この断片の３“末端は３の独立したλｇｉｌｌ単離体に
共通のＥｃ。 Ｒ＋部位であり、ＧＡＰ−４３遺伝子において天然に生
じるＥ ｃ ｏ ＲＩ部位と考えられる。ボリアテニル
化配列を有するインサートを含有するクローンはなかっ
たので、該ｃ Ｄ Ｎ Ａ内のＥｃｏＲ１部位はライブ
ラリー構築の間にメチル化されなかったようである。Ｇ
ＡＰ−４３についての予測される蛋白配列を該ＤＮＡ配
列の−Ｌ方に示す。イタリック体の第１のメチオニンは
後記する理由でコーティング領域のスターＩ・とじて選
択した。ここにアミノ酸５として示す他のメチオニンの
みか別に開始フトンとして働くのではないよってある。 アミノ酸７におけるアルキニン（Ｒ）からアミノ酸２０
にお（Ｉるイソロイノン（１）までの直接的な蛋白配列
決定によ−・て同定されたアミノ酸残基の」−に線を引
いた。確実性をもってアミノ酸を決定できる配列決定の
最初のサイクルはアルキニンてあ−１．た。 次のアミノ酸は確実性をもって決定できなかった。 断片化されていない蛋白を配列決定できないことは、ア
ミノ末端はブロックされているらしいことを示唆する。 Ｅ、ＥｃｏＲｌ ；ＭｌＭｓｐｌ ：ＶＰｖｕｌ；）ｌ
、Ｈａｅｌｌｌ；Ｐ、Ｐｓｔｌ；５Ｓａｕ３Ａ０ヌクレ
オチド１００および１０１間の矢印は第１および第２エ
クソン間の境界を示しヌクレオチド６６４および６６５
間の矢印は第３エクソンのスタートを示す。 第３図 ＰＣ１２細胞におけるＧ Ａ Ｐ −４３発現
の調節。 】０％ウマ血清および５％胎児ウノ血清を含有するＲＰ
ＭＩ培地中でＰＣ］２細胞を継代した。 該細胞を平板培養した４０時間後、該ｊ−Ｈ地を異なる
添加物を含むように変更した。４日後、該細胞を写真に
撮り（Ａ）、次いて、各細胞培養からＲＮＡを単離した
。ＲＮＡ（試料角たり］Ｏμｇ）を変性Ｌ、１．２％了
カロースーホルムアルテヒトケル−ヒＣ泳動させ、ノー
ンスクリーン（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ）ナイロンフィ
ルターに移し、紫外線架橋によって該フィルターに結合
させ、３２ｐ−標識化ＧＡＰ４３−２でプローブした（
Ｂ）。最終の洗浄は６５°ＣにおけるＳ Ｓ Ｃ（ｘ
０．２）、０．１％ＳＤＳであった。含まれる添加物は
（１）無し、（ｉｉ）１ミリリツトル当たりＮＧＦ５０
ｎｇ、（ｉｉｉ）１０−３Ｍ シブチリルｃＡＭＰ、お
よび（ｉｖ）１ミリリツトル当たりＮＧＦ５０ｎｇおよ
び１０−３Ｍ ジブチリルｃＡＭＰであった。最後のレ
ーンは、ブロア）法およびハイブリタイモーション法に
ついての陽性対照として泳動させた新生児脳からのＲＮ
Ａｌ０Ｍｇである。 第４図 ＧＡＰ−４３遺伝子発現の発育調節および組織
特異性。チャーゲインら（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔａｌ
）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ
） １８ ：５２９４（１９７９）の手法の修飾法によ
って、全細胞ＲＮＡを、示したラット組織から単離した
。 各ＲＮＡ（１０Ｍｇ）を変性し、１．２％アカロースー
ホルムアメテヒトゲルにて電気泳動を行い、ニトロセル
ロースに移した。該フィルターを二。 クトランスレーションによって、デオキ／ンチンン５′
−［α−３ｔｐ］ｈリホスフエートで標識したλｇｔｌ
ｌ ＧＡＰ４３−２からのＥｃｏＲＩインサートと４２
６Ｃにて一晩ハイブリタイズさせた。 最終の洗浄は６５°Ｃにて５ＳＣ（ｘｏ、２）、０．１
％ＳＤＳで行った。ＲＮＡ試料＝（１）胚１３日令（Ｅ
１３）心臓（Ｈ）、（ｉｉ）Ｅ １３肝臓（Ｌ）、（
ｉｉｉ）Ｅ１３脳（Ｂ）、（ｉｖ）Ｅ−１３後根神経節
（ＤＲＧ）、（ｖ）ないしくｖｉｉ ）胚１７日令心臓
、肝臓、脳、および後板神経節；（ｉｘ）ないしく ｘ
ｉｉ ）新生児心臓、肝臓、脳、および後板神経節：（
ｘｉｉｉ）ないしくｘｖｉ）成人心臓、肝臓、脳および
後板神経節。１８Ｓおよび２８ＳリホソームＲＮＡの位
置を右に示す。下方は同フィルターとグリセルアルナヒ
ト−３−ホスフエートデヒドロケナーセ（ＧＡＰＤＨ）
をコード付けするｃ ＤＮＡプローブ（ビエンヤチクら
（Ｐｉｅｃｈａｃｙｋ ｅｔ ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ
）４２ ： ５８９（１９８５））とのハイブリタイセ
−７ヨンである。 第５図 （Ａ）ヒトＧＡＰ−４３ｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列および帰結されるアミノ酸配列。 Ｅ：ＥｃｏＲＩ ；Ｈ：ＨａｅｌＩ［；Ｍ：Ｍｓｐ１
０コーディング領域は太線で示す。規模は１００ｂｐで
ある。矢印は配列決定した重複制限断片を示す。（Ｂ）
ヒト、ラットＧＡＰ−４３およびマウスＰ−５７アミノ
酸配列の配置。垂直線は同一性を示し、コロンは保存さ
れる置換を示す。アミノ酸は、ＩＵＰＡ（、−ＩＵＢ
ＣＢＮの一文字記号によって表す。うｙトの配列は第２
図のそれてあり、マウスの配列はシムラーら（Ｃｉｍｌ
ｅｒ ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・バイオロジカ
ル・ケミストリ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２６
２ ： １２１５８（１９８７）からのものである。（
Ｃ）ツカ−およびシュタイグラ−（Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ
Ｓｔｅｉｇｌｅｒ）、ヌクレイツク・アシソズ・リサ
ーチ（Ｎｕｃ］、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ） ９ ：
１３３（１９８０のひた（ｆｏｌｄ）プログラムによ
って予測される３”−非翻訳領域におけるステム−ルー
プ構造。 第６図 成熟を伴うＧＡＰ−４３発現の領域制限を示す
ノーサンプロット。８日令、１６年令、６４年令の脳領
域からの全１０μｇＲＮＡを各レーンに負荷し、該プロ
ットを、実施例■に記載したごとく、ヒトＧＡＰ−４３
プローブＣ１ａてプローブする。１８Ｓおよび２８Ｓの
ｒＲＮＡハンドの位置を示す。 第７図 ＧＡＰ’−４３発現か虚血事故のあとに増加す
ることを示すノーサンプロット。（Ａ）野（Ａ ｒｅａ
） １７ （視覚皮質）における卒中を有する患者の異
なる脳領域からのＲＮＡｌ０Ｍｇ０野１７における発現
は脳（野１１）における最大に匹敵するレベルまで増加
した。（Ｂ）すへて泳動させ、レーン２および３聞で切
り出した関係のないハンドを有する同プロット上でプロ
、トした、３人の患者からの野３．１．２．５からのＲ
ＮＡｌ０Ｍｇ０レーン３はわずかの卒中を包含り、ＧＡ
Ｐ４３発現の増加を示すのに対し、レーン１および２は
組織学的に正常であった。 第８図 ｉｎ ｓｉ″ｔｕ・ハイブリタイセー／ヨンに
より、梗塞に隣接する領域におけるＧＡＰ−４３発現の
増加が明らかにされる。（Ａ１）脂質負荷マクロファー
ジおよび反応性星状細胞による組織の散漫な浸潤を示す
Ｂにおける梗塞領域の高倍率拡大。この領域に残存する
ニューロンはない（Ｘ１６０）。（Ａ２）豊富な組織学
的に無傷なニューロンを有する正常な隣接皮質（ｘ ３
００）。（Ｂ）１の胴回（矢印頭）および隣接胴回にお
ける無傷皮質（矢印）を含む組織化虚血梗塞（１０ない
し］４日令）を有する視覚皮質の低倍率図（ｘ１２）。 （Ｃ）暗視野調査によると、正常な視覚皮質においては
、ＧＡＰ−４３発現は少数の散在ニューロンに制限され
る（矢印頭）。（Ｄ）梗塞皮質においては、アンチセン
スＧＡＰ−４３プローブの特異的結合はない。大きな明
るい焦点はセンスブローブチ非特異的に標識する凝集率
クローンスの領域からのものである（Ｇ）。対照的に、
隣接無傷皮質においては、多数のニューロンかＧ 、Ａ
Ｐ −４３を発現する（アンチセンスプローブで標識
したＥ−明視野およびＦ−暗視野）。特Ｗ的ＧＡＰ−４
３結合の不存在を示す、センスプローブで標識した（Ｆ
（）対照明視野および（＋）暗視野（（、−１ｘ１６０
）。 第９図 重症の低血圧症および低酸素症の発作の数日後
における小脳皮質のニューロンにおけるＧＡＰ−４３発
現の増強。すべての切断面を同時に処理した。（Ａ）検
出可能なＧＡＰ−４３標識化の不存在を示す正常成人小
脳皮質。（Ｂ）ブルキニエ細胞および外部顆粒細胞層に
おけるＧＡＰ４３の発現の顕著な増加を示す虚血後生脳
皮質。 （Ｃ）対照としてのセンス鎖ブローブトハイフリタイズ
させたＢに隣接する断面図くすべてＸ３１５）。 第１０図 ＣＨＯ細胞系における突起形成に対するＧＡ
Ｐ−４３の影響。中抜き線は４のＣＤＭ８−トランスフ
ェクト系統における突起を有する細胞を表し、切れ口の
ない線はＧＡｌ”４３を発現する４の細胞系を表す。細
胞系は実施例■に記載したごとくに得た。突起を有する
細胞のパーセンテージは、ＣＨＯ細胞をポリーＤ−リシ
ンー被覆カバーカラス十に平板培養することによって検
定した。２０ミクロンより長い突起をもつ細胞を陽性と
して記録した。比較性を確実とするために、すへてのア
ッセイは、平板培養の後、３０分から４５分にわたる時
間枠内で行った。本ア、セイの重要な要素は選択した時
間枠てあった。というのは、より長い平板培養時間の後
では、あるいは細胞が密集するに従い、突起は不明確と
なるからであった。この時間枠の間に、できるたけ多く
の細胞を計数し、調へたすべての細胞を包含させた。 異なる系について計数した細胞数はＬＡ、、４０６１Ｂ
、４０８：２Ａ、２８７ ２８ ３０３５Ｅ、２３４
；４，３３３；１２，１５６；１４゜１６１゜ＧＡＰ−
４３発現細胞系で突起をもつ細胞の割合は対照における
よりもかなり高か−）だ（ｐ＜０．００１．）。 第１１図 アミノ末端エクソンかＧＡＰ−４３蛋白を細
胞膜へ定方向化させる原因であること、およびそれはク
ロラノーフユニコールアセチルトランスフェラーセの膜
ターゲツティングを指令することを証明する実験の模式
図。左欄（「構築」）は、ＣＯ５，、Ｎ ＋ ＋（３Ｔ
３、ＣＨＯまたはＰＣＩ２細胞のトランスフェクンヨン
で用いる遺伝子の構築を示す。右欄（、ｒｌｌｉｌ ）
は、発現された蛋白または断片が、骨細胞分別、続いて
のウェスタンプロ２テイング、直接免疫蛍光、またはそ
の双方によって検定して、膜一連結（＋）であったか否
か（−）を示す。エクソン２の実質的部分（Ｇ Ａ、
Ｐ （−内部））またはＧ Ａ Ｐ−４３遺伝子のカル
ボキシ末端領域（ＧＡＰタッグ）を欠＜ＧＡＰ構築物も
そうであったように、無傷Ｇ Ａ Ｐ−４３遺伝子（Ｇ
ＡＰ）はかなり膜連結性であった。しかしながら、ＧＡ
Ｐ４３の最初の４個のアミノ酸をコード付けするヌクレ
オチドを欠失した場合（ＧＡＰ（−１−４））、発現さ
れた蛋白断片は膜連結性でなかった。 第１のエクソンの３（Ｃ３）または４（Ｃ４）位におけ
る／スティンをコード付１ブする配列に点突然変異を導
入した結果、得られた蛋白でアラニンが発現された。Ｃ
３（ＧＡＰ＊Ｃ８）またｉ；ＩＣ４（ＧＡｐ＊ｃ、）い
ずれかの突然変異の結果、無傷ＧＡＰ４３と比較して膜
レヘル（＋／−）か減少１７た。 Ｃ４を変更した場合、減少は特に顕著であった。 Ｃ３およびＣ４（ＧＡＰ＊Ｃ３，、）双方の突然変異は
膜連結を全く排除（７た。 この通常は細胞質ゾルの酵素について予測されるコト＜
、クロラムフェニコールアセチルトランスフラーゼ（Ｃ
ＡＴ）をコード付けする遺伝子の一時的発現により、膜
連結蛋白は産生されなかった。 第１のＧＡＰ−４３エクソンの１０個のアミノ酸をコー
ド付けするヌクレオチド配列をＣＡＴ遺伝子のアミノ末
端に結ぶと（ＧＡＰ（１−１０）ＣＡＴ）、発現された
蛋白は膜連結性であった。 第１２図 ＣＨ○細胞にトランスフェクトした場合、通
常のＧＡＰ−４３は膜成分および細胞質ゾル成分（Ｍ＝
膜；Ｃ−細胞質ゾル）を共に有することを示すウェスタ
ンプロット。第１のＧＡＰエクソンの第３または第４シ
ステイン（Ｃ−３またはＣ−４）をコード付けするヌク
レオチド配列の突然変異は膜結合成分に干渉し、一方、
両システィン（Ｃ−３，４）の突然変異は膜結合を完全
に排除した。対照細胞（ＣＯＮ）はＧＡＰ−４３を有さ
ず：脳膜（ＢＲ）はトランスフェクトした遺伝子からの
ものと同一の分子量のＧＡＰ−４３を有していた。 第１３図 ラ、 トＧＡＰ−４３遺伝子の地図Ａ、
５°から３°への向きのＧＡＰ−４３遺伝子の直線表示
。マツピングに用いたファージインサートの表示を示す
。３個のエクソンを垂直線として表す。示した部位は制
限エントヌクレアーセＢａｍＨＩ （Ｂ） 、Ｋｐｎ
Ｉ （Ｋ） 、および５ａｃｌ（Ｓ）についてのもので
ある。 Ｂ、イントロン−エクソン境界および３′ポリアデニル
化部位。コンセンサススプライス部位に最良に適合させ
、ここに記載するごときｃ ＤＮＡ配列と比較すること
によって、エクソンおよび隣接領域を配列決定し、イン
トロン−エクソン境界を決定した（マウント（Ｍｏｕｎ
ｔ）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）１０ ： ４５９−４７２（
１９８２）。主要ポリアデニル化部位は、ＲＮＡ５ ｅ
保護によって決定した。利用したポリアデニル化ングナ
ルの直く３′側にしばしば見い出される推定ポリアデニ
ル化シグナルおよびコンセンサス・モチーフ（ｍｏｔｉ
ｆ）のタンデム対に下線を引いた（マクラウヒランら（
ＭｃＬａｕｃｈｌａｎｅｔ ａｌ）、ヌクレイツク・ア
ンノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
）１３ ： １３４７−１３６８（１９８５））。 第１４図 ＧＡＰ−４３プロモーター領域の配列。ヌク
レオチド＋１位はＧＡＰ−４３蛋白の開始ＡＴＧコドン
のＡを示す。この配列は＋３０で終わる可変サイズの第
１のエクソンを包含する。 主要な転写スタート部位は矢印によって示す。プリン残
基は星印を下に示す。コンセンサスＰｉｔ１結合部位は
上に線を引く。 第１５図 Ｈ−ＤＮＡによって誘導された制限断片にお
ける移動度シフト。制限部位および主要なホモプリン−
ホモピリミジン領域（太くし標識したＩ、 Ｉ［、およ
び■）の位置を示す−５１８ないし＋８５のＧＡＰ−４
３プロモーター領域の模式図。下方に、以下の酵素でプ
ラスミドｂｓ１．５ＲＩＸ４を消化することによって遊
離したＧＡＰ４３プロモーター断片を表示する １）Ｓ
ｓｐｌ、６０３ｂｐ；２）ＸｂａＩ／５ｓｐｌ、５６０
ｂｐ：３）ＳｍａＩ／５ｓｐＩ、４９０ｂｐ４）Ｓｓｐ
ｌ／Ｎｈｅｌ、４０９ｂｐ；５）Ｓｓｐ１／Ｎｓ ｉ
Ｉ、２８４ｂｐ（領域■を含有）、３１９ｂｐ（領域■
および■を含有）；６）Ｓｓｐｌ／Ａｃｃ＋、３１４ｂ
ｐ （領域１）、２８９ｂｐ（領域■およびＩＩ［）；
７）Ｘｂａ Ｉ／Ｎｈｅ Ｉ、３６０ｂｐ：および８
）Ｓｍａ Ｉ／Ｎｈｅ Ｉ、２９５ｂｐ。 第１６図 ｐ３４およびｐ３８についての部分的蛋白配
列。 第１７図 ＧＡＰ−４３およびＧＡＰ−４３ペプチドに
よるＧ。に対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結合の変調。特
異的なＧ。に対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結合は、１μ
Ｍ ＧＡＰ−４３の存在下、対照の３１０＋４０％（ｎ
＝７）まで刺激される（Ａ。 左）。同一濃度のＧ。不含ＧＡＰ−４３は検出可能な（
３５Ｓ）ＧＴＰｕＳを結合しない。ＧＡＰ−４３ａ度の
変化は、この効果に対する＋５０ｎＭのＥＣ６ｏを示す
（Ａ、右）。様々なＧＡＰ−４３の調製物に関して、Ｅ
Ｃ５ｏの範囲は、おそらく精製の間にＧＡＰ〜４３の部
分的な不活性化を生じる１ｌ５０−８００ｎであった（
第１７図りを比較する）。ＧＡＰ−４３由来の最初の２
４アミノ酸を含む１ｍＭペプチド、すなわぢＭＬＣＣＭ
ＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫ Ｉ ＥＱＤＧの添加に
よって、１μＭＧＡＰ−４３によると同一のレベル（２
５０％）まで結合が刺激され、ＧＡＰ−４３および１−
２４ペプチドの添加によっては、両方共、さらに刺激は
生じない（Ｂ、左）。他の３つのペプチド、すなわちＧ
ＡＰ（３５−５３）−ＡＴＫ ＩＱＡＳＦＲＧＨＩＴＲ
ＫＫＬＫＤ、、ＧＡＰ（５３６９）＝ＤＥＫＫＧＤＡＰ
ＡＡＥＡＥＡＫＥＫおよびＧＡＰ（２］、０−２２６）
＝ＡＲＱＤＥＧＫＥＤＰＥＡＤＱＥＨＡは、１ｍＭてＧ
。に対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結合への効果を有しな
い。１２４ペプチドによる結合の刺激は、２０１１Ｍの
ＥＣ５０で飽和される。ｃ Ａ Ｐ −４３の最初の１
０アミノ酸からなるペプチド、すなわちＭＬＣＣＭＲＲ
Ｔ Ｋ Ｑは、１ｍＭて８０％まてＧ。に対する（３５
Ｓ）ＧＴＰυＳ結合を抑制する（Ｃ１左）。位置３およ
び４に７ステインの代わりにトレオニンを有するペプチ
ドは、Ｇｏに対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結合への効果
を有しない。１−１０ペプチドに関するＩＣ，。は２０
μＭである（Ｃ１左）。パネルＹ）は、５０μＭ １−
１０ペプチドの存在下または非存在下でのＧＡＰ−４３
１１度の関数としてＧｏに対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ
結合を示す。ＧＡ Ｐ−４３かペプチドによる抑制を逆
転させること、ＧＡＰ−４３のＥＣ５ｏかこのベブチ！
・の濃度によって６００％Ｍから１２μＭまで上昇する
ことに注意する。これは、１−１０ペプチドとＧＡＰ−
４：３間の直接的な競合と一致する。 方法 （３５Ｓ）ＧＴＰｕＳに−−・イングランド・ヌ
クレア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）、
２０００ Ｃｉ ／ ミリモル）結合は、以前に開示さ
れたとおり（フッ・アール・エムら（Ｈｕｆｆ、Ｒ，Ｍ
、 ｅｔ ａｌ、）、ジャーナル・オフ・バイオロジカ
ル・ケミスｉ・リ−（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）
２６０ ： １０８６４−１０８７１（１９８５）；ノ
ースラップ・ンエイ・ケイら（Ｎｏｒｌ、ｈｒｕｐ、Ｊ
、に、 ｅｔ ａｌ、）、／ヤーナル・オフ・バイオロ
ンカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
） ２５７・１１４１６−１１４２３（＋９８２））
、３０°Ｃで６分間、５０ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ５−ＨＣ
Ｃ，、ｐＨ８０，１ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ 、 ６
ｍＭ ＭｇＣＱｔ、０１％ Ｌｕ ｂ ｒ ｏ Ｉ
ＰＸ、 ２００１１９７１ｆｒ＆ウン血清アルブ
ミン、ｌｎ１Ｍジチオトレイト−ルの１００ノｌ（２中
てＧ。（１ｎＭ、 １０ｒ＋９）および（３５Ｓ）Ｇ
ＴＰｕＳ（２丁１Ｍ）をインキュベートし、ニトロセル
ロースを介して濾過し、結合放射活性をンンチレーンヨ
ンカウントすることによって測定された。これらのア、
セイにおける（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳの濃度は、見掛けの
ＫＤの約１０分の１であり（）７−アール・エムら（Ｉ
ｌｕｆｆ、Ｒ，Ｍ、 ｅｔ ａｌ、）、／ヤーナル・オ
フ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、）２６０ ： １０８６４−１０８７１（
１９８５）：ノースラップ・／エイ・ケイら（Ｎｏｒｔ
ｈｒｕｐ、Ｊ、に、 ｅｔ ａｔ、）、ジャーナル・オ
フ・バイオロンカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、）２５７：１１４１６−１１４２３（１９
８２））、この結果、見掛けのＫＤとＢｍａｘの両方に
おける変化は結合のレベルを変える。結合した放射活性
の合計は全ての場合に添加されたものの１０％以下であ
った。１０μＭ非標識化ＧＴＰｕＳの存在下で非標識化
結合を測定し、これを合計結合から差し引いて、特異的
結合を決定した。全てのアッセイを２回行った。平均ア
ッセイ管は８００，０００ｃｐｍを含んており、合計結
合３０．０００ｃｐｍおよび非特異的結合１５００ｃｐ
ｍを得た。Ｇ Ａ、 Ｐ４３の添加は非特異的結合に影
響せずに特異的結合を増加した。ＧＡＰ−４３は、ｌ−
ｕ ｂ ｒ ｏ ＩＰＸから調製したＧ。および１つの
アルファ。の２つの異なる試′＃１を活性化した。しか
しながら、活性の範囲は、調製物の間で変化した。ＧＡ
Ｐ４３による活性化は、Ｇｏの精製において使用される
洗剤および結合緩衝液組成物に対して感受性であるらし
い。ＧＡＰ−４３は、ツバイア−ら（Ｚ★１ｅｒｓ ｅ
ｔ ａｌ、）ノ方法（ンヤーナル中オフ゛壷ニューロケ
ミストリー（ｌ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、）４４ ：
１０８：３−１０９０（１９８５））を変形させた方
法によって精製し、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブ
ルー染色によると純度９７％以−してあ〜た。蛋白は、
アッセイ緩衝液に対して広範囲に透析し、これを上記で
示した濃度中でのＧＴＰｕＳ−Ｇｏインキュベーション
物に添加した。ペプチドは、ノーワード・ヒユーズ・メ
ディカル・インステイチュート・ラボラトリ−（Ｈｏｗ
ａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎ５ｔｉｔ
ｕｔｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ） （マサチューセノツ・
ゼネラル・ホスピタル（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏ５ｐｉｔａｌ）、ボストン、マサ
チューセ、ツ州）で合成され、逆相ＨＰＬＣによって精
製され、構造は、アミノ酸配列決定によって確認した。 このペプチドをアッセイ緩衝液中に溶解し、指示した濃
度てＧＴＰｕＳＧ、インキュヘーション物に添加した。 第１８図 ＧＡＰ−４３アミノ末端およびＧ結合レセプ
ターの細胞質テール間の相同性。ＧＡＰ４３の最初の１
０アミノ酸を、Ｇ結合レセプターの配列と比較した。Ｇ
ＡＰ−４３の最初の７アミノ酸および多数のＧ結合レセ
プターの細胞質テールのアミノ末端セグメント間に相同
性か見られる。共通の配列、すなわち、疎水性−Ｉｅｕ
ｃｙｓ−ｃｙｓ−ｘ−塩基一塩基と一致する残基に網掛
けをする。 １／セプター中に示されたンステインは、最後の膜内外
領域に対して末端の約１３アミノ酸が配置され、これは
、β、−アドレナリン作動性レセプターのｃｙｓ３４１
と一致しており、ヒガシジマ・ティーら（Ｈｉｇａｓｈ
ｉｊｉｍａ、Ｔ、 ｅｔ ａｌ、）（ジャーナル・オ
フ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 ＢｉｏｌＣ
ｈｅｍ、）２６３：６４９１−６４９４（１９８８）中
に開示されているように一直線にされる。この示された
配列は、ヒト（第５図）およびサカナ由来のＧＡＰ−４
３、ヒトβ−アドレナリン作動性レセプター（β１−ア
ドレナリン作動性、フレル・ティーら（Ｆｒｉｅｌｌｅ
、Ｔ、 ｅｔ ａｌ、）、プロシーティングズ・オプ・
ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）Ｕ、 Ｓ、Ａ
、 ８４ ： ４６−５０（１９８７））、ヒトロドプ
シン（ロドプシン、不イサンス゛・ンエイ・ティーおよ
びホブ不ス・ティー・ニス（Ｎａｔｈａｎｓ、 Ｊ、
Ｄ、 ＆ Ｈｏｇｎｅｓｓ、 Ｄ、 Ｓ、 ）プロシー
ティングズ・オフ・ナンヨナル・アカテミー・オフ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、）Ｕ、Ｓ、Ａ、８１：４８５１−４８５５（１９８
４））、ヒトブルー−オプシン（ブルー−オプシン、ネ
イサンズ・ジェイら（Ｎａｔｈａｎｓ、Ｊ、 ｅｔ ａ
ｌ、）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３２ ： １
９３−２０２（１９８６））、ヒトαアドレナリン作動
性レセプター（α、−アドレナリン作動性、コテッチャ
・ニスら（Ｃｏｔｅｃｃｈｉａｓ、 ｅｔ ａｌ、）、
プロシーディングズ・オフ・ナンヨナル・アカテミー・
オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１ｌＡｃａｄ、
Ｓｃｉ、）Ｕ、Ｓ、Ａ、８５ ： ７１５９−７１６３
（１９８８））、ヒト血小板α、アドレナリン作動性レ
セプター（ｐα、−アドレナリン作動性、コブリカ・ビ
ー・ケイら（Ｋｏｂｌｉｋａ、Ｂ、に、 ｅｔ ａｌ、
）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３８ ： ６５０
−６５６（１９８７））、ヒトムスカリン作動性レセプ
ターサブタイプ１〜５（Ｍｕｓ−ＡＣｈ−１〜−５、ヒ
ガンジマ０ティーら（Ｈｉｇａｓｈｉｊｉｍａ、Ｔ、
ｅｔ ａｌ、）、ンヤーナル・オフ・バイオロジカル・
ケミストリー（ＪＢｉｏｌ、 Ｃｈｅｔ）２６３ ：
６４９１−６４９４（１９８８）；ペルルタ・イー・ジ
ーら（Ｐｅｒｕｌｔａ、 Ｅ、 Ｇｅｔａｌ、）、ＥＭ
Ｂ○ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、 ）６ ： ３９２３−
３９２９（１９８７））、ヒトセロトニンレセプターサ
ブタイプＩＡ（５ＨＴ−ＩＡ、コブリカ・ビー・ケイら
（Ｋｏｂｌｉｋａ、Ｂ、に、 ｅｔ ａｌ、）、不イチ
＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３２９ ： ７５−７９（１９８
７））およびラットセロトニンレセプターサブタイプＩ
Ｃおよび２（５ＨＴ−ＩＣ，シュリアス・デイ−ら（Ｊ
ｕｌｉｕｓ、Ｄ、 ｅｔ ａｌ、）、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）２４１ ： ４７３−４７９（１９８８）
および５ＨＴ２、ブリソチェット・デイ−・ビーら（Ｐ
ｒｉｔｃｈｅｔｔＤ、Ｂ、 ｅｔ ａｌ、）、ＥＭＢ○
ジャーナノ喧ＥＭＢＯＪ、）７：４１３５−４１４０（
１９８８））である。 第１９図 ＧＡＰ−４３＝刺激されたＧ。に対するＧＴ
ＰｕＳ結合のカルモジュリンによる投与量依存性減少。 両パネルの縦軸は対照の割合（％）として表したＧＴＰ
γＳ結合である。Ｇ、に対するＧＡＰ−４３の添加（線
２）は、Ｇｏたけ（線１）と比較して２００％オーバー
まてＧＴＰγＳ結合を増加させた。カルモジュリンの添
加は、対照レベルまで（線５）この結合を減少させた。 ＧＡＰ４３たけ（線３）またはＧＡＰ−４，１１汁カル
モジユリン（線４）を用いて、Ｇ、の非存在下ではＧＴ
ＰγＳ結合は見られなかった。右側のパネルのカルモジ
ュリン濃度（μＭ）は、Ｇ、に対−するＧＴＰγＳ結合
へのカルモジュリンの影響の投与量依存性を示す。 好ましい具体例の記載 以下の記載において、分子遺伝学および神経学の分野の
当業者に公知の種々の方法を参照する。 参照がなされるかかる公知の方法を記載する出版物およ
び他の資料を十分に記載されているごとくその全体を参
照により一体化させる。 ＤＮＡ組換え技術の一般的な原理を記載する標準的な文
献はワトソン・ジュイ・デイら（Ｗａｔｓｏｎ。 Ｊ、Ｄ、 ｅｔ ａｌ）、モレキュラー・バイオロジー
・オフ・ザ０ジーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ｏｒ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ）、 Ｉおよび■巻、す
・ベンジャミン／クミングズ・パブリノンイング・カン
パニー・インコーポレイテノド （Ｂｅｎｊａｍｉｎ／
ＣｕＣｕｍｍ１ｎ Ｐｕｂｌ ｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ。 Ｉｎｃ、 ）、出版者、メン口・パーク（Ｍｅｎｌｏ
Ｐａｒｋ）、カリフォルニア化（１９８７）；ターネル
・ジェイ・イーら（Ｄａｒｎｅｌｌ、 、１． Ｅ、
ｅｔａｌ）、モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏ
ｉｅｃｕｌａｒ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇの。サイエン
ティフック・アメリカン・ブノクス・インコーボレイテ
ノド（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏ
ｏｋｓ、 Ｉｎｃ、）、出版者、ニューヨーク、ニュー
ヨーク州（１９８６）；レーウィン・ビイーｘム（Ｌｅ
ｗｉｎ、 Ｂ、 Ｍ、 ）、ジーン（Ｇｅｎｅ） Ｈ、
ジョン・ウィリー・アンド・サンプ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ ５ｏｎｓ）、 出版者、＝、、−ヨーク、ニ
ューヨーク州（１９８５）；オールド・アール・グブリ
ューら（Ｏｌｄ、 Ｒ，Ｌ 、 ｅｔ ａｔ）、ブワン
ンブルズ・オフ・シーン・マニュビュレーションニアン
・イントロタクション・トウ・ン５．不テイノク・エン
ジニアリング（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ
Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｔ＋
ｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ）、第２版、ユニバーシイティ・オフ・カリフォ
ルニア。 プレス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａ１ｉｆｏｒ
ｎｉａ Ｐｒｅｓｓ）、出版者、バーケレイ（Ｂｅｒｋ
ｅｌｅｙ）、カリフォルニア化（１９８１，）およびマ
ニアテイス・ティら（Ｍａｎｉａｔｉｓ丁 ｅｔ ａｌ
）、 モレキュラー・クローニング ア・ラホラトリー
・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ＾
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、出版者
、コールド・スプリング・ハーバ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（１９８２）を
包含する。 「クローニング」とは、特定の遺伝子または他のＤＮＡ
配列をベクター分子に挿入するｉｌ ｖｉｔｒ。 組換技術の使用を意味する。所望の遺伝子を首尾よくク
ローン化するためには、ＤＮＡ断片を生成させる方法、
該断片をベクター分子につなく方法、該複合ＤＮＡ分子
をそれが複製可能な宿主中に導入する方法、および受容
宿主細胞の間から標的遺伝子を有するクローンを選択す
る方法を使用する必要がある。 １−ｃＤＮＡＪとは、ＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラー
ゼ（逆転写酵素）の作用によってＲＮＡ鋳型から産生さ
れた相補的ＤＮＡまたはコピーＤＮＡを意味する。かく
して、ｒｃＤＮＡクローン」はクローニングベクターに
担持された、注目するＲＮＡ分子に対しご相補的なデュ
プレックスＤＮＡ配列を意味する。 ｒｃＤＮＡライブラリー」とは、−緒になって、生物体
の全ゲノムよりなるｃ Ｌ’） Ｎ Ａインサートを含
有する組換体ＤＮＡ分子の収集を意味する。かかるｃＤ
ＮＡライブラリーは、当業者に公知であって、例えば、
マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ）、モ
レキュラー・クローニング ア・ラボラトリ−・マニュ
アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、前掲、に記載されて
いる方法によって調製できる。一般に、そのゲノムから
特定の遺伝子をクローン化することが所望される生物の
細胞からＲＮＡをまず単離する。本発明の［−１的に好
ましいのは哺乳動物、および特にヒ１〜細胞系である。 「ベクター」とは、その中へＤ Ｎ Ａ断片を挿入また
はクローン化できるプラスミドまたはバタテリオファー
ン由来ＤＮＡ分子を意味する。ベクターは１個またはそ
れ以−Ｌの唯一の制限部位を含有し、クローン化配列か
再生可能なような定義宿主またはビヒクル生物中で自律
複製か凸Ｊ能である。 かくして、「ＤＮＡ発現発現ツクターは、Ｄ Ｎ Ａの
付加配列か自律要素ゲノムに組み込まれた後、宿主染色
体から独立して、宿主中で複製できるいずれの自律要素
も意味する。かかるＤＮＡ発現ベクターは細菌プラスミ
ドおよびファージを包含する。本発明の目的で好ましい
のはラムダｇｔＩ［発現ベクターである。 「実質的に純粋」とは、各々、他の抗原または遺伝子が
実質的になく、または通常天然に見い出される可能性の
ある他の不純物が実質的になく、天然に見い出されない
形態で存在する本発明のいずれの抗原、またはいずれの
かかる抗原をコード付けするいずれの遺伝子をも意味す
る。「機能的誘導体」とは、分子の「断片」、「変異体
」、「同族体」、または「化学的誘導体」を意味する。 本発明のｃＤＮＡ配列のいずれかの断片のごとき分子の
「断片」とは、分子のいずれのヌクレオチドサブユニッ
トをもいうものとする。かかる分子の「変異体」とは、
全分子、またはその断片いずれかに実質的に同様な天然
に生しる分子をいうものとする。分子の「同族体」とは
、全分子またはその断片いずれかに実質的に同様な非天
然分子をいうものとする。 両分子においてアミノ酸の配列が実質的に同一であれば
、分子は他の分子に「実質的に同様」であるという。実
質的に同様なアミノ酸分子は同様な生物学的活性を有す
る。かくして、２の分子か同様な活性を有するならば、
分子の一方が他方で見い出されない付加アミノ酸残基を
含有したり、またはアミノ酸残基の配列が同一でない場
合にもその用語を用いるごとく、それらは変異体である
と考えられる。本明細書中で用いるごとく、分子が通常
は当該分子の一部ではない付加化学部位を含有する場合
、該分子はもう１つの分子の「化学的誘導体」であると
言われる。かかる部位は分子の溶解性、吸収、生物学的
半減期等を改良する。 また、該部位は分子の毒性を減少させ、分子の望ましく
ない副作用を排除しまたは減衰させるなどする。かかる
効果を媒介できる部位は、例えば、レミントンズ・ファ
ルマンユーティカル・サイエンス（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ５ｃｉｅｎｃｅ
）、第１６版、マノク・パブリッシング・カンパニ（Ｍ
ａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、）、イーストン
（Ｅａｓｔｏｎ）、ペニシルハニア州（１９８０）に開
示されている。 同様に、本発明の抗原のいずれかの遺伝子の「機能的誘
導体」とは、ヌクレオチド配列が「実質的に同様であり
」、同様の活性を有する分子をコード付けする遺伝子の
「断片」、「変異体」、または「同族体」を包含させる
意図である。 ＧＡＰ−４３をコード付けするＤＮＡまたはその機能的
誘導体、あるいは膜−ターゲツティングペプチドまたは
その機能的誘導体は、結ぶための平滑末端またはスタガ
ード（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適当な末端を供給す
るための制限酵素消化、適当に粘着性末端を満たすこと
、望まない結合を回避するためのアルカリホスファター
セ処理、および適当なリガーセで結ぶことを含めた通常
の技術でベクターＤＮＡと組み合わせることかできる。 かかる操作についての技術はマニアティス・ティら（Ｍ
ａｎｉａｔ ｉｓ、 Ｔ、 、 ｅｔ ａｌ）、前掲、
によって開示されており、かつ当該分野でよく知られて
いる。 ＤＮＡのごとき核酸分子は、転写および翻訳調節情報を
含有するときはポリペプチドを「発現することができる
」と言われ、かかる配列は該ポリペプチドをコード付け
するヌクレオチド配列に「作動可能に結合」している。 作動可能な連鎖は、調節ＤＮＡ配列および発現が求めら
れるＤＮＡ配列が遺伝子発現を可能とするように連結し
た連鎖である。遺伝子発現に要する調節領域の正確な性
質は生物間で変わり得るが、それは、一般に、原核生物
においては、（ＲＮＡ転写の開始を指令する）プロモー
ターならびに、ＲＮＡに転写されたときに蛋白合成の開
始を指令するＤＮＡ配列を共に含有するプロモーター領
域を包含する。かかる領域は、通常、ＴＡＴＡホ、クス
、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列等のごとき、転写および
翻訳の開始に関与するそれらの５゛ −非コーディング
配列を。 包含する。 所望ならば、蛋白についてコード付けする遺伝子配列よ
り３°側の非コーディング領域は前記方法によって得る
ことかできる。この領域は、終始およびポリアデニル化
のごとき、その転写終始調節配列のために保持すること
かできる。かくして、蛋白についてコード付けするＤＮ
Ａ配列に本来隣接する３°−領域を保持することによっ
て、転写終始シグナルを供することができる。転写終始
シグナルが発現宿主細胞で満足に機能しない場合、該宿
主細胞において機能する３”領域を置き換えることかで
きる。 （プロモーター領域配列およびＧＡＰ−４３をコード付
けする配列のごとき）２のＤＮＡ配列は、２のＤＮＡ配
列間の連鎖の性質の結果、（１）フレーム−ソフト突然
変異の導入が起こらず、（２）ＧＡＰ−４３遺伝子配列
の転写を指令するプロモーター領域配列の能力に干渉せ
ず、または（３）プロモーター領域配列によって転写さ
れるべきＧＡＰ−４３遺伝子配列の能力に干渉しない七
きは、作動可能に連結していると言われる。かくして、
プロモーター領域は、該プロモーターかＤＮＡ配列の転
写を行うことかできるならば、その■）ＮＡ配列に作動
可能に連結していることになろう。 かくして、蛋白を発現させるには、適当な宿主によって
認識される転写および翻訳／グナルを要する。 本発明は、原核生物または真核生物細胞いずれかにおけ
るＧＡＰ−４３蛋白（またはその機能性誘導体）の発現
を含む。好ましい宿主はイー・コリ （Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレフトミセ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、／ニードモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） 、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔ ｉａ）等を包含
する。最も好ましい原核生物宿主はイー・コリである。 サルモ不う・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア喘マルセス
センス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｅｅｎｃ）、
および種々のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）種のごとき他の腸内細菌を利用することもてきる。か
かる条件下では、ＧＡＰ−４３はグリコ／ル化されない
であろう。原核生物宿主は発現プラスミドにおいでレプ
リコンおよび制御配列に適有するものでなければならな
い。 （例えば、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）、ビイ・スブチ
リス（Ｂ、 ５ｕｌ）ｔ ｉ Ｉ ｉｓ）、ンユードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等のごとき）原核生物細胞
でＧＡＰ−４３蛋白（またはその機能的誘導体）を発現
させるには、ＧＡＰ〜４３をコード付けする配列を機能
的原核生物プロモーターに作動可能に連結させなければ
ならない。かかるプロモーターは構成的または、より好
ましくは、調節可能（例えば、誘導可能または脱抑制可
能）いずれかであってよい。構成的プロモーターの例は
バクテリオファージλの１ｎｔプロモーターｐＢＲ３２
２のβ−ラクタマーセ遺伝子の＋：＋ ｌ ａプロモー
ター、およびｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーセ遺伝子のＣＡ Ｔプロモーター
等を包含する。誘導可能な原核生物プロモーターの例は
バクテリオファー／λの主要な右側および左側プロモー
ター（ＰＬおよびｐａ）、イー−ｒす（Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ）のｔｒｐ、、ｒｅｃＡ。 １ａｃＺ、１ａｃｌ、およびｇａｌプロモーターバチラ
ス・スブチリス（Ｂ、 ５ｂｔｉｌｉｓ）のα−アミラ
ーセ（ウルマ不ン・アイら（Ｕｌｍａｎｅｎ、１． ｅ
ｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・バタテリオロノ−（Ｊ
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１６２： １７６−１８２
（１９８５）およびσ−２８−ＭＸ的プロモーター（グ
リマン・ユム・七／Ｆら（ＧＩｉｍａｎ、Ｍ、Ｚ、、
ｅｔ ａｌ）、／−ン（Ｇｅｎｅ） ３２ ：１１〜
２０（１９８４））、バチルス属のハクテリオファーン
のプロモーター（グリソアン・ティ・ジエイ （Ｇｒｙ
ｃｚａｎ、 Ｔ、 Ｊ、 ）、す・モレキュラー・ノ＼
イオロジー・オフ・ザ・バチリ（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ
）、アカテミノク・プレス・インコーポレイテノド（Ａ
ｃａｄｅｍｅｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｉｎｃ、 ）、ニュ
ーヨーク化（１９８２））、およびストレプＩ・ミセス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロモーター（ワード・
／エイーｘムら（Ｗａｒｄ、 Ｊ、 Ｍ、 、 ｅｔ
ａｔ）、モレキュラー・アンド・／１不うル・シェ不テ
ィノクス（Ｍｏ１． ＧｅｎＧｅｎｅｔ、 ） ２０３
４６８−４７８（＋９８６））を包含する。原核生物
プロモーターはグリツク・ビイ・アール（Ｇｉｉｃｋ、
Ｂ、 Ｒ，）（／＋−ナル・オフ・インティアン秦マ
イクロバイオｏ ’； −（Ｊ、 ｌｎｄ、 Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、 ）１２７７〜２８２（１９８７））；セ
ナティエンボ・ワイ（Ｃｅｎａｔ ｉｅｍｐｏ、 Ｙ、
）（ビオ／ミー（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ）６８ ： ５
０５〜５１６（１９８６））；およびコテスマン・ニス
（Ｇｏｔｔｅｓｅｓｍａｎ、 Ｓ、 （アヌ・レブ・ジ
ェネ ト （Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、）１ ８
： ４ １ Ｅ＋−４４２（１９８４））によっ
て総括されている。 原核生物細胞での適当な発現には、遺伝子−コーディン
グ配列の上流のリポソーム結合部位の存在も必要である
。かかるリポソーム結合部位は、例えば、ボルド・エル
ら（Ｇｏｌｄ、 Ｌ、 、 ｅｔ ａｌ）（アヌ・レブ
ーフイクロバイオル（Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、 ）旦支： ３６５−４０４（１９８］、）
）によって開示されている。 もっとも好ましい宿主は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、または組
織培養いずれかにおける、酵母、昆虫、菌類、哺乳動物
細胞（特にヒト細胞）を含めた真核生物宿主である。哺
乳動物細胞は、正しい部位における正しい折り畳み（ｆ
ｏｌｄｉｎｇ）またはグリコ／ル化を包含する蛋白分子
に対する翻訳後修飾を提供する。 宿主として有用である得る哺乳動物細胞はＶＥＲＯまた
はＣＨＯ−ＫＩのごとき線維芽細胞起源の細胞、または
ハイブリドーマ５Ｐ２１０−ＡＧＩ４のごときリンパ系
起源の細胞または骨髄腫Ｐ３ｘ６３Ｓｇ８、およびその
誘導体を包含する。好ましい哺乳動物宿主細胞は、正し
い翻訳後ブロモ。 シンクについて良好な能力を提供するＳ Ｐ ２１０お
よびＪ ５５８Ｌ、ならひに１ＭＲ３２２のごとき神経
芽細胞腫細胞系を包含する。また、ＣＯ８細胞は、ＧＡ
Ｐ−４３発現、ならひにＧＡＰ−４３発現の調節の研究
について都合よい真核生物宿主であって、本目的につい
ては好ましい。 哺乳動物宿主については、多くの可能なベクター系がＧ
ＡＰ−４３の発現に利用できる。宿主の性質に応じ、多
くの種類の転写および翻訳調節配列を使用できる。調節
シグナルか高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連
するとき、転写および翻訳調節シグナルは、アデノウィ
ルス、ウシ乳頭腫ウィルス、７ミアンウイルス等のごと
きウィルス源に由来するものであってもよい。別法とし
て、アクチン、コラ−ケン、ミオンン等のごとき哺乳動
物発現産物からのプロモーターを用いることもてきる。 遺伝子の発現を調節できるように、抑制または活性化を
可能とする転写開始調節シグナルを選択できる。注目す
べきものは、温度を変化させることによって発現を抑制
または開始することができように温度感受性である調節
シグナル、あるいは化学調節、例えば、代謝物に付され
る調節シグナルである。 酵母はグリコジル化を含めた翻訳後ペプチド修飾も行う
ことができる点で実質的な利点を提供する。酵母での所
望の蛋白の産生に使用することができる強力なプロモー
ター配列および高コピー数のプラスミドを用いる多数の
組換えＤＮＡ技術か存在する。酵母はクローン化哺乳動
物遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、リーダー配列
を担持するペプチド（例えば、プレーペプチド）を分泌
する。 グルコースか豊富な培地で酵母を増殖させる場合に大量
に産生される解糖酵素についてコード付けし、活発に発
現される遺伝子からのプロモーターおよび終始要素を一
体化する一連の酵母遺伝子発現系のいずれを利用するこ
ともできる。また、公知の解糖遺伝子は非常に効果的な
転写制御シグナルを提供できる。例えば、ホスホグリセ
レートキナーセ遺伝子のプロモーターおよびターミネー
タ−シグナルを利用することができる。 ＧＡＰ−４３またはその機能的誘導体の昆虫での産生は
、例えば、当業者に公知の方法によって、昆虫宿主をＧ
ＡＰ−４３を発現するよう設計したバクロウィルスに感
染させることにより達成できる。かくして、１の具体例
において、ＧＡＰ−４３をコード付けする配列をウィル
ス多角体蛋白の調節領域に作動可能に連結することかで
きる（７ヤスニイ（Ｊａｓｎｙ）、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ） ２３８ ： １６５３（１９８７））。組
換体バクロウィルスで感染させ、培養した昆虫細胞、ま
たは生きた昆虫それ自体は、全蛋白生産の２０ないし５
０％もの量てＧＡＰ−４３蛋白を生産できる。生きた昆
虫を用いるべき場合、現在のところ、本発明による大規
模なＧＡＰ−４３生産用に毛虫か好ましい宿主である。 前記したごとく、真核生物宿主でのＧＡＰ−４３の発現
には真核生物調節領域を必要とする。かかる領域は、一
般に、ＲＮＡ合成の開始を指令するのに十分なプロモー
ター領域を包含する。好ましい真核生物プロモーターは
マウス・メタロチオネイン■遺伝子（ヘイマー・ティら
（ｌａｍｅｒ、 Ｄ、 、 ｅｔａｌ）、ジャーナル・
オフ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェ不ティ
ノクス（Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎ、 ）１
：２７３〜２８８（１９８２））；ヘルペスウィルスの
Ｔ Ｋ フロモーター（マノフナイト・ニス（ＭｃＫｎ
ｉｇｈｔ、 Ｓ、 ）、セル（Ｃｅｌｌ）３１ ： ３
５５〜３６５（１９８２））； ＳＶ４０初期プロモー
ター（ヘノイスト・シイら（Ｂｅｎｏｉｓｔ、 Ｃ，、
ｅｔ ａｌ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） （Ｌｏｎ
ｄｏｎ） ２９０ ： ３０４〜２１０（１９８１）；
酵母ｇａ１４遺伝子プロモーター（ンヨンストン・ニス
・エイら（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、 Ｓ、 Ａ、 、 ｅｔ
ａｌ）、プロ／−ティングズ・オフ・ナンヨナル・ア
カテミー・オフ・サイエン／ズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
１． Ａｃａｄ、 Ｓｃ ｉ、 ）（ＵＳＡ）７９ ：
６９７ ］〜］ ９７５（１９８２）：／ルバー・ビ
イ・エイ（Ｓｉ １ｖｅｒ、 Ｐ、 Ａ、 、 ｅｔ
ａｌ）、プロンーティングズ・オフ・す／ヨナル・アカ
テミ−・オフ・サイユンンズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、）（ＩＪＳＡ）８１ ： ５９５１
〜１９５５（１９８４））を包含する。 広く知られているごとく、真核生物ｍＲＮＡの翻訳は最
初のメチオニンをコード付けするコドンで開始される。 この理由により、真核生物プロモーターとＧＡＰ−４３
蛋白（またはその機能的誘導体）をコード付けするＤＮ
Ａ配列との間の連鎖か、メチオニンをコード付けてきる
いずれの介在コドン（すなわぢＡＵＧ）も含有しないこ
とを確認するのか好ましい。かかるコドンの存在の結果
、（ＡｔＪＧフドンかＧＡＰ−４３をコード付けするＤ
ＮＡ配列と同一のリーティングフレームにあれば）融合
蛋白を形成するか、または（Ａ Ｕ ＧコドンかＧ Ａ
、 Ｐ −４３をコード付けする配列と同一のリーティ
ングフレームにない場合は）フレームソフト突然変胃か
起こる。 ＧＡＰ４３をコード付けする配列および作動可能に連結
したプロモーターを、線状分子または、より好ましくは
閉環状分子いずれかであり得る非複製ＤＮＡ（またはＲ
ＮＡ）分子として、受容体原核生物または真核生物細胞
に導入することかできる。かかる分子は自律複製ができ
ないので、ＧＡＰ−４３蛋白の発現は導入された配列の
一時的発現を通じて起こり得る。別法として、永久的な
発現は、導入された配列の宿主染色体への組込を通じて
起こり得る。 １の具体例において、所望の遺伝子配列を宿主細胞染色
体に組み込むことができるベクターを使用する。導入さ
れたＤＮＡをそれらの染色体に安定に組み込んた細胞は
、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする
１またはそれ以上のマーカーも導入することによって選
択できる。該マーカーは、栄養素要求性宿主に対する原
栄養性、生物殺傷耐性、例えば抗生物質、または銅のご
とき重金属等を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子
は発現されるへきＩ） Ｎ Ａ遺伝子配列に直接連結す
るか、または共トランスフェクションによって同細抱に
導入することかてきる。また、−・本鎖結合蛋臼ｒｎ
ＲＮ Ａの最適合成には、さらなる要素か必要となり得
る。これらの要素はスプライスノブナル、ならびに転写
プロモーター、エンハンサ、および終始ングナルを包含
し得る。かかる要素を一体化するｃＤＮＡ発現ベクター
はオカヤマ・エイチ（Ｏｋａｙａｍａ、 Ｈ，）、モレ
キュラー・アント・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏ１
．Ｃｅ１．Ｂｉｏｌ、）３ ： ２８０（１９８３）に
よって記載されているものを包含する。 好ましい具体例において、導入された配列は受容体宿主
中で自律複製できるプラスミドまたはウィルスベクター
に組み込まれる。広範な種類のへフタ−いずれもこの目
的で使用することかできる。 特定のプラスミドまｆ：はウィルスベクターの選択で重
要な因子は ベクターを含有する受容体細胞かそれによ
り認識され、当該ベクターを含有しない受容体細胞から
選択される容４さ、特定の宿１：中で所望されるベクタ
ーのコピー数、および異なる種の宿主細胞間をベクター
を往来させることかできるのか望ましいか占かを包含す
る。好ましい原核生物ベクターは、（例えば、ｐＢＲ３
２２、Ｃｏ１Ｅ］、ｐｓｃ １０１、ｐＡＣＹＣ１８４
、πＶＸごとく）イー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌ ｉ）中で
複製できるもののごときプラスミドを包含する。かかる
プラスミドは、例えば、マニアティス・ティら（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ、 Ｔ、 、 ｅｔ ａｌ）（モレキュラー
・クローニング、ア・ラホラトリー・マニュアル（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド０スプリング・ハーバ
−・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＰ
ｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（１
９８２））によって開示されている。バチラス（Ｂａｃ
ｉ ｌ １ｕｓ）プラスミドはｐｃ１９４、ｐＣ２２１
、ｐＴ１２７等を包含する。かかるプラスミドはタリノ
ァン・ティ（Ｇｒｙｃｚａｎ、 Ｔ、 ） （す・モレ
キュラー・バイオロジー・オン０ザ０ハチリ（Ｔｈｅ
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆｔｈｅ Ｂ
ａｃｉｌｌｉ）、アカデミアイ・プレス（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃＰｒｅｓｓ）、ニューヨーク州（１９８２）、３０
７〜３２９頁）によって開示されている。適当なストレ
プトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プラスミドは
、ｐｌＪｌｏｌ（ケンタル・ケイ・ジェイら（Ｋｅｎｄ
ａｌ ｌ、 Ｋ、 Ｊ、 。 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オン・バクテリオロジ−（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１６９ ： ４１７７〜４
１８３（１９８７））、およびφＣ３１のごときストレ
プトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）バクテリオフ
ァージ（チャタ−・ケイ・エフら（Ｃｈａｔｅｒ、 Ｋ
、 Ｆ、 、 ｅｔ ａｌ） （シックスス・インター
ナショナル・シンポジウム・オン・アクチ／ミセテイル
ズ・バイオロジー（ＳｉｘｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔａｌｅｓＢｉｏｌｏｇｙ）、アカデミアイ・カイト
（ＡｋａｄｅｍｉａｉＫａｉｄｏ）、ブダペスト、ハン
ガリー（１９８６）、４５〜５４頁）を包含する。シュ
ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）プラスミドはジ
ョン・ジェイ・エフら（Ｊｏｈｎ、 Ｊ、 Ｆ、 、
ｅｔ ａｌ）（レビューズ・オン・ンンフエクシャス・
デイシーズ（Ｒｅｖ、 Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｄｉｓ、 ）
８： ６９３−７０４（１９８６））、およびイザキ・
ケイ（ｌｚａｋｉ、 Ｋ、 Ｘジャパニーズ・ンヤーナ
ル・オフ・パイテリオロジ−（Ｊｐｎ、 Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、 ） ３３： ７２９−７４２（１９７
８））によって総括されている。 好ましい真核生物プラスミドはＢＰＶ、ツクシニア、Ｓ
Ｖ４０，２−ミクロンサークル（ｃｉｒｃｌｅ）等、ま
たはその誘導体を包含する。かかるプラスミドは当該分
野でよく知られている（ホードスティン・ティら（Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎ、 Ｄ、 、 ｅｔ ａｌ）、マイアミラ
ントル・ンンボ（Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ、Ｓｙｍｐ、）
１９ ： ２６５〜２７４（１９８２）、ブローチ・ジ
エイ・アール（Ｂｒｏａｃｈ、 Ｊ、 Ｒ，） ：ザ・
モレキュラー・バイオロジー・オン・ザ・イースト・サ
ツカロミセス・ライフ・サイクル・アンド・インへりタ
ンス（ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
： Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎｈｅｒｉｔａ
ｎｃｅ）、コールド０スプリング・バーバー・ラボラト
リ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ）１ａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨー
ク州、４４５〜４７０頁（１９８１）；ブローチ・シェ
イ・アール（Ｂｒｏａｃｈ、 Ｊ、 Ｒ，）、セル（Ｃ
ｅｌｌ）２８ ： ２０３２０４（１９８２）；ポロン
・デイ・ビイら（Ｂｏｌ Ｊｏｎ、 Ｄ、 Ｐ、 、
ｅｔ ａｔ）、ジャーナル・オン・タリノ・ヘマトル・
オンフル（Ｊ、 ＣＩ ｉｎ、 Ｈｅｍａｔｏｌ、 ０
ｎｃｏ１． ）１０：３９〜４８（１９８０）；マニア
ティス・ティ（Ｍａｎｉａｔ ｉｓ、 Ｔ、 ）、セル
・バイオロジーニア・コンブリヘンンブ・トリーティズ
（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ： ＡＣｏｍｐｒｅｈｅ
ｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ）、３巻、ジーン９イク
スブレ７ヨン（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ア
カデミツク０ブレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）
、ニューヨーク州、５６３〜６０Ｂ（１９８０））。 一旦構築体を含有するベクターまたはＤＮＡ配列を発現
用に調製したならば、形質転換、トランスフエクンヨン
、接合、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿の
ごとき生化学的手段、およびジメチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）テキストランのごときポリカチオンの適用、お
よび電気穿孔、直接マイクロイン／ヱクンヨン、および
マイクロブロンエフティール（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃ
ｔｉｌｅ） （ハイオリスティック （ｂｉｏｌｉｓｔ
ｉｃ）ホンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）
（ジョンストンら（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ）、
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４０（４８５８）：
１５３８（１９８８）等を包含する種々の適当な手段の
うちいずれかによって、該ベクターまたはＤＮＡ構築体
を適当な宿主細胞に導入することができる。 ベクターの導入の後、含ベクター細胞の増殖について選
択する選択培地中で受容体細胞を増殖させる。クローン
化遺伝子配列の発現の結果、ＧＡＰ−４３蛋白が産生さ
れるか、またはこの蛋白の断片が産生される。これは、
形質転換細胞中で、あるいはく例えば、ブロモチオキン
ウラシルを神経芽細胞腫細胞等に投与することによって
）これらの細胞を分化するよう誘導した後、起こり得る
。 発現された蛋白は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動等のごとき
常法に従って単離し精製できる。 また、本発明は、ＧＡＰ−４３またはその断片およびヘ
ーターガラクトンターセのごとき検出可能な酵素、ある
いはいずれかの所望の同種または異種蛋白またはペプチ
ドよりなる融合蛋白をコード付けするクローン化遺伝子
に関する。かかる融合蛋白を産生ずる方法は教示されて
いる。例えば、ハイ・ティ・エイチら（Ｂａｉ、 Ｄ、
ｔｌ、 、 ｅｔ ａｌ）、／ヤーナル・オン・バイ
オロジカル・ケミストリー（ＪＢｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）
２６ ］ ： ］ ２３９５−１２３９９（１９８６）
、またはフィン・ティ・ニーら（Ｈｕｙｎｈ、 ＴＩＪ
、 ｅｔ ａｌ）、ティ・エヌ・エイ・クローニング・
テクニックス、ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮ
Ａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）中のｒｌｇｔｌｏ
およびλｇｔｌｌにおける構築およびスクリーニングｃ
Ｄ Ｎ Ａライブラリーズ（ＣｏｎＳｔｒｕｃｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｃＤＮＡ １−ｉｂ
ｒａｒｉｅｓ）、ティ・グロハー（Ｄ、 Ｇｌｏｖｅｒ
）ｆｔｍ、アイ・アール・エル・プレス（ＩＲＬ Ｐｒ
ｅｓｓ）、オノクスフォ−１’、１９８５．４９〜７７
頁。 ＧＡＰ−４３、その機能的誘導体、またはＧＡＰ−４３
またはその断片および検出可能な酵素または所望の蛋白
もしくはペプチドよりなる融合蛋白は当業者に公知の常
法によって単離できる。例えば、細胞を遠心によって収
集し、または適当な緩衝液で溶解でき、蛋白は、例えば
Ｄ Ｅ Ａ、 Ｅ−セルロース、ホスホセルロース、ポ
リリポ／チ／ル酸−アカロース、ヒトロキ／アパタイト
上のカラムクロマトグラフィーまたは電気泳動もしくは
免疫沈殿によって単離できる。別法として、ＧＡＰ４３
またはその機能性誘導体、またはＧＡＰ４３および検出
可能な酵素または所望の蛋白もしくはペプチドよりなる
融合蛋白は抗−ＧＡＰ−４３抗体の使用によって、また
は検出可能な酵素または所望の蛋白もしくはペプチドに
対する抗体の使用によって単離することかできる。かか
る抗体は、よく知られた方法によって得ることかでき、
そのうちいくつかを後記する。かくして、例えば、ポリ
クローナルウサキ抗−ＧＡＰ−４３血清の調製は本明細
書の実施例部分に開示されている。 本発明のもう１つの具体例は、対Ｇ Ａ Ｐ −４，３
蛋白抗体よりなる。本明細書中で用いる［抗体］（Ａｂ
）または［モノクローナル抗体Ｊ（Ｍａｂ）とは、抗原
を結合できる（例えば、ＦａｂおよびＦ （ａｂ’ ）
。 断片のごとき）無傷分子ならびにその断片を包含するも
のとする。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）、断片は無傷抗体
のＦｃ断片を欠き、循環から急速に消失し、無傷抗体の
低い非特異的組織結合を有し得る（ウオールら（Ｗａｈ
ｌ ｃｔ ａｔ）、ジャーナル・オン・ヌクレイツク・
メティシン（Ｊ、 Ｎｕｃｌ、 Ｍｅｃｌ、 ）２４３
１６〜３２５（１９８３））。 本発明の抗体は種々の方法のうちいずれによっても調製
できる。例えば、ＧＡＰ−４３蛋白、またはその機能性
誘導体を発現する細胞は、ＧＡＰ４３を結合できるポリ
クローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために
動物に投与できる。 最も好ましい方法では、本発明の抗体はモノクローナル
抗体である。かかるモノクローナル抗体はハイブリドー
マ技術を用いて調製できる（コーラ−ら（Ｋｏｈｌ、ｅ
ｒ ｅｔ ａｌ）、不イチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ） ２
５６：４９５（１９７５）；コーラ−ら（Ｋｏｈｌｅｒ
ｅｔ ａｌ）、ニーロビーアン・ツヤ−ナル・オン・
イミュノロ、／’−（Ｅｕｒ、Ｊ、 １ｍｍｕｎｏＬ）
６ ：５１１ （１９７６）：コーラーら（Ｋｏｈｌｅ
ｒ ｅｔ ａｌ）、ニーロビーアン・／ヤーナル・オン
・イミュノロ／−（Ｅｕｒｌ、 １ｍｍｕｎｏ１．）６
２９２（１９７６）、ハマーリングら（Ｈａｍｍｅｒｌ
ｉｎｇ６ｔ ａｌ、）、モノクローナル・アンティホ
ティズ・アンド・ティーセル・ハイブリトーマズ（Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ＴＣｅ
ｌｌ ｔｌｙｂｒｉｄｏｍａｓ）、エルセビエ・エヌ・
ワイ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、 Ｎ、 Ｙ、 ）、５６３〜
６８１頁（１９８１））。一般に、かかる手法はＧＡＰ
４３抗原での動物の免疫化を含む。かかる動物の肺臓細
胞を抽出し、適当な骨髄腫細胞系と融合させる。いずれ
の適当な骨髄腫細胞系も本発明で用いることができる。 融合の後、得られたハイフリトーマ細胞をＨＡＴ培地中
て選択的に維持し、次いて、ワンズ・ンエイ・アールら
（Ｗａｎｄｓ、 Ｊ、 Ｒ，、ｅｔａｌ）（カストロエ
ンテロロン−（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）８
０ ： ２２５〜２３２（１９８１）によって記載され
ているごとき限界希釈法によってクローン化する。次い
て、かかる選択により得られたハイブリドーマ細胞を検
定してＧＡＰ−４３抗原を結合できる抗体を分泌するク
ローンを同定する。 ハイブリトーマ細胞系の寄託 本発明の好ましいモノクローナル抗体はＭＡｂ抗−ＧＡ
Ｐ−４３（ＨＢ）と名付けたモノクローナル抗体の特異
性を有するものである。さらなる具体例として、本発明
は、本発明のモノクローナル抗体を産生ずるハイプリド
ーマ株よりなる。本発明による好ましいハイブリトーマ
細胞系はＨＢと名付け、ＭＡｂ抗−ＧＡＰ−４３（ＨＢ
）と命名したモノクローナル抗体を産生ずる。該Ｈ５細
胞系は、１９８９年１２別２１日に米国、メリーランド
州２０５８１、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、パ
ークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ
） １２３０１、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に寄託し、
受託番号ＡＴＣＣＨＢ １０３１６が与えられた。 本発明の抗体は、フォーワード（ｆｏｒｗａｒｄ）サン
ドイッチ、リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）サンドイッチ、
ンマルテイニアス（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）サンド
イッチアッセイのごときイムノメトリ、クアッセイまた
は「サンドイッチ」アッセイを包含する当該分野で公知
の標準的な免疫診断アッセイで用いるのによく適有する
。本発明の抗体は、当業者か、ＧＡＰ４３抗原またはそ
の同等物についての許容される特異性、感受性、および
正確性の免疫アッセイを行ために不都合な実験を行うこ
となく決定できるごとく、いずれの数の組み合わせで用
いることもできる。 免疫学の一般的原理に関する標準的な文献は、クライン
・ジェイ（Ｋｌｅｉｎ 、 Ｊ、 ）、イミュノロンー
ザ・サイエンス・オン・セルフ−ノンセルフ・ディスク
リミネーンヨン（１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ ５
ｃｉｅｎｃｅｏｆ ５ｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓ
ｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）、ジオン・ウィリー・アンド
・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ）、出
版者、ニューヨーク（１９８２）；ケネノト・アールら
（Ｋｅｎｎｅｔｔ、 Ｒ，、ｅｔ ａｌ）編、モノクロ
ーナル・アンティホディズ、ハイブリドーマニア・二ニ
ー・ティメンンヨン・イン・バイオロジカル・アナリン
ーズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：＾Ｎｅｂ Ｄｉｍｅｎｓｉｏ
ｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＡｎａｌｙＳｅｓ）
、ブレナム−プレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、出
版者、ニューヨーク（１９８０）；ブルドン・アールら
（ＢｕｒｄｏｎＲ，、ｅｔ ａｌ）［、ラホラトリー・
テクニックス・イン・バイオケミストリー・アンド・モ
レキュラー・ハイオロ／−（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉ。 ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ）、１３巻、エルセビエ（Ｅｌｓｅｖｉｅ
ｒ）、出版者、アムステルダム（１９８４）、中のカン
ペル・エイ（Ｃａｍｐｂｅｌ ］、 Ａ、 ）、［モノ
クローナル・アンティホディ・テクノロジー（Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ）を包含する。 「検出する」とは、物質の存在または不存在を測定する
こと、および物質の量を定量することを包含するものと
する。かくして、該語は、定量的および定性的測定につ
いての本発明の物質、組成物、および方法の使用をいう
。 本明細書中に記載したのと同一の特異性のモノクローナ
ル抗体を分ｉ・する他のハイブリトーマの単離は、抗−
イディオタイプスクリーニングの技術によって達成でき
る。ポトスミャ、りら（Ｐｏｔｏｃｍｊａｋ、 ｅｔ
ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２１５： １
６３７（１９８２）。簡単に言えば、抗−イディオタイ
プ抗体は注目するクローンによって産・生された抗体上
に存在する唯一の決定基を認識する抗体である。該抗−
イディオタイプ抗体は、モノクローナル抗体の源として
用いるのと同一の株の動物を注目するモノクローナル抗
体で免疫化することによって調製される。免疫化された
動物は、これらのイディオタイプ決定基（抗−イテイオ
タイプ抗体）に対する抗体を産生ずることによって、免
疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、それに応答
するであろう。単一クローンによって産生されたモノク
ローナル抗体について特異的な、第２の動物の抗−イテ
イオタイプ抗体を用いることによって、免疫化に用いた
他のクローンを同定することができる。２のクローンの
産物のイテイオタイプの同一性は、２のクローンか同一
のエピトープ決定基のそれらの認識に関して同一である
ことを示す。また、抗−イテイオタイプ抗体を「免疫原
」として用いてさらにもう１つの動物において免疫応答
を誘導し、元のＭＡｂに対してエピトープ的に同一であ
る、いわゆる抵−イテイオタイプ抗体を産生させること
かできる。かくして、モノクローナル抗体のエピトープ
決定基に対する抗体を用いることによって、同一のエピ
トープ特異性の抗体を発現する他のクローンを同定する
ことかできる。抗体において、イディオタイプ決定基は
所与のエピトープに結有する超可変領域に存在する。 従、って、本発明のモノクローナル抗体を用いてＢ Ａ
、 Ｌ Ｂ ／ ｃマウスのごとき適当な動物において
抗−イディオタイプＡｂｓを誘導することができる。こ
れらの動物からの牌臓細胞を用いて抗−イディオタイプ
ハイブリドーマ細胞系を産生ずる。 Ｋ Ｌ Ｈにカップリングしたモノクローナル抗−イテ
ィオタイプＡｂｓを「免疫原」として用いてＢＡＬＢ／
ｃマウスを免疫化する。これらのマウスからの血清は、
占められたエピトープについて特異的な元のＡｂの結合
特性を有する抗抗−イテイオタイプＡｂｓを含有するで
あろう。かくして、抗〜イティオタイプＭＡｂｓは評価
されるべきエピトープと構造的に同様なイテイオタイプ
抗原決定基を有する。 複製については、ノ＼イブリット細胞をｉｎνｉｔｒ。 およびｉｎ ｖｉｖｏ双方にて培養することかできる。 高ｉｎ ｖｉｖｏ産生はこれを現在液も好ましい培養方
法とする。略Ｌ′すれば、個々のノ＼イブリット株から
の細胞をプリスタンで初回抗原攻撃を受けたＢＡ Ｌ
Ｂ ／ ｃマウスに腹腔内投与して、高ａ度の所望のモ
ノクローナル抗体を含有する腹水液を産生させる。アイ
ソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのモノクローナル抗体は当
業者によく知られたカラムクロマトグラフィー法を用い
、培養上？登みから精製することかできる。 本発明の抗体は、それを液相で用いることかできるか、
または固相担体に結合させることかできる免疫アッセイ
で用いるのに特に適している。加えて、これらの免疫ア
ッセイにおける抗体は種々の方法で検出可能に標識する
ことかできる。 当該分野では、多くの異なる標識および標識法かある。 本発明で用いることができる標識のタイプ例は、酵素、
放射性同位元素、蛍光化合物、ケミルミネッセンス化合
物、生物ルミネッセンス化合物および金属キレ−１・を
包含するか、それらに限定されるものではない。当業者
ならば、抗体に結合させる他の適当な標識を知っている
であろうし、ルーチン的な実験の使用によってそれを確
認することかできるであろう。さらに、これらの標識の
抗体への結合は当業者に通常知られた標準的な技術を用
いて達成できる。 本発明の抗体を検出可能に標識できる方法の１つは、抗
体を酵素に結合させることによる。後でその基質に暴露
した場合、この酵素は、例えば、分光的または蛍光光度
的手段によって検出てきる化学基を生しるように基質と
反応するであろう。 本発明の抗体を検出可能に標識できる酵素の例はリンコ
酸デヒドロゲナーセ、スタフィロコノカスーヌクレアー
セ、チルターＶ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコ
ールデヒドロケナーセ、アルファグリセリンリン酸テヒ
トロケナーゼ、トリオースリン酸イソメラーセ、ビオチ
ン−アビノンベルオキ／ター上、ホースラティノユペル
オキンターセ、アルカリホスファターセ、アスパラキナ
ーセ、グルコースオキ／ター上、ヘーターカラクト／タ
ーセ、リホヌクレアーセ、ウレアー七、カタラーゼ、グ
ルコース−Ｖｌ−ホスフェ−トチヒドロゲナーゼ、グル
コアミラーセおよびアセチルコリンエステラーセを包含
する。 また、本発明の検出可能に標識した抗体の存在は、ガン
マカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用
のごとき手段によって測定できる放射能活性アイソトー
プで抗体を標識することによって検出できる。本発明の
目的に特に有用なアイソトープは、３）（Ｘ＋２５Ｉ、
３２ｐ、 ３５Ｓ、 ＋４Ｃ１”Ｃｒ、 ３８ＣＱ
、 ”Ｃｏ、”Ｃｏ、”Ｆｅおよび７５Ｓｅである。 また、抗体を蛍光化合物で標識することによって、本発
明の検出可能に標識した抗体の結合を検出することがで
きる。蛍光的に標識した抗体を適当な波長の光に暴露す
ると、染料の蛍光のため、その存在が検出てきる。最も
普通に使用される蛍光標識化合物の中には、フルオロセ
イン、イソチオシアネート、ロータミン、紅藻素、藻青
紫、アロフィコシアニン、０−フタロアルテヒトおよび
フルオレスカミンかある。 また、本発明の抗体はｌ＋２Ｅｕ１または他のランタノ
イド系列のごとき蛍光を発する金属を用いて、検出可能
に標識することもてきる。これらの金属は、ンエチレン
トリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミノ
四酢酸（ＥＤＴＡ）のごとき金属キレート基を用いて抗
体分子に結合させることができる。 また、本発明の抗体は、それをケミルミネッセンス化合
物にカップリングさせることによって検出可能に標識す
ることかできる。次いて、ケミルミネッセンス−標識抗
体の存在は、化学反応の間に生じるルミネッセンスの存
在を検出することによって決定できる。特に有用なケミ
ルミネッセンス標識化合物の例は、ルミナール、イソル
ミナール、セロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔ ｉｃ）ア
クリジニウムエステル、イミダゾール、アクリンニウム
塩およびオキサレートエステルである。 同様に、生物ルミネッセンス化合物を用いて本発明の抗
体を標識することができる。生物ルミネッセンスは、触
媒蛋白かケミルミネッセンス反応の効率を増加させる生
物学系で見い出されるタイプのケミルミネッセンスであ
る。生物ルミネッセンス抗体の存在はルミネッセンスの
存在を検出することによって決定される。標識の目的の
ための重要な生物ルミネッセンス化合物はルシフェリン
、ルンフェラーセおよびエクオリンを包含する。 本発明の抗体および実質的に精製された抗原は、理想的
には、キットの調製に適する。かかる牛。 トは、バイアル、試験官等のごとき１個またはそれ以上
の容器手段を閉じた区画に収容するように仕切った担体
手段よりなり、該容器手段の各々は用いるべきアッセイ
の別々の要素よりなる。 キット形態に一体化できるアッセイのタイプは多くあり
、例えば、競合アッセイおよび非競合ア。 セイを包含する。本発明の抗体を利用できるアッセイの
典型的な例はラジオイムノア、セイ（ＲＩＡ）、酵素イ
ムノアッセイ（ＥＩＡ）、免疫酵素法（ＥＬＩＳＡ）、
イムノメトリック、またはサンドイッチ、イムノアッセ
イである。 「イムノメトリックアッセイ」または［サンドイッチイ
ムノア、セイ」なる語とは、７マルテイニアス（ｓｉｍ
ｕｌｔａｎｅｏｕｓ）サンドイッチ、フォーワード（ｆ
ｏｒｗａｒｄ）サンドイッチおよびリバース（ｒｅｖｅ
ｒｓｅ）サンドイッチイムノアソセイを包含するものと
する。これらの語は当業者に十分理解されるであろう。 また、当業者ならば、本発明の抗体は他の変法および現
在公知であるまたは将来開発されるであろうアッセイ形
態において有用てあことを理解するであろう。これらは
本発明の範囲内に包含されるものとする。 フォーワード・サンドイッチ・アッセイは、例えば、米
国特許第３８６７５１７号、第４０１２２９４号および
第４３７６１１０号に記載されている。リバース・サン
トイ、チ・アッセイは、例えば、米国特許第４０９８８
７６号および第４３７６１１０号に記載されている。 当該アッセイを実行する好ましい態様においては、ある
種の「遮断薬（ｂｌｏｃｋｅｒ） Ｊをインキュヘーシ
ョン媒質に存在させることか重要である（通常、標識し
た可溶抗体と共に添加する）。該こ遮断薬」を添加して
、非特異的蛋白類、プロテアー七、または実験試料中に
存在するマウス免疫グロブリンに対するヒト抗体か、同
相支持体上の抗体、または放射能標識した抗体を架橋さ
せたりそれを破壊して誤った陽性結果または誤った陰性
結果を生じないことを確認する。従って、「遮断薬」の
選択は、本発明で記載したアッセイの特異性を実質的に
増加させる。 アッセイで用いるものと同一のクラスまたはサブクラス
（アイソタイプ）の多数の無関係ないくすなわち、非特
異的）抗体（例えば、Ｉ ｇ Ｇ ＋、１ｇＧ２．、Ｉ
ｇＭ等）を１遮断薬」として用いることかできる。適当
な感度を維持し、ヒト血清中で交差反応性蛋白を相互に
生じることによる望まない干渉を抑制するには、「遮断
薬」の濃度（通常１〜１００マイクログラム／マイクロ
リツトル）か重要である。加えて、「遮断薬」を含有す
る緩衝液系は最適化されることを要する。好ましい緩衝
液は、生理学的ｐ Ｈ範囲におけるイミタゾール、ＨＥ
ＰＰＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ト（Ｅ
ＰＥＳ、Ｐ Ｉ ＰＥＳ、ＴＲＩ Ｓ等のごとき弱有機
酸をヘースとするものである。幾分かは好ましくない緩
衝液は、リン酸塩、ホウ酸塩または炭酸塩のごとき無機
緩衝液である。最終的には、公知のプロテアーセ阻害剤
を、「遮断薬」を含有する緩衝液に（通常０．０１〜１
０マイクログラム／ｍＱで）添加すべきである。 これまでに使用されてきた、および本発明で用いること
かできる多くの固相免疫吸着剤かある。 よく知られた公知の免疫吸着剤は、チューフ、ビーズの
形態のガラス、ポリスチレン、ポリフロピレン、テキス
トラン、ナイロンおよび他の材料、およびかかる材料か
ら形成したまたはそれて被覆したマイクロタイタープレ
ートを包含する。固定化抗体は、アミドまたはエステル
結合を介する共有結合のごとき技術、あるいは吸着によ
って、同相免疫吸着剤に共有結合によりまたは物理的に
結合させることができる。当業者ならば、多くの適当な
固相免疫吸着剤およびその上に抗体を固定化する方法を
知っているであろうし、ルーチン的な実験を用いるたけ
て、それを確認することかできるであろう。 ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ５ｉｔ
ｕ診断については、放射性核種のごとき標識を、直接的
にまたは媒介官能基を用いることによって、本発明の抗
体に結合させることができる。金属カチオンとして存在
する放射性同位元素を抗体に結合させるのにしばしば用
いる媒介基は／エチレントリアミノ四酢酸（ＤＴＰＡ）
である。このようにして結合される金属チオンの典型的
な例は： ９９ ｍ Ｔ ｃ、１２３■、■１１ Ｎ、
＋３１）、 ９’ｌＲｕ、 ８７ＣｕＳｌ１７Ｇａお
よび”Ｇ ａである。また、本発明の抗体は診断目的の
非放射性同位元素で標識することもてきる。この方法で
特に有用な元素は＋５７Ｇｃｌ、”Ｍｎ、＋８２Ｄｙ、
”Ｃｒおよび５６Ｆｅである。 また、本発明の抗体は、本発明の抗体と反応性のエピト
ープを件うＧＡＰ−４３抗原を発現する良性または癌性
新形成のごとき障害を有するヒトを包含する動物におい
て免疫療法で用いることかできる。 免疫療法で用いる場合、本発明の抗体は治療剤で標識し
なくても標識してもよい。免疫療法て本発明の抗体にカ
ップリングできる治療剤の例は、放射性同位元素、レク
チンおよびトキ／ンである。 レクチンは特異的糖部値に結有する、通常、植物材料か
ら単離した蛋白である。また、多くのレクチンは細胞を
凝集させ、リンパ球を刺激することかてきる。す／ンは
免疫治療で用いられてきた毒性レクチンである。この使
用はく毒性の原因とナルリンンのアルファーペプチド鎖
を抗体分子に結合させて毒性欠損の部位特異的デリバリ
を可能とすることによって達成される。これは、例えば
、ビテノタら（Ｖｉｔｃｔｔａ ｅｔ ａｌｌｆイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３８ ： ］ ０９８（１９８
７）、およびパスタノら（Ｐｓａｔａｎ ｅｔ ａｌ）
、アトハ＋アレルキー（ＡｄｖΔｌｌｅｒｇｙ）４７
： ６４１ （］ ９８６）に記載されている。 トキノン類は、十分な用量であるとしばしば死に至らし
める、植物、動物または微生物によって産生される有毒
性物質である。例えば、ンフテリア）・キノンはコリ不
ハクテリウｊトンフチリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｅｔｅｒ
ｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）によって産生される蛋
白である。このトキシンは適当な条件下で分離できるア
ルファおよびベータサブユニットよりなる。該トキシン
のアルファ成分は抗体に結合し、部位特異的デリバリに
用いることができる。 免疫療法で用いる本発明の抗体に結合できる放射性同位
元素の例は： ”’Ｕｍ、 ＋３’Ｉ、”Ｙ、＠’ＴＣ
ｕ、！＋７Ｂｉ、を目Ａ ｔ 、 ””Ｐ ｂ、 ４７
Ｓ ｃおよび１０”Ｐｄである。 勿論、発現されたＧＡＰ−４３は、通常、細胞膜内に閉
じ込められている。従って、当業者ならば、本発明の抗
体を用いるｉｎ ｖｉｖｏ診断法および治療法は、かか
る抗体か細胞内膜上のＧＡＰ−４３を検出できるメカニ
ズムをいくらか必要とすることを理解するであろう。１
のかかる方法は、抗体またはその断片を細胞膜に導入す
るか、または細胞膜を通過させて細胞自体の中へ導入す
ることである。これは、例えば、標的細胞がそれに対し
てレセプタ一部位′を含有するりカントに抗体を結合さ
せることによって達成できる。かくして、当該抗体は、
リカントと共に細胞膜内に輸送されるか、または細胞膜
を通過することができる。 担体リガンドの選択は、当業者に理解されるごとく、い
くつかの因子に依存する。これらは、例えばリガンドお
よびそのレセプターの、および受動または能動を含む全
輸送の速度論を含み、活性化されて輸送されるリガンド
か好ましい。また、抗体をリガントに結合させる手段は
制限内で変化し、例えば、共有結合またはイオン結合と
することができるか、かかる結合はりガント−レセプタ
ーの親和性を許容されない程度に変化させるべきでない
ことを銘記すべきである。 かかる適用に適したレセプターの例はレセプターの飲食
作用について必要な情報をすべて含有することが示され
ている（デイビスら（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ）、ジャ
ーナル・サブ・セリュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１
ｌ Ｂｉｏｌ、） １０７ （６／ ３） 、アブスト
ラクト番号３１１２（１９８８）低密度リポ蛋白（ＬＤ
Ｌ）に対するレセプター、ならびにドーパミンについて
のもののごとき公知の脳−特異的レセプターを包含する
。この点に関し、リカンドはそれ自体で、本発明の抗体
かそれに対して結合し得るレセプターに特異的な抗体ま
たは断片となり得ることか理解されるであろう。 更に、当業者ならば、リガンド−レセプター相互作用に
干渉しないようであり、かつ容易に細胞膜を通過し得る
（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片のごとき）本
発明の抗体断片を使用するのが特に望ましいことを見い
出すであろう。当業者に理解されるであろうごとく、−
車路抗体がこれらのおよび他の理由で好ましいであろう
。 抗体が前記したごとく細胞膜内にまたは細胞内に輸送さ
れるべき場合、抗体がＧＡＰ’−４３蛋白上のその抗原
部位に結有するときに標識が比較的より効果的となるよ
うに診断または治療に際して抗体を標識するのが好まし
いであろう。これは、例えば、抗原−抗体コンプレック
スの形成の結果、活性または検出可能となる標識を使用
することによって達成できる。別法として、抗原−抗体
コンプレックスの形成か抗体のフンフォメーションの変
化を誘導してまた暴露されていないまたは十分には暴露
されていない標識を暴露したりまたは十分に暴露するよ
うに抗体自体を標識することかできる。前記基準および
その他のすべては本発明のこれらの態様を実施するに際
し当業者に明らかであろう。 また、本発明の抗体を有するリポソームをそれらの膜内
で利用して当該抗体を標的領域に特異的に輸送すること
もできる。これらのリポソームは、それらが、当該抗体
以外に、標的部位で放出されるであろう薬剤、放射性同
位元素、レクチンおよびトキシンのごとき免疫療法剤を
含有するように製造することができる。 抗体、および好ましくはＧＡＰ−４３をコード付けする
ヌクレオチド配列（およびその機能的および化学的誘導
体）を診断または治療目的で神経細胞に導入するもう１
つの好ましい方法は、レトロウィルスを包含するウイル
スベクターの使用ニよる。適当なウィルスの例として、
種々のヘルペスウィルスを挙げることかできる。適当な
ウィルスは、ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）を包含
する。他の適当なウィルスおよびレトロウィルスは当業
者によく知られている。哺乳動物細胞に遺伝子を導入す
るためにウィルスベクターを使用することは、例えば、
ハルマス（Ｖａｒｍｕｓ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）２４０（４８５８）： １４２７（１９８８）：エ
グリティスら（Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ）、バイオ
テクニックス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）６． ７
： ６０８ （１９８８）：ジェーニソンーＬ （Ｊ
ａｅｎｉｓｃｈ）サンエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４０
（４８５８）： １４６８（１９８８）：およびヘルン
／ユタインら（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ、 ａり、シ
ェ不テノクス・エンジニアリング・ニューズ（Ｇｅｎｅ
ｔ、Ｅｎｇ、ＸＮ、Ｙ、）７ ： ２３５（１９８５）
で総括されている。 本発明の目的では、弱毒化したウィルスまたはレトロウ
ィルス株を使用するのか好ましいでろう。 かくして、例えば、本発明の抗体またはＤＮＡ配列のた
めのベクターとして、ＣＤ４−依存メカニズム（フンケ
ら（Ｆｕｎｋｅ ｅｔ ａｌ）、ンヤーナル・オン・エ
クスベリメンタル・メティンン（Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅ
ｄ、 ） １６５ ： １２３０（１９８７））によっ
て神経細胞に侵入するＨＩＶ−２ＳＴ（コンブら（Ｋｏ
ｎｇ ｅｔ ａｌ）づンエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４
０（４８５８）： １５２５（１９８８乃またはＨＩＶ
−２ｕｃ、（エバンズら（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ）、
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４０ （４８５８）
： １５２３（１９８８））のごとき弱毒化細胞変性（
ｃｙｔｏｐａｔｈｉｅｉｔｙ）を有するレトロウィルス
を用いることかてきる。ＨＩＶ感染の神経生物学は、例
えば、ジョンメンら（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ）、
エフ・エイ・ニス・イー・ビイ・ジャーナル（ＦＡＳＥ
ＢＪ、）、 ２（１４）： ２９７０（１９８８）に
記載されている。当業者ならば、ルーチン的技量の努力
によって、ウィルスに対し公知の感受性を有する異なる
神経集団を標的とすることかできるであろう。 例えば、ＣＤ４はヒト脳において変異転写体を有するこ
とか知られており、前脳で含有量か最大である（マトン
ら（Ｍａｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ）、セル（Ｃｅｌ ｌ）
４７ ：３３３（１９８６）。 理想的には、遺伝子プリン＼り系の選択は、Ｍｉ織に適
した方法により、遺伝子の発現が適当なレベルであって
いずれの逆効果もなく、効果的かつ安定な遺伝子移送の
目的を銘記しつつ、当業者によってなされるであろう。 例えば、ウオルフら（Ｗｏｌｆｆｅｔ ａｌ）、リコー
ム・ディス・クリソ・ノース・アム（Ｒｈｅｕｍ、Ｄｉ
ｓ、Ｃｌ１ｎ、Ｎｏｒｔｈ Ａｍ、） １４ （２）
： ４５９（１９８３）参照。中枢神経系標的へのプリ
ン＼りに関しては、ＨＩ Ｖを包含する多くのウィルス
ベクターか血液脳関門を通過できる利点を提供する（ジ
ョンメンら（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ）、エフ・エ
イ・ニス・イー・ビイ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ Ｊ、
）２ （１４）： ２９７０（１９８８））。 標識したプローブを用いるラットＧＡＰ−４３の単離に
ついて前記した方法に従い、ＧＡＰ−４３をコード付け
するＤＮＡ配列、ま１こはその断片をＤＮＡプローブと
して用いて、ヒトにおける対応抗原を単離することがで
きる。次いて、ヒト抗原遺伝子をクローン化し、宿主で
発現させてヒト抗原を得ることかできる。次いで、この
ヒト抗原を、対応する自己抗体についての、およびヒト
を包含する動物の治療処置についての診断アッセイで用
いることかできる。 本発明者らは、Ｇ Ａ Ｐ−４３遺伝子の発現を制御す
る調節メカニズムを明らかにすへく設計１７た実験を行
った。ＧＡＰ−４３発現の変調は、中枢神経または末梢
神経組織の損傷、疾患または機能障害に罹ったヒトを包
含する哺乳動物を治療処置てきる便利で効果的な方法を
提供する。さらに、本発明による、ヒトを包含する哺乳
動物における通常の中枢または末梢神経組織で構造再編
成を変調する方法は、ニューロンの構造および機能のメ
カニズムをさらに明らかにする点て当業者にとって太い
に役立ってあろう。 神経学的病気または障害の治療における本発明の前臨床
治療的使用または臨床治療的使用は、診断および処置の
許容される原理を用いて、当業者により最善に達成され
るであろう。かかる原理は当該分野で公知であり、例え
ば、ビーターストルフ・アール・ンイら（Ｐｅｔｅｒｓ
ｄｏｒｆ、Ｒ，Ｇ、 ｅｔ ａｌ）ｍ、ハリスンズ・プ
リン／プル・オン・インターナル・メテインン（ｔｌａ
ｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ ｏｒ Ｉｎ
ｔｅｒｎａＭｅｄｉｃｉｎｅ）、第１０版、マグロ−ヒ
ル（ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ）、出版者、ニューヨーク、
ニューヨーク州（１９８３）、特にその文献のパートＡ
、セクション１１の「中枢神経系の障害（Ｄｉｓｏｒｄ
ｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅＣｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ
Ｓｙｓｔｅｍ）Ｊなる標題の部分に記載されている。 本発明の抗原、抗体および組成物、またはそれらの機能
的誘導体は医薬組成物の調製によく適有する。本発明の
医薬組成物は、本発明の化合物の有用な効果を享受でき
るいずれの動物に投与することもできる。かかる動物の
中で第１にはヒトであるか、本発明はそのように限定さ
れるものではない。 本発明の医薬組成物はその意図する目的を達成するいず
れの手段によって投与することもできる。 例えば、投与は非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内
、経皮、またはバッカル経路によって投与できる。別法
として、または同時に、投与は経口経路によって行うこ
とができる。投与すべき用量は受容者の年令、健康、お
よび体重、同時治療の種類、もしあれば、治療の頻度、
および所望する効果の性質に依存する。 薬理学的に活性な化合物に加え、新しい医薬製剤には、
活性化合物を医薬に使用できる製剤中に入れて加工する
のを容易とする賦形剤および添加剤よりなる適当な医薬
上許容される担体を含有させることができる。好ましく
は、製剤、特に錠剤、糖衣錠、およびカプセル剤のごと
き経口投与できる製剤および好ましい投与タイプで用い
ることができる製剤、および生薬のごとき直腸投与でき
る製剤、ならびに注射による投与に適した液剤には、賦
形剤と共に、活性化合物約０．００１ないし約９９パー
ント、好ましくは約０．０１ないし約９５パーセントを
含有させる。 本発明の組成物投与ための用量範囲は所望の効果を生じ
るのに十分な程犬であり、それにより、例えば、腫瘍性
組織は減少するか排除されあるいは改善される。用量は
、望まない交差反応、アナフィラキシ−反応等の逆効果
を引き起こすほど大であってはならない。一般に、用量
は患者の年令、状態、性及び病気の程度により変化する
。逆兆候（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）、も
しあれば、免疫寛容および他の変数もまた適切な用量に
影響するであろう。抗体は注射または時間をかけての徐
々に行う大量注入（ｐｒｏｆ ｕｓ １ｏｎ）によって
非経口投与できる。 また、本発明の抗体は静脈内、イントラバレントラリ（
ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌの、筋肉内または皮
下投与できる。 本発明の医薬製剤は、それ自体公知の方法、例えば、通
常の混合、顆粒化、糖衣作成、溶解、凍結乾燥工程によ
って製造できる。かくして、経口使用のための医薬製剤
は、活性化合物を固体賦形剤と合し、所望により、得ら
れた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工し、所望によ
りまたは要すれば、適当な添加剤の添加の後に錠剤また
は糖衣錠のコアを得る。 適当な賦形剤は、特に、糖類のごとき充填剤、例えばラ
クトースまたはスクロース、マンニトールまたはソルビ
トール調製物および／またはリン酸カルンウム、例えば
リン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム、なら
びに、例えばトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジ
ャガイモ澱粉、セラチン、トラガカント、メチルセルロ
ース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキ
シメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビ
ニルピロリドンを用いる澱粉ペーストのごき結合剤であ
る。所望ならば、前記澱粉およびカルボキシメチル−澱
粉、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン
酸またはアルギン酸ナトリウムのごときその塩のような
崩壊剤を添加することができる。添加剤は、前記したち
のすべて、流動調節剤および滑沢剤、例えば、シリカ、
タルク、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム
もしくはステアリン酸カルシウムのごときその塩、およ
び／またはポリエチレングリコールである。 糖衣錠コアには、所望ならば、胃液に対して耐性の適当
なコーティング剤を施す。この目的には、所望により、
アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエ
チレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカ
ー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含有さ
せてもよい濃い糖溶液を用いることができる。胃液に対
して耐性のコーチインク剤を得るには、アセチルセルロ
ースフタレートまたはヒドロキンフロビルメチルセルロ
ースフタレートのごとき適当なセルロース調製物の溶液
を用いる。染料または色素を、例えば、同一性のため、
または活性化合物用量の組み合わせを特徴付けるために
錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる
。 経口的に用いることができる他の医薬製剤は、ゼラチン
でつくったブノンユ フィツト（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カ
プセル剤、ならひにセラチンおよびグリセロールまたは
ソルビトールのごとき可塑剤でつくった柔軟で密封した
カプセル剤を包含する。該プラン。 フィ、トカプセル剤には、ラクトースのごとき充填剤、
澱粉のごとき結合剤、および７／またはタルクまたはス
テアリン酸マグネシウムのごとき滑沢剤、および所望に
より安定剤と混合できる顆粒形態の活性化合物を含有さ
Ｕることかできる。ソフトカプセル剤においては、活性
化合物は、好ましくは、脂肪油または流動パラフィンの
ごとき適当な液体に溶解または懸濁できる。加えて、安
定剤を添加することもてきる。 経直腸的に使用できる可能な医薬製剤は、例えば、１種
またはそれ以上の活性化合物と生薬基剤との組み合わせ
よりなる生薬を包含する。適当な生薬基剤は、例えば、
天然または合成トリグリセリド、パラフィン炭化水素で
ある。加えて、活性化合物と基剤との組み合わせよりな
るセラチン直腸カプセル剤を用いることもできる。５Ｊ
能な基剤は、例えば、液状トリグリセリｉ・、ポリエチ
レングリコール、またはパラフィン炭化水素を包含する
。 非経口投与用の適当な処方は、水溶性形態、例えば水溶
性塩である活性化合物の水性溶液を包含する。加えて、
適当な油性注射懸濁剤としての活性化合物の懸濁剤を投
与することかできる。適当な脂肪親和性溶媒またはビヒ
クルは脂肪１１１］、例えばコマ油、または合成脂肪酸
エステル、例えばオしイン酸エチルまたはトリグリセリ
ドを包含する。 水性注射懸濁剤には、懸濁剤の粘度を増加させる物質、
例えばカルホキジメチルセルロースナトリウム、ソルビ
トール、および／またはテキストランを含有させること
ができる。所望により、該懸濁剤には安定剤を含有させ
ることもてきる。 本発明のＧＡＰ−４３抗原はニューロン細胞に対してユ
ニークであり、かくして、便利で有用なマーカーを提供
する。従って、ＧＡＰ−４３に定方向化された抗体は当
業者によく知られた種々の技術で用いてニューロン細胞
を同定することかできる。さらに、本発明の抗体は新形
成およびニューロン起源の他の障害の検出、測定および
治療処置を可能とし、ヒトを包含する動物において癌お
よび他の障害の前臨床および臨床評価および治療のため
の、便利で有用なｉｎ ｖｌｖｏ、、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
またはｉｎ ５ｉｔｕ診断および治療方法を提供する。 本発明の抗原は、本発明の抗体を使用して、実質的に純
粋な形態て単離できる。かくして、本発明の具体例は実
質的に純粋な抗原ＧＡＰ−４３を提供し、該抗原は本発
明の抗体によって認識されかつそれに結有する点で特徴
付けられる。もう１一つの具体例において、本発明は、
ＧＡＰ−４３に定方向化された１種またはそれ以上の抗
体と該抗原とてコンプレックスを形成することによって
、ＧＡＰ−４３抗厚を単離しまたは精製する方法を提供
する。 本発明の実質的に純粋な抗原ＧＡＰ−４３は、脳を髄液
、血清または尿のごとき試料において対ＧＡＰ−４３抗
体を検出しまたは測定するのに用いることかできる。か
くして、本発明の１の具体例は、ＧＡＰ−４３抗原に対
する抗体を含有する試料と検出可能に標識されたＧＡＰ
−４３とを接触させ、次いて該標識を検出することを特
徴とする該試料中のＧ Ａ Ｐ−４３抗原に対する抗体
の存在またはその爪を測定する方法よりなる。Ｇ Ａ、
Ｐ４３の免疫反応性画分およびＧＡＰ−４３の免疫反
応性同族体も用いることかできることか理解されるであ
ろう。「免疫反応性画分−・なる詔は、ＧＡＰ−４３に
定方向化された抗体に対し同等の免疫応答を示すＧ Ａ
、 Ｐ −４３抗原のいずれの部分もいうものとする。 ［免疫反応性同族体、′なる語は、１個またはそれ以上
のアミノ酸だけＧＡＰ〜４３蛋白とは異なるか、本発明
の抗体に対し同等の免疫応答を示す蛋白をいうものとす
る。 本発明のなおさらにもう１つの態様において、ＧＡＰ−
４３蛋白は、ＧＡＰ−４３蛋白を細胞膜へ、特にニュー
ロン細胞の成長円錐の領域へ定方向化する新規な膜−タ
ーゲノティングペプチドドメインを含有することか判明
した。この膜−ターゲソティングドメインの構造を決定
し、該ペプチドは（通常は膜連結でない）通常は細胞質
ゾルの蛋白を細胞膜へ定方向化するのに効果的なことが
示された。本発明の詳細な説明する実験は明細書の実施
例■に詳細に記載する。 本発明の本態様の組成物および方法により、とりわけ、
通常は膜連結でない蛋白を含むいずれの所望の蛋白も細
胞膜へ定方向化することかできる。 更に、本発明の本態様の組成物および方法は、動物にお
ける、神経学的損傷および障害のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉ
ｎ ｖｉｖｏ、およびｉｎ ５ｉｔｕ冶療処置て利用で
きることは明らかである。当業者ならば、診断および治
療方法のこれまでの記載は本発明の本具体例に等しく適
用されることを理解するであろう。さらに、本発明の膜
−ターゲツティングペプチドはいずれの所望の蛋白また
はペプチドを細胞膜へ定方向化することにも使用され、
かくして、同様に、非神経学的指標において診断および
治療で使用されることも明らかである。かかる指標の例
は、細胞の膜か免疫学的指標のごとき重要な役割を演じ
るいずれの適用も包含するが、それらに限定されるもの
ではない。 本発明を実施する態様および方法は以下の実施例を参照
して当業者に十分に理解されるだろうか、これらの実施
例は、断して、本発明の範囲または請求の範囲を限定す
るものではない。 （実施例） 実施例Ｉ ラットＧＡＰ−４３についてのｃＤＮＡのクロニング １７日令胎由来のう・７ト後根神経節のＲＮＡからｃＤ
ＮＡライブラリーを得、λｇｉｌ１発現へフタ−中にク
ローニングした［ヒュインフ（Ｈｕｙｎｈ）ら、「ディ
ーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプ
ローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌＡｐｐｒｏａｃｈ） Ｊ、デイ・エム・クローンゞ
−（Ｄ、 Ｍ、 Ｇｌｏｖｅｒ）編（アイアールエル・
プレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、ワシントン・デイ−・
シー、１９８５）ｐｐ、 ４９−７８］。３つの推定Ｇ
ＡＰ−４３クローンを、スナイプス（Ｓｎｉｐｅｓ）ら
のＳｏｃ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ａｂｓｔｒ、 １２：
５００ （１９８６）によって記載されたＧＡＰ−４３
に対する抗体を用いて同定した。最長クローン、ＧＡＰ
４３−２の同定を、ハイブリッド選択翻訳法によって確
実とした（第１図）。ＧＡＰ４３−２は、ハイブリダイ
ゼーションによって、天然ＧＡｌ”４３、すなわち約４
３ｋＤの分子サイズの予測される移動度で５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドケル中を移動するポリペプチドの翻訳を
方向付けるメ、センンヤーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を選択し
た。このｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物をＧＡＰ−４３に対
する抗体によって選択的に免疫沈降させた。免疫沈降の
特異性は、非標識化精製ＧＡＰ−４３との競合によって
証明した。さらに確認のために、精製したＧＡＰ−４３
の臭化／アン分解によって調製したペプチドを配列化し
た。 該配列、Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ
４．ｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−ＧｌｕＡｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｙｓ−１ｉｅは、ＧＡＰ４３−２の予想されたオーフン
リーティングフレームの範囲内に完全に含まれている（
該Ｘは、アミノ酸の同一性か確実に決定され得ない配列
決定のサイクルを表す）。 ＧＡＰ４３−２の完全なヌクレオチド配列および予測さ
れるアミノ酸配列を第２図に示す。ｌ／−ディングフレ
ームは、配列決定されたベプケトフラグメ／トを含んて
おり、λｇｉｌｌのβ−カラクト／ターセ遺伝子と同一
のリーディングフレーム中にある。［ラットＧＡＰ−４
３に関するｃＤＮＡは、スキｍ＝（Ｊ、 ）ｉ、 Ｐ、
５ｋｅｎｅ）および彼の同僚（ハ／（Ｇ、Ｂａ５ｉ）
、ヤコブソン（Ｒ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ）、ビラグ（ＩＶ
ｉｒａｇ）、スキｍ＝＜Ｊ、 Ｈ，Ｐ、 ５ｋｅｎｅ）
、私信）によって独立して得られた。該配列のコピーを
交換した。 本発明の予測されるアミノ酸配列は、スキｍ＝（ＪＨ，
Ｐ、 ５ｋｅｎｅンによって提供さねたちのと完全に一
致し、ヌクレオチド配＋ｌｊは、３′非針訳領域におけ
る１っの位置たけ相異する。］オーブンリーディングフ
レームの開始と一致するメチオニンは、ヌクレオチド位
置１３のイン・フレーム（ｉｎ（ｒａｍｅ）停止コドン
（ＴＡＡ）の後の最初のメチオニンであり、真核生物の
翻訳を開始するのに最も有利な前後関係とするためにコ
サツク（Ｋｏｚａｋ）のセル（Ｃｅｌｌ）４４：２８３
（１，９８６）によって示唆された９つのヌク１／オ
チトコンセンサス配列のうちの８つによって囲まれてい
る。これは、ＧＡＰ−４３コーデイング領域の最初の残
基であることを示唆する。しかし、該情報は、この帰属
を明確とするには不十分てあり、従って、第２のメチオ
ニン（アミノ酸５）は、この役割を果す可能性かある。 Ｇ Ａ Ｐ−４３の予測される組成は、高極性であり、
明白な膜内外ドメインまたは可能なＮ−結合グリコンル
化部位を有していない。この組成は、Ｇ Ａ Ｐ−４，
３か膜連結性であるか、膜浸透化なしては抗体認識に達
しにくいという観察と一致しており「メイツ（Ｍｅｉｒ
ｉ）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３：３５３７ （１９８
６）］ ｉかくして、これは膜の内部表面に連結してい
るかもしれない。 オープンリーディングフレームからのＧＡＰ）４３蛋白
の予測される分子サイズは２４ｋＤであり、これは、５
ＤＳ−ボ１ノアク１フルアミドケル中の分子の見掛の分
子サイズとしてスキｍ＝（Ｓｋｅｎｅ）およびライリア
ーＦ Ｑｉｌｌｉａｒｄ）によって最初に観察された４
３ｋＤより小さい［スキｍ＝（Ｓｋｅｎｅ）およびウイ
リアート（Ｗｉｌｌｉａｒｄ）、ンヤーナル・イン・セ
ル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）８９：
８６ （１９８１）、同上、ｐ、 ９Ｂ］。ＧＡＰ−４
３の見掛の分子サイズはポリアクリルアミド１１度に依
存するので、該分子サイズは不確かであり［ヤコブソン
（Ｊ ａｃｏｂｓｏｎ）ら、ジャーナル・イン・ニュー
ロサイエンス（ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ） ６：１８４３
（１９８Ｂ）］、この蛋白か、ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル上で変則的に移動する蛋白の範鴫に入ることを示
唆するＬノーンカー（Ｂａｎｋｅｒ）ら、／ヤーナル・
イン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ
、 Ｃｈｅｍ、 ）、２４７：５８５６（１９７２）バ
ーフン（Ｐｅｒｓｓｏｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ） ２２５６８７ （１９８４） ；スマート（Ｓ
ｍａｒｔ）ら、）＜イロロシー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）
１１２ニア０３ （１９８１）］。この特性は、１ｎｖ
ｉｔｒｏ翻訳産物か天然ＧＡＰ−４３の移動度と同様の
移動度を有するので、翻訳後の修飾によるとは思われな
い（第１図）。 推定上のオープンリーディングフレームの範囲内てコー
ド付けされる蛋白の５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル移
動特性に関する情報を収集するために、ノルトン（Ｍｅ
ｌ ｔｏｎ）らのＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５
１２ニア０３５ （１９ｇ４）の方法によって、ハタテ
リオファ−ンＳＰ６ プロモーターを用いて、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写系においてｃＤＮＡからＧＡＰ−４３Ｒ
ＮＡを合成した。５ａｕ３Ａ部位、すなわち予測される
オープンリーディングフレームの端部の６５塩基３“側
で切断したｃＤＮＡを転写することによって８００＝塩
基ＲＮ Ａを得（第２図）、ｃＤＮＡの３′末端のポリ
リンカー領域におけるＨｉｎｄＴ１１部位で切断するこ
とによって１１００−塩基ＲＮＡを得た。８００−塩基
ＲＮＡおよび１１００１塩基ＲＮＡの両者は、網状赤血
球溶解産物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏて關訳し、１５％
５ＤＳ−ポリアクノルアミドケル上で分析すると見掛分
子サイズか４０ｋＤであるポリペプチドの合成を指令し
た。 両方の場合の４Ｃ１−ｋＤ翻訳産物を、対ＧＡＰ４３抗
体を用いて免疫沈降した。新生児ラット脳ＲＮＡからｉ
ｌ ｖｉｔｒｏ合成したＧＡＰ−４３は、これらの翻訳
産物と一緒に移動した。 ＧＡＰ−４３か成長円錐の機能に対して重要であるとい
う確信に関する証拠としては、成長円錐膜中の蛋白の豊
富さ［メイツ（Ｍｅｉｒｉ）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８３
：３５３７ （１９８６） ；スキｍ＝（Ｓｋｅｎｅ）
ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３３ニア８３
（１９８６）］、および発育および再生する神経におけ
る蛋白の輸送の増大［スキニ（Ｓｋｅｎｅ）およびウイ
リアート（Ｗｉｌｌｉａｒｄ）、ジャーナル・イン・セ
ル・バイオロン−（Ｊ、 Ｃｅｌ ］。Ｂｉｏ１． ）
８９・８６ （１９８１）、同書、ｐ、 ９６１か挙げ
られる。ＧＡＰ−４３遺伝子発現か神経突起の伸長と協
同して調整されるか否かを調へるために、その発現をＰ
Ｃ１２細胞において試験したか、そこでは神経突起の突
出は神経発育因子（ＮＧＦ）によって促進され、アテノ
ンン３’、 ５’〜モノホスフエート（ｃＡＭＰ）によ
ってはそれ程ではなかった。これらの薬物は神経突起の
突出を誘導する際に異なった機構によって作用する［カ
ニング（Ｇｕｎｎｉｎｇ）ら、ンヤーナル・イソ・セル
＋バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、） ８９：
２４０ （１９８１）］。いずれかの薬物によって誘導
される神経突起成長には、ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡレベル
の増加が伴い、両薬物に暴露された細胞で増加が最大で
ある（第３図）。 通常の成長期間のＧＡＰ−４３遺伝子の発現のパターン
を決定するために、全細胞性ＲＮＡを、１３日令胎、１
７日令胎、新生児、および成体ラットの脳、抜根神経節
、心臓、および肝臓から単離した。神経−特異的方法で
、ＧＡＰ−４３を発現させた（第４図）。全ての年令で
、約１５００ヌクレオチドの主要なハイブリタイズする
バンドは、ニューロン組織中たけで見える。本発明者ら
はケノミソクＧＡＰ’−４３遺伝子かイントロン配列を
含有していることを見い出したので、かすかな、大きい
分子サイズのハンドは、スブラインングしていない前駆
体分子に対応し得る。ＧＡＰ−４３はニューロン中に位
置するのて［メイツ（Ｍｅｉｒｉ）ら、ＰＮＡＳ ’Ｊ
ＳＡ ８３：３５３７ （１９８６）コ、ニューロン組
織におけるＧＡＰ−４３ｍＲＮＡは、神経膠（ダリア）
の起源よりもおそらく神経の起源てあり、ＧＡＰ−４３
ＲＮＡは、神経膠原（グリオーム）細胞系Ｃ６中では検
出されなかった。 神経組織において、ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡの量は、発育
段階によって変化する。ピーク濃度は、周産期に生じ、
末梢神経系に対し中枢神経系では若干遅延する。発現の
タイミングは、軸索成長のｌに一致する［ヤコブソン（
Ｊａｃｏｂｓｏｎ）、ティへローフメンタル・ニューロ
バソロノー（Ｄｅｖｅｌｏｐ−ｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒ
ｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）（プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、
ニュー・ヨーク、１９７ｇ）］。しかし、成体神経組織
中の有意な量のＧＡＰ−４３ＲＮＡは、周産期間よりも
有意に少量ではあるが、ＧＡＰ−４３蛋白か成体ラット
皮質中に存続するという観察と一致している［ヤコブソ
ン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）ら、／ヤーナル・イソ・ニュー
ロサイエンス（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ）、６１８
４３ （１９８６）］。ＧＡＰ−４３発現の持続は、成
体神経系における進行役を示唆している。ＧＡＰ−４３
から電気泳動的および抗原的に識別不可能なリン蛋白で
あるＢ−５０およびＦｌの特性は、成体神経組織におい
て評価されてきた。これらの蛋白は、プロティンキナー
ゼＣ様酵素に対する基質として働き、そのリン酸化は、
神経ペプチド、神経伝達物質、および長期相乗作用期間
によって調節される［ヤコブソン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）
ら、ンヤーナル・イソ・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉ、） ６：１８４３（１９８６） ；アロ
ヨ（Ａｌｏｙｏ）ら、ジャーナル・イソ・ニューロケミ
ストリー（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、 ） ４１ ：
６４９（１９８３） 、ツハイヤーズ（Ｚｗｅｉｅｒ
ｓ）ら、ｐｒｏｇｒ、 ＢｒａｉｎＲｅｓ、 ５６：４
０５ （１９８２）］。成体のＧＡ−１”４３調節か遺
伝子発現における変化によっても生じるか否かは知られ
ていない。成熟動物におけるＧＡＰ４３の機能に関する
１つのモデルとして、ンナブス交替［コツトマン（Ｃｏ
ｔｍａｎ） ラ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２２
５：１２８７ （＋９８４）］、および神経末端での構
造成長によって伴われる学習のような他の神経系の「形
成性の（ｐｌａｓｔｉｃ）Ｊ変化［ヘイリー（Ｂａｉｌ
ｅｙ）およびチェノ（Ｃｈｅｎ） 、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ） ２２０：９１ （１９８３）］における
進行役か挙げられる。 実施例■ ヒトＧＡＰ−４３についてのｃＤＮＡのクローニング 試験方法 組織入手 剖検時および死後１０時間以内のヒト脳組織を新しく入
手した。特定領域から得た２Ｘ２Ｘ０５ｃｚ以下の脳の
細片を、トライアイスで冷却したイソペンタン（２〜メ
チルブタン）中でスナップ凍結し、次いて、−９０°Ｃ
て貯蔵した。これらの標本は、ｉｎ ５ｉｔｕハイブリ
タイセーノヨンおよび免疫細胞化学のために用いた。さ
らに、新しく、または該凍結試料から得た同一領域から
の組織の小さい部分を、ノーサンプロット分析のために
用いた。凍結ブロックと直接隣接しているホルマリン固
定化、パラフィン−包埋した組織において、通常の組織
学を行った。 １日令の脳幹および７日令の小脳のｃ Ｉ） Ｎ Ａラ
イブラリー［両ライブラリー共に、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクンヨン（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐ
ｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）からのも
のであった］から］ヒ１−ＧＡＰ−４３ｃＤＮＡを単離
した。これらのライブラリーを、３２Ｐ−手票識化ラッ
トＧ Ａ Ｉ）４３ｃＤＮＡプローブてスクリーニング
した１カーンズ（Ｋａｒｎｓ）ら、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ） ２３６：５９７ （１９８７）］。ハイブ
リタイセー／ヨンは、４×標準ク工ン酸添加生理食塩水
（ＳＳＣ）、０８×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）、
１０％硫酸デキス［・ラン、４０％ホルトアミド、Ｉｎ
（ｌ当たりニシン精工ＤＮＡ２０μ７．７ｇＭｈリス（
Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７、６）、１％ＳＤＳ、および１０６
ｃｐｍ／ ｒｎＱのプローブ中、４２°Ｃて１６時間で
行った。フィルターを、オートう／オグラフィー前に、
室温て２ＸＳＳＣ１５３°ＣでｌＸ５ＳＣ１次に、再度
６０°Ｃて１×８ＳＣ中で、充分に洗浄した。陽性クロ
ーンをｐＧｅｍ３Ｚ［プロメカ・バイオチク（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）１およびＭ１３ｍｐ１８の両方
の中て継代クローンし、鎖成長停止反応方法Ｅサンガー
（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロ／−ティンゲス・イン・す／
ヨナル・アカテミー・イン・サイエンス・ニーニスニー
（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｊｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ） ７４：５４６
３ （１９７７）Ｉによって配列決定した。ｕｗｃｃｃ
ｒユニバージティー・イン・ウィスフンンン・ジェネテ
ィクス・コンピューター１グループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ％’１ｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）］ソフトウエアバノケー
／によってＤＮＡ配列を分析した。 ノーサンプロット分析 チオシアン酸グアニジン法［チャーブウィン（Ｃｈ ｉ
ｒｇｗ ｉ ｎ）ら、バイオケミストリー（ＢｉＯｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）１８：５２９４ （１９７９）］によ
って剖検したヒト組織から全細胞ＲＮＡを単離した。ノ
ーサンフロノドのために、各組織からの全ＲＮＡｌ０μ
？を変性し、１．２％アガロース−ホルムアルテヒ！−
ケルで泳動させ、ｌ ０ＸＳＳＣ中、ンーンスクリーン
（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ） ｌニュー・イングランド・
ニュークノア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ）ｌまたはナイトラン（Ｎｙｔｒａｎ）ｌニュ・アン
ト・ニス（Ｓ ｉ ｓ）’ｌに移し、紫外線架橋させ、
任意に準備した［ファインノ＼−グ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ
）およびホーケルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｉｅｉｎ）、
アナソテイカル・ノ１イオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、） １３２：６ （１９８３）１ヒ１−
ＧＡＰ−４３ｃ １．：） Ｎ ＡクローンＣ１ａと一
緒に４２°Ｃて一晩ノ＼イブリタイズした。最後にフィ
ルターを、６０°Ｃて、０１％ＳＤＳて１ｘＳＳＣに洗
浄した。Ｃ１ａてプローブした後、フィルターを細片化
し、対照とし、てラノトグリセルアルテヒドー３−ホス
フｙ−−１〜−テヒトロケナーセ（ＧＡＰＤＨ）ｃＤＮ
Ａ クローン［ビーチャフライク（Ｐｉｅｃｈａｃｚｙ
ｋ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）４２：５８９ （１９８５）
ｌて再プローブした。 ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセーシヨンヒト脳糺織の低
を品槽切片標本を４％パラホルｔ・アルデヒ）・中で固
定し、０３％トリトンＸ−１００で処理し、次いて１μ
ｙ／ ＭＱブロテイナーセにで処理し、アセチル化し、
５０％ポルムアミド／２ＸＳＳＣ中−Ｃブレハイブリダ
イス（−だ。５０’Ｃて５時間、湿気のあるチャンノ＼
−中、スライド当たり２ Ｘ Ｉ Ｏ’ｃｐｍの３Ｌ′
Ｓ−標識化ア゛／チセンスまたはセンスリホブローブ［
ノルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｃｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ． １２ニア０３５（１９８４）］を用
いてハイブリタイセーンヨンを行った。次いて、組織切
片標本を、最初に５０％ホルムアミドを含有しており、
次いて５０％ホルｔ・アミド＋０１％（・リドン（Ｔｒ
ｉｔｏｎ）Ｘ Ｘ ］ Ｏ Ｏを含有している１０ｍＭ
／チオトレイ）・−ルを有する２ＸＳＳＣ中で洗浄した
。５ ０ １１’ｉ／ｍＱ Ｒ Ｎ Ａａｓｅ Ａて処
理することによって、−重鎖ＲＮＡを取り出した。 該切片標本を、さらに２時間、ｌｘＭＤＴＴを有する２
ＸＳＳＣ中で洗浄し、次いて、０．３Ｍ酢酸アンモニウ
ムを含有する楼準アルコール（ｇｒａｄｅｄ ａｌｃｏ
ｈｏｌｓ）によって脱水した。Ｎ Ｔ Ｆ３ ２コタノ
ク（Ｋｏｄａｋ）エマルノヨンを用いて、放射能活性信
号を検出した。エマル／−３ン塗布したスライドをー＼
マトキ／リンで対比染色した。 結果 ヒｌ− Ｇ Ａ Ｐ − ４ ３はマウスカルモノニリ
ン結合タンパクと相同である 実施例１に記載のとおり、うｙ ｈ Ｇ Ａ Ｐ −
４ ３に関するｃＤＮＡをクローンし、プローブとして
用いて、ヒト脳幹および小脳ライブラリー由来の関連す
るｃＤＮＡ クローンを同定した。各ライブラリーから
重複しているクローンか得られ、これらは重複領域中で
一致していた。最長クローンの配列（小脳ライブラリー
由来Ｃ１ａ）を第５図Ａに示し、第５図Ｂにおいてラッ
トＧＡＰ−４３との比較を示した。Ｐ−５７と称する神
経特異性マウスカルモンユリン結合タンパクとＧＡＰ−
４３との同一性は、シムシー（Ｃｉｍｌｅｒ）らのジャ
ーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）２６２・１２１５８ （１
９８７）によって開示されたので、第５図Ｂにおいて配
列を示す。Ｐ−５７は、カルシウムレベルか上がるとカ
ルモゾュリンを結有するよりもむしろ放出するという例
外的な特性を有する神経特異性力ルモンーリン結合蛋白
として開示されている［アントリーセン（Ａｎｄｒｅａ
ｓｅｎ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ） ２２：４６１５ （１９８３）’、。 該蛋白は、ヒト、ラットおよびマウスの間でかなり維持
されている。例えば、ヒトおよびマウス間のアミノ酸の
同一性は８９％である。さらに、第５図Ｃに示す２つの
効果的に望ましいステム−ループ構造を含む３゛−非翻
訳領域間の維持は異常に高く（８０％）、これは、他の
遺伝子との類似性によって、メツセンジャーＲＮＡ安定
性を調節するのに役立つＵｊＪ−ヘス（Ｒｅｅｖｅｓ）
ら、プロシーティンゲス・イン・ナショナル・アカテミ
ー・イン・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔ １． Ａｃａｄ、 Ｓｃ １ＵＳＡ） ８３：３
２２ｇ （１９８６） ； ンヨ（Ｓｈａｗ）およびカ
メン（Ｋａｍｅｎ）、セル（Ｃｅ１１） ４６：６５９
（１９８６）］。 ＧＡＰ−４３発現は成人ヒト脳の孤立性領域において持
続する ＲＮＡ分解を最小にするために、死後１０時間以下の患
者から脳組織を得た。隣接する切片標本を組織病理学的
に試験した。８日令および７力月令の２乳児において、
ノーサーンブロノトによって評価すると、脳の至る所て
ＧＡＰ−４３か均一に健全に発現されていた。試験した
領域は、小脳、側頭皮質、側頭連合皮質、前頭皮質、眼
窩前頭皮質［野（Ａｒｅａ） １１ ］、海馬、視覚皮
質（野１７／１８）、およびを髄を含んでおり、幾つか
の例を第６図に示す。これらの令では、脳に対して、を
髄のレベルは低く、これは、この領域の早期成熟に関連
し得る［アナンド（Ａｎａｎｄ）およびヒキ（Ｈｉｋｅ
ｙ）、ニュー・イングランド・／ヤーナル・イン・メデ
イアン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、） ３１７：
１３２１ （１９８７）］。ＧＡＰ−４３は、新生児ま
たは成人のいずれにおいても試験された如何なる非ニュ
ーロン組織（腎臓、肺、肝臓および副腎を含む）におい
ても発現されなかった。正常な成人部において、ＧＡＰ
−４３発現は、様々な領域間で顕著に変化した。例えば
、３つの脳において、ブロードマン野１１（ｌ］ｆｆｌ
！前頭回）ては、新生児に匹敵するレベルか見られ、視
覚皮質（野１７／１８）では非常に低いレベルで発現し
た。海馬ては、一致して低いレベルてあった。ｌｆｆ１
体ラット海馬は、ＧＡＰ−４３に富んでいるので、後者
は興味深いものである。同様の分布か不ヘイ（Ｎｅｖｅ
）のＭｏ１ｅｃ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、 ２：１７７
（１９８７）によって近年報告された。 虚血性損傷後、再開されたＧＡＰ−４３発現死前ｌＯ〜
１４日に生じた小さい臨床的無症状梗塞（ｓｍａｌｌ
ｃｌｉｎｊｃａ］ｌｙ ５ｉｌｅｎｔ ｊｎｆａｒｃｉ
ｓ）を有する２人の患者からの脳組織を試験した。これ
らの亜急性梗塞を特徴付ける組織病理学的特徴としては
、以下のものか挙げられる ［１］梗塞形成組織と無傷
組織との間の鮮明なデリニエー／ヨン［２］ニユーロン
の喪失：［３］単核炎症細胞とリン１！マクロフアージ
による壊死組織の浸潤、および［４〕梗塞の縁にｔＱっ
だ線維性星状細胞の活性化。ある−人の患者は、視覚皮
質（野１７）に梗塞かあり、他の患者には、頭頂葉（野
３．１．２．５）に梗塞があった。該組織をノーサーン
分析に用い、ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセー／ヨンは
、梗塞形成組織および同一のブロードマン野からの周囲
の正常な脳の両方を含んだ。第７図Ａは、野１７におけ
る発作の後、ＧＡＰ−４３発現か、成人においてＧＡＰ
−４３か通常最も富んでいる領域である野］１に匹敵す
るレベルまて増加することを示す。第７図Ｂは、２つの
正常な脳からの野３、１．２．５におけるＧ Ａ Ｐ
−、−４３レベル（レーン１および２）かその場所で小
さな発作を有する別の患者（レーン３）と比較して低か
ったことを示す。 これらの観察は、Ｇ Ａ ｐ−４３か虚血性梗塞後、数
日以内増加することを示唆する。 上述のとおり、ＧＡＰ−４３は、その発現において二、
ニーロン制限され、ニューロンは梗塞した領域には存在
しないので（第８図Ａ１、Ｂ）、おそらく、ＧＡＰ４３
発現の増加は形態学的に無傷のニューロンから誘導され
たのであろう。この仮説を試験するために、ｉｎ ５ｉ
ｔｕハイブリタイセー／・フンを用いて、梗塞形成領域
におけるＧＡＰ４３発現の分布を研究した。、ＧＡＰ−
４３発現の詳細な細胞解剖学を実施例３に記載する。ノ
ー叶−ン分析から予想されるように、視覚皮質（野１７
）を含んでいる成人大脳皮質のはとんとの領域の全体に
わたって、ＧＡＰ−４３を発現した細胞かほんの少した
け散乱していた（第８図Ｃ）。率直に島って、壊死領域
はアンチセンスおよびセンスプローブの両方と非特異的
に結合したか、視覚皮質の梗塞領域において、特胃的な
ＧＡＰ４３発現は見られなかった（第８図Ｄ、第８図Ｇ
）。他方、隣接する形態学的に正常な野１７（第８図Ａ
２）において、本質的に、全てのニューロンかＧＡＰ４
３発現を明示しく第８図Ｅ、第８図Ｆ）、梗塞した組織
と隣接する領域か増加したＧＡＰ−４３発現の起源であ
ることを確認した。 Ｇ Ａ Ｐ −４，３発現による梗塞を伴わない一時的
虚血の影響も吟味した。大脳皮質および海馬のツマ−セ
クター（Ｓｏｍｍｅｒ’ｓ ５ｅｃｔｏｒ）のような脳
のある領域におけるニューロンは、特に層流低下による
場合、虚血性および低酸素発作に対して選択的に傷つき
易いことを証明する１ブリアーリー（Ｂｒｉｅｒｌｅｙ
）およびグラハム（Ｇｒａｈａｍ）、グリーンフィール
ズ・ニューロパソロンー（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｓＮ
ｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、第４版、アタムス（Ｊ
、 Ｈ，Ａｄａｍｓ）、コーセリス（Ｃｏｒｓｅｌ ｌ
ｉｓ、 Ｊ、 Ａ、 Ｎ、 ）、およびタデエン（１
）ｕｃｈｅｎ、 Ｌ、 Ｌ ）、Ｅｄｓ、 、 ニドワ
ード・アーノルト（Ｅｄｗａｒｄ Ａｒｎｏｌｄ）、ロ
ンドン、１９８４、ｐｐ、 １２５−１５６１゜このタ
イプの損傷は一時的なものであり、数週間以内て完全な
回復か起こり得る。ｌｎ ５ｉｔｕ ／・イブＪタイセ
ーン１ンを用いて、全無酸素症を付随した心拍停山をし
ブ計−人の患者の大脳皮質を試験した。該但者は数日後
に死亡し、剖検て、梗塞を伴わない無酸素性脳障害の形
跡かあった。これは、散乱した多数の核ｌ農縮（賭く縮
んだ）ニューロンまたは水ｌｉ＠ｉ（膨張した）ニー□
−ロンの存在ならひに大脳皮質、海馬および小脳におけ
る神経網の空り包形成によって証明された。小脳におい
て、虚血性プシ牛ンエ細胞は、水腫性であり、無色であ
った。 第ε〕図Ｂに示すとおり、小脳において、主に、正瓦な
成人においてｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセーノヨンに
よ−）て検出［１Ｊ能なＧ Ａ Ｐ −４３発現を伴わ
ないことかわかった領域であるプルキンゴ細飽層におい
て、ＧＡＰ４３発現の著しい増強かあった（第９図Ａ）
。 考察 成長内照は、？１１２杆を発育および再生させることに
３）−・で１ｆｒｔｈ）れた神経木端構造である［例え
ば、レイモン・イ・力／トル（Ｒａｍｏｎ ｙ Ｃａｊ
ａｌ）、］−テ／、ｘ不レしンヨン・アンド・リンエ不
し−ノヨン・Ａブ０す１ナーバス０システム（Ｄｅｇｅ
ｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ）へオノ
クスフォード・ユニバーンティー・プレス（Ｏｘｆｏｒ
ｄしｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ ＰｒｅｓＳ）、ロントノ（＋
９８２） 、ケイタ（Ｋａｔｅｒ７およびレトウアノイ
（１，ｅｔｏｕｒｎｅａｕ）、 ハイオロノー・イン・
す・ナーブ・グロース・コーン（Ｂｉｏｉｏｇｙ ｏｒ
ｔｈｅ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｅ）ｊ
、アラン１アール・リス・インフーヂレイテｙ ）”（
Ａｌａｎ Ｒ１、ｉｓｓ、 Ｉｎｃ、 ）、ニューヨー
ク （１９８５）ｌ。これらは、局部情報の連動性およ
び変換に関するＲ械装置を含んでおり、体細胞からの運
搬によって決定されたタンパク成分を有する。Ｇ Ａ
Ｐ −４３は、迅速に運搬されたタンパクの１つてあり
、これは、神経を発育および再生させる際に、軸木運搬
における明確な質の同士かＳＪ３’ｌである。再生ずる
へき哺乳動物ＣＮＳ二４ユーロノの欠損は、成人脳にお
ける低く誘導できないレベルのＧＡＰ−１４３と結びつ
け、：、れた］スキ一二（Ｓｋｅｎｅ）、セル（Ｃｅｌ
ｌ） ３７：６９７ （１９８４）ｌ。すなわち、もち
ろん、ＣＮＳ損傷および発作の治療において遭遇する問
題のために、ヒトにおいてこのタンパクの調節を研究す
るのは、特に興味深いものである。 ＧＡＰ−４３および成長円錐 ＧＡＰ−４３は、ラットとヒトの間で非常に保存持され
、周囲のカル７ウムが増加するとカルモジュリンを放出
する異常な特性を有するカルモジュリン−結合タンパク
として近年同定されたマウスタンパクに明らかに匹敵す
る［アンドリーセン（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ）ら、バイオ
ケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ２２：４
６１５ （１９８３） ；シムシー（Ｃｉｍｌｅｒ）ら
、ジャーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（
ＪＢｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） ２６０：１０７８４ （１
９８５） ；アレキサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）ら
、ジャーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） ２９２：６１０８ （１
９８７）］。上記著者らによって示唆されたように、成
長円錐におけるその役割に関する概念は、カルモジュリ
ン活性を調節すること、および局所的細胞ドメインにお
いてそれを放出することによってそのようにすることで
ある。すなわち、カルモジュリンに対するＧＡＰ−４３
の結合性は、例えば、活動電位の後、カルシウムか上昇
すると減少するであろう［ビラーデティ（Ｂｅｌａｒｄ
ｅｔｔｉ）ら、プロシーティンゲス・イン・ナショナル
・アカデミ−・イン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、５ｃｉ） ８３ニア０９４（１９８６）］
。そのために、成長円錐のカルモジュリン依存活性は、
カルシウム入口のすく近所の範囲内で調節することがで
きる。 成人におけるＧＡＰ−４３ ＧＡＰ−４３発現は、発育の間に非常に調節される。一
般に、最高レベルは、軸索伸ひ率のピークの期間とよく
相互関係をもつ。しかし、成熟脳の個々の領域における
高いレベルの発現は、ＧＡＰ−４３かいくつかの成体ニ
ューロンにおける進行役を有することを示唆している。 １つの可能性は、ＧＡＰ−４３発現か、特に神経末端で
、それらの構造を改造する際に活発に従事した細胞を示
すことである。これに関する証拠は、ラットにおいて、
ＧＡＰ−４３を発現する成体ニューロンか海馬ニューロ
ンおよび嗅球の僧帽状細胞を最も顕著に含んでおり、実
際に、該ニューロンは、成体においてそれらの末端を改
造することである。ヒト海馬は、低いレベルでのみＧＡ
Ｐ−４３を発現し、ＧＡＰ−４３が実際にこのような構
造上の改造の標識であるとすれば、ヒト脳の様々な領域
かこの機能を保持していたことを示唆している。ＧＡＰ
−４３について提案された他の機能は、そのホスホリル
化状態が長期相乗作用の結果として変化するので、学習
である［ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）およびルッテンバー
グ（Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅｒｇ）、イクスペリメンタル・
ニューロロシー（Ｅｘｐ、Ｎｅｕｒｏｌ、） ８９：２
Ｆ（１９８５）〕。実際に、構造上の改造は、長期学習
の一面てあり［チャン（Ｃｈａｎｇ）およびグリーナフ
（Ｇｒｅｅｎｏｕｇｈ）、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、 ３０
９：３５ （１９８４） ；ゲレ。 ト （Ｇｏｅｌｅｔ） ら、不イーチャ（Ｎａｔｕｒ
ｅ） ３２２：４１９（１９８３）Ｊ、神経末端領域の
成長は、アプリシア（Ａｐｌｙｓｉａ）において長期学
習を伴うことが立証された［ヘイリ（Ｂａｉｌｅｙ）お
よびチャン（Ｃｈａｎ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
） ２２０：９１ （１９８３）］。すなわち、１つの
興味をいたかせる可能性は、長期学習に関する構造上の
形成性を使用する成人脳のニューロンがＧＡＰ−４３を
発現するものであるということである。この可能性は、
不ルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）およびル、テンバーグ（Ｒｏ
ｕｔｔｅｎｂｅｒｇ）のイクスペリメンタル・ニューロ
ロシー（Ｅｘｐ、 Ｎｅｕｒｏｌ、） ８９：２１３
（１９８５）、ヤコブソン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）らのジ
ャーナル・イン・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ、） ６：１８４３ （１９８６）、および不ペ
イ（Ｎｅｖｅ）らのＭｏ１ｅｃ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ。 ２：１７７ （１９８７）を含む焼入かの研究者らによ
って検討されており、本研究は、これらの示唆と一致す
る。この提案は、種々の疾患状態とＧＡＰ−４３発現と
の密な相互関係を必要とするであろう。 成体ＣＮＳにおけるＧＡＰ−４３および修復ＣＮＳ損傷
からの回復による抑制は、あまり理解されていない。哺
乳動物の末梢神経または両生動物の中枢神経てさえ、切
断の後、完全に回復するか、これに反して、哺乳動物の
中枢神経におけるこのような損傷は回復しない。中枢神
経は、カイトとしてそれらか末梢神経鞘を有する限り、
軸索切断の後、長い距離伸びるので、成体ニューロンは
、成長する能力を維持−・Ｖる［ヘンフェイ（Ｂｅｒ＋
ｆｅｙ）およびアグア３ （Ａｇｕａｙｏ）、ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ） ２９６：１５０ （１９８２）Ｉ
ｏ修復の失敗は、末梢神経系とは反対に、中枢神経系に
おいては、軸索運搬タンパクのグループにお（′Ｉる異
なる調節抑制に起因していた。特に、ＧＡＰ−４３か関
係しているのは、そのレベルか正常な成長および回復力
に非常に匹敵しているからである［スキーニ（Ｓｋｅｎ
ｅ）、セル（Ｃｅｌｌ） ３７：６９７（１９８４）］
。本発明者らは、あるタイプの刺激の後で、成熟ニュー
ロンか高いレベルてＧ Ａ Ｐ −４３を発現すること
かできるということを示した。 一時的な虚血性および大脳梗塞のような疾患は、軸索切
断の後、障害か永久であるか、これに反して、臨床学的
回復かこのような病変の後にしばしば生じ、るので興味
深いものである。神経学的回復か損傷１１１１ ＩＩ包
の修（Ｕによって誘導されるかまたは近隣の無傷Ｉ’ｌ
ｌ胞の発生に、ｋ ７＋で誘導されるかは、臨床病理的
＋ＨＬＩ関係によって識別することはできない。高し△
、ルのＧＡＰ−４３を発現するニューロンど細胞死領域
との間の距離は、発芽を色味し得ることを示唆する。他
方、これらの場合に観察されるＧＡＰ−４３の増加は、
体幹の虚血性影響から誘導され、該影響は、軸索切断の
間にはあまり生しないらしい。例えば、これらは、興奮
性アミノ酸の放出および結果として起こる＼□−メチル
Ｄ−アスパラギン酸ｉｆＫ（ＮＭＤＡ）レセプター興奮
を含む［オル不イ（Ｏｌｎｅの、イクスベリメンタル・
アンド・クリニカル・ニューロＩ・キノコロ／−（Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｎ
ｅｕｒｏｔｏｘｉｅｏｌｏｇｙ）、スゝン！ −（Ｐ、
Ｓ、 ５ｐｅｎｃｅｒ）およびンヤウンノ＼−グ（Ｈ
，Ｈ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ）、ｅｄｓ、 （ハルテ
ィモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、ＭＤ ウィリアムズ
（！ｉｌｌｉａｍｓ）およびウィルキンズ（Ｗｉ １ｋ
ｉｎｓ）、ｐｐ、 ２７２−２９４ （１９８０） ；
ａスマン（Ｒｏｔｈｍａｎ）、ツヤ−ナル・オフ・ニ
ューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ４：１
８８４ （１９８４）Ｉ。 宋−数例１− 精製したＧ Ａ Ｐ −４３タンパクに対して指向する
抗体を用いるＧＡＰ−４３Ｒ現の検出光の免疫組織化学
研究は、特に成長し２ている神経系において、Ｇ Ａ、
Ｐ −４３か神経突起に限定されることを示唆してい
た１へ／つ゛イ２・ノ（Ｂｅｎｏ★１ｔｚ）う、Ｅ／ヤ
ーナル・オフ゛・二−ユーロ→ナイエンス（１゜Ｎｐｕ
ｒｏｓｃｉ、） ８：３３９−３５２ （１９８８）：
ノスペ７ （Ｇｉｓｐｅｎ）ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、
３２８：３８］−３８５（１９８５） ：メイツ（Ｖ
ｌｅｉｒｉ）ら、ブロン−ティンゲス・インφナノヨナ
ル・アカテミー・オフ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ） ８３
：３５３７−３５４１ （１９８６） ：スヰ一二（Ｓ
ｋｅｎｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３ニ
ア８３−７８６ （１９８６）］。本実施例において、
ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセーンヨンおよび神経細胞
形質染色（ｐｅｒｉｋａｒｙａｌ ｓｔ、ａｉｎｉｎｇ
）を示すＧＡＰ４３にｌ＝１する新規な抗体を用いて、
本発明各らは、Ｇ Ａ Ｐ −４３を発現する細胞個体
８Ｔを同定し、成体脳において、広＜？−’ｉき渡った
Ｇ Ａ Ｐ −４３免疫反応性軸索か；ニーロンの比較
的小さい個体群から発散され、このほとんとか局部的に
制限されることを小す。 方法 ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセー／３ンおよび免疫細胞
化学のために用いる組織を新しく入手し、トライアイス
によって冷却された２−メチルブタン中てスナップ凍結
した。使用直前に、適当な固定液を用いて低温槽切片標
本を固定した。胎芽うノｔ□（Ｅ）（１２，１５，１８
および２０日令）、生後発育しているラット（Ｐ）（１
，７および１４日令）および成体ラット由来の脳とを髄
を同時に研究した。 該組織を４％バラホルムアルテヒ）・中で［固定し、０
．３％トリトンＸＩＯ○て処理し、次いて１μ９／ｖ＝
Ｑプロテイナーセにで処理し、アセチル化し、５０％ホ
ルムアミ］／２Ｘ標準クエン酸添加生理食塩水（ＳＳＣ
）中でブレハイブリタイズした。 プローブは、」−記のとおり、ｃ Ａｐ −４３アンチ
センスＲＮ Ａの１１２１塩基てあ、った。５０°Ｃて
５時間、ｉｆｆ気のある千ヤンハー中、スライド当たり
２ Ｘ ］ ００６ｃｍの″Ｓ−標識化アンチセンスま
たはセンスリホプロ・−ブを用いてハイブリタイゼージ
ョンを行った。次いて、組織切片に本を、最初に５０％
ホルムアミドを含有しており、次いて、５０％ホルムア
ミド＋０１％トリトン−Ｘ１００を含有している１１０
ｌ１１ンチオトレイトールを有する２ＸＳＳＣ中で洗浄
した。５０μ９／ ｘ（ＩＲＮＡａｓｅＡで処理するこ
とによって、−重鎖ＲＮＡを取り出した。該切片標本を
、さらに２時間、１ｍＭＤＴＴを有する２ＸＳＳＣ中で
洗浄し、次いて、０．３Ｍ酢酸アンモニウムを含有する
標準アルコール（ｇｒａｄｅｄ ａｌｃｏｈｏｌｓ）に
よって脱水した。 ＮＴＢ２ コタノク（Ｋ ｏｄａｋ）エマルジョンヲ
用いて、放射能活性信号を検出した。エマルジョン塗布
したスライドをヘマトキシリンおよびエオシンで対比染
色した。 ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセーンヨンのために用いた
ものと隣接する組織切片標本を免疫組織化学のために用
いた。λｇｔｌｌ中で発生したキメラＧＡＰ４３−β−
カラクト／ターセ融合タンパクを注射したウサキにおい
て、ポリクローナル抗血清か高められた１カーンズ（Ｋ
ａｒｎｓ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３６
：５９７−６００ （１９８７） ：ヤング（Ｙｏｕｎ
ｇ）ら、プロソーティンゲス・オプ・ナショナル・アカ
テミー・イン・サイエンス・ニーニスニー（ＰｒｏｃＮ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ） ８０：１１９
４−１１９８ （１９８３）］。硫酸アンモニウム分画
法オよびＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーによっ
て、粗血清を処理した［ホロウ゛イソツ（Ｈｏｒｏｗｉ
ｔｚ）ら、ファンクメンタル・テクニクス・イン・ハイ
ロロシー（ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、ｐｐ、 ２９７−３１
５１゜新生児ラット脳から調製した成長円錐膜粒子を用
いて［フェニンカー（Ｍｅｎｎｉｎｇｅｒ）ら、セル（
Ｃｅｌｌ） ３５：５７８５８４ （１９８３）］、ウ
ウェスターンプロト９析法［メイツ（Ｍｅｉｒｉ）ら、
ブロン−ティ／ゲス・イン・す／ヨナル・アカデミ−・
イン・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｉＳＡ） ８３：３５３７−３
５４１ （１９８６）］によって該抗体を検査した。ウ
ェスターンプロ、トは、アルカリホスファターセ／ＢＣ
Ｉ Ｐ／ＮＢＴ キット「プロメカ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
］を用いて展開させた。ウェスターンプロ、ト検査法
において結有する抗体の特異性は、新生児う、ト脳から
精製されたＧＡＰ−４３タンパクによる予備吸収によっ
て示された［チャン（Ｃｈａｎ）ら、ンヤーナル・オプ
・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ６
：３６１８３６２７ （１９８６）］。ＧＡＰ−４３タ
ンパクは、クロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）として３
−３°ジアミノベンジジンおよび対比染色としてヘマト
キンリンを用いて、アビジン−ビオチン西洋ワサビペル
オキンターセ複合法［フス（Ｈｓｕ）ら、ジャーナル・
イン・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリ
ー（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）
２９：５７７−５８０ （１９８１）］を使用する免疫
組織化学染色によってＣＮＳ組織において示された。標
識化の特異性は、新生児う。 ト脳由来の精製した天然ＧＡＰ−４３タンパクと一緒に
第１抗体をブレインキュベートすることによって確認さ
れた。 糀果 １２および１５日令の胎芽て、ＣＮＳにおけるＧＡＰ−
４３ｍＲＮＡ発現は低いか、抜根神経節のニューロンは
、その軸索成長のピーク期間に応じて極度な標識化を呈
した。Ｅ２０で、ＧＡＰ４３レベルは、脳の全体に渡っ
て均一に、かつ著しく高かった。出生後生活期間第１週
の間、高レベルの発現か維持されたか、Ｅ２０およびＰ
ｌで観察された拡散した標識化に対照して、Ｐ７ラノト
の脳において、個々のニューロン上での別々の標識化は
、神経網の広がりおよび神経膠素子の成長によって、正
しく評価することかできた。最もよく試験することがで
きるように、全てのニューロンをこの年令で標識化した
。Ｐｌ４ては、ＧＡＰ ４３ｍＲＮＡ発現は、−船釣
な／グナルの強さか低く、皮質ニューロンの５０〜７５
％だけか標識された。 成体ＣＮＳにおいて、ＧＡＰ−４３は、はとんとの大脳
皮質の全体にわたって、拡散された細胞だけか標識化さ
れる程度の比較的少ないニューロンにおいて発現され、
標識化の強度かＰｌ４脳と比較して顕著に低下した。し
かし、内側嗅皮質（ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ ｃｏｒｔｅ
ｘ）は、適度に高い密度のＧＡＰ−４３−発現ニューロ
ンヲ有シタ。ニューロンの濃い局所的標識化は、Ｐ１４
ラットのを髄、脳幹、および小脳においてまた存在して
いるが、成体においては、ＧＡＰ〜４３−発現ニューロ
ンか、これらの領域において存在しないかまたは非常に
低い密度で存在するかのいずれかであった。しかし、成
体において、はとんとのニューロンの極度の標識化か海
馬および四球の２つの領域に維持された。海馬における
標識化のパターンは、歯状間、ＣＡＩおよびＣＡ３の全
体にわたって、ニューロンかＧＡＰ−４３ｍＲＮＡを発
現したことを示した。四球において、主に、高レベルの
ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡを含有する僧帽状細胞領域てあ−
った。 免疫組織化学によるＧ Ａ Ｐ−４３−発現の観察λｇ
ｔｌ］中て生りるキメラＧ Ａ Ｐ −４３−β−カラ
ク１−ンターセＥＡ合タンパクにＸ＝ｊするウカーキボ
リク
【コーナル抗体で、新生児う／）・脳のウェスター
ンプロットにおいてＧＡＰ）−４３を特異的に標識した
。Ｇ Ａ Ｐ −、−、−４３抗原に関する特売的な免
疫染色は、神経膠細胞においては検出されないが、ニュ
ーロンにおい−Ｃは検出された。発育の間じゅう、免疫
反応性ＧＡＰ−４３は、神経細胞形質および神経突起の
両方に存在した。神経突起−制限免疫反応性ＧＡＰ−４
３は、以前観察されていた「ヘノウ゛イノツ（Ｂｅｎｏ
ｗｉｔｚ）ら、ジャーナル・ベン・ニューロサイエンス
（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ８：３３９−３５２（１
９８ｇ）キスベン（Ｇｉｓｐｅｎ）ら、Ｂｒａｉｎ Ｒ
ｅｓ、 ３２８：３８１−３８５（１９８５） ：ス
キーニ（Ｓｋｅｎｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）２３３ニア８３−７８６ （１９８６）］。細胞分画
研究はＧＡＰ４３か細胞体中にもあることを示唆してい
る［アレキサンター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）ら、ンヤー
ナル・ベン・バイオロンカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、） ２６２：６１．０８−６１１３
（１９８７）ｉ。 我々の抗体を用いる免疫染色法は、ＧＡＰ−４３−発現
細胞の局在化およびｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセーン
ヨンのテークとの比較を可能にした。免疫反応性ｃ Ａ
Ｐ −４３を含有する二、−ロンの局所的な分布およ
び密度は、ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセー／ヨンによ
ってそのｍＲＮＡに関して観察されｔ−発育パターンを
反映した。Ｇ Ａ Ｐ −４３免疫標識化は、Ｅ１２胎
芽において検出されず、Ｅ】５ＣＮＳにおいて少↑たけ
存在した（かすかな免疫組織化学染色によって明示され
た）。Ｅ１８−ｒは、ＧＡＰ−４３免疫反応性は一層は
っきりと見え、Ｅ２０では、神経細胞の体幹および神経
突起の両Ｕにおいて高！ノベルで検出された。Ｇ Ａ、
ｐ４３タンパクに関する免疫染色のこの度合は、Ｐ７
まて持続された。その結果と１．て、ＧＡＰ−４３免疫
反応性は、はとんとの領域において減少ｌ７、したがっ
て、Ｇ Ａ Ｐ −４３免疫反応性の一層制限された分
布はそのままである。成体において、広がっているかか
すんでいる神経標識化（ｎｅｕｒｉｔｉｃｌａｂｅｌｉ
ｎｇ）は、ＣＮＳの全体にわたって立証された。−ニー
ロン神経細胞形質は、高レベルのＧＡＰ −４３を発現
するとしてｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセー／３ンによ
っ−ご同定された領域において、密に標識六れた。 例えば、海馬ては、ＣＡＩ、ＯＡ４および歯状間の全体
にわたる錐体細胞および顆粒細胞の両方において、強い
標識化か示される。抗体が、本明細書に記載のとおり単
離したケル精製Ｇ Ａ Ｐ −４３ど一緒に予備吸収さ
れると、標識化は生じなかった。β−カラクトシターセ
予備吸収は、標識化に影響を及はさなかった。小脳、脳
幹、およびを髄において、免疫標識化細胞はほとんとな
く、前頭皮質、体性感覚皮質、視覚皮質および脳幹神経
節における免疫標識化細胞は低い密度であり、内側嗅皮
質においては適度に高い密度であった。１ｎｓｉｔｕハ
イブリタイセーンヨンについて注はしたように、免疫反
応性ＧＡＰ−４３に関する強い押杆細胞形質染色は、２
つの領域 海馬および四球において最も顕著に維持され
た。ＣＡＬ、ＣＡ３および歯状間の全体にわたる錐体細
胞および顆粒細胞は両者とも標識された。四球において
、標識化は、僧帽状細胞に対して、および顆粒細胞のう
ちの神経突起に対して大きく制限されている。すなわち
、ＧＡＰ−４３免疫反応性のパターンは、１ｎｓｉｔｕ
ハイブリタイゼー／ヨンのものを反映した。 考察 本実施例は、ＧＡＰ−４３か周産期間の全ＣＮＳニュー
ロンにおいて発現されることを示している。発育が進行
するに従い、その解剖学的分布は、漸次的に制限され、
成体においては、ＧＡＰ−４３−含有ニューロンは不均
一に分布し、最も高いレベルの発現が、主に、２つの別
々の領域・海馬および四球に制限される。 ロゼンタール（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）らのＥＭＢＯＪ、
６：３６４１３６４６ （１９８７）による近年の報
告には、不均一なＧＡＰ−４３標識化が開示されており
、ここで報告されたものといくらか異なることは、小脳
および前頭皮質における高いレベルのそれらの発見およ
び歯状回における標識化の欠損であった。先の報告にお
いて、免疫反応性ＧＡＰ−４３は、その細胞起源の表示
なして神経突起において排他的に検出された［ヘノヴイ
ノツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ）ら、／ヤーナル・オフ・ニュ
ーロサイエンス（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ） ８３
３９−３５２ （１９８８） ；キスペン（Ｇｉｓｐｅ
ｎ）ら、ＢｒａｉｎＲｅｓ、 ３２８：３８１−３８
５ （１９８５） ；スキｍ＝（Ｓｋｅｎｅ）ら、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３３ニア８３−７８６
（１９３６）巳・。 本発明者らによって生じさせられたβ−ガラクトンター
ゼーＧＡＰ−４３融合タンパクに対する抗体は、ニュー
ロン神経細胞形質の極度の標識化を可能にした。この従
前の報告との相違点は、抗原のキメラ的性質によるもの
であり、おそらく、異なった程度にいくつかの異なった
エピトープをさらす。他方、該相違点は、アルデヒド固
化の省略を反映しており、これは、神経細胞形質標識化
を減少させるために本発明者らによって示された。 如何なる場合にも、本発明者らは、本発明の方法が、Ｇ
ＡＰ−４３遺伝子発現の部位がＧＡＰ４３免疫反応性の
ものを反映したということを示した。ＣＮＳにおけるＧ
ＡＰ−４３の分布は、ラットとヒトの間で異なる。成人
脳では、海馬における以上に連合皮質領域において高い
レベルを維持し［不ヘイ（Ｎｅｖｅ）ら、プロシーティ
ンゲス・オフ・す／ヨナル・アカテミー・オフ・サイエ
ンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ） ８５：３６３８−３６４２
（１９８８）］、これに反して、成体ラントては、海
馬、四球および内側嗅皮質において最も高いレベルのＧ
ＡＰ−４３発現かある。この発見の重要さは、不明瞭で
あるが、ニューロン形成性の領域的保持力に関して、種
の相違に関連しているのであろう。成体において高いレ
ベルのＧＡＰ−４３を安定に発現するＣＮＳニューロン
のサブセ’／ ｌ−か生物学的特徴を共有するか否かを
決定することか残っている。 １つの可能性は、ＧＡＰ−４３がシナプスの構造的改造
を行う際に含まれている細胞において発現されることで
ある。成長円錐は、成体脳のある領域において維持され
［ソテロ（Ｓｏｔｅｌｏ）ら、Ｌａｂｎｖｅｓｔ ２
５：６５３−６７１ （１９７１）１、直接観察によっ
て、少なくとも末梢神経系において、単一の細胞の進行
しているシナプス再配置か示される［バーヘス（Ｐｕｒ
ｖｅｓ）ら、不イチ（−−（Ｎａｔｕｒｅ） ３１５：
４０４−４０６ （１９８５）］。実際、このようなニ
ューロン改造か長期学習［チャン（Ｃｈａｎ）ら、Ｂｒ
ａｉｎ Ｒｅｓ、 ３０９：３５−４６ （１９８４
） ；ケレノト（Ｇｏｅｌｅｔ）ら、ネイチャー （ｌ
ｌａｔｕｒｅ）３２２：４１９−４２２ （１９８６）
；ホーン（Ｈｏｒｎ）ら、ジャーナル・オフ・ニュー
ロサイエンス（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ）５：３１
６１−３１６８ （１９８５）］および性的二形性行動
（ｓｅｘｕａｌｌｙ ｄｉｍｏｒｐｈｉｃ ｂｅｈａｖ
ｉｏｒ）［カーズ（Ｋｕｒｚ）ら、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ） ２３２：３９５−３９８ （＋９８６）］
にとって必須であるという証拠かある。 成長円錐およびンナブトソーム（ｓｙｎａｐｉｏｓｏｍ
ｅｓ）におけるタンパクの補充物は、定性的にはあまり
異なっておらず「エリス（Ｅｌｌｉｓ）ら、ンヤーナル
・オフ” 二、：Ｌ Ｄサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ、） ５：１３９３１４０１ （１９８５） ；
カソッ（Ｋａｔｚ）ら、ジャーナル・オフ・ニューロサ
イエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ５：ｌ４０２−
１４１１ （＋９８５） ：ソンデレ力−（Ｓｏｎｄｅ
ｒｅｇｇｅｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２
２］：１２９４−１２９７ （１９８３）］、成長円錐
は、その未来の／ナブス（ｓｙｎａｐｓｅｓ−ｔｏ−ｂ
ｅ）のマーカーを付ける「ヒユーム（Ｈｕｍｅ）ら、ネ
イチャ（Ｎａｔｕｒｅ） ３０５：６３２−６３４ （
１９８３） ：サン（Ｓｕｎ）ら、プロシーデインゲス
・オフ・す／ヨナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・
ニーニスニー（ＰｒｏｃＮａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ） ８４：２５４０−２５４４ （１９８７）ｌ
。成熟ニューロンは、これらの工程に移した分子の成分
を変化することによって部分的にこれらの構造を調節す
る「グラフスティン（Ｇｒａｆｓｔｅｉ＋ｉ）ら、Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、 Ｒｅｖ、 ６Ω：１１６７−１２８３
（１９８０） ；マクカー リ−（ＭｃＱｕａｒｒｉ
ｅ）ら、ジャーナル・イン・ニューロサイエンス（Ｊ、
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ６：１５９３−１６１）５ （
１９８６）１．、このような変化は、局所的にＵレイス
フ（Ｌａｓｅｋ）ら、Ｃ（ｑｌｌ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ、
ＲＤ Ｇｏｌｄｍａｎ、 Ｔ Ｐｏ１ｌａｒｄ Ｊ
Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、 Ｅｄｓ、、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓｏｎ
Ｃｅ１ｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ５ｅｒｉｅｓ
： Ｖｏｌ ３、コールド・スプリング・バーバー
ニューヨーク、ｐ、１．０２１−１０４９ （１９７６
）ｌ、該レベルの遺伝子発現で、例えば、チューブリン
について示されたような［ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、
ンヤーナル・イン・セル・ハイオロ／（Ｊ、Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、） １０５：３０６５−３０７３ （１９８
７）１およびＧＡＰ −４３について本発明者らによっ
て；ｊχされたようなレー・ルの遺伝子発現でもたらさ
れる。形成性を明示する成体ＣＮＳニューロンの特徴は
知られていないか、１戊熟神経系における／ナブスの発
育ル１および再設胴間の神経突起成長間で類似性か！う
えられ、分子レベルては、成長関連タンパクの必要性か
不合理でない。 形成性に対するＧ Ａ、 Ｐ −４３の結合を確実に４
−るために依存するマーカーはないか、成体において高
レベルのＧ Ａ Ｐ−４３を発現するニューロンのいく
つかは、ンナブス再設訂かできるという証拠かある。す
なわち、ＧＡＰ−４３発現は、嗅神経およびその標的、
四球の僧帽状細胞においで高い。嗅ニューロンは、生涯
をノ勇じて死と交換のサイクルを続けるのてＵグラシア
ティ（Ｇｒａｚｉａｄｅｉ）３ｙｓｔｅｍｓ、 Ｂｅ
ｒｌｉｎ、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｐｐ
、５５−８３ （１９７８）］、これらのンナプスは、
変化し続けなければならない。成体におけるＧＡＰ−４
３を発現する内側嗅ニューロンは、損傷の非存在下で再
設計することは明らかではないか、神経切断域中に発芽
することによって末梢領域を拡張することかできる。最
後に、海馬の回路は機能的に形成性てあり１ヘノウ゛イ
ノソ（Ｂｅｎｏｗ ｉ ｔ ｚ）ら、７ヤーナ、し、イ
ン。 ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ８：
３３９３５２（１９８８） ；コツトマン（Ｃｏｔｍａ
ｎ）ら、サイコロン−（Ｐｓｙｃｈｏｌ、） ３３：３
７１−４０１ （１９８２） ； リー（Ｌｅｅ）ら
１１．ｔ、。ｎｓ、 アヵテミ、り、ニュー３−り、
１９８１．１’ｉｐ、 １８９−２＋２ ；リ−（Ｌｅ
ｅ）ら、／ヤーナル・イン・ニューロフィ／′オロ／−
（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ、）伺２４７−２５８
（１９８０）：ｉ、形態学的分析によって、長期相乗
作用を伴っている／ナブスの数および形の変化を確認し
た［チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、
３０９：３ｂ−ｔ６（＋９ｇ４）ｉｏずなわち、成体
ＣＮＳにおいてＧＡ Ｐ−４３の制限された局在化は、
ＧＡＰ−４３発現ニューロンか再設計しごいる神経末端
において活動的に関係しているものであるという概念と
適有する。 実施例へ１ 多くの場合、個々のニーよ−ロンの表現禦（は、その微
・ｊ＼環境に依存する。このような１゛−形成性−：は
、例えば、交換神経副腎系のｉｉｒ駆細胞によって細胞
運（ｃｅｌｌ ｆａｔｅ）の選択において証明され、こ
れは、神経発育因子（ＮＧＦ）の影響下のニューロン表
現型またはコルチコステロイドの存在下の内分泌クロム
親和細胞表現型と仮定される。さらに、ニューロンは、
正常な発育の間およびンナプス使用に対して、それらの
関係、／ナプス形成性と称した現象を再設計する［イー
スター（ＥａＳｔｅｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ） ２３０：２０７−５１１ （１９８５）］。 これら２つのタイプの形成性に関するある統一テーマは
、元の華麗なニューロンの形の確立において劇的であり
、関係の再配列においてさらに微妙である構造的な再編
成である。１つの概念は、１セツトの遺伝子の発現かニ
ューロ／形成性について責任を有するということである
。微小環境によるこれら遺伝子の調節は、構造的な変化
をもたらすであろう。 フルチフステロイ）・は、哺乳動物の神経系の正常な発
育に必要であり、細胞運およびニューロ−′構造および
完全性に影響する１タウベ（１）ｏｕｐｅ）ら、／ヤー
ナル・イン・ニューロサイエンス（ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ
、） ５：２１１９−２１４２ （１９８５） ；ダウ
ペ（Ｄｏｕｐｅ）う、ジャーナル・イン・ニューロサイ
エンス（ｊ。 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ５：２１４３−２１６０ （１
９８５） ：アンダーマン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）および
アクセル（Ａｘｅｓ）、セル（Ｃｅｌｌ） ４７：１０
７９−１０９０ （１９８６） ；ホーン（Ｂｏｈｎ）
およびラウタ（Ｌａｕｄｅｒ）、Ｄｅｖ、Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ、 ｌ：２５０−２６６ （１９７ｇ） ；シェ
フ（Ｓｃｈｅｆｆ）ら、Ｅｘｐｔ、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ
６８：］９５−２０１（１９８０） ；シェフ（Ｓｃ
ｈｅｆｆ）およびフットマン（Ｃｏｔｍａｎ）、Ｅｘｐ
ｔ、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７６：６４４−６５４ （１
９ｇ２）サポルスキー（Ｓａｐｏｌｓｋのら、ジャーナ
ル・イン・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
、） ５：１２２２−１２２７（１９８５）］。培養中
、小さく極度の蛍光性の（ＳＩＦ）細胞および副腎髄質
細胞を含む神経堤うイニン（ｌｉｎｅａｇｅ）の細胞は
、ニューロン性またはクロム親和性のいずれの表現型を
呈することもてきる。 コルチコステロイドによって、それらがクロム親和性特
徴を帯ひる。コルチコステロイドの非存在下、ＮＧＦの
存在によって、それらかニューロン性の特性を発育させ
る［タウペ（Ｄｏｕｐｅ）ら、ンヤーナル・イン・ニュ
ーロサイエンス（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ）５：２
１１９−２１４２ （１９８５）］。 ラット副腎髄質クロム親和性細胞腫から誘導したクロー
ン株ＰＣＩ２の細胞［グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）および
ティジュラ−（７ｉｓｃｈｌｅｒ）、プロソーティンゲ
ス・イン・す／ヨナル・アカデミ−・イン・サイエンス
・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’ ］ Ａｃａｄ
、 ５ｃｉＵＳＡ） １３：２４２４−２４２８ （１
９８６） ；グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）およびティンニ
ラ−（Ｔｉｓｃｈｌｅｒ）、Ａｄｖａｎｃｅｓ １ｎＣ
ｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ
Ｊ、ｐｐ、 ３７３−４１３、アカデミツク・プレス、
ニューヨーク （１９ｇ２）］は、ＮＧＦによって、よ
りニューロン性となり、コルチコステロイドにさらして
クロム親和特性を維持する、同様の両能運（ｂｉｐｏｔ
ｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅ）を示す。 驚くへきことに、ＧＡＰ−４３発現の本研究は、ＰＣ１
２細胞および培養した交換神経ニューロンの両方におい
て、コルチコステロイドかＧＡＰ４３遺伝子発現の有用
な陰性調節物であることをホした。さらに、コルチフス
テロイトかＧＡＰ４３発現におけるＮＧＦの刺激効果を
抑制することを発見した。 実験方法 砂材 酵素は、ベーリンガー・マンノ−イム（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）、ニュー・イングランド・バ
イオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
）、またはヘセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）から購入し、供給者によって指定されたとおりに
使用した。組織培養産物は、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）から
購入した。放射化学物質は、二ニー・イングランド・ニ
ュークリアーテユ・ボン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ−Ｄｕ Ｐｏｎｔ）から購入した。 寒天および塩化セシウムは、ヘセスタ・リサーチ・ラボ
ラトリーズから購入した。機を得て懐妊しているスプシ
ーキュードーレイ種ラットは、チャールズ・リバー・ラ
ット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｒａｔ）から購入
した。ステロイドは、／グマ（Ｓｉｇｍａ）から、ＮＧ
Ｆは、コラホレイテイブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂ。 ｒａｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）（２、５ｓ型）から購
入した。他の全ての化学物質は、入手可能な最高級のも
のであった。 細胞培養 ５％熱不活化ウマ血清および１０％ウシ胎児血清を有す
るタルへノコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＰＣ１
２細胞を増殖した。約２０％の集合度の時に細胞をルー
チン通りに用いた。ＲＩＡによって測定したコルチソル
レベルは、血清含有培地中、３ｎＭまたはそれ以下であ
った。３７°Ｃて、５％二酸化炭素を有する湿気を帯び
たインキュヘーター中で細胞を増殖した。２０日齢胎芽
ラうト上頚神経節から分離したニューロンを、ＮＧＦ（
５０％ｇ／ｆｆの、０６％グルフースおよび１０％つ／
胎児血清を供給したハム（Ｈａｍ’ ｓ） Ｆ １２培
地中で培養した。ステロイド試験のために、通常、該化
合物を９５％エタノールに溶解した。ビヒクルとしてエ
タノールを用いて行った対ＩＩ６は、豊富なＧＡＰ−４
３またはＧＡＰＤＨＲＮＡ中で変化を示さなかった。 ＲＮＡブロッティング イソチオンアン酸グアニ／ン法によって、培養された細
胞から全ＲＮＡを調製した［チャーグウイン（Ｃｈ ｉ
ｒｇｗ ｉ ｎ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉ。 ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） １８：５２９４−５２９９ （
１９７９）’ｊ０各培養物由来の全ＲＮＡ２０μ７を、
２．２Ｍホルムアルデヒドを含有している１ ２％アカ
ロースゲルを介して電気泳動にかけ、ナイトラン（Ｎｙ
ｔｒａｎ）［／ユライヒャー・ア７ ｌ’ ・：ｌ／
：ｓ−ル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄＳｃｔｕ＋ｅ
ｌ ｌ）］にキャピラリティによって移し、核酸を加熱
固化によって固定化した。５０％ホルムアミド、５ｘＳ
ＳＣ（ｌｘｓｓｃ ： １５０ｍＭ塩化ナトリウト、１
５ｚＭクエン酸す１−リウム、ｐｌ（７０）、〕×テン
ハーツ（Ｄ ｅｎｈａｒｄｔ’ ｓ）溶液、１％ドテン
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１００μ９／ｇＱの
変性したづ−モン精液ＤＮＡを含有しているハイブリタ
イヤ−ノー３ン溶液中、４２°Ｃて、少なくとも１時間
、プレハイブリタイセーンヨンを行った。 Ｄ Ｎ ＡポリメシーセＩのフレノウフラグメン１へを
用いて、仕向のへキせヌクレオチ！・ブライミンク（こ
３上−・て調ｌ製（またｌ ｘ ］ ０ ’ｃｐｍ／ｍ
（！の３２Ｐ−標識化Ｌ）Ｎ Ａプローブを含有してい
る同一の溶液中、４２°Ｃて１０〜１２時間、ハイブリ
ッド形成を行った［ファインバーブ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ
）およびフオゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）、
Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １３２：６−１２（１
９８４）］。ここに記載したようなＧＡＰ−４３に対し
て、またはＧＡＰＤＨに対してクローンしたｃＩ）ＮＡ
から該プローブを作製した「ピエチャクツイク（Ｐｉｅ
ｃｈａｃｚｙｋ）ら、Ｎｕｅｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
１２：６９５１−６９６３ （１９８４）ｌ。プロ
ットを、６５°Ｃて、２ＸＳＳＣて２回、各２０分間、
ならひに６５°Ｃで、０２ｘＳＳＣでさらに２０分間洗
浄した。−７０’Ｃて、スクリーンを強めながら、オー
トラジオグラフィーを行った。１×テンハーツ溶液、１
％ＳＤＳ。 ５０ｍＭｈリス、ｐｌ、、＋ ７ 、４および０．０５
％ビロリン酸すＩ・リウムを含有している溶液中、８０
°Ｃて２時間、ハイブリクイズしたプローブをプロット
からストリップした。 Ｌ、 Ｋ Ｂウルトラスキャンによってスキャニングレ
ー寸−テンン用・メトリーを行った。与えられたプロ、
１・のいくつかの位置をスキャンし５、像の強度を時間
に対してプロットした。像の強度の測定は、曲線の線形
部分から得た。ＧＡＰＤＨＲＮＡレヘルの注＠深レベの
測定によって、これらのいくつかの実験条件ドて変化し
ないことかわか−。 た。 核追加検査（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｕｎ−０ｎ Ａｓ５ａ
ｙ）各実験の４８〜６０時間前に、Ｉ）Ｃ１２培養物を
スブリ、トシた。細胞は、未処理のままか、あるいはＮ
ＧＦ（５０ｎｙ／ｚ□またはデキサメタシン（１μＭ）
のいずれかで６時間処理（、た。約１，０００万の核を
、以下の変形を伴ってグリーンハーグの方法［グリ−ン
ハー グ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ、 ＲｉｏｌＣ
ｈｅｍ、 ２６０：１４１０１４４１１０ （１９８５
）］によって、それぞれから調製し、た。細胞溶解は、
］、ＯｚＭ塩化すトリウム、１０１Ｍ１−リス、ｐＨ７
，４，３ｍＭ塩化力ルンウムおよび２００ユニｙ ｌ−
／ｒｔｒＱ ＲＮ Ａｓ１ｎ［プロメカ＋バイオツク（
Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）ｉ、中たった。５０１
１Ｍｌ−リス、ｐ＋＋ ８．３．４０％グリセロール、
５ｉＭ塩化マグネ／・ラム、０．１ｚＭエチレン／アミ
ノ四酊酸（ＥＤＴＡ）、２ｘＭ／チ第１・レイｉ −、
ｒしおよび２００ｘ−＝−、、ｌｚｌｍＱ ＲＮＡ５ｉ
ｎ中細胞溶解緩衝液で洗浄した後、核を再懸濁した。 核を計数し、５，０００万／ｉｃの濃度で、液体窒素中
に貯蔵した。 懸濁した核に、同量の、１０ ｘＭ ｌ−リス、ｐＨ８
０，５ｍＭ塩化マグネ／ウム、０３Ｍ塩化ノノリウムお
よび各々］、ＯｘＭのアデノノン、ンチンンおよびグア
ノンンヌクレオチト三リン酸を含有している緩衝液に添
加することによって、解凍［７た核中の発生期鎖の標識
化を行った。次いて、ウリノン三リン酸（３２Ｐ）３０
０，１１Ｃｉを添加しく３０００Ｃ１／ミ’）モル）、
３０°Ｃて３０分間、成核を標識した。次いて、３′７
°Ｃて４５分間、６０ ｄｉ トリス、ｐ）−（７，５
，１５ｚＭ塩化すＩ・リウム、ＩＯｔＭ塩化マグ不ノウ
ム、および２００−１＝）ｌ−／ ｒｒｔρＲＮＡ５ｉ
ｎを含有している緩？Ｉｉ液６００μθ中て１００ユニ
ノ１−ＲＱ Ｉ ＤＮＡａｓｅ：プロメガ・バイオチ
ック」を添加して核を消化し７た。次いて、開示されて
いるとおり［グリーンハーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）ら
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２６０：１４１０１−
１４１１０ （１９８５）Ｉ、十票識化ＲＮ Ａ ヲフ
ロテイナーセＫ［ヘーリンメノ゛−・マンハイム（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］で消化した。 数回９フエノール、クロロホルム−イソアミルアルコー
ル抽出の後、酢酸ナトリウムの存在下、核酸をエタノー
ル沈殿した。回収した標識化核酸は、またＤＮＡを含有
しており、これを、３７°Ｃで４５分間、ＲＱＩ Ｄ
ＮＡａｓｅ（５０ｘＭトリス、１）Ｈ７，５、ＩＣ１ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、７．５ｉＭ塩化マグネシウムおよび
２００ユニツトＲＮＡ５ｉｎ／酎を含有している緩衝液
２５０μＣ中５０ユニツト酵素）、次いで、４２°Ｃで
３０分間、ブロテイナーゼＫ（５％ＳＤＳ、０．５Ｍト
リス、ｐＨ７゜４．１２５１Ｍ ＥＤＴＡおよび０ 、
２ ｍｇ／ ＲＱプロテイナーセＫを含有している緩衝
液１００μａを添加することによる）の別の循環にかけ
た。数回のフェノール、クロロホルム−イソアミルアル
コール抽出の後、標識化ＲＮＡを、酢酸アンモニウムに
よるエタノール沈殿を３回行い、一体化していないヌク
レオチド三リン酸を除去した。 チロ／ンヒトロキンシーセに関してクローンしたｃＤＮ
Ａ［ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、 ２８５：１４６３２−１４６３７ （１９８３）］
、］グリセルアルデヒドー３リン酸デヒドロケナーセＧ
ＡＰＤＨ）、ｐＢＲ３２２およびＧＡＰ−４３遺伝子の
８キロベースゲノムフラグメントを含むプラスミドを、
適当な制限酵素を用いて線形化し、フェノール抽出し、
エタノール沈殿し、そして、遠心分離によって回収シタ
。ＤＮＡ（２５０μｉｉ／ｒｃ）を、アルカリ（０５Ｎ
水酸化ナトリウム）によって変性し、１０容量の１Ｍ酢
酸アンモニウムの添加によって中和シた。ニトロセルロ
ースフィルターサークルヲ、重力濾過によってＤＮＡ５
０μ９て負荷した。２５ＩＭＰＩＰＥｓナトリウム、ｐ
Ｈ７，２，５０％ホルムアミド、０．７５Ｍ塩化ナトリ
ウム、２，５ＦＭＥＤＴＡおよび１００ ｔｔｇ／ｍ（
ｌのｔＲＮＡを含有している緩衝液中、４５°Ｃで１０
〜１２時間、該フィルターのプレハイブリット形成を行
った。 １〜３ ｘ １０６ｃｐｍ／ ｍρの範囲の比活性の標
識化ＲＮＡを含有する同一の緩衝液中で、４５°Ｃて４
日間、ハイブリタイセーションを行った。開示されてい
るように［グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）、Ｊ
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２６０°１４１０１−１４１１
０ （１９８５）］、洗浄およびＲＮ Ａ ａｓｅ処理
を行った。２回行ったフィルターを、シンチレーション
カウンターにおいて、乾燥後に計数した。データは、フ
ィルターを含有しているベクターからハックグランドを
引いた後ノ＼イブリダイズした１００万当たりの部数と
して表す。 結果 ＧＡＰ−４３発現の二重調節 ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡ蓄積に与えるＮＧＦおよび糖質フ
ルチコイトの影響をＲＮＡプロット法によって測定した
。デキサメタシンはＧＡＰ−４３ｍＲＮＡレベルの顕著
な減少を生じるのに対し、ＮＧＦ添加の結果、基底レベ
ルよりも著しく増加した。テンシトメトリーによって測
定し、ＲＮＡ負荷について修正したＧＡＰ−４３ＲＮＡ
の定量化の結果、デキサメタシンは５．５倍減少させる
か、Ｎ Ｇ Ｆは３５倍増加を生じることが明らかとな
った。ｃ−ｆｏｓとは異なり、ＮＧＦの存在下でのＧＡ
Ｐ−４３ｍＲＮＡの蓄積は安定しており、これは数時間
以内にピークに達し、次いて、ＮＧＦの継続存在にもか
かわらず素早く衰退する。 蓄積したＧＡＰ−４３ｍＲＮＡレベルに与えるステロイ
ドの効果の特異性を試験するために、いくつかの構造ク
ラスの種々のステロイドを、ある濃度範囲にわたって試
験した。各クラスのステロイドは、ｉｎ ｖｉｖｏで様
々なタイプのニューロンに選択的に影響を及ぼすことか
示された［マクエラエン（ＭｃＷｅｎ）ら、Ｐｈｙｓｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ、 ６６：１１２１−１１
８８（１９８６）］。 １つの試験において、ステロイドの７＃変は、４８時間
の処理の間、１μＭであった。テンシトメトリーによっ
て定量化を行い、ＲＮＡ入力におけるわずかな変動につ
いて正規化した。エストラノオール、テストステロン、
およびフ“レグ不ノロンは、蓄積したＧＡＰ−４３ｍＲ
ＮＡレベルに対し影響しなかった。デキサメタシン、コ
ルチコステロン、アルドステロンおよびプロゲステロン
は、ＧＡＰ−４３ＲＮＡのレベルを、各々、対照（ＧＡ
Ｐ−４３ＲＮＡのＮＧＦ−刺激レベルを１００％↓（、
て定義しまた）のＣ】％、１５％、１０％および１５％
まで減少した。プロケステロン効ψは、それ自イ本のレ
セプターによってもたらされるかもしれないか、これら
のテークは、鉱質コルチコイドまたは糖質コルチコイド
のいずれかのレセプターの活性化を示唆している［アリ
ｆ（Ａｒｒｉｚａ）ら、リイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
２３７：２６８−２７５ （１９８７） ；キケレ（
Ｇｉｇｕｃｒｅ）ら、セル（Ｃｅｌｌ） ４６：６４５
−６５２ （１９８６１゜コルチコステロイドは、ＳＩ
Ｆおよび副腎骨髄細胞の両方においてニューロン表現型
のＮＧＦ誘導を遮断する［タウベ（Ｄｏｕｐｅ）ら、／
ヤーナル・オフ・二、−口＠ゴイエンス（Ｊ、 Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ、 ） ５：２１！！ｌ−２１４２（１９８
５） ；タウベ（１）ｏｕｐｅ）ら、ンヤーナ／ｌｚ−
オフ・ニュー０升イエンス（１，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）
５：２１４３−２１６０ （１９８５）１．。Ｇ Ａ
Ｐ −４３発現に際しての２つの薬物の相互作用の性
質を調へるために、ＮＧＦ（５ｏｎ？・ｉｃ）およびデ
キサメタソン（１ｔｔ ｌｔ４ ）ノミｒ在下、ＰＣ］
２１［Ｂ胞を３（３時間均油させた。ギ２．東は、デキ
サメタソンか、Ｎｃｒ”によってもたらされるＧＡＰ−
４３ｍＲＮＡの増加を妨げることを小す。 Ｎ Ｇ Ｆおよびステロイドの効果は直接的であるＮ
Ｇ Ｆおよびコルチコステロイドの効果か直接的に及ぼ
されるのかまたは間接的に及ぼされるのかという疑問を
、タンパク合成抑制薬ンクロベキ／ミ１−の使用によっ
て処理した。０５Ｈｇ／ｍＱのシクロへキンミドの濃度
は、２４時間目の細ｔｌａ成育能力への影響なくしてタ
ンパクへの（３Ｈ）ロインンの取り込みの９４％以十を
抑制する。ンクロヘキンミトは、ＧＡＰ−４３遺伝子発
現のＮＧＦ強化およびデキサメタソン抑制のいずれをも
妨げず、これはいずれの効果ちｄｅ ｎｏｖｏタンパク
合成を必要としないことを示す。ＮＧＦ処理細胞と、な
らびにＮＧＦおよび０５Ｈｇ／杼または２μｙｌｍσン
クロヘキンミト・て処理した細胞と、対照よを比較した
。０５μｙｌ ｖｔ（２／クロへキンミドによる処理の
後、大きいサイズの転写産物か示され、これは、スプラ
イスしていない前駆体を表すてあろう。Ｇ Ａ Ｐ −
４３発現のテキ→ブメタソン抑制は、デキサメタソンだ
（づを用いるよりもシクロへキ／ミｌとデキサメタソン
を用いる方かまり著Ｉ−いものてあ−）だ。 ０、’］ｖＭのａ度にて、より強力なタンパク合成抑制
薬アニソマイ／・ンを用い、これらの実験を、１２時間
までに細胞死か生じるために６時間の暴露時間−Ｃ繰り
返した。了ニソマインノは、ＮＧＦによってもたらされ
るＧＡＰ−４３ｍＲＮＡの増加に影響を及ぼさなかった
。デキサメタソン抑制は、Ｎ Ｇ Ｆ誘導よりも遅く、
６時間までは認識されず、従って、該効果は、アニソマ
インン感受性に関して検査することかできなかった。Ｎ
Ｇ Ｆによるプレ処理は、ステロイド抑制を直接防止
しなかった。 別の試験において、ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡの充分に抑制
された安定状態レベルを達成するのに必要とする時間は
、ＮＧＦ−）備処理の後にステロイ１−を添加すると一
層長くなることか判明した。 ステロイド抑制は転写的である Ｎ Ｇ Ｆおよびステロイドの両効果に関！−ｊする調
節のレベルを評価するために、核追加試験（ｎｕｃｌｅ
ａｒ ｒｕｎ−ｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）を行っ
た。核は、５０％ｇ／ｍＯＮＧＦまたは１ＨＭテキせメ
タシンで６時間処理し７たＰＣＩ２１１（ｔｌｌｌＫか
ら調製した。各グループからの標識化ＲＮ 、Ａを、固
定化Ｄ Ｎ Ａ、 ｓを含有スる二）゛ロセルロースフ
ィルターにハイブリクイズした。ハイブリダイゼー／−
３ンおよび洗浄の後、各フィルターに関する特異的放射
能活性を算出し、テークを１００万当たＩりの部数でハ
イブリクイズされた数として表（７た。ＮＧＦは、基本
的な転写率に対し影響は認められなかったか、テキ±メ
タシンは、Ｇ Ａ Ｐ −４３の転写率を約４５倍減少
した。比較すると、千ロ／ンヒドロキンシーセ転写は、
デキサメタソンによって増大し、ＧＡＰＤＨの転写は変
化し５なかった。 Ｇ Ａ Ｉ） −４３転写ユニツトを定義する一連の実
験において、新生児脳核から調製した流出（ｒｕｎｏｆ
ｆ）−標識化ＲＮΔを、第１イン）・ロンの初期部分を
通って、５′フランキング領域にわたる近隣の一連の一
Φ鎖Ｍ １３クローンにハイブリクイズした。結果は、
転写かコーディング鎖たけからでアリ、フランキングセ
グメントからではないことを示した。 ＮＧＦ処理ＰＣＩ２細胞は、分化したニューロンの良い
モテルであるとみなされるが、フルチコステロイドの効
果か、充分な分化状態を達成した後、−次ニューロンに
よって発揮されるか否かを決定するのが望まれた。そう
するために、ラット上類神経節の分離したニューロンを
培養し、これに１μＭデキサメタシンを４８時間添加し
た。上記のとおり、全ＲＮＡを調製し、分画し、プロッ
トし、プローブした。デキサメタシンは、交換神経ニュ
ーロンにおけるＧＡＰ−４３ＲＮＡの発現を減少させた
。デキサメタシン処理培養物中のニューロンの形態学的
外観は、未処理細胞のものと相異しなかった。これは、
短時間にわたる神経突起の延長または維持かＧＡＰ
４３ ｍＲＮＡの持続性に依存しないらしいか、ＧＡＰ
−４３遺伝子産物か長い半減期を有するので、長期の効
果を評価する必要かあることを示唆している。 考察 本実験において、ＧＡＰ−４３遺伝子発現は、ＮＧＦに
よる陽性および糖質コルチコイドによる陰性の両対照に
支配されることを示す。両効果は、直接的であり、いず
れも新しいタンパク合成を必要としない。興味深くかつ
驚くべきことに、シクロへキンミドは、ＧＡＰ−４３ｍ
ＲＮＡのデキサメタシン抑制をさらに増加させることが
分かった。 特定の理論によって結有することを意図しないが、これ
は、ｍＲＮＡ安定化タンパク上での合成の抑制によるも
のであろう。 Ｉｎ ｖｉｖｏで、ＧＡＰ−４３遺伝子は高度に調整さ
れる。それは今日まで、ニューロンにおいてた゛け報告
されてきた。しかしなから、本発明者らは、神経環から
誘導される他の細胞における低レベルの発現を支持する
データを得た。動物におけるピークレベルは、神経突起
の成長時に達成され、正常な成長または再生に関係して
いる。その細胞特異的かつ成長に関連する発現の分子調
節器は、また明らかにされていない。神経発育因子は、
中間フィラメントに関連するｃ−ｆｏｓＳＮＧＦ Ｉ
Ａ、 ＮＧＦＩＢ、ヘーターアクチンおよびクローン化
ｃＤＮＡのようないくつかの遺伝子の発現を直接増加さ
せる［グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）ら、ＪＢ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２６０：１４１０１−１４１１
０ （１９８５） ； ミルプラント（Ｍｉｌｂｒａ
ｎｄｔ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３８ニア
９７７９９ （１９８７） ；ミルプラント（Ｍｉｌｂ
ｒａｎｄｔ）、ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ） ｌ：１８
３−１８８ （１９８１３） ；レオナルト（Ｌｅｏｎ
ａｒｄ）ら、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー（
Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、） １０６：１８１−１９３
（１９８８）］。 本データは、ＧＡ、１”４３％節とこれらの他の遺伝子
の調節との間にいくつかの顕著な相異点かあることを示
している。ｃ−ｆｏｓおよびＮＧＦＩＡおよびＮＧＦＩ
Ｂのようなものについて、ＮＧＦ誘導は、迅速であり、
数分以内に影響を及ぼし、数時間後に衰退する。これは
、ＧＡＰ−４３発現へのＮＧＦ効果とは対照的であり、
着手はゆっくりであり、安定である。 さらに、広範囲の刺激は、カル／ラムエントリ、他の成
長因子および血清離脱症状および多血症の増加を牛ヒさ
せることができ、これらの効果は様々なタイプの細胞に
おいて見られる［グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ
）およびシフ（Ｚｊｆｆ）、不イチャ（Ｎａｔｕｒｅ）
３１１：４３３−４３８ （１９８４）］。ｃ ｆ
ｏｓのような遺伝子は、ＤＮＡウィルスのごく初期の遺
伝子にたとえられており［ゲレノト（Ｇｏｅｌｅｔ）ら
、不イチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ） ３２２：４１９−４２
２ （１９８６）］、そのうちのいくつかはそれ自体、
細胞機構を専用機能に再プログラムする転写的調節器を
コードする。 ＮＧＦに対するＧＡＰ−４３の遅延応答は、ｃ ｆｏ
ｓ、ＮＧＦ ＩＡＳＮＧＦ Ｉ Ｂ等とは別で異なるク
ラスのＮＧＦ−調節遺伝子に当てはまり、即時応答にお
けるよりもむしろ長期適合における役割を果すらしいこ
とを示唆している。これらの他の遺伝子とは異なり、Ｎ
ＧＦはＧＡＰ−４３ｍＲＮＡ蓄積の大きい増加を生じる
が、転写速度に与える効果は、ごくわずかである。した
がって、その作用は、転写後のメカニズムを介−しても
たらされるらしい。 神経系に与えるコルチコステロイドの影響は広範囲であ
る［マクエラエン（ＭｃＥｗｅｎ）ら、Ｐｈｙｓｉｏｌ
。 ｇｉｃａｌ Ｒｅｖ、 ６６：１１２１−１１８８ （
１９８６）］。ステロイドは、転写調節薬としてそれら
のレセプターを介して作用するので、いずれのニューロ
ン遺伝子がコルチフステロイドによって調節されるのか
を決定することは重要である。神経堤行数の細胞を考え
ると、細胞表現型に与えるコルチコステロイドおよびＮ
ＧＦの拮抗効果が遺伝子発現のレベルで反映されている
か否か、すなわち、同一の遺伝子が２つの薬物によって
双峰的に調節されるか否かを決定するのは特に興味深い
。 本発明者らは、ＧＡＰ−４３転写がコルチコステロイド
によって抑制され、ＮＧＦの同時存在がこの抑制を妨げ
ないことを示した。これは、培養したクロム親和性細胞
のＮＧＦによってもたらされたニューロン分化に対する
糖質コルチコイド抑制効果と類似している［タウベ（Ｄ
ｏｕｐｅ）ら、／ヤーナル・オフ・ニューロサイエンス
（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ）５：２１１９−２１４
２ （１９８５）ｌ。かくして、ＧＡＰ−４３は、細胞
運命のこれらのモジ、レータ−の公知の分岐効果に少な
くとも匹敵する方法て、ＮＧＦおよびコルチコステロイ
ドによって双峰的に調節される。５ＣＧＩＯと称される
他の神経特異性遺伝子がＰＣＩ２細胞において双峰的に
調節されることは興味深い［スティン（Ｓｔｅｉｎ）ら
、Ｉ）ｅｖｅｌｏｐ。 Ｂｉｏｌ、 １２７：３１６−３２５ （１９８８）
］。Ｇ Ａ Ｐ−４３と同様に、ＳＣ０１０発現は、Ｎ
ＧＦによって刺激され、糖質コルチコイドによって抑制
されるか、抑制レベルは２つの遺伝子間で多少異なる。 コルチフステロイドは、ＰＣ１２細胞の形状に顕著に影
響を及ぼさない。ＧＡＰ−４３か抑圧されるので、通常
レベルのｍＲＮＡは、ＰＣＩ２細胞における神経突起延
長に必要ではないことは明らかである。しかしなから、
これらの結果か、ＧＡＰ−４３か神経突起成長に不必要
であることを意味すると解釈し得ることは明らかではな
い。第１に、低レベルのＧＡＰ−４３ＲＮＡは、ステロ
イド抑制の後にも存在する。第２に、該タンパクは、長
い細胞半減期を有する。さらに、ＰＣＩ２細胞は、形質
転換され、これらのｉｎ ｖｉｖｏ相対物によってもた
らされたものとは異なる構造制限を課せられるらしい。 実施例■ 本実施例において、本発明者らは、ＧＡＰ−４３が、お
そらく細胞構造のレベルで、固有のニューロン表現型の
確立に直接貢献しているという仮説を試験することを説
明する。かくして、本発明のもう１つの態様において、
ラットＧＡＰ−４３をコードイー１けする発現ベクター
を、いくつかのタイプの非ニューロン性細胞に導入する
。 アデノウィルス主要後期プロモーター、ＳＶ４０早期プ
ロモーター、またはサイトメガウィルスプロモーターの
抑制下、ＳＶ４０複製開始点を含有するプラスミドに挿
入したラットＧＡＰ−４３ｃＤＮＡを用いて、発現ベク
ターを構築した１カーンズ（Ｋａｒｎｓ）ら、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３６：５９７（１９８７）］。 結果は、これらのベクターの全てを用いても同様であっ
た。 ＣＯ８７細胞［グルラマン（Ｇｌｕｚｍａｎ、 Ｙ、
）、セル（Ｃｅｌｌ） ２３：１７５ （１９８１）］
を、開示に従ってトランスフェクトし［ツバ−（Ｚｕｂ
ｅｒ、 Ｍ、 Ｘ、 ）ら、サイエンス（Ｓｅｉｅｎｅ
ｅ） ２３４：１２５８ （１９８６）］、七Ｍ己ウつ
キ゛抗ＧＡＰ抗体を用いてＡＧＰ−４３免疫反応性につ
いて試験（−た。Ｔ−細胞特異性膜タンパクＣＩ） ８
を発現する同様のベクターを用いて、同しく、対照ｌ・
ランスフェクションを行った「ンーＦ（ＳｅｅｄＢ、）
う、プロン−ティンゲス・オフ・ナンタナル・アカテミ
ー ・オフ・＠ヅイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｅ
、 Ｎａｊ １． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）
８４ ：３３６５ （＋９８７）ｉｏ細胞は平板培養の
１時間後に試験（２，た。 対照ＣＯ８細胞は、ＣＤ８に対する抗、体をｎするＣＤ
８−１−ランスフェクト細胞の免疫蛍光標識化の後は実
質的に丸かった。ＧＡＰ−４３１−ランスフェクト細胞
において、ＧＡＰ−４３免疫反応性は、細胞の約５〜２
０％において顕著であり、トランスフェクンヨン効率に
依存した。あるＧＡＰ−４３は、細胞質ゾル画分と膜画
分を比較するウェスターンプロット分析によって確認し
た観察のごとく、膜連結性のようであった。 高レベルのＧＡＰ−４３を発現する細胞はそれらの細胞
周界から突起を伸延している多くの細胞を有する独特の
構造を有していた。これが対ＧＡＰ−４３抗体による細
胞表面の良好な可視化によらなかったことを確認するた
めに、すべての細胞の表面をローダミン処理した麦芽凝
集素によって標識化した。ＣＤ８４ランスフエクト細胞
、偽トランスフェクト細胞（ｍｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｅ
ｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）、またはＧＡＰ−４３を発現し
なかった同一のＧＡＰ−４３トランスフ工クト皿におけ
る細胞は、短いまたは単一の突起を生じたが、これらの
伸延突起を有していなかった。長く細い突起は、高いレ
ベルのＧＡＰ−４３発現たけに関連していると思われた
。高いレベルのＧＡＰ−４３発現と突起成長の同様の関
係か、ポリオーマＴ抗原を発現する３Ｔ３細胞、ｗｏｐ
細胞［ペイル（Ｖａｌｌｅ）ら、Ｍｏ１Ｃｅ１１．Ｂｉ
ｏｌ、 Ｉ：４１７ （１９８１）］を］ＣＤＭ８−
ＧＡＰ１ＣＤ−−マ複製開始を含むＧＡＰ−４３発現ベ
クターによってトランスフェクトした場合、見つかった
。これらの−時的トランスフェクションアッセイにおい
て、トランスフェクションの効率および発現のレベルは
共に変化し、該効果の定量化を困難にする。 定量化の問題点を解決するために、構成的にＧＡＰ−４
３を発現する一連の安定に形質転換されたクローンＣＨ
Ｏ細胞系を得た。平板培養の３０分後の対照細胞系は、
−船釣に丸かった。ＧＡＰ４３発現系において、ＧＡＰ
−４３発現は、突起伸延と明らかに関連していた。ＧＡ
Ｐ−４３を発現する多くの細胞は、狭くかつ長さ２０〜
７５μｍの糸状足突起を伸延した。対照およびＧＡＰ４
３を発現する細胞系の両方において、周界は、しばしば
、幅広く、細く、ひた飾りのあるラメリボデイラムを含
んでいた。 Ｃａ−Ｐ○４共沈法およびＧ４１８選択法によってＣＨ
Ｏ細胞にＣＤＭ８−ＧＡＰおよび不オマインン耐性発現
プラスミドを共トランスフェクトすることによって、Ｇ
ＡＰ−４３を構成的に発現するクローン細胞系を樹立し
た［マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラ
ー・クローニングニア・ラボラトリー−７ニユアル（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ハーバ−・ラボラ
トリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−ニ
ューヨーク （１９８２）］。対照のトランスフェクト
した細胞において、ＣＤＭ８−ＧＡＰの代わりに、プラ
スミドｐＣＤＭ８［シード（３ｅｅｄ、 Ｂ、 ）、不
イチャ（Ｎａｔｕｒｅ） ３２９：８４０ （１９８７
）］を用いた。細胞が密集した後、これらをトリプシン
で継代し、ポリＤ−リシンー塗布したグラスカバースリ
ップ上で平板培養した。 突起形成は、対照プラスミドによってトランスフェクト
した４つの独立系、およびウェスタンプロット法によっ
て測定した最大量のＧＡＰ−４３を発現する４つの独立
系から評価した。ノマルスキー光学系の使用によって、
生きている細胞を試験した。ＧＡＰ−４３免疫反応性を
有する全ＣＨ○細胞系は、対照細胞系よりも突起を伸延
させる傾向にあった。さらに、ＧＡＰ−４３を発現する
細胞は、対照セルライン（０，５％〜１％）と比較する
としばしば複数の突起を有しており（細胞の６％〜１１
％の間の範囲）、該突起の長さは対照細胞のものよりも
長かった。 したがって、ニューロン蛋白ＧＡＰ−４３はこれらの非
ニューロン細胞の形状変化をひき起こす。 細胞突出が成長円錐に似ているように、糸状足およびラ
メリポデイラムは細胞体幹から直接伸延する。 非ニューロン細胞において、ＧＡＰ−４３は、その正常
な生物学的情況から取り出され、調節されていない形態
で発現されるので、ここで観察された変化は、そのニュ
ーロン情況におけるＧＡＰ４３の効果を疑似しない。し
かしなから、実際に、ＧＡＰ−４３は、成長円錐におい
て豊富であるという点で、成長円錐機能に関連しており
［カッツ（Ｋａｔｚ、 Ｆ、 ）ら、ジャーナル・イン
・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ５
：１４０２ （１１８５） ：デグラーン（ＤｅＧｒａ
ａｎ、 Ｐ、 Ｎ、 Ｅ、 ）ら、ニューロサイエンス
（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ６１：２３５ （１９８５）
；メ・ｆす（Ｍｅｉｒｉ、 Ｋ、 Ｆ、 ）ら、プロ
シーデインゲス・イン・ナショナル・アカテミー・イン
・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｅｉ、 ＵＳＡ） ８３：３５３７
（１９８６） ；スキーニ（Ｓｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ，
Ｐ、 ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３ニア
３８ （１９８６）］、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖ
ｉｔｒｏて軸索を伸延しているニューロンにおいて最高
レベルであり［スキーニ（Ｓｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ，Ｐ
、 ）ら、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー（Ｊ
、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、） ８９：８６（１９８１）、
ベノウ°イッツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ、 Ｖ、 Ｅ、 ）
ら、ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） １°
３００ （１９８１） ；メイリ（Ｍｅｉｒｉ、 Ｋ、
Ｆ、 ）らジャーナル・イン・ニューロサイエンス（
Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ） ８：２５７１ ；ベノ
ヴイッツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ、 Ｌ、 １． ）ら、Ｔ
、１．Ｎ、Ｓ、 １０：５２７ （１９８７）Ｅ、上
記のように、ＮＧＦに暴露したＰＣＩ２細胞で増加し、
神経突起成長を伴うという証拠かある。 本発明者らは、特定の理論によって結び付けようとする
ものではないか、これらのテークの１つの解釈は、ＧＡ
Ｐ−４３、ニューロン特異性分子はこれらの細胞に全く
新規なニューロン様構造を−Ｉｊえることかてきること
である。別の説明は、ＧＡＰ’−４３が細胞の形状を制
御するより一般的なメカニズムに関係するということで
ある［プレイ（Ｂｒａｙ、 Ｄ、 ）ら、サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３９：８８３ （１９８８）ニス
ミス（Ｓｍｉｔｈ、 Ｓ、 Ｊ、 ）、サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）２４２ニア０ｇ （１９８ｇ）’］。 多くの細胞は、糸状足またはラメリポディアを伸延する
ことができ、これは、細胞サイクルの相、平板培養条件
、および第２メソセン／ヤー〇レベルを含めたいくつか
の因子に依存する傾向にある［オールレッド（Ａｌｌｒ
ｅｄ、 Ｌ、 Ｅ、 ）ら、サーフエイ／ズ・イン・ノ
ーマル・アンド・マリグナント・セルズ（Ｓｕｒｆａｃ
ｅｓ ｏｆ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｍａｌｉ
ｇｎａｎｔ Ｃｅ１ｌｓ） ノ＼イネス（Ｒ，０
，Ｈｙｎｅｓ）編（ジョー７・ウィリー・アンド・サン
ズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ）、ニュー
ヨーク、１９７９）、ｐ、２１］。この理由で、まさに
同一の厳格な平板培養条件下で細胞を検査した。細胞に
突起を伸延さセることを可能とする細胞メカニズムは複
雑であり、すへての細胞に存在すると思われる要素を含
んでいる。したかって、成長円錐の突起と線維芽細胞の
突起との類似性は、驚くへきことではない。実際、成長
円錐構造□は、細胞運動を与える一般的な方法として用
いられることができる皮質のアクチンの流動および選択
的付着のような細胞メカニズムを利用することか示唆さ
れている［プレイ（Ｂｒａｙ、 Ｄ、 ）ら、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３９：８８３ （１９８８）
ニスミス（Ｓｍｉｔｈ、 Ｓ、 Ｊ、 ）サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４２ニア０８ （１９８８）］
。ＧＡＰ−４３がこのような機構といかに関連するかを
判断するかが残されている。 実施例■ 新規な膜ターゲノテイングペプチトの同定さらにもう１
つの本発明の態様において、ＧＡＰ−４３蛋白は、該Ｇ
ＡＰ−４３蛋白を細胞膜、特にニューロン細胞の成長円
錐の領域へ定方向化する新規な膜−ターケ、テイングペ
プチドトメインを含有することが判明した。この膜ター
ゲツティングドメインの構造を決定し、該ペプチドは、
（通常は膜連結ではない）通常は細胞質ゾルの蛋白を細
胞膜へ定方向化するのに有効であることか示された。 本発明の本態様の組成物および方法により、とりわけ、
通常は膜連結ではない蛋白を包含する所望の蛋白のいず
れも細胞膜へ定方向化することか可能である。さらに、
本発明の本態様の組成物および方法は、動物において、
神経学的損傷および障害のｉｎ ｖｉｔｒｏ、 ｉｎ
ｖｉｖｏ、およびｉｎ ５ｉｔｕ治療処置で利用できる
のは明らかである。 はとんどの膜連結蛋白は細胞膜と直接インターカレート
する高疎水性ドメインを含有することはよく知られてい
る。しかしなから、驚くへきことに、ＧＡＰ）−４３は
、細胞膜に連結し、特に発育または再生するニューロン
細胞の成長円錐と連結しているか、かかる高疎水性領域
を欠くことか発見された。 今や、第２図に示すごとく、ＧＡＰ−４３蛋白は３つの
エクソンにてコード付けされることか発見された。短い
（１，０個のアミノ酸残基）アミノ末端エクソンは、驚
くべきことに、膜−ターケノテイングペブチドドメイン
をコード付けすることか発見された。第２のＧＡＰ−４
３エクソンの大部分を除去した実験は残りの蛋白の膜結
合に影響を与えなかった。同様に、ＧＡ、Ｉ”４３のカ
ルボキシ末端の置き換えは膜結合に影響しないことが判
明した。しかしながら、最初の４個のアミノ酸（ＭＥＴ
ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳ）を欠き、第５位のＭＥＴで開
始する合成ＧＡＰ−４３遺伝子はニューロンまたは非ニ
ューロン宿主細胞の膜に結合せず（第１１図）、これは
最初のエクソンはこの膜−ターケラティング機能の原因
であることを示す。 「膜−ターゲツティングペプチド」とは、以下の ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳ ＭＥＴ ＡＲＧ Ａ
ＲＧ ＴＨＲＬＹＳ ＧＬＮまたはその機能的誘導体の
いずれのアミノ酸配列もを意味し、それは、所望の蛋白
またはペプチドのアミノ末端またはその近くに結合した
場合、該蛋白またはペプチドの細胞膜への定方向化に影
響するであろう。 本発明の膜−ターゲツティングペプチドは、手動による
、または好ましくは自動方法による直接合成を包含する
がそれに限定されることのないよく知られた方法によっ
て所望の蛋白またはペプチドに結合させることかできる
。本発明の膜−ターゲツティングペプチドを所望の蛋白
またはペプチドに結合させる別の好ましい方法は、当該
所望の蛋白またはペプチドをコード付けする遺伝子を、
発現された遺伝子産物がそのアミノ末端に膜−ターゲツ
ティングペプチドを含むように修飾することを含む。こ
れは、本明細書中に記載するごとく、平滑末端または粘
着末端を結ぶ方法によって達成されるが、それらに限定
されるものではない。 かくして、もう１つの態様において、本発明は、ヌクレ
オチド配列 ａｔｇ ｃｔｇ ｔｇｃ ｔｇｔ ａｔｇ ａｇａ ａ
ｇａ ａｃｃ ａａａ ｃａｇまたはその機能的誘導体
よりなる膜−ターゲツティングトメインについてコード
付けするｃＤＮＡを提供するものである。 勿論、遺伝子暗号の縮退のため、所望の結果をなお達成
させつつヌクレオチドを変化させることは可能である。 同様に、当業者ならば、ある種の例においては、発現か
特定の宿主において考えられる場合、好ましいコドン使
用のため、ヌクレオチドを変更するのか望ましいことを
理解するであろう。これらのおよび他のかかる修飾は本
発明の範囲内のものであると考えられる。 さらにＧＡＰ−４３膜−ターゲツティングトメインを明
らかとするために、（ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、
およびＣＨＯ細胞を包含する）非ニューロン細胞オヨび
ニューロン細胞（ＰＣ１２細胞）を、突然変異が３位（
Ｃ３）および４位（Ｃ４）のシスティンのヌクレオチド
配列に導入されたＧＡＰ−４３遺伝子を含有するプラス
ミドで形質転換して、代わりに、それらの位置において
アラニンを発現させた（第１１図）。 Ｃ３またはＣ４いずれかの突然変異の結果、膜結合か大
いに減少することか判明した。最も顕著な効果はＣ４を
変更した場合に観察された。Ｃ３およびＣ４の両突然変
異は当該現象を完全に排除した。この効果のメカニズム
は明らかでないが、それらの位置における酸化状態の単
純な変更に関係しないことは明らかである。というのは
、酸化還元実験は膜結合を変化させなかったからである
。 さらに、最初の４個のアミノ酸（ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹ
ＳＣＹＳ）を欠き、５位のＭＥＴで開始する合成ＧＡＰ
４３遺伝子を構築した。発現された蛋白はニューロンお
よび非ニューロン宿主細胞の膜に結合しなかったく第１
１図参照）。これは、最初の４個のアミノ酸か膜結合に
必要であることを示す。以下で考察するように、通常は
細胞質ゾルの蛋白での実験では、１０個のアミノ酸ペプ
チドで明らかに十分であることか証明された。予備デー
タは、最初の４個のアミノ酸でも膜結合に対し十分であ
ることを示す。 かくして、もう１つの具体例において、本発明は、 ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳよりなるア
ミノ酸配列またはその機能的誘導体よりなり、その配列
は、所望の蛋白またはペプチドの膜結合を可能とするた
めに、当該所望の蛋白またはペプチドのアミノ末端に結
合させることができる。 さらに、エクソンｌの最初の５，６．７．８または９個
のアミノ酸を包含するペプチドは、所望の蛋白またはペ
プチドに結合させた場合、膜結合を可能とするであろう
。当業者ならば、特定の適用における膜結合を指令する
これらの中間的長さのペプチドの十分性は単にルーチン
的技量の努力によって判断できることを理解するであろ
うし、これは本発明の教示の利点でもある。従って、そ
れと同一のもの、およびそれらと同等のものは、本発明
の範囲内のものである。 追加の実験において、前記した最初のＧＡＰ４３エクソ
ンを、通常は細胞質ゾルであり、膜連結性ではない蛋白
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）をツー１−付けする遺伝子のアミ／末端に結んた
。この配列を含有するプラスミドを用いてニューロンお
よび非ニューロン細胞をトランスフェクトした（第１１
図）。免疫蛍光アッセイにより、発現されたＣＡＴ蛋白
は、トランスフェクトした細胞において膜連結性である
ことか明らかとなった。これは、最初のＧＡＰ−４３エ
クソンのアミノ酸は所望の蛋白またはペプチドの膜ター
ケノティングを達成するのに十分であることを示す。 さらに、実験により、ＧＡＰ−４３の最初の４０個のア
ミノ酸は、トランスフェクトされたＰＣ１２細胞におけ
るＧＡＰ−４３と同位置へｃＡＴを定方向化することか
示された。これらの細胞は、成長円錐によって傾いた長
い突起を引き出す点てニューロン細胞に似ている。ＧＡ
Ｐ−４３は、通常、特にニューロン細胞成長円錐で豊富
であり、テークは、本発明の膜〜ターケノテイングペプ
チ１−はこの観察された成長円錐富化の原因であること
を示唆する。 さらに、本明細書中に記載した選択的な成長円錐蓄積現
象を明確とするために、本発明者らは、Ｇ Ａ Ｐ −
４３およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＣＡＴ）を包含する融合蛋白の突然変宥分析お
よびレーづ一走査共焦鏡検を使用した。その結果、ＧＡ
Ｐ−／１３アミノ末端の短いストレッチは成長円錐膜、
特に糸状足における蓄積を指令するのに十分であること
が確認された。レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）ペプチ
ドに融合した種々の量のＧ Ａ Ｐ−４，３アミノ末端
をコード付けする構築体をＣＯ８およびＰＣ１２細胞で
発現させた。クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡ Ｔ）は真核生物細胞で発現された場合
には細胞質ゾルであって、非常に安定であるので、レポ
ーターペプチドとして選択した。完全なＣＡＴ蛋白に対
しアミノ末端に融合したＧＡＦ）４３の最初ノ１０個ノ
ア 、： ／酸ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱの融合蛋白（ＧＡ
Ｐｌ ０ＣＡＴ） 、まタハｃＡＴに融合したＧＡＰ−
４３の最初の４０個のアミノ酸の融合蛋白（ＧＡＰ４０
ＣＡＴ）をコード付けするプラスミドを構築しまた。 免疫プロット法を以下のごとくに行った ＣＡゴに融合
したＧＡＰ−４３のアミノ末端を有するキメラ蛋白はＣ
Ｏ８細胞膜に連結する。ＣＡ、 Ｔ、ＧＡＴｌ ０ＣＡ
ＴおよびＧＡＰ４ｏＣＡＴはＣＯ８細胞て一時的に発現
された。抗−ＣＡＴ抗体を用い、各トランスフェクショ
ンからの膜（Ｍ）および細胞質ゾル（Ｃ）画分の免疫プ
ロットを調製した。ＣＡＴ−１−ランスフェクトされた
細胞において、免疫反応性は細胞質ゾル画分てのみ発見
され、精製したＣＡＴ蛋白と共に移動する。免疫反応性
のはとんとすべては膜連結性であり、ＣＡＴよりも大き
い分子１ｉ４０００または１０００を有する融合蛋白に
ついて予期されるごとく、ＣＡＴよりもゆっくりと移動
する。１１６．８４．５８．４８５．３５６および２６
６キロクルトンの分子量標準を用いた。 ＧＡＰおよびＧＡＰ４０ＣＡ、Ｔの膜連結をＣＰ１２細
胞で評価した。本明細書中に記載するごとくに、ＣＡＴ
、、ＧＡＰ４０ＣＡＴ、またはＧＡＰを発現する安定に
トランスフェトされたＰ ＣＩ ２細胞を選択した。膜
（Ｍ）および細胞質ゾル（Ｃ）画分の免疫プロットを抗
−ＣＡＴまたは抗−ＧＡＰ抗体で染色した。ＣＡＴ−ト
ランスフェクトされた細胞（ＣＡ Ｔ）は細胞質ツル中
で免疫反応性全含有していたが、膜画分中では含有せず
、この免疫反応性ＣＡＴは精製したＣＡＴと共に移動し
た。対照的に、ＧＡＰ４０ＣＡＴトランスフェクトされ
た細胞（Ｇ４０ＣＡＴ）は、よりゆっくりと移動する膜
一連結ＣＡＴ免疫反応性を含有していた。ラット脳（Ｂ
Ｒ）からの画分は、すべてではないが、はとんどの内
因性ＧＡＰ−４３免疫反応性は膜一連結性であることを
示した。ＧＡＰ４３を過剰発現するトランスフェクトＰ
ＣＩ２細胞においては、ＧＡＰ−免疫反応性のほとんど
すべては膜一連結性であり、精製したＧＡＰ−４３と共
に移動した。 ＧＡＰ−４３発現プラスミドｐＧＡＰにおいて、ＧＡＰ
−４３をコード付けする配列はソート・ビイ（Ｓｅｅｄ
、 Ｂ、 ）、不イチ＋ （Ｎａｔｕｒｅ）３２９
： ８４Ｃ）−８４６（１９８７）によって記載されて
いるＣＤＭ８プラスミドのＸｂａ １部位でスタファ−
（ｓｔｕｆｆｅｒ）を置き換えた。本明細書中で記載す
るごとく、挿入されたＧＡＰ−４３配列は、翻訳のスタ
ートのＮｌａ ■部位から終始コドンから６ｓｂｐ部
位下流の５ａｕ３Ａ１部位までのラットＧＡＰ−４３の
全コーディング配列を包含していた。ＣＡＴ発現プラス
ミドｐＣＡＴについては、ＣＡＴコーディング配列およ
びｐＳＶ２ＣＡＴ（ボルマン・シイ・エム、モファート
・エル・エフおよびホワード・ビイ・エイチ（Ｇｏｒｍ
ａｎ、 ｃ、 Ｍ、 、 Ｎｏｒ ｆａｔ。 Ｌ、 Ｆ、 ＆ Ｈｏｔｖａｒｄ、 Ｂ、 Ｈ，）、モ
レキュラー・アンド・セリュシー・バイオロジー（Ｍｏ
１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ）２ ：１０４４−１
０５１ （１６８２）からのポリアデニル化部位を含有
するＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ断片はスタファ−
（ｓｔｕｆｆｅｒ）およびポリアデニル化部位を含有す
るＣＤＭ８のＨｉｎｄＩＩｌないしＢａｍＨＩ断片を置
き換えた。 ｐＧＡＰｌｏＣＡＴおよびｐＧＡＰｌ ０ＣＡＴは、ポ
リリンカーの使用によってｐＣＡＴにおけるＣＡＴとイ
ン・フレームにて融合した、各々、ＧＡＰ−４３の最初
の４０個または１０個のアミノ酸を包含する。ＣｏＳ細
胞の一時的トランスフェクションについては、ＤＥＡＥ
デキストランおよびクロロキンを、記載されているごと
くに用いた（ツバ−・エム・エックス、シンプソン・イ
ー・アールオヨヒウォーターマン・エム・アール（Ｚｕ
ｂｅｒ、 Ｍ、 Ｘ、 、 Ｓｉｍｐｓｏｎ、 Ｅ、
Ｒ，＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、 Ｍ、 Ｒ，）、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３４ ： １２５８〜１２６１
（１９８６））。ＰＣＩ２細胞の安定なトランスフクシ
ョンのために、１：１０の比にて注目するプラスミドで
共トランスフェクトしたネオマイシン耐性プラスミドを
本明細書中に記載したごとくに用いた。ＰＣＩ２細胞の
選択の間に、４００μｇ／ｍＱの活性ジエネティチン（
Ｇｅｎｅｔｉｃｊｎ）（ジフコ（ＧＩＢＣＯ））を用い
た。ＰＣ１２細胞の一時的トランスフェクションは、３
００ボルトおよび９６０マイクロフアラツドを用い、バ
イオ−ラド・インコーポレイション（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
Ｉｎｃ、）の電気穿孔システムでの電気穿孔によって行
った。８時間後、培地を変えた。電気穿孔の２４時間後
、５０ｎｇ／ｍ（ｌＮＧＦの存在下、ポリーＤ−リジン
ー被覆カバーカラス上で細胞を平板培養し、２４時間後
に分析した。 免疫化学アッセイのために、ラットＧＡＰ−４３のａａ
ｌないし２４、ａａ３５ないし５３、ａａ５３ないし６
９、およびａａ２１２ないし２２８を包含する４種のペ
プチド類に対してウサギを免疫化することによってウサ
ギ抗−ＧＡＰ−４３抗体を作製した。抗−ＧＡＰ−４３
抗体をＧＡＰペプチド寒天上でアフィニティー精製した
。臭化シアン法によってアガロースにカンブリングさせ
た各ペプチドの１０ｍｇ／ｍ（！を含有する樹脂に抗−
ＧＡＰ−４３抗体を結合させ、ｐＨ３，５で抗体を溶出
させた。ウサキ抗−ＣＡＴ抗体は５プライム（Ｐｒｉｍ
ｅ） ３プライム（Ｐｒｉｍｅ） ・インコーボレイ
テ、ドから入手した。第２の抗体はオルガノン・テクニ
カ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ） 、ンヤクソン
。 イミュノロンカルズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌｓ）、およびベクター・ラブダ（Ｖｅｃｔ
ｏｒ １ａｂｓ）から得た。 細胞の分画については、ＣＯ８またはＰＣＩ２細胞をｌ
ｏｏｒｎｍの密集したベトリ皿から掻き取り、２０００
ｘｇにて１０分間ペレ／ト化した。 該ペレット化細胞を１０ｍＭトリス−ＨＣρ、ｌｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ７，６（３００）ｌ（！／皿）中のポ
リトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）によってホモン不−ｊ・
し、４°Ｃ，２５０，ＯＯＯｘｇにて３０分間遠心した
。 上澄みを細胞質ゾル画分として収集した。該ベレットを
同緩衝液中のホモジネート化および遠心によって洗浄し
、次いで、細胞質ゾル画分として再懸濁して同容量とし
た。ラット脳を１日令ラットから得、１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ２．１ｍＭ ＥＤＴＡ。 ｐＨ７，６（１０ｍ（！／ダラム湿潤重量組織）中のポ
リトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）によってホ不ジ不−卜し
た。細胞抽出物について記載したごとく、遠心によって
、細胞質ゾルおよび洗浄した膜画分を調製した。アンタ
ーソンら（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ）（バイオケ
ミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ２２ ：
４６１５−４６１８（１９８２））の方法の変法によっ
てＧＡＰ４３蛋白をラット脳から精製し、免疫染色につ
いての陽性対照として用いた。細胞質ゾルまたは膜画分
の同容量（通常１００μＱ）をポリアクリルアミドゲル
上の電気泳動に付した（レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネ
イチャ（Ｎａｔｕｒｅ）２２７ ： ６８０−６８５（
１９７０））。蛋白を電気泳動的にニトロセルロースに
移し、過剰の部位を４％ＢＳＡてブロックした。 次いで、４０μｇ／ｍ（ｌアフィニティー精製の抗ＧＡ
Ｐで、または抗〜ｃ Ａ Ｔ抗体の１：１０００希釈で
、４°Ｃにて、膜を２４時間インキュベートした。製造
業者の指示に従い、抗−ウ廿キ・ヘクタステインＯ’ｅ
ｃｔａｓｔａｉｎ）ホースラティッ／ユベルオキシタ゛
−セ法を用い、結合した抗体を検出した。ベルオキンダ
ーセ基質としては、テトラメチルヘンンジン（キルケガ
−１” （Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ）およびペリイ（Ｐｅ
ｒｒｙ）、カイセルスブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）、メリーラント州）を使用した。 免疫プロｙｔ４により、ＣＯ８細胞またはＰ Ｃ１２細
胞で発現されたＣＡＴは細胞質ゾル画分にのみ存在する
ことが明らかとなった。対照的に、キメラ蛋白ＧＡＰ
１０ＣＡＴおよびＧＡＰ４０ＣＡＴは膜連結性である。 融合蛋白は洗剤によって抽出されるか、塩化すトリウム
、塩化カルシウム、またはＥＧＴＡによっては抽出され
ない。かくして、この膜結合の性質はう、ト脳中におけ
る天然ＧＡＰ−４３の性質と同様である（ペロー不−ビ
ゾセ口・エヌ・アイ、ワイ不ル・テ゛イ、ハウサー・シ
イおよびベノビ、ツ・エル・アイ（ＰｅｒｒｏｎｅＢｉ
ｚｚｏｚｅｒｏ、 Ｎ、 １． 、 Ｗｅｉｎｅｒ、
Ｄ、 、 Ｈａｕｓｅｒ、 Ｇ、 ＆ Ｂｅｎｏｗｉｔ
ｚ。 Ｌ、１．）、ジャーナル・イン・ニューロサイエンス・
リサーチ（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ｒｅｓ、） ２０
：３４６−３５０（１９８８）；エストライヘル・エイ
・ビイ、パン・ドンゴン・シイ・シェイ、ツビールス・
エイチおよびジスベン・タブリュー・エイチ（Ｏｅｓｔ
ｒｅｉｃｈｅｒＡ、Ｂ、、Ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ、Ｃ，
Ｊ、、Ｚｗｉｅｒｓ、ＨＪ＋ Ｇ１５ｐｅｎ、Ｗ、Ｈ，
）、ジャーナル・イン・二ニーロケミスドリー（ＪＮｅ
ｕｒｏｃｈｅｍ、）４１ ： ３３１−３４０（１９８
３）；シャン・ニス・シイ、ムラカミ・ケイおよびロウ
テンベルグーｘイ（Ｃｈａｎ、Ｓ、Ｙ、、 Ｍｕｒａｋ
ａｍｉ、に、＆Ｒｏｕｔ ｔｅｎｂｅｒｇ、 Ａ、）、
ジャーナル・イン・ニューロサイｘ）７ス（Ｊ、Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ、）６ ： ３６１８−３６２７（１９８６
）＋スケ不・ジェイ・エイチ・ビイおよびビラグ・アイ
（Ｓｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ，Ｐ、 ＆ Ｖｉｒａｇ）、
ンヤーナル・イン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ
Ｂｉｏｌ、）１０Ｂ・６１：３−６２４（１９８９）
）。 アミノ末端かニューロン細胞におけるＧＡＰ４３の成長
円錐富化を説明するか否かを判断するために、ＰＣＩ２
細胞のＮＧＦ−処理トランスフェクト体におけるＧＡＰ
−４３およびＧＡＰ−ＣＡＴキメラ蛋白の細胞分布を共
焦鏡検によって調べた。このアッセイによると、ＧＡＰ
）−４３は成長円錐か顕著に豊富な斑点状パターン、ニ
ューロンにおける天然ＧＡＰ−４３のものと同様のパタ
ーンで分布するのに対し、ＣＡＴは細胞質ゾルのままで
ある。ＣＡＴに融合したＧＡＰ−４３のアミノ末端は、
得られた融合蛋白をしてＧ Ａ Ｐ−４３自体の分布に
非常によく似た分布を獲得せしめた。 ＧＡＰ−４３およびキメラ蛋白双方の核周囲標識は低レ
ベルで検出され、これは天然ＧＡＰ−４３で観察された
ように（パン・ホー７・シイ・オー・エム、ホルスイス
・シイ・エム、エストライヘル・エイ・ビイ、フーンス
トラ・／Ｊ、イ、デ・グラン・ビイ・エヌ・イーおよび
ノスペン・ダブリュー・エイチ（Ｖａｎ Ｈｏｏｆｆ’
、Ｃ，Ｏ，Ｍ、、 ）ｌｏｌｔｈｕｉｓ、 Ｃ，Ｍ
Ｏｅｓｔｒｅｉｃｈｅｒ、 Ａ、 Ｂ、 、 Ｂｏｏｎ
ｓｔｒａＪ、 、 Ｄｅ Ｇｒａａｎ、 Ｐ、 Ｎ、
Ｅ＆ Ｇ１５ｐｅｎ、 Ｌ Ｈ，Ｊ、 ）、ンヤーナル
・イン・セル・バイオロジー（Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏ
ｌ、）１０８ ： １１１５＋〜１１２５（１９８９）
）、コルジへの局在のためであろう。グルタルアルデヒ
ド固定により、成長円錐の細い突起の良好な組織保存か
なされ、キメラ蛋白は特に糸状定向に蓄積することが明
らかとなった。 トランスフェクトしたＰＣ１２細胞におけるＣＡＴ、Ｇ
ＡＰ−４３および融合蛋白の細胞下位置決めは以下のご
とくに行った：ＰＣ１２細胞にお、ける（Ａ）ＣＡＴ、
（Ｂ）ＧＡＰ−４３、（Ｃ）ＧＡＰ４０ＣＡＴ、および
（Ｄ）ＧＡＰｌ ０ＣＡＴの共焦免疫蛍光により、ＧＡ
Ｐ−４３は斑点状で膜に局在し、成長円錐でいくらか豊
富であるのに対し、ＣＡＴ標識は散漫で細胞質ツルであ
ることか明らかとなった。アミノ末端の４０個のアミノ
酸（ＧＡＰ４０ＣＡＴ）または１０個のアミノ酸（ＧＡ
ＰｌｏＣＡＴ）いずれかをＣＡＴに融合させた場合、免
疫蛍光の分布は、成長円錐での富化を含めてＧＡＰ−４
３についての分布に似ていた。固定に先立ち、すべての
細胞をＮＧＦで２４時間処理した。 ＧＡＰ−４３については抗−ＧＡＰ−４３抗体を用いた
のに対し、ＣＡＴ、ＧＡＰ４０ＣＡＴおよびＧＡ、Ｐｌ
ｏＣＡＴについては抗−ＣＡＴ抗体を用いた。この変異
体の対照ＰＣ１２細胞は検出不可能なレベルのＧＡＰ−
４３およびＣＡＴ免疫反応性を発現した。５０μｇ／ｍ
Ｑの神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下で、免疫蛍光の２
４時間前に、ＰＣ１２細胞をポリーＤ−リジン被覆カバ
ーガラスに移した。３．７％ホルムアルデヒドで７分間
固定し、０１％トＩノトンーＸ−１００を３分間浸透さ
せた。試料をＰＢＳ中の４％ＢＳＡで１時間ブロックし
、−次抗体中で１時間インキュベートし、ＰＢＳてすす
ぎ、ＰＢＳ中の０．３％Ｈ，−０゜にて１５分間インキ
ュベートして（バックグラウンドを減少させ）、再度す
すぎ、二次抗体中で１時間インキュベートした。ＰＢＳ
て数回洗浄した後、カバーガラスを水ですすぎ、０，４
％没食子Ｍｎ−プロピルを含有するケルバトール（Ｇｅ
ｌｖａｔｏｌ）て処理して逝色を減少させた。細胞か特
異的抗原を含有しない場合、または−次または二次抗体
が省略された場合、免疫蛍光はバックグラウンドを超え
ては検出できなかった。 抗−ＣＡＴ抗体で標識し、／マルスキイ（Ｎｏｍａｒｓ
ｋｉ）のオプティックス・アンド・スキャンニング・コ
ンフォーカル・イミュノフルオレセンス（ｏｐｔｉｃｓ
ａｎｄ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍ
ｍｕｎ。 ｆ １ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）法で観察したＧＡＰ４０
ＣＡＴを発現するＰＣＩ２細胞の高出力比較を用いて、
ＰＣＩ２細胞の成長円錐内のＧＡＰ４０ＣＡＴの局在を
証明した。細胞はＮＧＦて７日間処理したものであった
。１の大きな成長円錐は明るく標識されて見えたが、小
さなものはそうてはながった。 たとえ同一の細胞であってもその異なる成長円錐で同等
でない標識がニューロン中の天然ＧＡＰ４３て起こる（
コスリン・ケイ、シュレイヤー・ティ・ジェイ、スケ不
・ジェイ・エイチ・ビイおよびバンカー・シイ（Ｇｏｓ
ｌｉｎ、 Ｋ、 、 ５ｃｈｒｅｙｅｒ、 Ｄ、 Ｊ、
。 ５ｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ，Ｐ、 ＆ Ｂａｎｋｅｒ、
Ｇ、 ）、不イチャ（Ｎａｔｕｒｅ）３３６ ： ６７
２〜６７４（１９８８））。ノマルスキイ（Ｎｏｍａｒ
ｓｋｊ）および免疫蛍光の像の比較により、糸状足は特
に標識されることか示された。同様の結果かＧＡＰ Ｉ
０ＣＡＴについて観察された。 高分解能共焦鏡検については、糸状足の細かい構造を保
存するのに必須の新たに作成した４％バラホルムアルデ
ヒドおよび０．５％グルタルアルデヒド、続いて、０１
％トゾトンーＸ−１００で３分間、ＰＢＳ中の２ ｍ
ｇ ／ ｍσホウ水素化ナトリウムで１０分間細胞を固
定した。共焦分析では、バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）の
ＭＲＣ−５００走査型共焦イメーンングンステムおよび
ツェイス・アキンオプラン（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌ
ａｎ）顕微鏡を使用した。 これらの実験は、ＧＡＰ−４３の最初の１０個のアミノ
酸が成長円錐蓄積を指令するのに十分であるという本発
明者らの驚くべき発見を確認するものである。本発明者
らは、成長円錐膜中に蓄積する少なくとも１の他の非細
胞膜内蛋白５ＣＧＩＯ（スティン・アール、モリ・エヌ
、マチユーズ・ケイ、ロー・エル・シイおよびアンター
ソン・ティ・シエイ（Ｓｔｅｉｎ、 Ｒ，、Ｍｏｒｉ、
Ｎ、 、 Ｍａｔｔｈｅｗｓ、 Ｋ、 、 Ｌｏ、
ＬＣ，＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、ＤＪ、）、ニーニーロン
位置２２および２４）にもかかわらず、ＧＡＰ−４３ア
ミノ末端に密接に関連する配列を有する他の蛋白を知ら
ない。 偏光をかけた上皮細胞において、異なる蛋白は、膜蛋白
および分泌蛋白の輸送をそれらの個々の目的場所に向け
て指令する信号と同様の、蛋白内の選別信号に依存する
と考えられる突起（ライフナ−・ダブりニー・ティおよ
びロデッシュ・エイチ・エフ（Ｗｉｃｋｎｅｒ、 Ｌ
Ｔ、 ＆ Ｌｏｄｉｓｈ、 Ｈ，Ｆ、 ）、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３０ ： ４００−４０７（１９
８５）；ヘルナー・ケイおよびシヤフラ・シイ（Ｖｅｒ
ｎｅｒ、 Ｋ。 ＆ ５ｃ−ｈａｔｚ Ｇ、 ）サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）２４１ ： １３０７〜１３１３（１９８８）；
フェファ−・ニス・アールおよびロスマン・シェイ・イ
ー（Ｐｆｅｆｆｅｒ、ＳＲ，＆ Ｒｏｔｈｍａｎ、 Ｊ
、 Ｅ、 ）、アヌ・レフ・バイオケム（Ａｎｎ、 Ｒ
ｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）５６ ： ８２９〜８５２（
１９８７乃を先端および基底外側原形質膜に（マｌ−１
１ン・ケイ・ニス（Ｍａｔｌｉｎ、 Ｋ、 Ｓ、 ）、
ジャーナル°イン・セル＋７’？イオロジ−（Ｊ、 Ｃ
ｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）１０３２５６５−２５６８（］
９８６）；ロンリケスホラン・イー・シェイおよびサハ
テーニ・デイ・デ４ （Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｂｏｕｌ
ａｎ、 Ｅ、 Ｊ、 ＆ ５ａｂａｔｉｎｉ、 Ｄ、
Ｄ、 ）、プロ／−ティングズ・イン・ナショナル・
アカテミー・イン・サンエンシス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）ＵＳＡ７５：５０７１
〜５０７５（１９７８）：ンモンズ・ケイおよびフレー
・ニス・ティ（Ｓｉｍｏｎｓ。 Ｌ ＆ Ｆｕｌｌｅｒ、 Ｓ、 Ｄ、 ）アヌ・レフ・
セル・ハイオル（Ａｎｎ Ｒｅｓ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ
、）１ ： ２４３〜２８８ （１９８５乃蓄積する。 上皮細胞の場合は、かかる信号は先端および基底外側と
しての原形質膜の異なる領域も認識するであろう。 ニューロンにおいては、成長円錐膜はその蛋白構造でも
区別される。１の興味深い可能性は、成長円錐膜かＧＡ
Ｐ−４３のパルミチル化アミノ末端を認識しそれを結合
させる結合部位を有することである。本発明者らはいず
れかの特定の説に拘束されるつもりはないか、パルミチ
ル化残基は脂質二層と直接相互作用するものではないら
しい。 何故ならば、それはＧＡＰ−４３についてのより均一な
膜分布を引き起こすようだからである。この線に沿って
、もう１つのアンル化蛋白の脂肪酸部位、ポリオウィル
スのＮ−ミリスチル化ＶＰ４は、Ｘ線回折によって、他
のウィルス蛋白の特異的アミノ酸残基と相互作用するか
脂質二重層とは相互作用しないことか示されている（シ
ュルツ・エイ・エム、ヘンターマン・エル・イーオヨヒ
オロスズランーエス（Ｓｃｈｕｌｔｚ、 Ａ、 Ｍ、
、 Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、 Ｌ、 Ｅ。 ＆ ０ｒｏｓｚｌａｎ＋ Ｓ、 ）、アヌ・レフ・セル
・ハイオル（Ａｎｎ、Ｒｅｓ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）
４ ： ６１１〜６４７（１９ｓｓ）；／ヨウ・エム、
ニューマン・ンエイ・エフ、フィルマン・デイ、ホグル
・ジェイ・エム、ロウランズ・デイ・シェイおよびブラ
ウン・エフ（Ｃｈｏｗ、 Ｍ、 、 Ｎｅｗｍａｎ、
Ｊ、 Ｆ、 、 Ｆｉｌｍａｎ、 Ｄ、 、 Ｈｏｇ
ｌｅ、 Ｊ、 Ｍ、 。 Ｒｏｔｖｌａｎｄｓ、 Ｄ、 Ｊ、 ＆ Ｂｒｏｗｎ、
Ｆ、 ）、ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ）３２７・４
８２〜４８６（１９８７））。ＧＡＰ４３およびＧＡＰ
−ＣＡＴ融合蛋白は非ニューロン細胞の膜に結有するの
で、同様のまたは同一の結合部位か他の細胞タイプに存
在しなければならないが、ＧＡＰ−４３はニューロン−
特異的である故に、これらの部位は恐らくは非ニューロ
ン細胞における異なる蛋白についての標的であろう。 ＧＡＰ〜４３の選別ドメインは特に糸状足における富化
を引き起こすことは注目される。電子顕微鏡検査によっ
て証明されたごとく（パン・ホーフ・シイ・オー・エム
、ホルスイス・シイ・工ｌ・、エストライヘル・エイ・
ビー、ブーンストラ参ンエイ、デ・グラーン・ビイ・エ
フ・イーおよびシスペン・ダブリュー・エイチ（Ｖａｎ
Ｈｏｏｈｈ、 Ｃ，０，Ｍ。 Ｈｏ１ｔｈｕｉｓ Ｃ，Ｍ、 ０ｅｓｔｒｅｉｃｈｅｒ
Ａ Ｂ Ｂｏｏｎｓｔｒａ ＪＤｅ Ｇｒａａｎ、
Ｐ、 Ｎ、 Ｅ、 ＆ Ｇ１５ｐｅｎ、 Ｗ、 Ｈ，
）、／ヤーナル・イン・セル・バイオロジー（Ｊ、 Ｃ
ｅｌ Ｉ Ｂｉｏｌ、 ） １０８１１１５〜１１２５
（１９８９戸、これは、これらの細胞におけるＧＡＰ−
４３の通常の位置である。トランスフェクトされたＧＡ
Ｐ−４３か本明細書中に記載するごとき糸状足を延長さ
せる非ニューロン細胞の性向を増強させる観察かあれば
、ＧＡＰ−４３の位置を特定の糸状足の運動活性と関係
付Ｉするのは興味深いであろう。 かくして、本発明は、もう］つの態様において、所望の
蛋白またはペプチドをニューロンまたは非ニューロン細
胞の股領域に導入する方法、および所望の蛋白またはペ
プチドをニューロン細胞の成長円錐領域へ定方向化する
方法を提供する。１の例示的具体例において、 （ａ） １ 、 ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳ ＭＥＴ Ａ
ＲＧ ＡＲＧ ＴＨＲＬＹＳ ＧＬＮ・Ｉｌ、 ＭＥＴ
ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳ ＭＥＴ ＡＲＧ ＡＲＧ
ＴＨＲＬＹＳＩＩｌ、 ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹ
Ｓ ＭＥＴ ＡＲＧ ＡＲＧ ＴＨＲ；ＩＶ、 ＭＥＴ
ＬＥｔｌ ＣＹＳ ＣＹＳ ＭＥＴ ＡＲＧ ＡＲＧ
；Ｖ、 ＭＥＴ ＬＥＤ ＣＹＳ ＣＹＳ ＭＥＴ
ＡＲＧ ＶＴ、 ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳ Ｍ
ＥＴ ；■ ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳ およ
び■、その機能的誘導体 よりなる群から選択されるアミノ酸配列からなる膜−タ
ーケノテイングペプチトを所望の蛋白またはペプチドの
アミノ末端に結ひ９次いで、（ｂ）該膜−ターケノティ
ングトメインよりなる得られた蛋白またはペプチドを細
胞に導入することよりなり、 工程（ｂ）の得られた蛋白またはペプチドは該膜ターゲ
ツティングドメインにより該細胞の該膜へ定方向化され
ていることを特徴とする該所望の蛋白またはペプチドを
細胞の膜へ定方向化する方法が提供される。 もう１つの非限定的例示具体例において、本発明は、前
記アミノ酸配列またはそれらの機能的または化学的誘導
体よりなる膜−ターゲッティングペプチドをコード付け
するヌクレオチド配列、ならびによく知られた方法によ
るＧＡＰ’−４３以外の蛋白またはペプチド（ならびに
ＧＡＰ−４３自体）をコード付けするヌクレオチド配列
へのこれらの配列の付加、および当業者によく知られた
方法による得られた配列の原核生物または真核生物宿主
における発現を提供する。 勿論、本明細書中に記載するごとく、所望の蛋白または
ペプチドを診断用または治療用に標識することかでき、
本発明の本態様の組成物および方法の利用性は当業者に
明らかであろうし、単にルーチン的な技量の努力でもっ
て、ヒトを含めた動物において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉ
ｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ５ｉｔｕにての診断または
治療目的で容易に利用できる。 実施例■ 本明細書中に記載するごとき本発明者らの成果は、ＧＡ
Ｐ−４３調節が遺伝子発現のレベルで起こることを強く
示唆する。しかしながら、現在まで、その発現を調節し
得るシスまたはトランス作用要素については何も知られ
ていなかった。元来、その応答性を成長因子に付与する
ＧＡＰ−４３遺伝子の要素を定義し、発現の細胞制限を
引き起こし、および神経系の発育の間に該遺伝子を調節
するのは非常に興味深い。調節要素を同定するために、
ＧＡＰ−４３の全ラットゲノミックＤＮＡをクローン化
した。 従って、ゲノミックＧＡＰ−４３を単離し、そのイント
ロン−エクソン境界および転写スタート部位をマツプし
た。驚くへきことに、プロモーターはその構造かかなり
異常であり、異常なフンフォメーションを形成てきる反
復配列を含有し、いくつかの正準なプロモーター成分を
欠いている。転写は１を超える部位から開始でき、スタ
ート部位のうちいくつかは中枢および末梢神経系で異な
って利用される。 さらに、本発明者らは、ＧＡＰ−４３プロモーターが脳
−特異的核蛋白によって認識される領域を含有するか否
かを調べた。該ＧＡＰプロモーターの領域をゲル電気泳
動移動度シフトによって調べ、脳核抽出物には存在する
か肝臓核抽出物には存在しない蛋白（類）を結合させる
ドメインを同定した。結合活性は脳の成熟に伴って減少
する。結合部位は約２０ヌクレオチドのストレッチに限
定され、それはまた、脳核抽出物によるＤＮａ ｓ ｅ
保護アッセイにおいて特異的に保護されるか、肝臓抽出
物によるとそうではない。該領域はＰｏＵとして公知の
クラスのＤＮＡ結合蛋白によって認識される結合部位と
同様の配列を有する。 これらの結果は、脳−特異的核蛋白かＧＡＰ４３の上流
の特異的領域に結有することを示唆す実験手法 ゲノミッククローニングおよびマツピングクローニング
で用いたすべての方法はアウスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ
ｅｔ ａｌ）ｍ、カラント・プロトコルズ・イン・モ
レキュラー・バイオロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
）、７ヨン０ウイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｖ
ｉｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ）、出版者、（１９８７）によ
って記載されたものであった。すべての酵素は二ニー・
イングランド・バイオロジー（Ｎｃｖ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）から購入した。 ３つのＧＡＰ−４３エクソンを含有するゲ／ミ。 ククローンは、ラット・ゲノミノクＤＮＡのサイズ分画
５ａｕｌｌｌＡ部分消化物をバクテリオファージＥ Ｍ
Ｂ Ｊ、−３のＢａｍＨｌに挿入することによって構
築したライブラリーから単離した。 該ライブラリーを、まず、前記したごとく、コロニー・
プラーク・スクリーン・フィルター（テユポン（ＤｕＰ
ｏｎｔ／ＮＥＮ））、続いてのランタムに初回抗原攻撃
したＧＡＰ−４３ｃＤＮＡての標準的なプロトコルにて
スクリーニングした。エクソン■を見つけるために、該
ライブラリーを再度平板培養し、ｃＤＮＡの最も５゛領
域に相補的な３のオリゴヌクレオチド（第１４図におい
て、＃４．−６８ないし−３９・＃２ −３８ないし−
９および＃５．＋１ないし−２０）で重複リフト（ｌｉ
ｆｔ）を順次プローブした。少なくとも２のオリゴヌク
レオチドについて陽性のクローンをさらなる分析用に選
択した。種々の制限酵素でのマツピングのために、陽性
ファージからのイン＋＋−トをｐＢｌｕｅｓｃｒ １ｐ
ｔ（ストラタンーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））の５ａ
１１部位に継代クローン化した。 Ｈ−Ｄ Ｎ Ａケル （酢酸でｐＨ７゜４またはｐＨ４，０に調整した）４５
ｍＭトリス塩基を緩衝液として用い、２の２５ｃｍ長の
１．４％アカロースケルを注いた。負伺’４Ｎ 衝’ｔ
ｆ＜は５％グリセロール、０．１％フロモフェノールブ
ルーおよび０１％キシレンンアノールを含有する電気泳
動緩衝液であった。第１５図の凡例に掲げたプラスミド
ｂｓ１．５ＲＩＸ４を含有するエクソンＩの消化物をケ
ルに負荷し、２０Ｖで１６時間泳動させ、ｐＨ９のトリ
ス酢酸塩中のエチジウムブロマイドで染色し、脱色し、
写真にとった。 配列決定 供給業者（ＵＳＢ）によって記載されているごとくにシ
クエナーセ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）を用い、サンガーら
（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ）、ブロンーディングズ・
イン・ナンヨナル・アカテミー・イン・サンエンメス、
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）Ｕ Ｓ
Ａ ７４ ： ５４６３〜５４６７（１９７７）のシ
ブオキ／法によってＧＡＰ−４３プロモーターを配列決
定した。二本鎖配列決定についてはｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ、（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））お
よび−水路配列決定についてはＭ１３ベクター（メ７ン
グ（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メス・エンサイモル（Ｍｅｔｈ
、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ） １０１ ： ２０〜７ Ｂ
（１９８３））での標準的な方法によって、ｉ？７１Ｊ
のエクソンを含有するパイテリオファ−シフローンの継
代クローンを構築した。 ＲＮＡ５ｅマノビング クソーグおよびノルトンＣＫｒｉｅｇ ａｎｄ Ｍｅｌ
ｔｏｎ）、メス・エンサイモル（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、 ） １５５ ： ３９７〜４ ］ ５（１９
８７）ｉこ記載されているこ゛とくにＲＮＡ５ ｅ保護
分析を行った。該保護については、翻訳スタート部位か
ら−４７５のＸｂａ １部位から＋８３の５ｓｐ１部位
（最初のイン）−ロン中）に至るＧＡＰ−４３のケノミ
、り片をｐＳＰ７２（プロメカ（Ｐｒｏｍｅｇａ））の
Ｘｂａ ｌおよびＥｃｏＲＶ部位にクローンした。 ＲＮＡ５ｅ保護分析は翻訳スタート部位から４７／４８
、−５１１５２および一７８塩基の３種の主要ＧＡＰ−
４３転写体を示した。新生児ラットの肺、抜根神経節、
および大脳皮質から調製したｔＲＮＡ、ＲＮＡについて
保護を行った。クローンは１訳スタート部位（Ｘｂａ１
部位）から４７５塩基」−流に伸ひるものであった。過
剰疑露は、ＤＲＧとは反対に、大脳皮質にかなり豊富な
長い転写体をさらに示した。マーカーはＭＳＰｎ消化の
ｐＢＲ３２２てあった。 他のＲＮＡ５ｅ保護は、神経系の異なる領域およびＰＣ
１２細胞でＧＡＰ−４３転写体の不均質性を示すよう行
った。対照ＰＣＩ２細胞からのＲＮＡをＮＧＦ処理のＰ
ＣＩ２細胞、ｔＲＮＡ、ＤＲＧ、小脳、皮質、および海
馬から得たものと比較した。ＣＮＳ由来の ＲＮＡ試料
はＤＲＧまたはＰＣ］２細胞からの試料よりも高い割合
の長い転写体を有していた。 もう１つのＲＮＡ５ｅ保護分析において、前記したプラ
スミドをＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、ＤＮ
Ａポリメラーシークレノー断片で満たすことによって、
−２３３のＮｄｅＩ部位から＋８３の同５ｓｐ１部位の
ＧＡＰ−４３のゲノミック片をクローン化した。Ｈｉｎ
ｄｌｌ）部位を再形成した。すべての場合において、ベ
クターをＨｉｎｄｌｌｌで直線化した後、転写体をＴ７
ポリメラーゼで延長した。かくして、この部位を超えて
伸びるすべての転写体は−２３４の単一バンドとして集
まる。新生児うｙトの心臓、肝臓、肺、小脳、を髄、皮
質、海馬、および後根神経節からのＲＮＡ試料を用いた
。群としてのより長い上流スタート部位は中枢神経系組
織においてＲＮＡの重要な画分を構成していたが、後根
神経節では構成していなかった。 糀釆 ＧＡＰ−４３ゲノミック配列のクローニング前記したご
とく、ＧＡＰ−４３ｃＤＮＡから得たプローブでラット
・ゲノミソタライブラリーをスクリーニングした。放射
能標識した全長ｃＤＮＡでの最初のスクリーニングによ
り２のクラスのファージが得られ、引き続いての分析に
より、遺伝子の第２および第３エクソンに対応すること
か示された。第１のエクソンは小さく、従って、該ｃＤ
ＮＡプローブでは十分に表されていないことが判明した
ので、該ｃＤＮＡの最も５′側領域からの３のオリゴヌ
クレオチドプローブを用いるさらなるラウンドのスクリ
ーニングが、該遺伝子の５”末端を含有するクローンを
得るために必要であった。 ＧＡＰ−４３遺伝子のマツプを第１３ａ図に示し、それ
をマツプするのに用いたファージも共に表示する。該遺
伝子は少なくとも ５０ｋｂにわたり、３つの小さいエ
クソンを含有する。最初のは約８０ｂｐ（５’末端の変
異性の記載については後記参照）、第２番目のは５６５
ｂｐであって、第３番目のは６７２ｂｐであり、それら
は、各々、２４ｋｂおよび２０ｋｂを越える２つのイン
トロンによって隔てられている。 第１のエクソンはｍＲＮＡの５°非翻訳配列を含有し、
蛋白の最初の１０個のアミノ酸をコード付けする。当該
蛋白のこの短いアミノ末端領域は、前記したごとく、Ｇ
ＡＰ−４３（および異種融合蛋白）の成長円錐膜への結
合を指令する［選別配列Ｊを含有する。第２のエクソン
は蛋白バルクをコード付けし、カルモジュリン結合部位
としてアレキサンダーら（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ
ａｌ）、ジャーナル・イン・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ、ＢｉｏｌＣｈｅｍ、）、２６３ ： ７５４
４〜７５４９（１９８Ｂ）によって同定された領域を包
含する。第３のエクソンはカルホキシ末端の２８個のア
ミノ酸をコード付けし、非翻訳配列の５８７塩基および
ポリＡ付加部位を含有する。 第１３ｂ図に示したイントロン−エクソン境界は配列決
定法によって同定したものであり、コンセンサススプラ
イス部位（マウント（Ｍｏｕｎｔ）、ヌクレイツク・ア
シノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
）１０：４５９〜４７２（１９８２））に適有する。 ここに示したポリアデニル化部位はＲＮＡ５ｅ保護によ
って確認したものであり、ローインクールら（Ｒｏｓｅ
ｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ）、イー・エム・ビイ・オー（
ＥＭＢＯ）６ ： ３６４１−３６４６（１９８７）に
よって主要部位として予測されたものである。しばしば
、ポリＡ付加部位の直ぐ３”側に見い出されるフンセン
サスモチーフ（ｍｏｔｉｆ）のタンテム対（ＹＧＴＧＴ
ＴＹＹ）（？クラウヒラン（ＭｃＬａｕｃｈ １ａｎ）
、ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、＾ａ
ｉｄｓＲｅｓ、）１３： １３４７〜１３６８（１９８
５））には図中で下線を引いた。 ＧＡＰ−４３プロモーターはＨ−ＤＮＡを含有する。 遺伝子の５“領域の配列を第１４図に示す。それは、Ｔ
ＡＴＡまたはＣＡＡＴボックスを含有しないが、コンセ
ンサスＰｉｔ−１結合部位と同一である配列ＴＡＴＴＣ
ＡＴＧ（上線）を含有する。 このオクタマーはプロラクチンおよび成長ホルモンを含
めていくつかの遺伝子の転写を調節すると考えられるク
ラスの蛋白を結合させる（ホンダ−ら（Ｂｏｎｄｅｒ
ｅｔ ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）、５５：５０５〜５１
８（１９８８）；インプラノ１ムら（ｌｎｇｒａｈａｍ
ｅｔａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）５５ ： ５１９〜５
２９（１９８８））。 プロモーター配列の驚（べき特徴は、８０％を超えるコ
ーティング鎖がプリン類よりなり（図中にて星印を下に
記す）、各々、−１１８ないし１８８、および−２３８
ないし−３７０にわたる２の連続プリンホモポリマース
トレッチかあることである。ＧおよびＡを単に変更しな
いこれらのホモポリマーストレッチのいつくかの領域は
、幾分鏡映対称性を持つタンデム反復を含有する（例え
ば、−１６８ないし一部１８）。−１１２，２３２およ
び−５０９に中心をもつ自己相補的配列を形成するヘア
ピンはホモポリマー領域の両側にあり、二次構造に影響
１２得る。 ブリンービリミジンホモポリマーストレソチ、特に鏡映
対称性を持つもの（ミルキン（Ｍｉｒｋｉｎ）、不イチ
＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）、３３０ ： ４９５〜４９７
（１９８７乃は、Ｈ−ＤＮＡなる語の３重鎖コンフォメ
ーションをとる可能性かある（レビューについては、ウ
ェルズら（簀ｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・イ
ン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 ＢｉｏｌＣ
ｈｅｍ、）２６３： １０９５−１０９８（１９８８）
フトーンおよびダルベルブ（Ｈｔｕｎ ａｎｄ Ｄａｈ
ｌｂｅｒｇ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４３
： １５７１〜１５７６（１９８９））。 ＧＡＰ−４３プロモーターがｉｎ ｖｉｔｒｏで強力な
一次構造を含有することかます示されたのは、それを配
列決定しているときてあった。配列決定は二本鎖シナオ
キ／法を用いてルーチン的に達成されるが、この技術を
ＧＡＰ−４３プロモーターに適用する場合、読み取り可
能な配列は−２５０におけるホモポリマー領域に到達す
ると突然止まる。 −車路配列決定のために小さな断片をＭ１３に継代クロ
ーニングした後でのみ、本発明者らは該配列に到達する
ことができた。 フトーンおよびダルベルブ（Ｉ（ｔｕｎ ａｎｄ Ｄａ
ｈｌｂｅｒｇ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４
１ ：１７９１〜１７９５（１９８８）は、Ｈ−ＤＮＡ
がＤＮＡ中にひどいもつれを導入することを証明する単
純なケル系を発明している。それらのアッセイは低ｐＨ
におけるＨ−ＤＮＡの安定性の促進に基づくものである
。Ｈ−形成領域を含有するＤＮＡの断片を低ｐｉ（で電
気泳動に付した場合、Ｈ−ＤＮＡ誘導のもつれは、Ｈ−
ＤＮＡ形成に好都合でないＴ）Ｈでの移動性と比較して
、移動を遅くする（フトーンおよびダルベルブ（Ｈｔｕ
ｎ ａｎｄ Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、（１９８８）、前掲
）。本発明者らは、ＧＡＰ−４３プロモーター中の−２
４０ないし−３７０からのプリンホモボマー領域かｉｎ
ｖｉｔｒｏで直線状ＤＮＡ中で安定なＨ−ＤＮＡ構造
を形成することかできることを証明するこの移動度シフ
ト法を開発した。 第１５図は後記するごとくゲル電気泳動によって分析し
たＧＡＰ−４３プロモーターの制限消化断片を表すもの
である。可能なＨ−Ｄ Ｎ Ａ形成ホモプリン−ホモピ
リミジン領域を太線て示す。ケル電気泳動を行うに際し
ては、第１５図に表した消化物の一部を、予めｐＨ７，
４または４０いずれかにてトリス−酢酸塩で平衡化しで
ある１４％アガロースゲル上に負荷し、平行して泳動さ
せた。ｐＨ４でシフトしたバンドはＢないしＩ」塩基転
位に由来する可能性かある塗抹を呈した（フトーンおよ
びダルベルブ（Ｈｔｕｎ ａｎｄ Ｄａｈｌｂｅｒｇ）
、サイエンス（Ｓｃ １ｅｎｃｅ）、２４１ ： １７
９１〜＋７９５（１９８８））。ホモポリマー領域■
（すなわち、上流（−２４０ないし−３７０）ホモプリ
ンストレッチを含有する断片）を含有するバンドのみか
本アッセイにおいてｐ）１４．０にて移動度の変化を示
した。マーカーまたはプロモーター領域の外部からのプ
ラスミド゛の断片、または領域Ｉから分離した場合の領
域■および■を含有する断片にあっても、観察可能な／
フトはなかった。かくして、上流領域のみがそれ自体に
ついてのシフトを示した。領域■および■を含有する断
片はｐＨ４ではシフトしなかったことに注意されたい。 ホモポリマー領域の外部のＤＮＡを徐々に除去すると、
移動度の相対的シフトが増加した。領域Ｉを同様のサイ
ズとした断片中に単独で存在させた場合よりも領域■を
領域Ｉと共に断片中に包含させた場合の方がかなり大き
な移動度のシフトが観察された。 本アッセイにおいては、領域■および■はそれら自体の
シフトに影響を与えることができなかったが、それらは
上流領域と協同して作用するかも知れない。 ＧＡＰ−４３転写開始の不均質性 ＧＡＰ−４３上流配列のもう１つの注目すべき特徴はＴ
ＡＴＡモチーフが存在しないことである。 転写の開始を指令するＴＡＴＡ配列を欠く遺伝子はしば
しば多重量ＲＮＡスタート部位を有する。 これはＧＡＰ−４３について当てはまることが判明した
。ＲＮＡ５ｅ保護分析を用いて、いつくかの組織で、Ｇ
ＡＰ−４３についての転写スタート部位を決定した。肺
、後根神経節（ＤＲＧ）および大脳皮質（ＣＴＸ）から
のＲＮＡを、翻訳スタート部位から一４７５塩基まで伸
びるプローブで分析した。このプローブを用い、−４７
／−４８，５１／−５２、および−７８の転写スタート
部位に対応させて、３つの主要バンドを保護した。 これらの同部位はブライマー伸長によって同一性を確認
した。さらに、従たるバンドは長時間の暴露の後、可視
化された。 ２３０あたりのいくつかの転写体は、後根神経節と比較
して、大脳皮質からのｍＲＮＡにおいて、かなりの程度
存在する。中枢神経系と末梢神経系におけるＧＡＰ−４
３遺伝子発現の調節は異なる（スケネら）Ｓｋｅｎｅ
ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー
（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）８９ ： ８６〜９５；
ジャーナル・イン・セル・バイオロジー（ＪＣｅｌｌ
Ｂｉｏｌ、）８９ ： ９６〜１０３（１９８１））こ
とを示唆する観察を考慮すると、これは興味深いことで
ある。よって、ＣＮＳの他の領域、ならびに（交感神経
副腎前駆細胞に由来すると信じられている）ＰＣＩ２細
胞からのＲＮＡを分析した。海馬、皮質および小脳から
のＲＮＡは、ＤＲＧまたはＰＣ１２細胞からのＲＮＡよ
りも、−２３０あたりの領域から開始する転写体の割合
が高い。しかしながら、これらのより長いメツセージの
各々の量は比較的少ない。−２３４を越えてスタートす
るすべてのメツセージをプールするプローブを用いた場
合、ＣＮＳとＰＮＳにおけるスタート部位間の差異はよ
り明確となった。この分析は、より長いＧＡＰ−４３転
写体は、現実に、−緒になって、全ＧＡＰ−４３転写体
の重要な両分を説明すること、およびこれらの転写体は
ＤＲＧまたはＰＣ１２細胞からのＲＮＡよりもＣＮＳか
らのＲＮＡにおいて普通であることを示した。要するに
、ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡの５°端部は異種起源であり、
上流スタート部位は、末梢神経系と比較すると、中枢神
経系で使用するのが普通である。 ４察 本発明の本具体例は、ＧＡＰ’−４３遺伝子を含有する
ケノミソク配列の単離および特徴付けに指向される。１
．５ｋｂ ｍＲＮＡに対応する３つの小さなエクソンは
、各々、少なくとも２４および２０ｋｂのイントロンに
よって隔てられている。 プロモーター領域はかなり異常である。３重鎖「Ｈ−Ｄ
ＮＡ」を潜在的に形成できる上流領域にはいくつかの長
いホモプリン−ホモピリミジン・ストレッチが存在する
（ウェルズら（Ｖｅｉｌｓ ｅｔ ａｌ）、エフ・エイ
・ニス・イー・ビイ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ Ｊ、
）２ ： ２９３９〜２９４９（１９８８））。 ここに、事実、これらの領域のうちの１つがｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでＨ−ＤＮＡを形成することが示される。 プロモーターは正準なＴＡＴＡポ、クスを欠き、多重転
写開始部位を有する。これらの部位のいくつかの利用は
神経系の種々の部分で異なる。 う、）ＧＡＰ−４３遺伝子は、少なくとも５０ｋｂにわ
たる３つのエクソンと２つのイントロンよりなる単一コ
ピー遺伝子である。本発明者らは、該エクソンが該蛋白
における機能的ドメインに対応する証拠をいくつか得た
。最初の１０個のアミノ末端残基のみをコード付けする
第１のエクソンはＧＡＰ−４３の膜ターゲツティングの
原因となるストレッチを含有する。蛋白の３位おＪひ４
位のシスティンはアシル化されており、前記したごとく
、膜結合に関与し得る。アミノ末端はＧＡＰ−４３の膜
結合に必要であり、前記したごとく、異種蛋白を、成長
円錐のものを含めたＧＡＰ−４３と同一の膜ドメインへ
向けるのに十分な情報を含有する。 第２のエクソンはアミノ酸４３ないし５１からのカルモ
ジュリン結合領域（アレキサンダーら（Ａｌｅｘａｎｄ
ｅｒ ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・イン・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）
２６３： ７５４４〜７５４９（１９８８））ならひに
プロテインキナーセＣについての基質である４１位のセ
リン（コギングおよびツビエルズ（Ｃｏｇｇｉｎｓ ａ
ｎｄＺｗｉｅｒｓ）、ソサイエティ・イン・ニューロサ
イエンス（Ｓｏｃ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）アブストラ
クト（１９８８））を包含する。エクソンＩおよび■は
魚類およびいくつかの哺乳動物ＧＡＰ−４３蛋白の間で
よく保存されている領域を含有する（ラハテおよびスケ
不（Ｌａｂａｔｅ ａｎｄ ５ｋｅｎｅ）、（１９８９
乃。 ＧＡＰ”−４３のプロモーターは、配列および構造か異
常である。ＴＡＴＡホ、クスの欠如およびその結果とし
ての多重スタート部位の使用は、ＧＡＰ−４３プロモー
ターか、構成的に発現されるハウスキーピング（ｈｏｕ
ｓｅｋｅｅｐｉｎｇ）遺伝子のプロモーターに似る原因
となる。しかしながら、ＧＡＰ−４３プロモーターはハ
ウスキーピング（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ）遺伝子の
プロモーターに関係付けられてきたコンセンサスＳｐ−
１結合部位（ＧＧＧＣＧＧＧ）を欠く〈タイナン（Ｄｙ
ｎａｎ）、トレンズ・ジェネト（Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎ
ｅｔ、）２ ： ］ ９６〜１９７ （１９８６））。 さらに、発育におけるＧＡＰ−４３の密接に調節された
発現、ニューロンに対するその特異性、および特に成人
のニューロンにおけるその誘導可能性は、それかこのク
ラスの遺伝子に属しないことを示唆する。 ＧＡＰ−４３は中枢神経系と末梢神経系では異なって調
節される。例えば、哺乳動物中枢ニューロンの軸索切断
は、末梢神経の軸索切断かＧＡＪ）４３の発現および輸
送の増加を引き起こすのに対し、それを引き起こさない
（スケ不およびウィリアード（Ｓｋｅｎｅ ａｎｄ Ｙ
ｉｌｌａｒｄ）、ジャーナル・イン・セル・バイオロジ
ー（Ｊ、 Ｃｅｌ ｌ Ｂｉｏｌ、 ） ８９ ： ９
６〜１０３（１９８１）。前記したごとく、ＧＡＰ４３
はＣＮＳで不可逆的に抑制されるようには見えず、軸索
成長における以外の形成性で役割を演じ得るが（ベノウ
ィッツおよびロウテンベルブ（Ｂｅｎｏｖｉｔｚ ａｎ
ｄ Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅｒｇ）、ティーアイ・エヌφｘ
ス（Ｔ、 １．Ｎ、Ｓ、）１０：５２７〜５３２（１９
８７））、中枢的および末梢的調節においては差異が存
在することは明らかである。よって、異なるスターＩ・
部位の使用は、異なるニューロンからのｍＲＮＡはりホ
ソームの結合または安定性を調節する５端部で異なる可
能性を示唆する。 制限されるものではないが、ニューロンで発現される遺
伝子Ｔｈｙ−＋は、転写レベルにて、発育に付随して調
節され、組織特異的に発現されることが証明されている
ことに注目するのは興味深い（スバノポウロウら（Ｓｐ
ａｎｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ）、モレキュラー・ア
ンド・セリスター・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃ、Ｃｅ１
１．Ｂｉｏｌ、）８ ： ３８４７〜３８５６（１９８
Ｂ））。また、ＧＡｐ−４３のように、Ｔｈｙ１プロモ
ーターにおける転写スタート部位の選択は発現組織間で
変化し得、上流スタート部位が脳においてより顕著であ
る（同上）。これは、ＧＡＰ−４３およびＴｈｙ−１双
方についての膜対−他の組織における対照の付加レベル
を示唆する。 ＧＡＰ−４３プロモーターに存在する可能な上流調節要
素はコンセンサスＰｉｔ−１結合部位（ＴＡ、ＴＴＣＡ
ＴＧ）である。この配列および関連配列は、集合的にＰ
ＯＵ蛋白として公知の転写因子によって認識され結有す
る。この群は元来哺乳動物において、Ｐｉｔ−１，０ｃ
ｔ−１および０ｃｔ−２を、および線虫において、ｕｎ
ｃ８６を包含するものであり（ヘールら（Ｈｅｒｒ ｅ
ｔ ａｌ）、ジーンズ・デイベロブＣＧｅｎｅｓ Ｄｅ
ｖｅｌｏｐ、 ） ２°１５１３〜１５１６（１９８８
））、この科を特徴付ける２のペプチド領域を占める蛋
白をコード付けするｃＤＮＡの発見によって、最近、拡
大された（へら（Ｈｅ ｅｔ ａｌ）、ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）３４０ ： ３５〜４２（１９８９））。 以下の実施例に記載するごとく、本発明者らは、ＧＡＰ
−４３のこの領域を結合させ、その転写を調節し得る脳
−特異的蛋白を同定し、クローン化した。 ＧＡＰ−４３プロモーターのもう１つの顕著な特徴は、
長いホモプリン−ホモピリミジン・ストレッチの存在で
ある。これらは興味深いものである。何故ならば、それ
らはＧＡＧＡストレッチに特異的な蛋白を結合させ（ピ
キンおよびティヤン（Ｂｉｇｇｉｎ ａｎｄ Ｔｊｉａ
ｎ）、セル（Ｃｅｌｌ）５３ ： ６９９〜７１１（１
９８８）；キルムアら（Ｇｉｌｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ）
、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４５ ： １４８７
〜ｌ ４９０（１９８９乃、それらはＨ−Ｄ Ｎ、Ａと
呼ばれる３重鎖フンフォメーションをとる可能性を今す
るからである。かかるホモポリマー領域は真核生物遺伝
子および真核生物ウィルス遺伝子の５′端部において十
分に表わされることか判明しており、それらは転写制御
に幾分関与しているらしいことか推測される（ウェルズ
ら（Ｙｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ）、エフ・エイ・ニス・イ
ー・ビイ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ Ｊ、 ）２ ：
２９３９〜２９４９（１９８８）；フトーンおよびダー
ルベルグ（Ｈｔｕｎ ａｎｄ Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４３： １５７１〜１５
７６（１９８９））。例えば、恐らくは蛋白相互作用に
よって安定化されているＨ立体配置を採ると、ＤＮＡに
よじれを引き起こすと仮定されている。このよじれは、
よじれた領域からの締出しによってヌクレオチドムを順
応させ得、それにより、よじれの辺りのＤＮＡを転写因
子により接近させる（フトーンおよびタールベルブ（Ｈ
ｔｕｎ ａｎｄ Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）２４１ ： １７９１〜］ ７９５（１
９８Ｂ）；ハンおよびグルンステイン（ｌｌａｎ ａｎ
ｄＧｒｕｎｓｔｅｉｎ）、セル（Ｃｅｌｌ）５５ ：
１１３７〜１１４５（１９８８））。加えて、かかるよ
じれは上流の配列をそれらの下流により近く並置させ、
配列間またはそれらに結合した蛋白間の相互作用を可能
とするように働くであろう（フトーンおよびタールベル
ブ（Ｈｔｕｎ ａｎｄ Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４１：１７９１〜１７９５（１
９８８乃。 代わりに、Ｈ−ＤＮＡは、その直ぐ隣接するＤＮＡへの
接近を直接に遮断することによって、転写のリプレッサ
ーとして働くかも知れない（マヘールら（Ｍａｈｅｒ
ｅｔ ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４５
７２５〜７３０（１９８９））。 したがって、本発明のさらなる具体例は、内部領域、ゲ
ノミックＧＡＰ−４３をコードしている第１図に示すよ
うなヌクレオチド配列、またはその機能的もしくは化学
的誘導体、およびＧＡＰ４３プロモーターをコードして
いる第１４図に示すようなヌクレオチド配列またはその
機能的もしくは化学的誘導体からなる。本発明のＧＡＰ
−４３プロモーターかＧＡＰ−４３自体の活性を変形さ
せるだけではなく当業者に周知の方法を用いて他の構造
遺伝子の発現における所望の修正を達成する手段として
非常に有用性のあるものであるということか理解される
であろう。 さらに広（言えば、本発明のこの態様は、実質的には第
１４図に示されるようなプロモーターに関するものであ
り、Ｔ Ａ Ｔ Ａボックスおよび共通の５ｐ−１結合
部位を欠失しているか多重スタート部位および共通Ｐｉ
ｔ−１結合部位を含有していることを特徴とし、そして
二重鎖（Ｈ−ＤＮＡ）構造を取る能力かある長いホモプ
リン−ホモプリミジンストレッチからなることを特徴と
する。相中において、そのアミノ末端で、本明細書に記
載のＧＡＰ−４３プロモーターのヌクレオチド配列およ
びその機能的もしくは化学的誘導体からなる構造遺伝子
、またはそのフラグメントもまた、本発明の意図された
具体例を形成する。 さらなる具体例において、上記構造遺伝子からなるＤＮ
Ａ発現発現ツクターれらのベクターとトランスフェクト
する宿主細胞、およびそれによって産生される蛋白を提
供する。 実施例■ ニューロン成長円錐はミクロ環境からの信号を軸索また
は樹状突起の定方向成長に変換する特別の変換機構を持
つ。成長円錐膜中で豊富な新生児う、ト脳からの細胞下
画分は単純かつ区別される蛋白組成を有する。成長円錐
脱調製物中の２種の主要な非細胞骨格蛋白は４００００
および３５０００の分子量を有する。電気泳動的、免疫
学的および部分的な蛋白配列評価基準によって、これら
の蛋白はＧＴＰ結合蛋白Ｇ。のアルファおよびベータ・
サブユニットと同定された。ニューロン的に分化したラ
ット褐色細胞腫細胞の免疫組織学的染色により、細胞突
起の遠位端に高濃度のＧｏのアルファザブユニットか示
される。これらのテークは、成長円錐運動性の調節はＧ
。信号変換メカニズムを利用するらしいことを示唆する
。 脳発育の間に達成され、シナプス形成性を通して洗練さ
れるニューロン連結性の複合状態はニューロン軸索によ
る特異的標的の選択を要する。それによって、それらの
細胞外環境からの情報を軸索が定方向成長に変換するメ
カニズムはあまり理解されていない。ニューロン軸索の
遠位端は成長円錐なる語のユニークな超構造を有し、こ
れはこの突起について臨界的であると考えられている（
プレイ・デイら（Ｂｒａｙ、 Ｄ、 、 ｅｔ ａｌ）
、アヌ・レフ・セル・ハイオル（Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、
Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、 ）４°４３（１９８８））。幸
いなことに、軸索成長円錐の膜、および従ってその変換
系は他のニーロン構成から分画することができる（フェ
ニンゲル・レイ・エイチら（Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ、
Ｋ、 Ｈ，、ｅｔ ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）３５５７
３（１９８３）；ゴルドンーウイークス・ビイら（Ｇｏ
ｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓ、 Ｐ、 、 ｅｔ ａｌ）、ニ
ューロサイエンス（λｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）１３
： １１９（１９８４）；エリス・エルら（Ｅｌｌｉｓ
、Ｌ、、ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・セル・バイ
オロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）ｌ Ｏ１゜１９
７７（１９８５））。それは、はんの数種の主要蛋白よ
りなり、これらの蛋白のうちいつくかは同定されている
°チューブリン、アクチン、および神経−特異的、成長
−関連蛋白、ＧＡＰ−４３（フェニンケル・レイ・エイ
チら（Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ、 ＫＨ，、ｅｔ）、セル
（Ｃｅｌｌ）３５ ： ５７３（１９８３）；エリスー
ｘルら（Ｅｌｌｉｓ、Ｌ、ｅｔ ａｌ）、ンヤーナル。 オフ・セル・バイオロン−（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、
） Ｉ Ｏ１： １９７７（１９８５）；シムコビノツ
・ビイら（Ｓｉｍｋｏｗｉｔｚ、 Ｐ、 、 ｅｔ、
ａｌ）、ジャーナル・オフ・ニューロサイエンス（Ｊ、
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）９ ： １００４（１９８９）
；チョン・エフら（Ｃｈｅｕｎｇ、 Ｎ、 、 ｅｔ
ａｌ）、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミスト
リー（ＪＢｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６３ ： ３９３５
（１９８８）：メイノ・ケイ・エフら（Ｍｅｉｒｉ、
Ｋ、 Ｆ、 、 ｅｔ ａｔ）、プロンーティングズ・
オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）Ｕ
Ｓ Ａｓ２・３５３７（１９８６）；スケ不・シェイ
・エイチ・ビイら（Ｓｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ，Ｐ、 、
ｅｔ ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３
： ７８３（１９８６））。他の主要成長円錐膜構成
の特徴付けにより、細胞外キューに対する軸索の応答か
説明されるであろう。 新生児ラット脳から成長円錐膜画分を調製した（フェニ
ンケル・ケイ・エイチラ（Ｐｆｅｎ旧ｎｇｅｒ、 ＫＨ
，、ｅｔ ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）３５ ： ５７３
（１９８３）エリス・エルら（Ｅｌ ｌｉｓ、 Ｌ、
、 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・セルＨバイオロ
ジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）１０１１９７７（１
９８５）ニジムコビッツ・ビイら（Ｓｉｍｋｏｗｉｔｚ
、 Ｐ、 、 ｅｔ ａｌ）、／ヤーナル・オフ・ニュ
ーロサイエンス（Ｊ、 Ｎｃｕｒｏｓｃｉ、 ）９ ：
１００４ （１９８９）、チョンーｘヌら（Ｃｈｅｕ
ｎｇ、 Ｎ、 、 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅ
ｍ、）２６３ ： ３９３５（１９８８））。 この調製物は５ＤＳ−ＰＡＧＥによると単純な蛋白組成
を有する（エワス・エルら（Ｅｌｌｉｓ、Ｌ、、 ｅｔ
ａｌ）、ジャーナル・オフ・セル・バイオロジー（ｊ。 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）Ｉ ０１ ： １９７７（１９
８５）： ’／ムコビッツ・ビイら（Ｓｉｍｋｏｗｉｔ
ｚ Ｐ、、ｅｔ ａｌ）、ンヤーナル・オフ・ニューロ
サイエンス（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ）９ ： １
００４（１９８９）；チ舎ンーｊｌ−ヌら（Ｃｈｅｕｒ
＋ｇ。 Ｎ、、ｅｔ ａｌ）、／ヤーナル・オフ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６３
： ３９３５（１９８８））。５０〜５５０００タル
トンにて移動する最も強く染色されるハンドはチューブ
リンと同定された（シムコビノッ・ビイら（Ｓｉｍｋｏ
ｗｉ ｔｚ、 Ｐ、。 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・ニューロサイエンス
（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）９ ： １００４ （１９
８９）；チョン・エフら（Ｃｈｅｕｇ、 Ｎ、 、 ｅ
ｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６３ ：
３９３５（１９８８））。また、ｐ３４およびｐ３８と
呼ばれ、特に成長円錐膜に豊富な約３５０００および４
００００のＭ、を有する重要な蛋白が存在する（シムコ
ビソツ・ビイら（Ｓｉｍｋｏｗｉｔｚ。 Ｐ、、ｅｔａｌ）、ジャーナル・サブ・ニューロサイエ
ンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）９ ： １００４ （
１９８９））。さらに特徴付けを行った２つの未同定蛋
白がある。 細胞骨格蛋白を除き、それらは成長円錐脱調製物中で最
も重要な蛋白である。 ｐ３４およびｐ３８はＧＴＰ−結合蛋白Ｇ。のアルファ
およびベータ・サブユニットと同様の分子量を有するこ
とか注目された（ストリニル・エルら（Ｓｔｒｙｅｒ、
Ｌ、 ｅｔ ａｌ、 ）、アヌ・レフ・セル・ハイオ
ル（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）２ ：
３９１ （１９８６）；キルマン・エイ・／イ（Ｇｉ
１ｍａｎ、 Ａ、 Ｇ、 ）、アヌ・レプ・ハイオケム
（Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）５６ ：
６ ］５（１９８７））。精製したランｇｒａｉｎＧ
ｏと成長円錐膜との共電気泳動により、ｐ３４はＧ。 のへ−タサブユニノトと共に移動し、ｐ３８はアルファ
サブユニットと共に移動することか示された。免疫プロ
ット法により、ｐ３４は抗−ベータサブユニット抗血清
と反応し、ｐ３８は抗−アルファサブユニットＧ。抗血
清と反応することか示された。 さらに、ｐ３８の顕著な蛋白種はアルファ。にちがいな
い。何故ならば、コーマンーブルー染色によって判断し
て、等しい濃度の蛋白濃度のｐ３８およびアルファ。は
同一の免疫反応性を示したからである。そのことはｐ３
４およびＧ。のベータサブユニットについても当てはま
る。アルファＬサブユニ・ノドはこの抗血清とはアルフ
ァ。の約１／１０の反応性であり（キルマン・エイ・ン
イ（Ｇｉｌｍａｎ、 Ａ、 Ｇ、 ）、アヌ・レフ・バ
イオケム（ＡｎｎＲｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）５６ ：
６１５（１９８７））、従って、アルファ。免疫反応
性の主要バーセンチ−／を説明できない。 これらの免疫学的および電気得泳動的データを確かめる
ために、電気泳動で精製したｐ３４およびｐ３８から部
分的な蛋白配列を得たく第１６図）。 ｐ３４およびｐ３８は共にアミノ末端はブロックされて
いた。ＨＰＬＣによって分離したトリプンンの断片から
、および５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したスタフィロ
コッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈａｕｒｅｕｓ）Ｖ
８プロテア一ゼ部分消化断片から配列を得た。ｐ３８か
らの３種の各ペプチドの配列はアルファ。のちのと同一
であり、アルファ。はｐ３８蛋白の主要成分であること
か確認された。他の公知のアルファサブユニットは同様
であるが独自の配列を有する。該３種のｐ３４蛋白はＧ
蛋白のベータサブユニットのものと同一の配列を有して
いた。２種のペプチドは、ベータ、およびベータ。 サブユニットが同一である領域からのものであり、第３
のものはベータ、およびベータ、についての配列の混合
物を含有していた。かくして、Ｇ、のアルファおよびベ
ータサブユニットは成長円錐膜細胞下画分の主要構成成
分である。 これらの調製物は実質的には成長円錐膜に豊富であるか
、それらは純粋ではない（フェニンゲル・ケイ・エイチ
ら（Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ、 Ｋ、 Ｈ，、ｅｔ ａｌ
）、セル（Ｃｅｌｌ）３５：５７３ （１９８３）；コ
ルトンーウィークス・ビイら（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋ
ｓ、 Ｐ、 、 ｅｔ ａｌ）、ニューロサイエンス（
Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ） ］ ３ ： ］ １９
（１９８４））。末画分組織の従前の免疫組織学は、Ｇ
ｏは成長したラット脳の神経網に濃縮されること（ウォ
ーリイ・ビイ・エフら（Ｗｏｒｌｅｙ、 Ｐ、 Ｆ、
、 ｅｔａｌ）、プロシーティングズ・サブ・ナンヨナ
ル・アカテミー・サブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔ ＩＡｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８３ ： ４５６
１（１９８６））、および関連Ｇ蛋白Ｇ。１．が成人に
おける一次嗅ニューロンの末端領域に位置すること（ン
ヨーンズ・ティ・ティら（Ｊｏｎｅｓ、 Ｄ、 Ｔ、
、 ｅｔ ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４
４ ： ７９０（１９８９））、およびＧｏは培養され
た一次ニューロン全体を染色するか細胞−細胞接触の領
域に濃縮される（ノヨーンズ・ティ・ティら（Ｉｏｎｅ
ｓ、 Ｄ、 Ｔ、 、 ｅｔ ａｌ）、サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）２４４ ： ７９０（］ ９８９））こ
とをボしている。これらの研究は成長円錐におけるＧ。 の局在と矛盾しないかそれを証明するものではない。従
って、ＮＧＦ＝処理ＰＣＩ２細胞に免疫組織学的方法を
使用して無傷細胞におけるＧ。の分孔を調へた。ＮＧＦ
は、これらの細胞が成長円錐を先端とした長い突起を伸
長させるのを可能とする。−次ニューロンのものにおけ
るごとく、ニューロン蛋白ＧΔＰ−４，３はこれらの成
長円錐で豊富である（パン・フープ・シイ・オー・エム
ら（Ｖａｎ Ｈｏｏｆ ｒ、 Ｃ，Ｏ，Ｍ、 、 ｅｔ
ａｌ）、ジャーナル・オフ・セル＋７’＋イオロン（
１，ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、）１０８ ： １１１５（１
９８９））。アルファ。の免疫蛍光はＰＣＩ２細胞のこ
れらの成長端て高濃度であった（そζで専ら見い出され
るのではなか−）だうり。 Ｘ！ｉ広 成長円錐膜の調製 従来法（フェニンケル・ケイ・エイチら（Ｐｆｃｎｎｉ
ｎｇｅｒ、 Ｋ、 Ｉｔ、 、 ｅｔ ａｌ）、セル（
Ｃｅｌｌ）３５ ： ５７３（１９８３）、ｆｆ−リス
・ｆｆ−ルら（Ｅｌｌｉｓ、Ｌ、 ｅｔａｌ）、／ヤ
ーナル・オフ・セル・ハイオロ／−（ｊＣｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ、）１０１ ： １９７７（１９８５）； ンｌ−
コビノツ−ｔｌ’イら（Ｓｉｍｋｏｗ・ｉｔｚ、 Ｐ、
、 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・ニューロづイ
エンス（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ）９ ： ］ ０
０４（１９８９）ニチオン・エヌら（ＣｈｅｕｎｇＮ、
ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・
ケミス）−リ−（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６３
： ３９３５ （１９８８））を少し修正して、成長円
錐膜を調製した。 ２４時間令未満のＳＤう、トの首を切り、０３２Ｍスク
ロース、１ｍＭトリス−ＨＣＣ，１，ｍＭＭｇＣ（！
、ｐＨ７，６の５倍容量中、カラス／テフロン製ホモケ
ナイザー中の６通路にて、脳を４００でホモジネートし
た。以下のプロテアーセ阻害剤を該手法の間に使用した
・ｌＱＯμｇ／ｍρ大豆トリブンン阻害剤、１）１ｇ／
ｍ１２ペプスタチンＡ、３０μＭ口イペブティン（Ｉｅ
ｕｐｅｐｔｉｎ） 、および１ｍＭ ＰＭＳＦ８０．７
５Ｍ、１．０Ｍおよび２．２Ｍのスクロースの段階グラ
ジェントの上にｆｆｌ 製瓶ホモジネートを重ねた。該
クラ／ユントを２５００００ｘｇで４０分間遠心し、０
３２／○ ７５Ｍ界面を成長円錐粒子画分として収集し
た。この両分を５ｍＭトリス−ＨＣ（ｌ！、ｐＨ７，６
中に溶解し、４０分間の２５００００ｘｇての遠心によ
って該膜を収集した。、該膜を２０１１ｇ／ｍＱサポニ
ンおよび０．３Ｍ Ｎａ、ＳＯ２中に再懸濁すること
によって洗浄し、遠心によって再度収集した。ウソ脳Ｇ
。を前記１．たごとくに調製した（プレイ・デイら（Ｂ
ｒａｙ、 Ｄ、 、 ｅｔ ａｌ）、アヌ・レフ・セル
・パイオル（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）
４：４３（１９８８））。 抗−血清の産生 つ号ギにおける抗−ウシ脳アルファ。および抗ベータ抗
血清の生産およびキャラクタライセーションハｉｔｓ
載されている（フッ・アール・エムら（）ｔｕｒｆ、
Ｒ，Ｍ、 、 ｅｔ ａｌ）、ツヤ−ナル・オフ・バイ
オロンカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、）２６０１０８６４（１９８５））。ＳＤＳを含む
１０％ポリアクリルアミドゲルに免疫プロット試料を通
して電気泳動を行い、次いて、電気泳動によりニトロセ
ルロースに移した。非特異的蛋白結合部位を１０ｍｇ／
ｍ（Ｊつ／血清アルブミンで遮断し、４°にて、該プロ
ットを１４００抗−アルファ抗血清またはｌ ： １０
０抗−ベータ抗面清と共に晩インキ−１へ−１・した（
フッ・アール・エムら（ｔ（ｕｌＴ、 Ｒ，Ｍ、 、
ｅｔ ａｌ）、／ヤーナル・オフ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） ２６
０１０８６４（１９８５））。ベルオキ／ターセ基質と
してテトラヘンン／ンを用い、アビノン・ビオチン複合
体法（ベクタスタチン（Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ）、パ
ーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）、カリフォルニ
ア州）によって結合抗体を検出した。 成長円錐膜蛋白のアミノ酸配列決定 前記したごとくに成長円錐膜を分画した。蛋白をポリビ
ニルフルオリンン（ＰＤＶＦ）膜に移しり場合、ｐ３４
およびｐ３８についてのスポットは配列を与えなかった
。何故ならば、恐らくは、該蛋白はアミノ末端か遮断さ
れているからであろう。従って、蛋白配列はｐ３４およ
びｐ３８についての蛋白分解断片から得た。トリプンン
消化については、蛋白をニトロセルロースに移し、ポン
ソーＳて染色し、適当なバンドを切り出した。バーバー
ド・マイクロケミストリー・ファンリティ（Ｈａｒｖａ
ｒｄ Ｍｉｅｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔ
のにおいて、トリブンン消化をニトロセルロース膜上て
行い、放出されたペプチドを逆相１−＋ Ｐ Ｌ Ｃに
よって分離し、気相自動配列決定器（モース・エムら（
Ｍｏｏｓ。 Ｍ、、ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・サブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６３
： ６００５（１９８８戸で配列決定した。さらに、
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ、 Ａｕ
ｒｅｕｓ） Ｖ ８プロテアーゼ（ヘーリンケル（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ）、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ乃
での部分的消化によりｐ３４についてアミノ酸配列を得
た。ｐ３４を含有するポリアクリルアミド立方体をＶ８
でｉｎ ５ｉｔｕ消化し、ＤＳＤ−ＰＡＧＥで分画し、
ＰＶＤＦ膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ベット
フォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、マサチューセッツ州）に
電気フロノドし、コーマシーブルーで可視化した（ケ不
テイ・ティ・イーら（ＫｅｎｎｅｄｙＴ、 Ｅ、 、
ｅｔ ａｌ）、プロシーテイングズ・サブ・ナショナル
・アカデミ−・サブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８５ ： ７００８（１９
８８））。 ペプチド断片を切り出し、コロンビア大学のノ・ウワー
ト・ヒユーケス・メテイカル・インステイテユート・フ
ロティン・ケミストリー・コア・ファシリイテイ（Ｈｏ
ｗａｒｄ ）ｌｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎ５ｔ
ｉｔｕｔｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｏ
ｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）にてアプライド・″イオシス
テムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（フ
ォスター・シイティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ１ｔｙ）、カリ
フォルニア州）の４７０Ａ気相シーケンサ−で配列決定
して配列ｐ３４−Ｂを得た。 ＰＣ１２細胞のアルファ。免疫染色 ］００ｎｇ／ｍｆｆ神経成長因子の存在下、ＰＣ１２細
胞をポリーＤ−リンン処理カバーガラス上で４８時間増
殖させた。該細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
中の３．７％ホルムアルテヒドで固定し、次いで、０１
％トリトン−Ｘ−１００を浸透させた。ＰＢＳ中の５
ｍ ｇ ／ ｍρウシ血清アルブミンでのインキュベー
ションの後、該細胞を２３°Ｃにて１：１０００抗−ウ
シ脳アルファ。 抗血清と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳですすぎ
、０３％Ｈ，Ｏ，と共に１５分間インキユヘートしてハ
ックグラウンドを減少させた。結合したウサキ免疫グロ
ブリンはテキサス・レッド・コンシュケート（Ｔｅｘａ
ｓ ｒｅｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ロバ抗つサキＩｇ
Ｇ（／ヤクソン・イミュノロ／カルズ（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ））の使用によって検
出した。 結果 かにする。 軸索成長円錐膜の蛋白をＤＳＤ−ＰＡＧＥによって同定
した。軸索成長円錐膜、精製したラン脳Ｇｏ、および粗
製瓶ホモジネートの２の別々の調製物を、ＳＤＳの存在
下、１０％ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動に
付し、コーマシーブルーで染色した。粗製瓶に対し成長
円錐膜調製物におけるｐ３４およびｐ３８と呼んだ２の
バンドの層化を観察した。これらの蛋白は精製したＧ。 のアルファおよびベータサブユニットと共に移動した。 これらの条件下、アクチンおよびＧＡＰ４３は見掛は分
子！１４３０００て移動した。 成長円錐膜の抗−Ｇｏ免疫プロットはＧ。反応性を示す
。 成長円錐膜調製物双方におけるアルファ・コーマシーブ
ルー染色の位置で移動するアルファ。免疫反応性を明ら
かにした。アルファ。のコーマシーブルー標識がＰ３８
のものと同一となるようにゲルを負荷し、同様に他の対
について適合させた。 コーマシーブルー染色ゲルを平行にて泳動させた。 全蛋白か増加するにつれ、該対は固定度に免疫染色され
、これはｐ３８がこの抗血清に対して標品アルファ。と
固定度に免疫反応性であることを示す。これは、はとん
どまたはすべてのＩ）３８かアルファ。であることを示
唆する。Ｇｏ試料にはアルファ。を越えて移動する少量
の免疫反応性かあり、これはアルファ、てのわずかな汚
染またはそれとの交差反応によるものであるようたった
。これは、以前、各々、ベータおよびｐ３４についてコ
ーマシーブルーで同一に染色することか示された成長お
よび成長円錐膜（Ａ）画分ては観察されず、また、抗−
ベータ抗血清との同様の免疫反応性か示された。 免疫プロット法は、精製したＧ。調製物およびはＧ。の
ものど同一である。 ｐ３４およびｐ３８についての部分的蛋白配列を第１６
図に示す。ｐ３８からの３種のペプチドの配列はラット
脳由来のアルファ。からの３種のペプチドの配列に調和
する（ゴー・ジェイ・タブリュー （Ｇｏｈ、 Ｊ、
Ｗ、 ）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４４９８０
（１９８９））。ｐ３４からの３種のペプチドの配列は
つ／脳からのベータ１およびヘータ２号ブユニソトと比
較される〈フイング・エイチ・ケイ・タブリューら（Ｆ
ｏｎｇ、 Ｈ，Ｋ、 １． 、 ｅｔ ａｌ）、プロシ
ーティングズ・イン・す、′ヨナル・アカテミー・イン
・サンエンンズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ）Ｕ ５Ａ８４・３７９２（＋９８７乃。 ２種のペプチドはベータおよびベータ、か同一である領
域に同一であることに／ｉはされたい。他のベプチ１−
はベータ、およびベータ、についての配列の混合物を含
有する。 アルファ、１免疫反応性はＰＣＩ２突起の先端に〆層線
される１、 神経成長因子で区別されるＰＣｌ、２細胞のアルファ。 染色により、細胞突起の遠位端における抗原の高濃度か
明らかとなった。また、核の回りの細胞質体の領域にお
１プる低レベルの散漫な染色もあった。抗体の特異性は
証明されている（フッ・アール・エムら（Ｈｕｆｆ、
Ｒ，Ｍ、、ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・イン・バイオロ
ンカル・ケミスｌ−’） −（Ｊ、 ＢｉｏｌＣｈｅｍ
、）２６０ ： １０８６４（１９８５）：ウオーレイ
・ビイ・エフら（Ｎｏｒ！ｅｙ、 Ｐ、 Ｆ、 、 ｅ
ｔ ａｌ）、プロ／−ティングズ・イン・す／ヨナル・
アカテミー・イン・サイエン／ズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）Ｕ ５Ａ８３：４５６
１（１９８６）か、さらに対、照として、過剰の精製し
たラン脳Ｇ。（３０ｔｔ ｇ／ｍｃ ）を、抗血清での
インキユベーシヨン、または抗血清の代わりに通常のウ
サキ血清で置き換えたインキュベーションに添加して同
一の試料を調製した。 これらの対照は実質的に細胞突起の染色を小さなかった
。 考察 本実施例で示された結果は、Ｇ蛋白、特にＧ。 は成長円錐膜の主要構成成分であることを／Ｊ’Ｃす。 事実、成長円錐膜には、他のいずれの非細胞骨格蛋白よ
りもＧ。が多くある。脳において第一に明らかにされた
ことだが、Ｇｏの役割は明瞭ではないにもかかわらず、
一般に、Ｇ蛋白は、膜内外レセプターを細胞内信号系に
カップリングさせるくストリニル・エルら（Ｓｔｒｙｅ
ｒ、 Ｌ、 、 ｅｔ ａｌ）、アヌ・レフ・セル＋ハ
イオル（Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、
）２ ： ３９１（１９８６）；ギルマン・エイ・シイ
（Ｇｉｌｍａｎ、 Ａ。 Ｇ、）、アヌ・レフ・ハイオケム（Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）５６・６１５ （１９８７）；
ネール・イー・／、。 イ（Ｎｅｅｒ、 Ｅ、 Ｊ、 ）、ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）３３３ ： １２９（＋９８８）；ロス・イー
・エム（Ｒｏｓｓ、 Ｅ、 Ｍ、 ）、ニューロン（Ｎ
ｅｕｒｏｎ）３ ： １４１ （１９８９乃。Ｇ。 は子数の細胞表面レセプターと相互反応し、ホスホリバ
ーセＣ、ホスホリバーセＡ７、カリウムチャネルおよび
カルシウムチャネルを含めた種々の細胞内信号系に影響
を与え得る（スケ不・ン・。−イ・エイチ・ビイら（Ｓ
ｋｅｎｅ、 Ｊ、 ＩＬ ｐ、 、 ｅｔ ａｌ）、サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３ ： ７８３（１９
８６） ニストリニル・エルら（Ｓｔｒｙｅｒ、 Ｌｌ
、ｅｔａｌ）、アヌ・レフ・セル・パイオル（八ｎｎ、
Ｒｅｖ、ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、）２ ： ３９１ （＋
９８６）：ネール・イー・／エイ（Ｎｅｅｒ、 Ｅ、
Ｊ、 ）、ネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ）３３３ ： １２
９（１９８８）：ロスφイーーエム（Ｒｏｓｓ、 Ｅ、
Ｍ、 ）、ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）３・１４１（
１９８９）ニブラウン・エイ・エムら（Ｂｒｏｗｎ、
Ａ、 Ｍ、 、 ｅｔ ａｌ）、アメリカン・ジャーナ
ル・イン・シイジオロン−（Ａｍ、 Ｊ、 Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、 ） ２５４Ｈ４０１（１９８８））。桿状体お
よび錐状体外部セグメントにおける網膜Ｇ蛋白トランス
トウノン（ｔ ｒａｎｓｄｕｃ ｉｎ）と匹敵する、成
長円錐膜におけるＧｏの驚くべき高しベルは、成長円錐
におけるＧ。 に基つく変換系を強く示唆する。 ｃ Ａ Ｍ Ｐに向かう化学走性かＧ蛋白を介して変換
される、枯菌ンクチオステリウム（Ｄｉｃｔｙ。 ５ｔｅｌ ｉｕｍ）における発育形態形成にとってＧ蛋
白は非常に重要であるこ七か判明している（スナールン
ヤカルスカ・ビイ・イーら（Ｓｎａａｒ−Ｊａｇａｌｓ
ｋａＢ、 Ｅ、 、 ｅｔ ａｌ）、エフ・イー・ビイ
・ニス・レターズ（Ｆ、Ｅ、Ｂ、Ｓ、Ｌｅｔｔ、）２３
２ ： ｌ ４８ （］ ９８８）スナールーンヤカル
ス力・ビイ・イーら（ＳｎａａｒＪａｇａｌｓｋａ、
Ｂ、 Ｅ、 、 ｅｔ ａｌ）、エフ・イー・ビイ・ニ
ス・レターズ（Ｆ、Ｅ、Ｂ、Ｓ、Ｌｅｔｔ、）２３６
： １３９ （１９８８）：ケスベケーｘフら（Ｋｅｓ
ｂｅｋｅ、 Ｆ、 、 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・イ
ン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）
１０７ ： ５２１（１９８８乃。同様に、発育神経系
における経路または標的からの信号は、成長円錐膜にお
ける、Ｇ、一連結レセプター、またはレセプターに結合
し得、それにより、細胞内二次メソセンジャーのレベル
、従って成長円錐移動度を変化させる。一般に、これら
の信号、レセプターおよび二次メツセンジャーは現在未
知である。１のクラスの候補レセプターは細胞粘着分子
、ＮＣＡＭおよびＬｌであり、ニューロン成長円錐に局
在する（ルトウルワーノ・ビイ・シイら（Ｌｅｔｏｕｒ
ｎｅａｕ、 Ｐ、 Ｃ，、ｅｔ ａｌ）、デイベロノブ
メント（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ） １０５ ： ５０
５ （１９８９））。これらの分子に対する抗体は、Ｐ
１２細胞におけるカルシウムレベルおよびホスホチシル
イノシトール代謝を変化させ、これらの抗体の影響はＧ
蛋白拮抗剤百日咳トキシンによって阻止される（ハン・
フーフー’ｉイ・オー・エムら（ｖａｎ ｔｌｏｏｆＴ
、 Ｃ，Ｏ，Ｍ、 。 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー
（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）１０８ ： ｌ １１５
（１９８９））。 成人神経系におけるＧ。発現の持続性（ウォーレイ・ビ
イ・エフら（Ｗｏｒｌｅｙ、 Ｐ、 Ｆ、 、 ｅｔ
ａｌ）、プロシーディングズ・イン・ナショナル・アカ
テミー・イン・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）Ｕ ５Ａ８３ ： ４５６
１（１９８６））は、アキソノケネ／ス（ａｘｏｎｏｇ
ｅｎｅｓ ｉｓ）の調節以外の役割を意味する。 もう１つの成長円錐富化分子、ＧＡＰ−４３も成人脳の
不連続領域に存在する（ベノビノッ・エル・アイら（Ｂ
ｅｎｏｗｉｔｚ、Ｌ、 １．、 ｅｔ ａｌ）、トレン
ズ・二二一口サイ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、
）１０ ： ５２７（１９８７）；スケ不・エイチ・シ
ェイ・ビイ（ＳｋｅｎｅＨ，Ｊ、 Ｐ、 ）、アヌ・レ
フ・ニューロサイ・（Ａｎｎ、 ＲｅｖＮｅｕｒｏｓｃ
ｉ、）１２ ： １２７（１９８９））。ＧＡＰ４３の
局在、その遺伝子調節の性質、および特にそのホスホリ
ル化状態と海馬スライスにおける長期増強との関係（ロ
ウテンベルブ・エイ（Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅｒｇ、 Ａ、
）、ニューヨーク・アカデミ−・イン・サイエンシズ
（Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）４４４ ： ９８０（
１９８９）は、成人のシナプス形成性におけるＧ Ａ
Ｐ−４，３の役割を示唆している（ベノビッツ・エル・
アイら（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ、Ｌ、 １．、 ｅｔ ａｌ
）、トレンズ・二二一口サイ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ、）１０ ： ５２７（１９８７）；スケ不・
エイチ・ジエイ・ビイ（Ｓｋｅｎｅ、 Ｈ，Ｊ、 Ｐ、
）、アヌ・レフ・ニューロサイ（ＡｎｎＲｅｖ、Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉ、） １２ ： １２７（１９８９））。 百日咳トキンンが長期増強を阻止し、恐らくはやはりこ
の突起におけるＧ。を意味するものであることは注目に
値する（ゴー・ジェイ・ダブりニー（Ｇ ｏ ｈ ＋Ｊ
、 Ｌ ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４４
： ９８０ （１９８９））。よって、Ｇｏはニューロ
ン発育の間の軸索伸長および成人神経系におけるシナプ
ス形成性についての調節信号を変換し得る。 実施例■ ＧＡＰ−４３は蛋白結合の新規な内部調節器である。 もう１つの態様において、本発明は、ＧＡＰ４３か細胞
内てＧ。のちのを含めた他の細胞蛋白の結合能力を修飾
するように作用するという驚くへき発見に指向される。 本発明者らか知る限り、これは、外部細胞レセプターに
対する効果および利用性において匹敵する重要な新しい
クラスの内部調節蛋白（ｒｌＲＰＪＸそのうち、ＧＡＰ
−４３が代表的なものである）の最初の報告をなす。 当業者ならば、本発明の本態様のＩＲＰ組成物および方
法は、ニューロンおよび非ニューロン細胞において、蛋
白活性の内部変調を可能とし、それにより細胞の活性お
よび機能の内部変調を可能とする。 さらに、驚くべきことに、ＧＡＰ−４３のアミノ末端ア
ミノ酸よりなる合成ペプチドは、無傷ＧＡＰ−４３蛋白
によって引き起こされたＧ。によるＧＴＰ結合における
変調を正確に複製することが判明した。例えば、ＧＡＰ
−４３の最初の２４アミノ酸からなるペプチドは、ＧＡ
Ｐ−４３と同レベルにＧＴＰｕｓ結合を刺激し、十分な
ＧＡＰ−４３アゴニストとして作用する。短いペプチド
、例えば、アミノ酸１−１０からなるペプチドは、ＧＴ
Ｐｕｓ結合を刺激しないが、Ｇｏへの結合に関してＧＡ
Ｐ−４３と競合し、その結果、逆アコニスト（ｒｅｖｅ
ｒｓｅ ａｇｏｎｉｓｔ）として作用するらしい。周知
の方法を使用し゛Ｃ当業者によって慣例的にその固有の
作用が決定されるこのような生物学的に活性なペプチド
は、本発明のもう１つの態様を形成する。 本具体例による生物学的に活性な合成ＩＲＰペプチドは
、以下の配列 Ｉ Ｍｌ、ＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫ
ＩＥＱＤＧＶ；Ｉｌ、 ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶ
ＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱＤＧＩＩｌ、 ＭＬＣＣ
ＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱＤＩＶ、
ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱ ；
Ｖ ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩ
Ｅ ；■ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＩ’：ＤＱＫ
Ｉ；■、 ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＩ
’）ＱＫ〜’ｌ ＭＬＣＣＭＲＲＴＱＶＩＫＩＩ
ＤＩＤＱＩＸ、 ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮ
ＤＩミＤ＼ Ｍｌ、ＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥ
Ｘｌ、 ＭＬ、ＣＣＪＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤ■
ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＸ ＩＩｌ、
ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＸ ＩＶ 、 ＭＬ
ＣＣＭＲＲＴＱＶＥ ；Ｘ Ｖ 、 ＭＬＣＣＭＲ
ＲＴＫＱＶ ：Ｘ Ｖｌ 、 ＭＬＣＣＭＲＲＴＸ
ＱＸＶｌｌ、 ＭＬＣＣＭＲＲＴＫ Ｘ〜１． ＭＬＣＣＭＲＲＴ’ ＸＩＸ、 ＭＬＣＣＭＲＲ Ｘ Ｘ 、 ＭＬＣＣＭＲ； Ｘ Ｘ Ｉ 、 ＭＬＣＣＭ ＸＸＩｌ、 ＭＬＣＣ；および ＸＸ用 その機能的誘導体 よりなる。 本発明の関連具体例は、前記した合成ＩＲＰペプチドを
コー）・付けするヌクレオチド配列に指向され、その配
列は本発明の教示を理解した当業者によって容易に決定
されるであろう。 本発明のさらなる態様は、コンセンサスアミノ酸配列か
ＧＡＰ−４３およびベータアトレナリン作動性レセプタ
ーで見い出されるという発見に指向され、該配列は 疎水性−川ｅｕ −ｃｙｓ −ｃｙｓ −ｘ−塩基性−
塩基性またはその機能的誘導体よりなる。さらに、本発
明のＩＲＰ類およびＩＲＰペプチド類のンステインはバ
ルミチル化し易いことも理解されるであろう。 また、当業者ならば、本発明のＩＲＰ蛋白類およびペプ
チド類の構造を変化させることによって、標的蛋白活性
か増強され、所望ならば、前例のないことであるが抑制
され得ることを理解するであろう。かくして、もう１つ
の具体例におい°Ｃ１所望の蛋白およびその結合基質よ
りなる環境に有効量のＴＲＰペプチドを導入することを
特徴とする該所望の蛋白の結合活性を刺激する方法か提
供される。該所望の蛋白は、好ましくは、Ｇ蛋白であり
、最も好ましくはＧ。である。該環境は、好ましくは、
中枢神経細胞または末梢神経細胞であってよい生きた細
胞の内部の環境である。 当業者ならば、本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉ
ｎ ５ｉｔｕ、またはｉｎ ｖｉｖｏで実施することか
でき、ここに考察するごとく、当該分野でよく知られた
許容される投与原理を一峠に銘記すると、後者が最も好
ましいことを理解するであろう。 本発明の組成物および方法は、とりわけ、ニューロン成
長およびンナブス形成性に関与するメカニズムに指向さ
れるので、本発明の教示の利益を享受する当業者ならば
、蛋白ｌ舌件の内部調節はヒトを含めた哺乳動物におけ
る障害の効果的治療について重要な機会を提供すること
、およびかがる治療は神経の病気または機能障害の影響
を防止し、改善しまたは逆行させるのに特に価値がある
ことを理解するであろう。所与の薬効指示にとっては、
神経の成長または形成性を減少させならひに増強させる
のか望ましいてあろう。これは、例えば、本発明のｌ
ＲＰペプチド、またはかがるＩＲＰペプチドか生理学的
効果を有する部位へ定方向化された抗体を投与すること
によって達成できる。また、かかる手段によって、所望
の蛋白の活性を、かなりの制御度でもって調節すること
が呵能である。かくして、もう１つの態様において、本
発明は、本発明のＩＲＰペプチドへ定方向化された抗体
、好ましくはモノクローナル抗体、およびその機能的も
しくは化学的誘導体に指向され、該抗体またはその該誘
導体は所望により検出可能にまたは治療可能に標識され
たものでよい。 もう１つの態様において、本発明は、医薬上許容される
担体と共に本発明のＩＲＰペプチドよりなる、および所
望により１種またはそれ以上の治療上有効な剤よりなる
医薬組成物、ならびに、医薬上許容される担体と共に本
発明のＴＲＰペプチドへ定方向化された抗体よりなる、
および所望により１種またはそれ以上の治療上有効な剤
よりなる医薬組成物に指向される。本発明の医薬組成物
の使用は、本明細書中に記載されかつ当該分野でよく知
られた投与の原理を銘記しつつ、不都合な実験を行うこ
となく当業者によって達成れさるであろう。 もう１つの態様において、本発明は、本発明の組成物の
有効量を神経細胞に投与することを特徴とする該神経細
胞における構造再編成を変調する方法に指向される。 さらにもう１つの本発明の具体例において、本発明のＧ
ＡＰ−４３配列を用いて神経細胞からＧ様蛋白を単離し
た。ＧＡＰ−４３カラムを用い、ＭＷ３９０００の蛋白
は高親和性をもってＧＡＰ４３を特異的に結合させるこ
とが判明した。５０ｍＭ トリス、１ｍＭＣａ（Ｊｊ
、、および１ｍＭＩＶ１ｇｃＱｔよりなる緩衝液中にＧ
ＡＰ”４３を含有するカラムに細胞抽出物を導入した。 等モルのＥＤＴＡ緩衝液にて蛋白を単一ノクンドで溶出
させた。該蛋白はＧ蛋白に対するポリクローナル抗体と
反応しない。かくして、それは、成長ニューロンに関連
する独自で新規な蛋白であり、本発明のさらなる具体例
を形成する。 また、本発明のＩＲＰペプチドは、いずれの公知手段、
例えば前記した遺伝子組換え法によっても生産でき、本
発明のＩＲＰペプチドをコード付けするヌクレオチド配
列は、単にルーチン的技量の努力てもって所望の宿主発
現系が推断され、最適化される。 Ｇｏのごとき細胞変換系の修飾における本発明の新規組
成物および方法の重要性は、Ｇｏがニューロン成長円錐
に存在する主要非細胞骨格蛋白であるという証明と結合
させて考えると増大する。 その機能は従前知られていなかったＧＡＰ−４３がＧ０
活性を変調するという発見は、ＧＡＰ−４３か細胞変換
系における第１および第２メツセンジャー間の長らく求
められてきた「欠けている部分」であるという証拠であ
る。いずれか特定の理論に拘束されるつもりはないが、
ＧＡＰ”４３によるＧ。の持続的活性化は細胞がその環
境を無視し、よって構成的に増殖するようにさせるであ
ろう。また、今回の成果は、ＧＡＰ−４３のアミノ末端
と同様の配列を含有し、よってＧ。を細胞の内部から調
節する一群の他の分子が存在することを示唆する。ＧＡ
Ｐ”４３のアミノ末端はいくつかの（ベータレセプター
のごとき）Ｇ蛋白−結合レセプターの細胞質ゾルドメイ
ンに対する大きな類似性を有することは非常に興味深い
。これは、Ｇ蛋白−結合レセプターの細胞質ゾルドメイ
ンがそうであるように、ＧＡＰ−４３は分子中の同様の
箇所でＧ。と相互反応し得ることを示唆する。 内部調節蛋白および内部調節ペプチド（本明細書中テは
、ｒｌＲＰペプチド」とも記す）の新規な変調効果は、
例えば刺激することまたは抑制することであるというこ
とかさらに理解されるであろう。すなわち、ＩＲＰｓお
よびＩＲＰペプチド、またはこのような内部調節作用を
有する他の物質は、当業者に知られており、かつ、例え
ば、レミングトン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）のファーマシ
ューティカル・サイエンシズ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ ５ｃｉｅｎｃｅｓ）、第１６版、マーク・パブ
リッシング・カンパニー（ＭａｒｋＰｕｂｌ ｉｓｈｉ
ｎｇ Ｃｏ、 ）、イーストン、ペンシルバニア（＋９
８０）ならひにグツトマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）およびギ
ルマン（Ｇｉｌｍａｎ）のす・ファーマコロジカル・ベ
インス・イン・セラビューティクス（Ｔｈｅ Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌｏｆｉｃａｌ Ｂａ５ｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃｓ）、第７版、マクミラン・パブリッシ
ング・カンパニー（ＭａｃｍｉｌｌａｎＰｕｂｌ ｉｓ
ｈｉｎｇ Ｃｏ、 ）、ニューヨーク（＋９８５）また
はそれらの現在の版を含む標準的な参考文献に開示され
ているＪ、うな、々１ｊ何なる可能な薬理学的効果をも
有し得る。このように、これらは、アコニスト、部分ア
コニスト、逆アゴニスト、アンタゴニストなどとして作
用する。当業者には、このような効果の特徴付けか、関
心のある如何なる結合蛋白に関しても、Ｇ （１に対す
るＧ’ｒＰ結合に関して本明細書中に記載した方法のよ
うな周知の標準的なアッセイ方法を用いて行われ得るこ
とは、認識されるであろう。 本発明によ・〕で、所望の蛋白およびその結合基質から
なる環境中にスクリーニングをしようとする物質を導入
し、該物質の非存在下での基質結合に関する基質結合の
増加または減少を測定することを特徴とする所望の蛋白
の結合活性を変調する能力を有する物質についてスクリ
ーニングする方法が提供される。所望の蛋白はＧ蛋白で
あり、好ましくはＧ。である。 ム仏扶夷μ結果 ＧＡＰ−４３はＧ。へのＧＴＰγＳ結合を刺激する。 同定された主要成長円錐膜蛋白に関し、本発明者らは、
これらの成分は分子間複合体を形成できるか否かを決定
することを追及した。特に、Ｇ。 およびＧＡＰ−４３を調べた。というのは、それらは、
成長円錐膜における主要な非細胞骨格蛋白だからである
。ゲル排除クロマトグラフィー、免疫沈澱およびアフィ
ニティークロマトグラフィーによってＧＡＰ−４３／Ｇ
ｏ複合体を物理的に単離する試みは不成功に終わった。 溶液中ての一時的Ｇ Ａ Ｐ−４３／ Ｇ ｏ相互作用
を同定するために、精製したＧ。に対する（３５Ｓ）Ｇ
ＴＰｕＳの結合を種々の濃度の精製したＧＡＰ４３の存
在下で測定した（フッ・アール・エムら０１ｕｆｆ、Ｒ
，Ｍ、、 ｅｔ ａｌ、）、ンヤーナル・インＩハイオ
ロ／カル・ケミストーリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、 ） ２６０： １０８６４−１０８７１（１９８
５）；ノースラップ・ノエイ・ケイら（Ｎｏｒｔｈｒｕ
ｐ、Ｊ、に、 ｅｔ ａｌ、）、／ヤーナル・イン・バ
イオロンカル・ケミストす（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、）２５７： １１４ ］ｆ３−］ １４２３（１９
８２））。ＧＡＰ−４３自体は、（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ
を結合させないか、ＧＡＰ−４３は、Ｇ （、に対する
特定の（３５５）ＧＴ Ｐ ｕ Ｓ結合を対照の３ ］
、 Ｏ＋ ４０％（ｎ＝＝７）レベルに刺激する（第１
７Ａ図を参照）。この効果は飽和し、１５０８００ｎＭ
ＧＡＰ−４３の存在下では最適の半分である。Ｇ Ｏ
およびＧＡＰ−４３が溶液中に含まれず、かつｉｎ ｖ
ｉｖｏて膜結合し、ないならば、それらのＩｆｆは、全
脳中約２μＭである。したかって、本明細書に記載され
たアッセイで測定されたＧｏに対するＧ Ａ、 Ｐ −
４３の親和性はｉｎ ｖｉｖｏ状態に矛盾［７ない。す
へてのアッセイは２００μｇ、／′ＴｎρＢＳＡの存在
下で行い、従−）で、Ｇ Ａ Ｐ−４３による非特異的
蛋白効果はＧＴＰｕＳ結合の刺激を説明し得ない。、Ｇ
ｏはＧ Ｔ Ｐ ｕ Ｓなくしての３（’）’Ｃにおけ
るブし・インキュヘーソヨンの間に部分的に不活性化さ
れることは公知である（オタウト・ビー−エフら（０’
Ｄｏｗｄ、Ｂ、’Ｆ、 ｅｊ ａｌ）、シャーノール・
フ６ブ・バイオロンカル・ケミストリー（ＪＲｉａｌ、
ＣＩ−＋０ｍ、 ）２６３ ： ］ ５９ε３５−１
５９９２（１９８８））、、ｃＡｐ−４３はＧ。のハネ
安定性の程度に影響を与えない。 様々な条件下で評価されるけれと、Ｇ蛋白と相性作用す
るりカント−レセプター複合体は、ＧＡｌ） −４３か
行うのとほぼ固定度のＧＴＰｕＳ結合を刺激する（フロ
リオ・ブイ・エイ・アン１−・スターンウェイズ・ピー
−／−（Ｆｌｏｒｉｏ、Ｖ、Ａ、 ＆Ｓｔｅｒｎｗｅｉ
ｓｅ Ｐ、 Ｃ，）、／ヤーナル・インφノクイオロシ
カル・ケミストリー（１，Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）
２６４３９０９−３９１５（１９８９））。 ＧＡＰ−４３デカペプチドはＧ。と相互作用する。 膜連結に対して臨界的であるアミノ末端テカベブチトの
ノステインがＧ０調節に関しても必要とされるかとうか
を判断するために、２個のノステインの代わりにスＩ／
オニンで置換したデカペプチドを合［戊した。このペプ
チドは、１−１０ペプチド効果の特巽性および／スティ
ンの必要性を示すＧｏに対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結
合への効果を有していなかった（第１７ｃ図）。 Ｇ蛋白へのＧＴＰｕＳ結合を刺激することか知られてい
る他の群の蛋白はホルモンおよび神経伝達物質レセプタ
ーである。全ホルモンおよび神経伝達物質レセプター構
造（例えば、大きい細胞外領域および７つの膜内外ドメ
イン）は、ＧＡＰ４３の構造とは非常に異なっている。 したかって、本発明者らは、Ｇ蛋白と相互に作用し合う
と思われるこれらのドメインに焦点を絞って、これらの
蛋白間の相同性について追及してきた。レセプターに関
し、位置特異的突然変異誘発およびペプチド競合研究は
、Ｇ−蛋白カノブリングにおいて、第３細胞質ループの
カルボキシル末端と細胞質テールの末端付近を関係させ
た（コニノブ・ビーら（Ｋｏｎｉｇ、Ｂ、 ｅｔ ａｌ
、）、プロ／−デインゲス・イン・ナショナル・アカテ
ミー・イン・サイエンス・ニー・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、
）８６・６８７８−６８８２（１９８９）；オタウト・
ビー・エフら（０’Ｄｏｗｄ Ｂ、Ｆ、 ｅｔ ａｌ、
）、ンヤーナル・イン・バイオロンカル・ケミストリー
（ＪＢｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２６３ ： ］ ５９８
５−］ ５９９２（１９８８）ニストレーター・ター・
ティーら（ＳｔｒａｄｅｒＣ，Ｄ、 ｅｔ ａｔ、）、
／ヤーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２６２ ： １６４３９
−１６４４３（１９８７））。Ｇｓとβ、−アドレナリ
ン作動性レしプター七の結合は、蛋白の細胞質テール中
のバルミチル化ンステインにおける点突然変異によって
最も特異的に妨害される（オダウド・ビー・エフら（０
’Ｄｏｗｄ、Ｂ、Ｆ、 ｅｔ ａｌ、）、ジャーナル・
イン・バイオロジカル・ケミストリー（ＪＢｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、）２６４ ： ７５６４−７５６９（１９８
９））。Ｇ、調節のために必要とされるＧＡＰ４３のア
ミノ末端におけるシスティンもｉｎ ｖｉｖ。 でパルミチル化される（ス牛−二・ジエイ・エイチ・ビ
ー・アント・ビラグ・アイ（Ｓｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ，
Ｐ＆ Ｖｉｒａｇ、 １． ）、／ヤーナル・イン・セ
ル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）１０８
二６１３−６２４（］９８９））。一連のレセプター
由来の細胞質テールのアミノ末端部分とＧＡ、Ｐ−４３
アミノ末端との比較によって、疎水性−］ ｅ ｕ−ｃ
ｙ ｓ−ｃ ｙ ｓＸ−塩基一塩基の共通の配列か判
明する（第１８図）。この配列内で、研究したシスティ
ンはバルミチル化される（スキｍ：・ジェイ・エイチ・
ビー・アンド・ビラグ・アイ（Ｓｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ
，Ｐ、 ＆Ｖｉｒａｇ、 １．）、ジャーナル・イン・
セル・バイオロジー（Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）１
０８ ： ６１３−６２４（１９８９）；オダウド・ビ
ーーｘフら（０’ Ｄｏｗｄ、 Ｂ、 Ｆｅｔａ＋、）
、ジャーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２６４ ： ７５６４
−７５６９（１９８９）；インキニコブ・ワイ・エイら
（Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ、Ｙ、Ａ、 ｅｔ ａｌ、）
、ＦＥＢＳ ［、ｅｔｔｓ。 ２３０ ： １−５（１９８８））。 Ｇ蛋白に対するＧＴＰｕＳ結合の他の内因性調節物は知
られていない。しかしながら、Ｇ蛋白を反対に活性化す
るペプチド毒素、マストパランがある（ヒカソジマ・テ
ィーら（Ｈｉｇａｓｈｉｊｉｍａ、Ｔ、 ｅｔａｌ、）
、ジャーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２６３ ： ６４
９１−６４９４（１９８８））。ＧＡＰ”４３は、この
ペプチド相同性ではない。 大きな細胞外領域および７つの膜内外ドメインをもつそ
れらの全構造はＧＡＰ−４３のものとかなり異なってい
たが、それらに拘わらず、本発明者らは、これらの蛋白
とＧＡＰ〜４３のアミノ末端間の相同性を追及してきた
。β、−アドレナリン作動性レセプターとＧｓとの相互
作用は蛋白の細胞質テール中のバルミチル化システィン
における点突然変異によって最も特異的に妨害される。 ＧＡＰ−４３のアミノ末端におけるシスティンもバルミ
チル化される。システィンがバルミチル化され易い疎水
性−ｌｅｕ−ｃｙｓ−ｃｙｓ−ｘ塩基性−塩基性よりな
る、ＧＡＰ−４３およびこれらのレセプターか共に有す
る共通の配列かある。 ＧＡＰ−４３かカルモジュリンと結合し、その相互作用
かカル７ウムの非存在下で増強されることは以前から知
られていた（アレキサンター・ケイ・エイら（ＡＩｅｘ
ａｎｄｅｒ、に、Ａ、 ｅｔ ａｔ、）ジャーナル・イ
ン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 ＢｉｏｌＣ
ｈｅｍ、）２６２：６］０８−６１１３（１９８７））
。 これに関する生理学的な重大問題は明らかではない。Ｇ
ｏに対する低ＩＩＩＡ度のＣｄ゛−カルモジュリンまた
はＥＧＴＡ−カルモジュリンの添加によって、ｃ Ａ
Ｐ−４３か（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結合を刺激する能力に
変化は生巳ない。しかしながら、より高濃度のカルモジ
ュリンは、ＧＡＰ−４３−刺激化（３５５）ＧＴ Ｐ
ｕ Ｓ結合を投与量に依存して減少させる（第１９図）
。 煮察 本テータは、ニューロン形態形成の間におはる細胞内成
長関連の発現に関する細胞外信号の協力についての成長
円錐メカニズムを提供する。成長円錐膜におけるＧ。の
アルファおよびベータザブユニットの驚くへき高レベル
は、神経突起ＸｆＭ］節におけるＧ。についての主要な
役割を示唆する。成長円錐膜中のＧ。２１ ｆｊｔは、
網膜光受容体細胞の高度に特殊化された外部セグメント
における、もう１つのＧ蛋白トランメンユ／ン（ｔｒａ
ｎｓｄｕｃｉｎ）の７ａ度を超える。 Ｇ蛋白機能か明瞭に定義される系において、そ１］は、
細胞外信号の膜内外レセプターへの結合と細胞内二次メ
ソセンンヤーを変調する酵素またはイオンチャネルの調
節との間の連動である。第にそのアルファサブユニット
で異なる多くのへテロ）・リマーのアルファーベーター
カンマＧ蛋白かある。一般に、アルファポリペプチドは
、作動剤レセプター複合体かＧＤＰの代わりにＧＴＰの
交換を引き起こすまでＧＤＰ−結合状態で存在する。次
いて、ＧＴＰ−結合活性化アルファサブユニットは二次
メツセン／ヤー系にその作用を及ぼす。内因性アルファ
サブユニノｈＧＴＰａ ｓ ｅ活性は信号変換を終始さ
せる。Ｇｏは顕著に脳で発現され、そこでは、それはＧ
蛋白の主要形態である。成人では、神経網＜−＞て見い
出され、本発明のテークは、それは主要非細胞骨格蛋白
である増殖細胞において神経突起の先端にＧ。を位置付
ける。Ｇｏは種々のレセプターに応答することができ、
カル／ラムチャ不ル、カリウムチャネル、ホスホリパー
ゼＧおよびホスホリパーゼＡ、を含めた多数の細胞内系
を調製する。 成長円錐に対するいくつかの基盤たるおよび解決できる
効果かＧ−蛋白変換を伴うという証拠かある。成長円錐
に局在する細胞粘着蛋白Ｎ−ＣＡＭおよびＬ＋に対する
抗体はＰＣＩ２細胞におけるカルシウムレベルおよびホ
スホチンルイノントール代謝を変化させる。これらの抗
体の効果はＧ ｏ／ Ｇ ＋抑制剤百日咳トキシンによ
って明１トされる（ンユーヒ・ニーら（Ｓｃｈｕｃｈ、
［１，、ｅｔ ａｌ）、ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）
３ ： １３（１９８９））。ある種のヘリオソーム（
ｈｅｌ ｉｏｓｏｍｅ）ニューロンにおいて、Ｇにカン
ブリングしたレセプターを介して作用するセロトニンは
神経突起延長の優れた抑制剤である。 Ｇｏの制限された局在は、蛋白の調節または作用か１種
またはそれ以上の二、−ロン−特に的分子によって媒介
されることを示唆する。ＧＡＰ４３はニューロンにおい
てのみ発現され、該蛋白は成長円錐に富化する。従って
、本発明者らは、Ｇ Ａ Ｐ −４３か６゜と相互作用
するか否がか不思議であった。ＧＡＰ）−４３はＧ。へ
のＧＴＰγＳ結合を増強する。さらに、合成テカペブチ
トによって定義されるＧＡＰ−４３の小さな領域はこの
作用を発揮する。ＧＡＰ−４３によるＧＴＰγＳ結合の
刺激は、作動剤−レセプター複合体によるそれに同様で
あり、該テカベブチド配列はこれらの１−セブターと千
日同性を有する。特定の理論に拘束されるつもりはない
か、最もありそうな解釈は、ｉｎ ｖｉｖｏにて、Ｇ
Ａ Ｐ −４３か膜内外レセプターを模擬し、Ｇ、を活
性化し、ＧＴＰ−結合アルファサブユニ、トを生じ、次
いで、それか細胞内二次メンセンツヤ−系の引金となる
ことである。あるいは、Ｇｏ／＼のＧＡＰ−４３結合は
ますＧ。−レセプターまたはＧ。−エフェクター相互作
用を破壊するように機能するかも知れない。また、Ｇ、
１）４３は、何等かのまた知られていない方法により、
レセプターによるＧ。活性化のエフェクターであるとい
うことも考えられる。 成長関連蛋白ＧＡＰ−４３によるＧ。円錐変換系の変調
は、細胞外信号をニューロン成長についての細胞内プロ
グラムと統有するメカニズムを提供する。さらに、該系
の調節はＢ Ａ ＲＫのごときレセプターキナーゼによ
るレセプターのホスホリル化、または蛋白キナーゼＣに
よるＧＡＰ−４３のホスホリル化のような他の修飾を介
して起こり得る。本モデルにおいて、ＧＡＰ−４３は細
胞外リガンドに対するＧ。の応答を相乗的に増強するか
、またはＧ。のレセプターへの依存性をくつがえすこと
によってリガンドに対する応答性を減少させるであろう
。後者の場合において、シナプス形成の間に起こるごと
く、ＧＡＰ−４３の除去は、細胞外リガンドに対する感
受性を回復させるであろう。ＧＡＰ”４３の作用がレセ
プターの効率に与える正味の効果は成分の相対的濃度に
依存するであろう。 ＧＡＰ−４３は、直接に細胞外リガンドに応答する公知
の能力を現在有していない細胞内蛋白である点で、Ｇ−
蛋白調節器の中でユニークである。 しかしながら、膜結合ＧＴＰａｓｅ蛋白の細胞内調節は
優位を有する。通常のＲＡＳ蛋白は、広範囲に分布した
１２０ＫＤ細胞内蛋白ＧＡＰによって刺激される。それ
らの名称の類似性に拘わらず、ＧＡＰ−およびＧＡＰ−
４３は無関係な蛋白である。 ＧｏへのＧＴＰγＳ結合を刺激するＧＡＰ−４３の領域
およびレセプターにおけるシスティンをパルミチル化に
付す。本発明の実験において、非バルミチル化状態にお
いては、アミノ末端ペプチドおよび恐らくは（膜のｐＨ
ＩＩ抽出によって調製した）ＧＡＰ−４３が存在する。 バルミチル化対−非バルミチル化ＧＡＰ−４３、および
Ｇ連結レセプターかＧ蛋白を刺激する相対的能力は知ら
れていない。急速なバルミチル化−説パルミチル化はこ
れらの蛋白についての調節の役割を演しることは可能で
ある。 成人神経系におけるＧ。発現の持続性（ウメ−レイ・ビ
イ・エフら（Ｗｏｒｌｅｙ、 ｐ、 Ｆ、 、 ｅｔ
ａｌ）、プロ７−チイングズ・イン・ナンヨナル・アカ
デミ−・イン・サイエンンズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１ｌ
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）Ｕ ５Ａ８３：４５６１（１
９８６）は、発育および再生の間の神経突起延長の調製
以外の役割を意味する。 また、ＧＡＰ−４３は成人脳の不連続領域に存在し、小
脳を除くと、２種の蛋白についての免疫組織化学的マツ
プは驚くほど類似している（ベノウソツ・アイ・アイら
（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ、 ｌ、１．、ｅｔ ａｌ）、トレ
ンズ＋＝、−ｏサイ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
、 ） １０ ： ５２７（１９８７）；スケ不・エイ
チ・ジェイ・ビイ（Ｓｋｅｎｅ、 Ｈ，Ｊ、 Ｐ、 ）
、アヌ・レフ・ニューロサイ（ＡｎｎＲｅｖ、Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ、）１２ ： １２７ （１９８９））。ＧＡ
Ｐ−４３の位置決め、その遺伝子調節の性質、および特
にそのホスホリル化状態と海馬スラトスにおける長期増
強との関係（ロウテンプルグ・エイ（Ｒｏｕｔｔｅｎｂ
ｅｒｇ、 Ａ、 ）、アヌ・ニューヨーク・アカテミー
・イン・サイエンシズ（Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、）４４４ ： ２０３（１９８５））は、成人
でのシナプス形成性におけるＧＡＰ−４３についての役
割を示唆している（ベノウッッら（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ、
１．１． 、 ｅｔａｌ）、トレンズ１ニューロサイ
（Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｊ、）１０・５２７（
１９８７）；スケ不・エイチ・ンエイ・ビイ（Ｓｋｅｎ
ｅ、 Ｈ，Ｊ、 Ｐ、 ）＋アヌ・レフ・ニューロサイ
（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）１２ ： １
２７（１９８９））。 Ｇ ｏ／ Ｇ ｌ拮抗剤、百日咳トキシンは長期増強を
阻止し、これは、恐らく同様にこの過程におけるＧｏを
意味する（ゴー・シェイ・タブリューら（Ｇｏｈ。 Ｊ、Ｗ、、ｅｔ ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
） ２４４ ： ９８０（１９８９））。よって、発育
間の神経突起延長についての、および成人神経系におけ
るシナプス形成性についての細胞内および細胞外信号を
変換し得る。 以上のことから、当業者は、本発明の特定の具体例か説
明のために本明細書に記載されているが、本明細書の意
図および範囲から逸脱せずに種々の変形を行い得るとい
うことを認識するであろう。 したかって、本発明は、特許請求の範囲による以外は制
限されない。
ンプロットにおいてＧＡＰ）−４３を特異的に標識した
。Ｇ Ａ Ｐ −、−、−４３抗原に関する特売的な免
疫染色は、神経膠細胞においては検出されないが、ニュ
ーロンにおい−Ｃは検出された。発育の間じゅう、免疫
反応性ＧＡＰ−４３は、神経細胞形質および神経突起の
両方に存在した。神経突起−制限免疫反応性ＧＡＰ−４
３は、以前観察されていた「ヘノウ゛イノツ（Ｂｅｎｏ
ｗｉｔｚ）ら、ジャーナル・ベン・ニューロサイエンス
（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ８：３３９−３５２（１
９８ｇ）キスベン（Ｇｉｓｐｅｎ）ら、Ｂｒａｉｎ Ｒ
ｅｓ、 ３２８：３８１−３８５（１９８５） ：ス
キーニ（Ｓｋｅｎｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）２３３ニア８３−７８６ （１９８６）］。細胞分画
研究はＧＡＰ４３か細胞体中にもあることを示唆してい
る［アレキサンター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）ら、ンヤー
ナル・ベン・バイオロンカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、） ２６２：６１．０８−６１１３
（１９８７）ｉ。 我々の抗体を用いる免疫染色法は、ＧＡＰ−４３−発現
細胞の局在化およびｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセーン
ヨンのテークとの比較を可能にした。免疫反応性ｃ Ａ
Ｐ −４３を含有する二、−ロンの局所的な分布およ
び密度は、ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセー／ヨンによ
ってそのｍＲＮＡに関して観察されｔ−発育パターンを
反映した。Ｇ Ａ Ｐ −４３免疫標識化は、Ｅ１２胎
芽において検出されず、Ｅ】５ＣＮＳにおいて少↑たけ
存在した（かすかな免疫組織化学染色によって明示され
た）。Ｅ１８−ｒは、ＧＡＰ−４３免疫反応性は一層は
っきりと見え、Ｅ２０では、神経細胞の体幹および神経
突起の両Ｕにおいて高！ノベルで検出された。Ｇ Ａ、
ｐ４３タンパクに関する免疫染色のこの度合は、Ｐ７
まて持続された。その結果と１．て、ＧＡＰ−４３免疫
反応性は、はとんとの領域において減少ｌ７、したがっ
て、Ｇ Ａ Ｐ −４３免疫反応性の一層制限された分
布はそのままである。成体において、広がっているかか
すんでいる神経標識化（ｎｅｕｒｉｔｉｃｌａｂｅｌｉ
ｎｇ）は、ＣＮＳの全体にわたって立証された。−ニー
ロン神経細胞形質は、高レベルのＧＡＰ −４３を発現
するとしてｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイセー／３ンによ
っ−ご同定された領域において、密に標識六れた。 例えば、海馬ては、ＣＡＩ、ＯＡ４および歯状間の全体
にわたる錐体細胞および顆粒細胞の両方において、強い
標識化か示される。抗体が、本明細書に記載のとおり単
離したケル精製Ｇ Ａ Ｐ −４３ど一緒に予備吸収さ
れると、標識化は生じなかった。β−カラクトシターセ
予備吸収は、標識化に影響を及はさなかった。小脳、脳
幹、およびを髄において、免疫標識化細胞はほとんとな
く、前頭皮質、体性感覚皮質、視覚皮質および脳幹神経
節における免疫標識化細胞は低い密度であり、内側嗅皮
質においては適度に高い密度であった。１ｎｓｉｔｕハ
イブリタイセーンヨンについて注はしたように、免疫反
応性ＧＡＰ−４３に関する強い押杆細胞形質染色は、２
つの領域 海馬および四球において最も顕著に維持され
た。ＣＡＬ、ＣＡ３および歯状間の全体にわたる錐体細
胞および顆粒細胞は両者とも標識された。四球において
、標識化は、僧帽状細胞に対して、および顆粒細胞のう
ちの神経突起に対して大きく制限されている。すなわち
、ＧＡＰ−４３免疫反応性のパターンは、１ｎｓｉｔｕ
ハイブリタイゼー／ヨンのものを反映した。 考察 本実施例は、ＧＡＰ−４３か周産期間の全ＣＮＳニュー
ロンにおいて発現されることを示している。発育が進行
するに従い、その解剖学的分布は、漸次的に制限され、
成体においては、ＧＡＰ−４３−含有ニューロンは不均
一に分布し、最も高いレベルの発現が、主に、２つの別
々の領域・海馬および四球に制限される。 ロゼンタール（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）らのＥＭＢＯＪ、
６：３６４１３６４６ （１９８７）による近年の報
告には、不均一なＧＡＰ−４３標識化が開示されており
、ここで報告されたものといくらか異なることは、小脳
および前頭皮質における高いレベルのそれらの発見およ
び歯状回における標識化の欠損であった。先の報告にお
いて、免疫反応性ＧＡＰ−４３は、その細胞起源の表示
なして神経突起において排他的に検出された［ヘノヴイ
ノツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ）ら、／ヤーナル・オフ・ニュ
ーロサイエンス（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ） ８３
３９−３５２ （１９８８） ；キスペン（Ｇｉｓｐｅ
ｎ）ら、ＢｒａｉｎＲｅｓ、 ３２８：３８１−３８
５ （１９８５） ；スキｍ＝（Ｓｋｅｎｅ）ら、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３３ニア８３−７８６
（１９３６）巳・。 本発明者らによって生じさせられたβ−ガラクトンター
ゼーＧＡＰ−４３融合タンパクに対する抗体は、ニュー
ロン神経細胞形質の極度の標識化を可能にした。この従
前の報告との相違点は、抗原のキメラ的性質によるもの
であり、おそらく、異なった程度にいくつかの異なった
エピトープをさらす。他方、該相違点は、アルデヒド固
化の省略を反映しており、これは、神経細胞形質標識化
を減少させるために本発明者らによって示された。 如何なる場合にも、本発明者らは、本発明の方法が、Ｇ
ＡＰ−４３遺伝子発現の部位がＧＡＰ４３免疫反応性の
ものを反映したということを示した。ＣＮＳにおけるＧ
ＡＰ−４３の分布は、ラットとヒトの間で異なる。成人
脳では、海馬における以上に連合皮質領域において高い
レベルを維持し［不ヘイ（Ｎｅｖｅ）ら、プロシーティ
ンゲス・オフ・す／ヨナル・アカテミー・オフ・サイエ
ンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ） ８５：３６３８−３６４２
（１９８８）］、これに反して、成体ラントては、海
馬、四球および内側嗅皮質において最も高いレベルのＧ
ＡＰ−４３発現かある。この発見の重要さは、不明瞭で
あるが、ニューロン形成性の領域的保持力に関して、種
の相違に関連しているのであろう。成体において高いレ
ベルのＧＡＰ−４３を安定に発現するＣＮＳニューロン
のサブセ’／ ｌ−か生物学的特徴を共有するか否かを
決定することか残っている。 １つの可能性は、ＧＡＰ−４３がシナプスの構造的改造
を行う際に含まれている細胞において発現されることで
ある。成長円錐は、成体脳のある領域において維持され
［ソテロ（Ｓｏｔｅｌｏ）ら、Ｌａｂｎｖｅｓｔ ２
５：６５３−６７１ （１９７１）１、直接観察によっ
て、少なくとも末梢神経系において、単一の細胞の進行
しているシナプス再配置か示される［バーヘス（Ｐｕｒ
ｖｅｓ）ら、不イチ（−−（Ｎａｔｕｒｅ） ３１５：
４０４−４０６ （１９８５）］。実際、このようなニ
ューロン改造か長期学習［チャン（Ｃｈａｎ）ら、Ｂｒ
ａｉｎ Ｒｅｓ、 ３０９：３５−４６ （１９８４
） ；ケレノト（Ｇｏｅｌｅｔ）ら、ネイチャー （ｌ
ｌａｔｕｒｅ）３２２：４１９−４２２ （１９８６）
；ホーン（Ｈｏｒｎ）ら、ジャーナル・オフ・ニュー
ロサイエンス（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ）５：３１
６１−３１６８ （１９８５）］および性的二形性行動
（ｓｅｘｕａｌｌｙ ｄｉｍｏｒｐｈｉｃ ｂｅｈａｖ
ｉｏｒ）［カーズ（Ｋｕｒｚ）ら、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ） ２３２：３９５−３９８ （＋９８６）］
にとって必須であるという証拠かある。 成長円錐およびンナブトソーム（ｓｙｎａｐｉｏｓｏｍ
ｅｓ）におけるタンパクの補充物は、定性的にはあまり
異なっておらず「エリス（Ｅｌｌｉｓ）ら、ンヤーナル
・オフ” 二、：Ｌ Ｄサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ、） ５：１３９３１４０１ （１９８５） ；
カソッ（Ｋａｔｚ）ら、ジャーナル・オフ・ニューロサ
イエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ５：ｌ４０２−
１４１１ （＋９８５） ：ソンデレ力−（Ｓｏｎｄｅ
ｒｅｇｇｅｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２
２］：１２９４−１２９７ （１９８３）］、成長円錐
は、その未来の／ナブス（ｓｙｎａｐｓｅｓ−ｔｏ−ｂ
ｅ）のマーカーを付ける「ヒユーム（Ｈｕｍｅ）ら、ネ
イチャ（Ｎａｔｕｒｅ） ３０５：６３２−６３４ （
１９８３） ：サン（Ｓｕｎ）ら、プロシーデインゲス
・オフ・す／ヨナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・
ニーニスニー（ＰｒｏｃＮａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ） ８４：２５４０−２５４４ （１９８７）ｌ
。成熟ニューロンは、これらの工程に移した分子の成分
を変化することによって部分的にこれらの構造を調節す
る「グラフスティン（Ｇｒａｆｓｔｅｉ＋ｉ）ら、Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、 Ｒｅｖ、 ６Ω：１１６７−１２８３
（１９８０） ；マクカー リ−（ＭｃＱｕａｒｒｉ
ｅ）ら、ジャーナル・イン・ニューロサイエンス（Ｊ、
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ６：１５９３−１６１）５ （
１９８６）１．、このような変化は、局所的にＵレイス
フ（Ｌａｓｅｋ）ら、Ｃ（ｑｌｌ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ、
ＲＤ Ｇｏｌｄｍａｎ、 Ｔ Ｐｏ１ｌａｒｄ Ｊ
Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、 Ｅｄｓ、、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓｏｎ
Ｃｅ１ｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ５ｅｒｉｅｓ
： Ｖｏｌ ３、コールド・スプリング・バーバー
ニューヨーク、ｐ、１．０２１−１０４９ （１９７６
）ｌ、該レベルの遺伝子発現で、例えば、チューブリン
について示されたような［ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、
ンヤーナル・イン・セル・ハイオロ／（Ｊ、Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、） １０５：３０６５−３０７３ （１９８
７）１およびＧＡＰ −４３について本発明者らによっ
て；ｊχされたようなレー・ルの遺伝子発現でもたらさ
れる。形成性を明示する成体ＣＮＳニューロンの特徴は
知られていないか、１戊熟神経系における／ナブスの発
育ル１および再設胴間の神経突起成長間で類似性か！う
えられ、分子レベルては、成長関連タンパクの必要性か
不合理でない。 形成性に対するＧ Ａ、 Ｐ −４３の結合を確実に４
−るために依存するマーカーはないか、成体において高
レベルのＧ Ａ Ｐ−４３を発現するニューロンのいく
つかは、ンナブス再設訂かできるという証拠かある。す
なわち、ＧＡＰ−４３発現は、嗅神経およびその標的、
四球の僧帽状細胞においで高い。嗅ニューロンは、生涯
をノ勇じて死と交換のサイクルを続けるのてＵグラシア
ティ（Ｇｒａｚｉａｄｅｉ）３ｙｓｔｅｍｓ、 Ｂｅ
ｒｌｉｎ、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｐｐ
、５５−８３ （１９７８）］、これらのンナプスは、
変化し続けなければならない。成体におけるＧＡＰ−４
３を発現する内側嗅ニューロンは、損傷の非存在下で再
設計することは明らかではないか、神経切断域中に発芽
することによって末梢領域を拡張することかできる。最
後に、海馬の回路は機能的に形成性てあり１ヘノウ゛イ
ノソ（Ｂｅｎｏｗ ｉ ｔ ｚ）ら、７ヤーナ、し、イ
ン。 ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ８：
３３９３５２（１９８８） ；コツトマン（Ｃｏｔｍａ
ｎ）ら、サイコロン−（Ｐｓｙｃｈｏｌ、） ３３：３
７１−４０１ （１９８２） ； リー（Ｌｅｅ）ら
１１．ｔ、。ｎｓ、 アヵテミ、り、ニュー３−り、
１９８１．１’ｉｐ、 １８９−２＋２ ；リ−（Ｌｅ
ｅ）ら、／ヤーナル・イン・ニューロフィ／′オロ／−
（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ、）伺２４７−２５８
（１９８０）：ｉ、形態学的分析によって、長期相乗
作用を伴っている／ナブスの数および形の変化を確認し
た［チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、
３０９：３ｂ−ｔ６（＋９ｇ４）ｉｏずなわち、成体
ＣＮＳにおいてＧＡ Ｐ−４３の制限された局在化は、
ＧＡＰ−４３発現ニューロンか再設計しごいる神経末端
において活動的に関係しているものであるという概念と
適有する。 実施例へ１ 多くの場合、個々のニーよ−ロンの表現禦（は、その微
・ｊ＼環境に依存する。このような１゛−形成性−：は
、例えば、交換神経副腎系のｉｉｒ駆細胞によって細胞
運（ｃｅｌｌ ｆａｔｅ）の選択において証明され、こ
れは、神経発育因子（ＮＧＦ）の影響下のニューロン表
現型またはコルチコステロイドの存在下の内分泌クロム
親和細胞表現型と仮定される。さらに、ニューロンは、
正常な発育の間およびンナプス使用に対して、それらの
関係、／ナプス形成性と称した現象を再設計する［イー
スター（ＥａＳｔｅｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ） ２３０：２０７−５１１ （１９８５）］。 これら２つのタイプの形成性に関するある統一テーマは
、元の華麗なニューロンの形の確立において劇的であり
、関係の再配列においてさらに微妙である構造的な再編
成である。１つの概念は、１セツトの遺伝子の発現かニ
ューロ／形成性について責任を有するということである
。微小環境によるこれら遺伝子の調節は、構造的な変化
をもたらすであろう。 フルチフステロイ）・は、哺乳動物の神経系の正常な発
育に必要であり、細胞運およびニューロ−′構造および
完全性に影響する１タウベ（１）ｏｕｐｅ）ら、／ヤー
ナル・イン・ニューロサイエンス（ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ
、） ５：２１１９−２１４２ （１９８５） ；ダウ
ペ（Ｄｏｕｐｅ）う、ジャーナル・イン・ニューロサイ
エンス（ｊ。 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ５：２１４３−２１６０ （１
９８５） ：アンダーマン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）および
アクセル（Ａｘｅｓ）、セル（Ｃｅｌｌ） ４７：１０
７９−１０９０ （１９８６） ；ホーン（Ｂｏｈｎ）
およびラウタ（Ｌａｕｄｅｒ）、Ｄｅｖ、Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ、 ｌ：２５０−２６６ （１９７ｇ） ；シェ
フ（Ｓｃｈｅｆｆ）ら、Ｅｘｐｔ、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ
６８：］９５−２０１（１９８０） ；シェフ（Ｓｃ
ｈｅｆｆ）およびフットマン（Ｃｏｔｍａｎ）、Ｅｘｐ
ｔ、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７６：６４４−６５４ （１
９ｇ２）サポルスキー（Ｓａｐｏｌｓｋのら、ジャーナ
ル・イン・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
、） ５：１２２２−１２２７（１９８５）］。培養中
、小さく極度の蛍光性の（ＳＩＦ）細胞および副腎髄質
細胞を含む神経堤うイニン（ｌｉｎｅａｇｅ）の細胞は
、ニューロン性またはクロム親和性のいずれの表現型を
呈することもてきる。 コルチコステロイドによって、それらがクロム親和性特
徴を帯ひる。コルチコステロイドの非存在下、ＮＧＦの
存在によって、それらかニューロン性の特性を発育させ
る［タウペ（Ｄｏｕｐｅ）ら、ンヤーナル・イン・ニュ
ーロサイエンス（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ）５：２
１１９−２１４２ （１９８５）］。 ラット副腎髄質クロム親和性細胞腫から誘導したクロー
ン株ＰＣＩ２の細胞［グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）および
ティジュラ−（７ｉｓｃｈｌｅｒ）、プロソーティンゲ
ス・イン・す／ヨナル・アカデミ−・イン・サイエンス
・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’ ］ Ａｃａｄ
、 ５ｃｉＵＳＡ） １３：２４２４−２４２８ （１
９８６） ；グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）およびティンニ
ラ−（Ｔｉｓｃｈｌｅｒ）、Ａｄｖａｎｃｅｓ １ｎＣ
ｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ
Ｊ、ｐｐ、 ３７３−４１３、アカデミツク・プレス、
ニューヨーク （１９ｇ２）］は、ＮＧＦによって、よ
りニューロン性となり、コルチコステロイドにさらして
クロム親和特性を維持する、同様の両能運（ｂｉｐｏｔ
ｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅ）を示す。 驚くへきことに、ＧＡＰ−４３発現の本研究は、ＰＣ１
２細胞および培養した交換神経ニューロンの両方におい
て、コルチコステロイドかＧＡＰ４３遺伝子発現の有用
な陰性調節物であることをホした。さらに、コルチフス
テロイトかＧＡＰ４３発現におけるＮＧＦの刺激効果を
抑制することを発見した。 実験方法 砂材 酵素は、ベーリンガー・マンノ−イム（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）、ニュー・イングランド・バ
イオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
）、またはヘセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）から購入し、供給者によって指定されたとおりに
使用した。組織培養産物は、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）から
購入した。放射化学物質は、二ニー・イングランド・ニ
ュークリアーテユ・ボン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ−Ｄｕ Ｐｏｎｔ）から購入した。 寒天および塩化セシウムは、ヘセスタ・リサーチ・ラボ
ラトリーズから購入した。機を得て懐妊しているスプシ
ーキュードーレイ種ラットは、チャールズ・リバー・ラ
ット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｒａｔ）から購入
した。ステロイドは、／グマ（Ｓｉｇｍａ）から、ＮＧ
Ｆは、コラホレイテイブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂ。 ｒａｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）（２、５ｓ型）から購
入した。他の全ての化学物質は、入手可能な最高級のも
のであった。 細胞培養 ５％熱不活化ウマ血清および１０％ウシ胎児血清を有す
るタルへノコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＰＣ１
２細胞を増殖した。約２０％の集合度の時に細胞をルー
チン通りに用いた。ＲＩＡによって測定したコルチソル
レベルは、血清含有培地中、３ｎＭまたはそれ以下であ
った。３７°Ｃて、５％二酸化炭素を有する湿気を帯び
たインキュヘーター中で細胞を増殖した。２０日齢胎芽
ラうト上頚神経節から分離したニューロンを、ＮＧＦ（
５０％ｇ／ｆｆの、０６％グルフースおよび１０％つ／
胎児血清を供給したハム（Ｈａｍ’ ｓ） Ｆ １２培
地中で培養した。ステロイド試験のために、通常、該化
合物を９５％エタノールに溶解した。ビヒクルとしてエ
タノールを用いて行った対ＩＩ６は、豊富なＧＡＰ−４
３またはＧＡＰＤＨＲＮＡ中で変化を示さなかった。 ＲＮＡブロッティング イソチオンアン酸グアニ／ン法によって、培養された細
胞から全ＲＮＡを調製した［チャーグウイン（Ｃｈ ｉ
ｒｇｗ ｉ ｎ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉ。 ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） １８：５２９４−５２９９ （
１９７９）’ｊ０各培養物由来の全ＲＮＡ２０μ７を、
２．２Ｍホルムアルデヒドを含有している１ ２％アカ
ロースゲルを介して電気泳動にかけ、ナイトラン（Ｎｙ
ｔｒａｎ）［／ユライヒャー・ア７ ｌ’ ・：ｌ／
：ｓ−ル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄＳｃｔｕ＋ｅ
ｌ ｌ）］にキャピラリティによって移し、核酸を加熱
固化によって固定化した。５０％ホルムアミド、５ｘＳ
ＳＣ（ｌｘｓｓｃ ： １５０ｍＭ塩化ナトリウト、１
５ｚＭクエン酸す１−リウム、ｐｌ（７０）、〕×テン
ハーツ（Ｄ ｅｎｈａｒｄｔ’ ｓ）溶液、１％ドテン
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１００μ９／ｇＱの
変性したづ−モン精液ＤＮＡを含有しているハイブリタ
イヤ−ノー３ン溶液中、４２°Ｃて、少なくとも１時間
、プレハイブリタイセーンヨンを行った。 Ｄ Ｎ ＡポリメシーセＩのフレノウフラグメン１へを
用いて、仕向のへキせヌクレオチ！・ブライミンク（こ
３上−・て調ｌ製（またｌ ｘ ］ ０ ’ｃｐｍ／ｍ
（！の３２Ｐ−標識化Ｌ）Ｎ Ａプローブを含有してい
る同一の溶液中、４２°Ｃて１０〜１２時間、ハイブリ
ッド形成を行った［ファインバーブ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ
）およびフオゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）、
Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １３２：６−１２（１
９８４）］。ここに記載したようなＧＡＰ−４３に対し
て、またはＧＡＰＤＨに対してクローンしたｃＩ）ＮＡ
から該プローブを作製した「ピエチャクツイク（Ｐｉｅ
ｃｈａｃｚｙｋ）ら、Ｎｕｅｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
１２：６９５１−６９６３ （１９８４）ｌ。プロ
ットを、６５°Ｃて、２ＸＳＳＣて２回、各２０分間、
ならひに６５°Ｃで、０２ｘＳＳＣでさらに２０分間洗
浄した。−７０’Ｃて、スクリーンを強めながら、オー
トラジオグラフィーを行った。１×テンハーツ溶液、１
％ＳＤＳ。 ５０ｍＭｈリス、ｐｌ、、＋ ７ 、４および０．０５
％ビロリン酸すＩ・リウムを含有している溶液中、８０
°Ｃて２時間、ハイブリクイズしたプローブをプロット
からストリップした。 Ｌ、 Ｋ Ｂウルトラスキャンによってスキャニングレ
ー寸−テンン用・メトリーを行った。与えられたプロ、
１・のいくつかの位置をスキャンし５、像の強度を時間
に対してプロットした。像の強度の測定は、曲線の線形
部分から得た。ＧＡＰＤＨＲＮＡレヘルの注＠深レベの
測定によって、これらのいくつかの実験条件ドて変化し
ないことかわか−。 た。 核追加検査（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｕｎ−０ｎ Ａｓ５ａ
ｙ）各実験の４８〜６０時間前に、Ｉ）Ｃ１２培養物を
スブリ、トシた。細胞は、未処理のままか、あるいはＮ
ＧＦ（５０ｎｙ／ｚ□またはデキサメタシン（１μＭ）
のいずれかで６時間処理（、た。約１，０００万の核を
、以下の変形を伴ってグリーンハーグの方法［グリ−ン
ハー グ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ、 ＲｉｏｌＣ
ｈｅｍ、 ２６０：１４１０１４４１１０ （１９８５
）］によって、それぞれから調製し、た。細胞溶解は、
］、ＯｚＭ塩化すトリウム、１０１Ｍ１−リス、ｐＨ７
，４，３ｍＭ塩化力ルンウムおよび２００ユニｙ ｌ−
／ｒｔｒＱ ＲＮ Ａｓ１ｎ［プロメカ＋バイオツク（
Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）ｉ、中たった。５０１
１Ｍｌ−リス、ｐ＋＋ ８．３．４０％グリセロール、
５ｉＭ塩化マグネ／・ラム、０．１ｚＭエチレン／アミ
ノ四酊酸（ＥＤＴＡ）、２ｘＭ／チ第１・レイｉ −、
ｒしおよび２００ｘ−＝−、、ｌｚｌｍＱ ＲＮＡ５ｉ
ｎ中細胞溶解緩衝液で洗浄した後、核を再懸濁した。 核を計数し、５，０００万／ｉｃの濃度で、液体窒素中
に貯蔵した。 懸濁した核に、同量の、１０ ｘＭ ｌ−リス、ｐＨ８
０，５ｍＭ塩化マグネ／ウム、０３Ｍ塩化ノノリウムお
よび各々］、ＯｘＭのアデノノン、ンチンンおよびグア
ノンンヌクレオチト三リン酸を含有している緩衝液に添
加することによって、解凍［７た核中の発生期鎖の標識
化を行った。次いて、ウリノン三リン酸（３２Ｐ）３０
０，１１Ｃｉを添加しく３０００Ｃ１／ミ’）モル）、
３０°Ｃて３０分間、成核を標識した。次いて、３′７
°Ｃて４５分間、６０ ｄｉ トリス、ｐ）−（７，５
，１５ｚＭ塩化すＩ・リウム、ＩＯｔＭ塩化マグ不ノウ
ム、および２００−１＝）ｌ−／ ｒｒｔρＲＮＡ５ｉ
ｎを含有している緩？Ｉｉ液６００μθ中て１００ユニ
ノ１−ＲＱ Ｉ ＤＮＡａｓｅ：プロメガ・バイオチ
ック」を添加して核を消化し７た。次いて、開示されて
いるとおり［グリーンハーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）ら
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２６０：１４１０１−
１４１１０ （１９８５）Ｉ、十票識化ＲＮ Ａ ヲフ
ロテイナーセＫ［ヘーリンメノ゛−・マンハイム（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］で消化した。 数回９フエノール、クロロホルム−イソアミルアルコー
ル抽出の後、酢酸ナトリウムの存在下、核酸をエタノー
ル沈殿した。回収した標識化核酸は、またＤＮＡを含有
しており、これを、３７°Ｃで４５分間、ＲＱＩ Ｄ
ＮＡａｓｅ（５０ｘＭトリス、１）Ｈ７，５、ＩＣ１ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、７．５ｉＭ塩化マグネシウムおよび
２００ユニツトＲＮＡ５ｉｎ／酎を含有している緩衝液
２５０μＣ中５０ユニツト酵素）、次いで、４２°Ｃで
３０分間、ブロテイナーゼＫ（５％ＳＤＳ、０．５Ｍト
リス、ｐＨ７゜４．１２５１Ｍ ＥＤＴＡおよび０ 、
２ ｍｇ／ ＲＱプロテイナーセＫを含有している緩衝
液１００μａを添加することによる）の別の循環にかけ
た。数回のフェノール、クロロホルム−イソアミルアル
コール抽出の後、標識化ＲＮＡを、酢酸アンモニウムに
よるエタノール沈殿を３回行い、一体化していないヌク
レオチド三リン酸を除去した。 チロ／ンヒトロキンシーセに関してクローンしたｃＤＮ
Ａ［ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、 ２８５：１４６３２−１４６３７ （１９８３）］
、］グリセルアルデヒドー３リン酸デヒドロケナーセＧ
ＡＰＤＨ）、ｐＢＲ３２２およびＧＡＰ−４３遺伝子の
８キロベースゲノムフラグメントを含むプラスミドを、
適当な制限酵素を用いて線形化し、フェノール抽出し、
エタノール沈殿し、そして、遠心分離によって回収シタ
。ＤＮＡ（２５０μｉｉ／ｒｃ）を、アルカリ（０５Ｎ
水酸化ナトリウム）によって変性し、１０容量の１Ｍ酢
酸アンモニウムの添加によって中和シた。ニトロセルロ
ースフィルターサークルヲ、重力濾過によってＤＮＡ５
０μ９て負荷した。２５ＩＭＰＩＰＥｓナトリウム、ｐ
Ｈ７，２，５０％ホルムアミド、０．７５Ｍ塩化ナトリ
ウム、２，５ＦＭＥＤＴＡおよび１００ ｔｔｇ／ｍ（
ｌのｔＲＮＡを含有している緩衝液中、４５°Ｃで１０
〜１２時間、該フィルターのプレハイブリット形成を行
った。 １〜３ ｘ １０６ｃｐｍ／ ｍρの範囲の比活性の標
識化ＲＮＡを含有する同一の緩衝液中で、４５°Ｃて４
日間、ハイブリタイセーションを行った。開示されてい
るように［グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）、Ｊ
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２６０°１４１０１−１４１１
０ （１９８５）］、洗浄およびＲＮ Ａ ａｓｅ処理
を行った。２回行ったフィルターを、シンチレーション
カウンターにおいて、乾燥後に計数した。データは、フ
ィルターを含有しているベクターからハックグランドを
引いた後ノ＼イブリダイズした１００万当たりの部数と
して表す。 結果 ＧＡＰ−４３発現の二重調節 ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡ蓄積に与えるＮＧＦおよび糖質フ
ルチコイトの影響をＲＮＡプロット法によって測定した
。デキサメタシンはＧＡＰ−４３ｍＲＮＡレベルの顕著
な減少を生じるのに対し、ＮＧＦ添加の結果、基底レベ
ルよりも著しく増加した。テンシトメトリーによって測
定し、ＲＮＡ負荷について修正したＧＡＰ−４３ＲＮＡ
の定量化の結果、デキサメタシンは５．５倍減少させる
か、Ｎ Ｇ Ｆは３５倍増加を生じることが明らかとな
った。ｃ−ｆｏｓとは異なり、ＮＧＦの存在下でのＧＡ
Ｐ−４３ｍＲＮＡの蓄積は安定しており、これは数時間
以内にピークに達し、次いて、ＮＧＦの継続存在にもか
かわらず素早く衰退する。 蓄積したＧＡＰ−４３ｍＲＮＡレベルに与えるステロイ
ドの効果の特異性を試験するために、いくつかの構造ク
ラスの種々のステロイドを、ある濃度範囲にわたって試
験した。各クラスのステロイドは、ｉｎ ｖｉｖｏで様
々なタイプのニューロンに選択的に影響を及ぼすことか
示された［マクエラエン（ＭｃＷｅｎ）ら、Ｐｈｙｓｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ、 ６６：１１２１−１１
８８（１９８６）］。 １つの試験において、ステロイドの７＃変は、４８時間
の処理の間、１μＭであった。テンシトメトリーによっ
て定量化を行い、ＲＮＡ入力におけるわずかな変動につ
いて正規化した。エストラノオール、テストステロン、
およびフ“レグ不ノロンは、蓄積したＧＡＰ−４３ｍＲ
ＮＡレベルに対し影響しなかった。デキサメタシン、コ
ルチコステロン、アルドステロンおよびプロゲステロン
は、ＧＡＰ−４３ＲＮＡのレベルを、各々、対照（ＧＡ
Ｐ−４３ＲＮＡのＮＧＦ−刺激レベルを１００％↓（、
て定義しまた）のＣ】％、１５％、１０％および１５％
まで減少した。プロケステロン効ψは、それ自イ本のレ
セプターによってもたらされるかもしれないか、これら
のテークは、鉱質コルチコイドまたは糖質コルチコイド
のいずれかのレセプターの活性化を示唆している［アリ
ｆ（Ａｒｒｉｚａ）ら、リイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
２３７：２６８−２７５ （１９８７） ；キケレ（
Ｇｉｇｕｃｒｅ）ら、セル（Ｃｅｌｌ） ４６：６４５
−６５２ （１９８６１゜コルチコステロイドは、ＳＩ
Ｆおよび副腎骨髄細胞の両方においてニューロン表現型
のＮＧＦ誘導を遮断する［タウベ（Ｄｏｕｐｅ）ら、／
ヤーナル・オフ・二、−口＠ゴイエンス（Ｊ、 Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ、 ） ５：２１！！ｌ−２１４２（１９８
５） ；タウベ（１）ｏｕｐｅ）ら、ンヤーナ／ｌｚ−
オフ・ニュー０升イエンス（１，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）
５：２１４３−２１６０ （１９８５）１．。Ｇ Ａ
Ｐ −４３発現に際しての２つの薬物の相互作用の性
質を調へるために、ＮＧＦ（５ｏｎ？・ｉｃ）およびデ
キサメタソン（１ｔｔ ｌｔ４ ）ノミｒ在下、ＰＣ］
２１［Ｂ胞を３（３時間均油させた。ギ２．東は、デキ
サメタソンか、Ｎｃｒ”によってもたらされるＧＡＰ−
４３ｍＲＮＡの増加を妨げることを小す。 Ｎ Ｇ Ｆおよびステロイドの効果は直接的であるＮ
Ｇ Ｆおよびコルチコステロイドの効果か直接的に及ぼ
されるのかまたは間接的に及ぼされるのかという疑問を
、タンパク合成抑制薬ンクロベキ／ミ１−の使用によっ
て処理した。０５Ｈｇ／ｍＱのシクロへキンミドの濃度
は、２４時間目の細ｔｌａ成育能力への影響なくしてタ
ンパクへの（３Ｈ）ロインンの取り込みの９４％以十を
抑制する。ンクロヘキンミトは、ＧＡＰ−４３遺伝子発
現のＮＧＦ強化およびデキサメタソン抑制のいずれをも
妨げず、これはいずれの効果ちｄｅ ｎｏｖｏタンパク
合成を必要としないことを示す。ＮＧＦ処理細胞と、な
らびにＮＧＦおよび０５Ｈｇ／杼または２μｙｌｍσン
クロヘキンミト・て処理した細胞と、対照よを比較した
。０５μｙｌ ｖｔ（２／クロへキンミドによる処理の
後、大きいサイズの転写産物か示され、これは、スプラ
イスしていない前駆体を表すてあろう。Ｇ Ａ Ｐ −
４３発現のテキ→ブメタソン抑制は、デキサメタソンだ
（づを用いるよりもシクロへキ／ミｌとデキサメタソン
を用いる方かまり著Ｉ−いものてあ−）だ。 ０、’］ｖＭのａ度にて、より強力なタンパク合成抑制
薬アニソマイ／・ンを用い、これらの実験を、１２時間
までに細胞死か生じるために６時間の暴露時間−Ｃ繰り
返した。了ニソマインノは、ＮＧＦによってもたらされ
るＧＡＰ−４３ｍＲＮＡの増加に影響を及ぼさなかった
。デキサメタソン抑制は、Ｎ Ｇ Ｆ誘導よりも遅く、
６時間までは認識されず、従って、該効果は、アニソマ
インン感受性に関して検査することかできなかった。Ｎ
Ｇ Ｆによるプレ処理は、ステロイド抑制を直接防止
しなかった。 別の試験において、ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡの充分に抑制
された安定状態レベルを達成するのに必要とする時間は
、ＮＧＦ−）備処理の後にステロイ１−を添加すると一
層長くなることか判明した。 ステロイド抑制は転写的である Ｎ Ｇ Ｆおよびステロイドの両効果に関！−ｊする調
節のレベルを評価するために、核追加試験（ｎｕｃｌｅ
ａｒ ｒｕｎ−ｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）を行っ
た。核は、５０％ｇ／ｍＯＮＧＦまたは１ＨＭテキせメ
タシンで６時間処理し７たＰＣＩ２１１（ｔｌｌｌＫか
ら調製した。各グループからの標識化ＲＮ 、Ａを、固
定化Ｄ Ｎ Ａ、 ｓを含有スる二）゛ロセルロースフ
ィルターにハイブリクイズした。ハイブリダイゼー／−
３ンおよび洗浄の後、各フィルターに関する特異的放射
能活性を算出し、テークを１００万当たＩりの部数でハ
イブリクイズされた数として表（７た。ＮＧＦは、基本
的な転写率に対し影響は認められなかったか、テキ±メ
タシンは、Ｇ Ａ Ｐ −４３の転写率を約４５倍減少
した。比較すると、千ロ／ンヒドロキンシーセ転写は、
デキサメタソンによって増大し、ＧＡＰＤＨの転写は変
化し５なかった。 Ｇ Ａ Ｉ） −４３転写ユニツトを定義する一連の実
験において、新生児脳核から調製した流出（ｒｕｎｏｆ
ｆ）−標識化ＲＮΔを、第１イン）・ロンの初期部分を
通って、５′フランキング領域にわたる近隣の一連の一
Φ鎖Ｍ １３クローンにハイブリクイズした。結果は、
転写かコーディング鎖たけからでアリ、フランキングセ
グメントからではないことを示した。 ＮＧＦ処理ＰＣＩ２細胞は、分化したニューロンの良い
モテルであるとみなされるが、フルチコステロイドの効
果か、充分な分化状態を達成した後、−次ニューロンに
よって発揮されるか否かを決定するのが望まれた。そう
するために、ラット上類神経節の分離したニューロンを
培養し、これに１μＭデキサメタシンを４８時間添加し
た。上記のとおり、全ＲＮＡを調製し、分画し、プロッ
トし、プローブした。デキサメタシンは、交換神経ニュ
ーロンにおけるＧＡＰ−４３ＲＮＡの発現を減少させた
。デキサメタシン処理培養物中のニューロンの形態学的
外観は、未処理細胞のものと相異しなかった。これは、
短時間にわたる神経突起の延長または維持かＧＡＰ
４３ ｍＲＮＡの持続性に依存しないらしいか、ＧＡＰ
−４３遺伝子産物か長い半減期を有するので、長期の効
果を評価する必要かあることを示唆している。 考察 本実験において、ＧＡＰ−４３遺伝子発現は、ＮＧＦに
よる陽性および糖質コルチコイドによる陰性の両対照に
支配されることを示す。両効果は、直接的であり、いず
れも新しいタンパク合成を必要としない。興味深くかつ
驚くべきことに、シクロへキンミドは、ＧＡＰ−４３ｍ
ＲＮＡのデキサメタシン抑制をさらに増加させることが
分かった。 特定の理論によって結有することを意図しないが、これ
は、ｍＲＮＡ安定化タンパク上での合成の抑制によるも
のであろう。 Ｉｎ ｖｉｖｏで、ＧＡＰ−４３遺伝子は高度に調整さ
れる。それは今日まで、ニューロンにおいてた゛け報告
されてきた。しかしなから、本発明者らは、神経環から
誘導される他の細胞における低レベルの発現を支持する
データを得た。動物におけるピークレベルは、神経突起
の成長時に達成され、正常な成長または再生に関係して
いる。その細胞特異的かつ成長に関連する発現の分子調
節器は、また明らかにされていない。神経発育因子は、
中間フィラメントに関連するｃ−ｆｏｓＳＮＧＦ Ｉ
Ａ、 ＮＧＦＩＢ、ヘーターアクチンおよびクローン化
ｃＤＮＡのようないくつかの遺伝子の発現を直接増加さ
せる［グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）ら、ＪＢ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２６０：１４１０１−１４１１
０ （１９８５） ； ミルプラント（Ｍｉｌｂｒａ
ｎｄｔ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３８ニア
９７７９９ （１９８７） ；ミルプラント（Ｍｉｌｂ
ｒａｎｄｔ）、ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ） ｌ：１８
３−１８８ （１９８１３） ；レオナルト（Ｌｅｏｎ
ａｒｄ）ら、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー（
Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、） １０６：１８１−１９３
（１９８８）］。 本データは、ＧＡ、１”４３％節とこれらの他の遺伝子
の調節との間にいくつかの顕著な相異点かあることを示
している。ｃ−ｆｏｓおよびＮＧＦＩＡおよびＮＧＦＩ
Ｂのようなものについて、ＮＧＦ誘導は、迅速であり、
数分以内に影響を及ぼし、数時間後に衰退する。これは
、ＧＡＰ−４３発現へのＮＧＦ効果とは対照的であり、
着手はゆっくりであり、安定である。 さらに、広範囲の刺激は、カル／ラムエントリ、他の成
長因子および血清離脱症状および多血症の増加を牛ヒさ
せることができ、これらの効果は様々なタイプの細胞に
おいて見られる［グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ
）およびシフ（Ｚｊｆｆ）、不イチャ（Ｎａｔｕｒｅ）
３１１：４３３−４３８ （１９８４）］。ｃ ｆ
ｏｓのような遺伝子は、ＤＮＡウィルスのごく初期の遺
伝子にたとえられており［ゲレノト（Ｇｏｅｌｅｔ）ら
、不イチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ） ３２２：４１９−４２
２ （１９８６）］、そのうちのいくつかはそれ自体、
細胞機構を専用機能に再プログラムする転写的調節器を
コードする。 ＮＧＦに対するＧＡＰ−４３の遅延応答は、ｃ ｆｏ
ｓ、ＮＧＦ ＩＡＳＮＧＦ Ｉ Ｂ等とは別で異なるク
ラスのＮＧＦ−調節遺伝子に当てはまり、即時応答にお
けるよりもむしろ長期適合における役割を果すらしいこ
とを示唆している。これらの他の遺伝子とは異なり、Ｎ
ＧＦはＧＡＰ−４３ｍＲＮＡ蓄積の大きい増加を生じる
が、転写速度に与える効果は、ごくわずかである。した
がって、その作用は、転写後のメカニズムを介−しても
たらされるらしい。 神経系に与えるコルチコステロイドの影響は広範囲であ
る［マクエラエン（ＭｃＥｗｅｎ）ら、Ｐｈｙｓｉｏｌ
。 ｇｉｃａｌ Ｒｅｖ、 ６６：１１２１−１１８８ （
１９８６）］。ステロイドは、転写調節薬としてそれら
のレセプターを介して作用するので、いずれのニューロ
ン遺伝子がコルチフステロイドによって調節されるのか
を決定することは重要である。神経堤行数の細胞を考え
ると、細胞表現型に与えるコルチコステロイドおよびＮ
ＧＦの拮抗効果が遺伝子発現のレベルで反映されている
か否か、すなわち、同一の遺伝子が２つの薬物によって
双峰的に調節されるか否かを決定するのは特に興味深い
。 本発明者らは、ＧＡＰ−４３転写がコルチコステロイド
によって抑制され、ＮＧＦの同時存在がこの抑制を妨げ
ないことを示した。これは、培養したクロム親和性細胞
のＮＧＦによってもたらされたニューロン分化に対する
糖質コルチコイド抑制効果と類似している［タウベ（Ｄ
ｏｕｐｅ）ら、／ヤーナル・オフ・ニューロサイエンス
（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ）５：２１１９−２１４
２ （１９８５）ｌ。かくして、ＧＡＰ−４３は、細胞
運命のこれらのモジ、レータ−の公知の分岐効果に少な
くとも匹敵する方法て、ＮＧＦおよびコルチコステロイ
ドによって双峰的に調節される。５ＣＧＩＯと称される
他の神経特異性遺伝子がＰＣＩ２細胞において双峰的に
調節されることは興味深い［スティン（Ｓｔｅｉｎ）ら
、Ｉ）ｅｖｅｌｏｐ。 Ｂｉｏｌ、 １２７：３１６−３２５ （１９８８）
］。Ｇ Ａ Ｐ−４３と同様に、ＳＣ０１０発現は、Ｎ
ＧＦによって刺激され、糖質コルチコイドによって抑制
されるか、抑制レベルは２つの遺伝子間で多少異なる。 コルチフステロイドは、ＰＣ１２細胞の形状に顕著に影
響を及ぼさない。ＧＡＰ−４３か抑圧されるので、通常
レベルのｍＲＮＡは、ＰＣＩ２細胞における神経突起延
長に必要ではないことは明らかである。しかしなから、
これらの結果か、ＧＡＰ−４３か神経突起成長に不必要
であることを意味すると解釈し得ることは明らかではな
い。第１に、低レベルのＧＡＰ−４３ＲＮＡは、ステロ
イド抑制の後にも存在する。第２に、該タンパクは、長
い細胞半減期を有する。さらに、ＰＣＩ２細胞は、形質
転換され、これらのｉｎ ｖｉｖｏ相対物によってもた
らされたものとは異なる構造制限を課せられるらしい。 実施例■ 本実施例において、本発明者らは、ＧＡＰ−４３が、お
そらく細胞構造のレベルで、固有のニューロン表現型の
確立に直接貢献しているという仮説を試験することを説
明する。かくして、本発明のもう１つの態様において、
ラットＧＡＰ−４３をコードイー１けする発現ベクター
を、いくつかのタイプの非ニューロン性細胞に導入する
。 アデノウィルス主要後期プロモーター、ＳＶ４０早期プ
ロモーター、またはサイトメガウィルスプロモーターの
抑制下、ＳＶ４０複製開始点を含有するプラスミドに挿
入したラットＧＡＰ−４３ｃＤＮＡを用いて、発現ベク
ターを構築した１カーンズ（Ｋａｒｎｓ）ら、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３６：５９７（１９８７）］。 結果は、これらのベクターの全てを用いても同様であっ
た。 ＣＯ８７細胞［グルラマン（Ｇｌｕｚｍａｎ、 Ｙ、
）、セル（Ｃｅｌｌ） ２３：１７５ （１９８１）］
を、開示に従ってトランスフェクトし［ツバ−（Ｚｕｂ
ｅｒ、 Ｍ、 Ｘ、 ）ら、サイエンス（Ｓｅｉｅｎｅ
ｅ） ２３４：１２５８ （１９８６）］、七Ｍ己ウつ
キ゛抗ＧＡＰ抗体を用いてＡＧＰ−４３免疫反応性につ
いて試験（−た。Ｔ−細胞特異性膜タンパクＣＩ） ８
を発現する同様のベクターを用いて、同しく、対照ｌ・
ランスフェクションを行った「ンーＦ（ＳｅｅｄＢ、）
う、プロン−ティンゲス・オフ・ナンタナル・アカテミ
ー ・オフ・＠ヅイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｅ
、 Ｎａｊ １． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）
８４ ：３３６５ （＋９８７）ｉｏ細胞は平板培養の
１時間後に試験（２，た。 対照ＣＯ８細胞は、ＣＤ８に対する抗、体をｎするＣＤ
８−１−ランスフェクト細胞の免疫蛍光標識化の後は実
質的に丸かった。ＧＡＰ−４３１−ランスフェクト細胞
において、ＧＡＰ−４３免疫反応性は、細胞の約５〜２
０％において顕著であり、トランスフェクンヨン効率に
依存した。あるＧＡＰ−４３は、細胞質ゾル画分と膜画
分を比較するウェスターンプロット分析によって確認し
た観察のごとく、膜連結性のようであった。 高レベルのＧＡＰ−４３を発現する細胞はそれらの細胞
周界から突起を伸延している多くの細胞を有する独特の
構造を有していた。これが対ＧＡＰ−４３抗体による細
胞表面の良好な可視化によらなかったことを確認するた
めに、すべての細胞の表面をローダミン処理した麦芽凝
集素によって標識化した。ＣＤ８４ランスフエクト細胞
、偽トランスフェクト細胞（ｍｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｅ
ｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）、またはＧＡＰ−４３を発現し
なかった同一のＧＡＰ−４３トランスフ工クト皿におけ
る細胞は、短いまたは単一の突起を生じたが、これらの
伸延突起を有していなかった。長く細い突起は、高いレ
ベルのＧＡＰ−４３発現たけに関連していると思われた
。高いレベルのＧＡＰ−４３発現と突起成長の同様の関
係か、ポリオーマＴ抗原を発現する３Ｔ３細胞、ｗｏｐ
細胞［ペイル（Ｖａｌｌｅ）ら、Ｍｏ１Ｃｅ１１．Ｂｉ
ｏｌ、 Ｉ：４１７ （１９８１）］を］ＣＤＭ８−
ＧＡＰ１ＣＤ−−マ複製開始を含むＧＡＰ−４３発現ベ
クターによってトランスフェクトした場合、見つかった
。これらの−時的トランスフェクションアッセイにおい
て、トランスフェクションの効率および発現のレベルは
共に変化し、該効果の定量化を困難にする。 定量化の問題点を解決するために、構成的にＧＡＰ−４
３を発現する一連の安定に形質転換されたクローンＣＨ
Ｏ細胞系を得た。平板培養の３０分後の対照細胞系は、
−船釣に丸かった。ＧＡＰ４３発現系において、ＧＡＰ
−４３発現は、突起伸延と明らかに関連していた。ＧＡ
Ｐ−４３を発現する多くの細胞は、狭くかつ長さ２０〜
７５μｍの糸状足突起を伸延した。対照およびＧＡＰ４
３を発現する細胞系の両方において、周界は、しばしば
、幅広く、細く、ひた飾りのあるラメリボデイラムを含
んでいた。 Ｃａ−Ｐ○４共沈法およびＧ４１８選択法によってＣＨ
Ｏ細胞にＣＤＭ８−ＧＡＰおよび不オマインン耐性発現
プラスミドを共トランスフェクトすることによって、Ｇ
ＡＰ−４３を構成的に発現するクローン細胞系を樹立し
た［マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラ
ー・クローニングニア・ラボラトリー−７ニユアル（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ハーバ−・ラボラ
トリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−ニ
ューヨーク （１９８２）］。対照のトランスフェクト
した細胞において、ＣＤＭ８−ＧＡＰの代わりに、プラ
スミドｐＣＤＭ８［シード（３ｅｅｄ、 Ｂ、 ）、不
イチャ（Ｎａｔｕｒｅ） ３２９：８４０ （１９８７
）］を用いた。細胞が密集した後、これらをトリプシン
で継代し、ポリＤ−リシンー塗布したグラスカバースリ
ップ上で平板培養した。 突起形成は、対照プラスミドによってトランスフェクト
した４つの独立系、およびウェスタンプロット法によっ
て測定した最大量のＧＡＰ−４３を発現する４つの独立
系から評価した。ノマルスキー光学系の使用によって、
生きている細胞を試験した。ＧＡＰ−４３免疫反応性を
有する全ＣＨ○細胞系は、対照細胞系よりも突起を伸延
させる傾向にあった。さらに、ＧＡＰ−４３を発現する
細胞は、対照セルライン（０，５％〜１％）と比較する
としばしば複数の突起を有しており（細胞の６％〜１１
％の間の範囲）、該突起の長さは対照細胞のものよりも
長かった。 したがって、ニューロン蛋白ＧＡＰ−４３はこれらの非
ニューロン細胞の形状変化をひき起こす。 細胞突出が成長円錐に似ているように、糸状足およびラ
メリポデイラムは細胞体幹から直接伸延する。 非ニューロン細胞において、ＧＡＰ−４３は、その正常
な生物学的情況から取り出され、調節されていない形態
で発現されるので、ここで観察された変化は、そのニュ
ーロン情況におけるＧＡＰ４３の効果を疑似しない。し
かしなから、実際に、ＧＡＰ−４３は、成長円錐におい
て豊富であるという点で、成長円錐機能に関連しており
［カッツ（Ｋａｔｚ、 Ｆ、 ）ら、ジャーナル・イン
・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ５
：１４０２ （１１８５） ：デグラーン（ＤｅＧｒａ
ａｎ、 Ｐ、 Ｎ、 Ｅ、 ）ら、ニューロサイエンス
（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） ６１：２３５ （１９８５）
；メ・ｆす（Ｍｅｉｒｉ、 Ｋ、 Ｆ、 ）ら、プロ
シーデインゲス・イン・ナショナル・アカテミー・イン
・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｅｉ、 ＵＳＡ） ８３：３５３７
（１９８６） ；スキーニ（Ｓｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ，
Ｐ、 ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３ニア
３８ （１９８６）］、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖ
ｉｔｒｏて軸索を伸延しているニューロンにおいて最高
レベルであり［スキーニ（Ｓｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ，Ｐ
、 ）ら、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー（Ｊ
、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、） ８９：８６（１９８１）、
ベノウ°イッツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ、 Ｖ、 Ｅ、 ）
ら、ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、） １°
３００ （１９８１） ；メイリ（Ｍｅｉｒｉ、 Ｋ、
Ｆ、 ）らジャーナル・イン・ニューロサイエンス（
Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ） ８：２５７１ ；ベノ
ヴイッツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ、 Ｌ、 １． ）ら、Ｔ
、１．Ｎ、Ｓ、 １０：５２７ （１９８７）Ｅ、上
記のように、ＮＧＦに暴露したＰＣＩ２細胞で増加し、
神経突起成長を伴うという証拠かある。 本発明者らは、特定の理論によって結び付けようとする
ものではないか、これらのテークの１つの解釈は、ＧＡ
Ｐ−４３、ニューロン特異性分子はこれらの細胞に全く
新規なニューロン様構造を−Ｉｊえることかてきること
である。別の説明は、ＧＡＰ’−４３が細胞の形状を制
御するより一般的なメカニズムに関係するということで
ある［プレイ（Ｂｒａｙ、 Ｄ、 ）ら、サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３９：８８３ （１９８８）ニス
ミス（Ｓｍｉｔｈ、 Ｓ、 Ｊ、 ）、サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）２４２ニア０ｇ （１９８ｇ）’］。 多くの細胞は、糸状足またはラメリポディアを伸延する
ことができ、これは、細胞サイクルの相、平板培養条件
、および第２メソセン／ヤー〇レベルを含めたいくつか
の因子に依存する傾向にある［オールレッド（Ａｌｌｒ
ｅｄ、 Ｌ、 Ｅ、 ）ら、サーフエイ／ズ・イン・ノ
ーマル・アンド・マリグナント・セルズ（Ｓｕｒｆａｃ
ｅｓ ｏｆ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｍａｌｉ
ｇｎａｎｔ Ｃｅ１ｌｓ） ノ＼イネス（Ｒ，０
，Ｈｙｎｅｓ）編（ジョー７・ウィリー・アンド・サン
ズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ）、ニュー
ヨーク、１９７９）、ｐ、２１］。この理由で、まさに
同一の厳格な平板培養条件下で細胞を検査した。細胞に
突起を伸延さセることを可能とする細胞メカニズムは複
雑であり、すへての細胞に存在すると思われる要素を含
んでいる。したかって、成長円錐の突起と線維芽細胞の
突起との類似性は、驚くへきことではない。実際、成長
円錐構造□は、細胞運動を与える一般的な方法として用
いられることができる皮質のアクチンの流動および選択
的付着のような細胞メカニズムを利用することか示唆さ
れている［プレイ（Ｂｒａｙ、 Ｄ、 ）ら、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３９：８８３ （１９８８）
ニスミス（Ｓｍｉｔｈ、 Ｓ、 Ｊ、 ）サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４２ニア０８ （１９８８）］
。ＧＡＰ−４３がこのような機構といかに関連するかを
判断するかが残されている。 実施例■ 新規な膜ターゲノテイングペプチトの同定さらにもう１
つの本発明の態様において、ＧＡＰ−４３蛋白は、該Ｇ
ＡＰ−４３蛋白を細胞膜、特にニューロン細胞の成長円
錐の領域へ定方向化する新規な膜−ターケ、テイングペ
プチドトメインを含有することが判明した。この膜ター
ゲツティングドメインの構造を決定し、該ペプチドは、
（通常は膜連結ではない）通常は細胞質ゾルの蛋白を細
胞膜へ定方向化するのに有効であることか示された。 本発明の本態様の組成物および方法により、とりわけ、
通常は膜連結ではない蛋白を包含する所望の蛋白のいず
れも細胞膜へ定方向化することか可能である。さらに、
本発明の本態様の組成物および方法は、動物において、
神経学的損傷および障害のｉｎ ｖｉｔｒｏ、 ｉｎ
ｖｉｖｏ、およびｉｎ ５ｉｔｕ治療処置で利用できる
のは明らかである。 はとんどの膜連結蛋白は細胞膜と直接インターカレート
する高疎水性ドメインを含有することはよく知られてい
る。しかしなから、驚くへきことに、ＧＡＰ）−４３は
、細胞膜に連結し、特に発育または再生するニューロン
細胞の成長円錐と連結しているか、かかる高疎水性領域
を欠くことか発見された。 今や、第２図に示すごとく、ＧＡＰ−４３蛋白は３つの
エクソンにてコード付けされることか発見された。短い
（１，０個のアミノ酸残基）アミノ末端エクソンは、驚
くべきことに、膜−ターケノテイングペブチドドメイン
をコード付けすることか発見された。第２のＧＡＰ−４
３エクソンの大部分を除去した実験は残りの蛋白の膜結
合に影響を与えなかった。同様に、ＧＡ、Ｉ”４３のカ
ルボキシ末端の置き換えは膜結合に影響しないことが判
明した。しかしながら、最初の４個のアミノ酸（ＭＥＴ
ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳ）を欠き、第５位のＭＥＴで開
始する合成ＧＡＰ−４３遺伝子はニューロンまたは非ニ
ューロン宿主細胞の膜に結合せず（第１１図）、これは
最初のエクソンはこの膜−ターケラティング機能の原因
であることを示す。 「膜−ターゲツティングペプチド」とは、以下の ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳ ＭＥＴ ＡＲＧ Ａ
ＲＧ ＴＨＲＬＹＳ ＧＬＮまたはその機能的誘導体の
いずれのアミノ酸配列もを意味し、それは、所望の蛋白
またはペプチドのアミノ末端またはその近くに結合した
場合、該蛋白またはペプチドの細胞膜への定方向化に影
響するであろう。 本発明の膜−ターゲツティングペプチドは、手動による
、または好ましくは自動方法による直接合成を包含する
がそれに限定されることのないよく知られた方法によっ
て所望の蛋白またはペプチドに結合させることかできる
。本発明の膜−ターゲツティングペプチドを所望の蛋白
またはペプチドに結合させる別の好ましい方法は、当該
所望の蛋白またはペプチドをコード付けする遺伝子を、
発現された遺伝子産物がそのアミノ末端に膜−ターゲツ
ティングペプチドを含むように修飾することを含む。こ
れは、本明細書中に記載するごとく、平滑末端または粘
着末端を結ぶ方法によって達成されるが、それらに限定
されるものではない。 かくして、もう１つの態様において、本発明は、ヌクレ
オチド配列 ａｔｇ ｃｔｇ ｔｇｃ ｔｇｔ ａｔｇ ａｇａ ａ
ｇａ ａｃｃ ａａａ ｃａｇまたはその機能的誘導体
よりなる膜−ターゲツティングトメインについてコード
付けするｃＤＮＡを提供するものである。 勿論、遺伝子暗号の縮退のため、所望の結果をなお達成
させつつヌクレオチドを変化させることは可能である。 同様に、当業者ならば、ある種の例においては、発現か
特定の宿主において考えられる場合、好ましいコドン使
用のため、ヌクレオチドを変更するのか望ましいことを
理解するであろう。これらのおよび他のかかる修飾は本
発明の範囲内のものであると考えられる。 さらにＧＡＰ−４３膜−ターゲツティングトメインを明
らかとするために、（ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、
およびＣＨＯ細胞を包含する）非ニューロン細胞オヨび
ニューロン細胞（ＰＣ１２細胞）を、突然変異が３位（
Ｃ３）および４位（Ｃ４）のシスティンのヌクレオチド
配列に導入されたＧＡＰ−４３遺伝子を含有するプラス
ミドで形質転換して、代わりに、それらの位置において
アラニンを発現させた（第１１図）。 Ｃ３またはＣ４いずれかの突然変異の結果、膜結合か大
いに減少することか判明した。最も顕著な効果はＣ４を
変更した場合に観察された。Ｃ３およびＣ４の両突然変
異は当該現象を完全に排除した。この効果のメカニズム
は明らかでないが、それらの位置における酸化状態の単
純な変更に関係しないことは明らかである。というのは
、酸化還元実験は膜結合を変化させなかったからである
。 さらに、最初の４個のアミノ酸（ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹ
ＳＣＹＳ）を欠き、５位のＭＥＴで開始する合成ＧＡＰ
４３遺伝子を構築した。発現された蛋白はニューロンお
よび非ニューロン宿主細胞の膜に結合しなかったく第１
１図参照）。これは、最初の４個のアミノ酸か膜結合に
必要であることを示す。以下で考察するように、通常は
細胞質ゾルの蛋白での実験では、１０個のアミノ酸ペプ
チドで明らかに十分であることか証明された。予備デー
タは、最初の４個のアミノ酸でも膜結合に対し十分であ
ることを示す。 かくして、もう１つの具体例において、本発明は、 ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳよりなるア
ミノ酸配列またはその機能的誘導体よりなり、その配列
は、所望の蛋白またはペプチドの膜結合を可能とするた
めに、当該所望の蛋白またはペプチドのアミノ末端に結
合させることができる。 さらに、エクソンｌの最初の５，６．７．８または９個
のアミノ酸を包含するペプチドは、所望の蛋白またはペ
プチドに結合させた場合、膜結合を可能とするであろう
。当業者ならば、特定の適用における膜結合を指令する
これらの中間的長さのペプチドの十分性は単にルーチン
的技量の努力によって判断できることを理解するであろ
うし、これは本発明の教示の利点でもある。従って、そ
れと同一のもの、およびそれらと同等のものは、本発明
の範囲内のものである。 追加の実験において、前記した最初のＧＡＰ４３エクソ
ンを、通常は細胞質ゾルであり、膜連結性ではない蛋白
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）をツー１−付けする遺伝子のアミ／末端に結んた
。この配列を含有するプラスミドを用いてニューロンお
よび非ニューロン細胞をトランスフェクトした（第１１
図）。免疫蛍光アッセイにより、発現されたＣＡＴ蛋白
は、トランスフェクトした細胞において膜連結性である
ことか明らかとなった。これは、最初のＧＡＰ−４３エ
クソンのアミノ酸は所望の蛋白またはペプチドの膜ター
ケノティングを達成するのに十分であることを示す。 さらに、実験により、ＧＡＰ−４３の最初の４０個のア
ミノ酸は、トランスフェクトされたＰＣ１２細胞におけ
るＧＡＰ−４３と同位置へｃＡＴを定方向化することか
示された。これらの細胞は、成長円錐によって傾いた長
い突起を引き出す点てニューロン細胞に似ている。ＧＡ
Ｐ−４３は、通常、特にニューロン細胞成長円錐で豊富
であり、テークは、本発明の膜〜ターケノテイングペプ
チ１−はこの観察された成長円錐富化の原因であること
を示唆する。 さらに、本明細書中に記載した選択的な成長円錐蓄積現
象を明確とするために、本発明者らは、Ｇ Ａ Ｐ −
４３およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＣＡＴ）を包含する融合蛋白の突然変宥分析お
よびレーづ一走査共焦鏡検を使用した。その結果、ＧＡ
Ｐ−／１３アミノ末端の短いストレッチは成長円錐膜、
特に糸状足における蓄積を指令するのに十分であること
が確認された。レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）ペプチ
ドに融合した種々の量のＧ Ａ Ｐ−４，３アミノ末端
をコード付けする構築体をＣＯ８およびＰＣ１２細胞で
発現させた。クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡ Ｔ）は真核生物細胞で発現された場合
には細胞質ゾルであって、非常に安定であるので、レポ
ーターペプチドとして選択した。完全なＣＡＴ蛋白に対
しアミノ末端に融合したＧＡＦ）４３の最初ノ１０個ノ
ア 、： ／酸ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱの融合蛋白（ＧＡ
Ｐｌ ０ＣＡＴ） 、まタハｃＡＴに融合したＧＡＰ−
４３の最初の４０個のアミノ酸の融合蛋白（ＧＡＰ４０
ＣＡＴ）をコード付けするプラスミドを構築しまた。 免疫プロット法を以下のごとくに行った ＣＡゴに融合
したＧＡＰ−４３のアミノ末端を有するキメラ蛋白はＣ
Ｏ８細胞膜に連結する。ＣＡ、 Ｔ、ＧＡＴｌ ０ＣＡ
ＴおよびＧＡＰ４ｏＣＡＴはＣＯ８細胞て一時的に発現
された。抗−ＣＡＴ抗体を用い、各トランスフェクショ
ンからの膜（Ｍ）および細胞質ゾル（Ｃ）画分の免疫プ
ロットを調製した。ＣＡＴ−１−ランスフェクトされた
細胞において、免疫反応性は細胞質ゾル画分てのみ発見
され、精製したＣＡＴ蛋白と共に移動する。免疫反応性
のはとんとすべては膜連結性であり、ＣＡＴよりも大き
い分子１ｉ４０００または１０００を有する融合蛋白に
ついて予期されるごとく、ＣＡＴよりもゆっくりと移動
する。１１６．８４．５８．４８５．３５６および２６
６キロクルトンの分子量標準を用いた。 ＧＡＰおよびＧＡＰ４０ＣＡ、Ｔの膜連結をＣＰ１２細
胞で評価した。本明細書中に記載するごとくに、ＣＡＴ
、、ＧＡＰ４０ＣＡＴ、またはＧＡＰを発現する安定に
トランスフェトされたＰ ＣＩ ２細胞を選択した。膜
（Ｍ）および細胞質ゾル（Ｃ）画分の免疫プロットを抗
−ＣＡＴまたは抗−ＧＡＰ抗体で染色した。ＣＡＴ−ト
ランスフェクトされた細胞（ＣＡ Ｔ）は細胞質ツル中
で免疫反応性全含有していたが、膜画分中では含有せず
、この免疫反応性ＣＡＴは精製したＣＡＴと共に移動し
た。対照的に、ＧＡＰ４０ＣＡＴトランスフェクトされ
た細胞（Ｇ４０ＣＡＴ）は、よりゆっくりと移動する膜
一連結ＣＡＴ免疫反応性を含有していた。ラット脳（Ｂ
Ｒ）からの画分は、すべてではないが、はとんどの内
因性ＧＡＰ−４３免疫反応性は膜一連結性であることを
示した。ＧＡＰ４３を過剰発現するトランスフェクトＰ
ＣＩ２細胞においては、ＧＡＰ−免疫反応性のほとんど
すべては膜一連結性であり、精製したＧＡＰ−４３と共
に移動した。 ＧＡＰ−４３発現プラスミドｐＧＡＰにおいて、ＧＡＰ
−４３をコード付けする配列はソート・ビイ（Ｓｅｅｄ
、 Ｂ、 ）、不イチ＋ （Ｎａｔｕｒｅ）３２９
： ８４Ｃ）−８４６（１９８７）によって記載されて
いるＣＤＭ８プラスミドのＸｂａ １部位でスタファ−
（ｓｔｕｆｆｅｒ）を置き換えた。本明細書中で記載す
るごとく、挿入されたＧＡＰ−４３配列は、翻訳のスタ
ートのＮｌａ ■部位から終始コドンから６ｓｂｐ部
位下流の５ａｕ３Ａ１部位までのラットＧＡＰ−４３の
全コーディング配列を包含していた。ＣＡＴ発現プラス
ミドｐＣＡＴについては、ＣＡＴコーディング配列およ
びｐＳＶ２ＣＡＴ（ボルマン・シイ・エム、モファート
・エル・エフおよびホワード・ビイ・エイチ（Ｇｏｒｍ
ａｎ、 ｃ、 Ｍ、 、 Ｎｏｒ ｆａｔ。 Ｌ、 Ｆ、 ＆ Ｈｏｔｖａｒｄ、 Ｂ、 Ｈ，）、モ
レキュラー・アンド・セリュシー・バイオロジー（Ｍｏ
１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ）２ ：１０４４−１
０５１ （１６８２）からのポリアデニル化部位を含有
するＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ断片はスタファ−
（ｓｔｕｆｆｅｒ）およびポリアデニル化部位を含有す
るＣＤＭ８のＨｉｎｄＩＩｌないしＢａｍＨＩ断片を置
き換えた。 ｐＧＡＰｌｏＣＡＴおよびｐＧＡＰｌ ０ＣＡＴは、ポ
リリンカーの使用によってｐＣＡＴにおけるＣＡＴとイ
ン・フレームにて融合した、各々、ＧＡＰ−４３の最初
の４０個または１０個のアミノ酸を包含する。ＣｏＳ細
胞の一時的トランスフェクションについては、ＤＥＡＥ
デキストランおよびクロロキンを、記載されているごと
くに用いた（ツバ−・エム・エックス、シンプソン・イ
ー・アールオヨヒウォーターマン・エム・アール（Ｚｕ
ｂｅｒ、 Ｍ、 Ｘ、 、 Ｓｉｍｐｓｏｎ、 Ｅ、
Ｒ，＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、 Ｍ、 Ｒ，）、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３４ ： １２５８〜１２６１
（１９８６））。ＰＣＩ２細胞の安定なトランスフクシ
ョンのために、１：１０の比にて注目するプラスミドで
共トランスフェクトしたネオマイシン耐性プラスミドを
本明細書中に記載したごとくに用いた。ＰＣＩ２細胞の
選択の間に、４００μｇ／ｍＱの活性ジエネティチン（
Ｇｅｎｅｔｉｃｊｎ）（ジフコ（ＧＩＢＣＯ））を用い
た。ＰＣ１２細胞の一時的トランスフェクションは、３
００ボルトおよび９６０マイクロフアラツドを用い、バ
イオ−ラド・インコーポレイション（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
Ｉｎｃ、）の電気穿孔システムでの電気穿孔によって行
った。８時間後、培地を変えた。電気穿孔の２４時間後
、５０ｎｇ／ｍ（ｌＮＧＦの存在下、ポリーＤ−リジン
ー被覆カバーカラス上で細胞を平板培養し、２４時間後
に分析した。 免疫化学アッセイのために、ラットＧＡＰ−４３のａａ
ｌないし２４、ａａ３５ないし５３、ａａ５３ないし６
９、およびａａ２１２ないし２２８を包含する４種のペ
プチド類に対してウサギを免疫化することによってウサ
ギ抗−ＧＡＰ−４３抗体を作製した。抗−ＧＡＰ−４３
抗体をＧＡＰペプチド寒天上でアフィニティー精製した
。臭化シアン法によってアガロースにカンブリングさせ
た各ペプチドの１０ｍｇ／ｍ（！を含有する樹脂に抗−
ＧＡＰ−４３抗体を結合させ、ｐＨ３，５で抗体を溶出
させた。ウサキ抗−ＣＡＴ抗体は５プライム（Ｐｒｉｍ
ｅ） ３プライム（Ｐｒｉｍｅ） ・インコーボレイ
テ、ドから入手した。第２の抗体はオルガノン・テクニ
カ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ） 、ンヤクソン
。 イミュノロンカルズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌｓ）、およびベクター・ラブダ（Ｖｅｃｔ
ｏｒ １ａｂｓ）から得た。 細胞の分画については、ＣＯ８またはＰＣＩ２細胞をｌ
ｏｏｒｎｍの密集したベトリ皿から掻き取り、２０００
ｘｇにて１０分間ペレ／ト化した。 該ペレット化細胞を１０ｍＭトリス−ＨＣρ、ｌｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ７，６（３００）ｌ（！／皿）中のポ
リトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）によってホモン不−ｊ・
し、４°Ｃ，２５０，ＯＯＯｘｇにて３０分間遠心した
。 上澄みを細胞質ゾル画分として収集した。該ベレットを
同緩衝液中のホモジネート化および遠心によって洗浄し
、次いで、細胞質ゾル画分として再懸濁して同容量とし
た。ラット脳を１日令ラットから得、１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ２．１ｍＭ ＥＤＴＡ。 ｐＨ７，６（１０ｍ（！／ダラム湿潤重量組織）中のポ
リトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）によってホ不ジ不−卜し
た。細胞抽出物について記載したごとく、遠心によって
、細胞質ゾルおよび洗浄した膜画分を調製した。アンタ
ーソンら（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ）（バイオケ
ミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ２２ ：
４６１５−４６１８（１９８２））の方法の変法によっ
てＧＡＰ４３蛋白をラット脳から精製し、免疫染色につ
いての陽性対照として用いた。細胞質ゾルまたは膜画分
の同容量（通常１００μＱ）をポリアクリルアミドゲル
上の電気泳動に付した（レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネ
イチャ（Ｎａｔｕｒｅ）２２７ ： ６８０−６８５（
１９７０））。蛋白を電気泳動的にニトロセルロースに
移し、過剰の部位を４％ＢＳＡてブロックした。 次いで、４０μｇ／ｍ（ｌアフィニティー精製の抗ＧＡ
Ｐで、または抗〜ｃ Ａ Ｔ抗体の１：１０００希釈で
、４°Ｃにて、膜を２４時間インキュベートした。製造
業者の指示に従い、抗−ウ廿キ・ヘクタステインＯ’ｅ
ｃｔａｓｔａｉｎ）ホースラティッ／ユベルオキシタ゛
−セ法を用い、結合した抗体を検出した。ベルオキンダ
ーセ基質としては、テトラメチルヘンンジン（キルケガ
−１” （Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ）およびペリイ（Ｐｅ
ｒｒｙ）、カイセルスブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）、メリーラント州）を使用した。 免疫プロｙｔ４により、ＣＯ８細胞またはＰ Ｃ１２細
胞で発現されたＣＡＴは細胞質ゾル画分にのみ存在する
ことが明らかとなった。対照的に、キメラ蛋白ＧＡＰ
１０ＣＡＴおよびＧＡＰ４０ＣＡＴは膜連結性である。 融合蛋白は洗剤によって抽出されるか、塩化すトリウム
、塩化カルシウム、またはＥＧＴＡによっては抽出され
ない。かくして、この膜結合の性質はう、ト脳中におけ
る天然ＧＡＰ−４３の性質と同様である（ペロー不−ビ
ゾセ口・エヌ・アイ、ワイ不ル・テ゛イ、ハウサー・シ
イおよびベノビ、ツ・エル・アイ（ＰｅｒｒｏｎｅＢｉ
ｚｚｏｚｅｒｏ、 Ｎ、 １． 、 Ｗｅｉｎｅｒ、
Ｄ、 、 Ｈａｕｓｅｒ、 Ｇ、 ＆ Ｂｅｎｏｗｉｔ
ｚ。 Ｌ、１．）、ジャーナル・イン・ニューロサイエンス・
リサーチ（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ｒｅｓ、） ２０
：３４６−３５０（１９８８）；エストライヘル・エイ
・ビイ、パン・ドンゴン・シイ・シェイ、ツビールス・
エイチおよびジスベン・タブリュー・エイチ（Ｏｅｓｔ
ｒｅｉｃｈｅｒＡ、Ｂ、、Ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ、Ｃ，
Ｊ、、Ｚｗｉｅｒｓ、ＨＪ＋ Ｇ１５ｐｅｎ、Ｗ、Ｈ，
）、ジャーナル・イン・二ニーロケミスドリー（ＪＮｅ
ｕｒｏｃｈｅｍ、）４１ ： ３３１−３４０（１９８
３）；シャン・ニス・シイ、ムラカミ・ケイおよびロウ
テンベルグーｘイ（Ｃｈａｎ、Ｓ、Ｙ、、 Ｍｕｒａｋ
ａｍｉ、に、＆Ｒｏｕｔ ｔｅｎｂｅｒｇ、 Ａ、）、
ジャーナル・イン・ニューロサイｘ）７ス（Ｊ、Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ、）６ ： ３６１８−３６２７（１９８６
）＋スケ不・ジェイ・エイチ・ビイおよびビラグ・アイ
（Ｓｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ，Ｐ、 ＆ Ｖｉｒａｇ）、
ンヤーナル・イン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ
Ｂｉｏｌ、）１０Ｂ・６１：３−６２４（１９８９）
）。 アミノ末端かニューロン細胞におけるＧＡＰ４３の成長
円錐富化を説明するか否かを判断するために、ＰＣＩ２
細胞のＮＧＦ−処理トランスフェクト体におけるＧＡＰ
−４３およびＧＡＰ−ＣＡＴキメラ蛋白の細胞分布を共
焦鏡検によって調べた。このアッセイによると、ＧＡＰ
）−４３は成長円錐か顕著に豊富な斑点状パターン、ニ
ューロンにおける天然ＧＡＰ−４３のものと同様のパタ
ーンで分布するのに対し、ＣＡＴは細胞質ゾルのままで
ある。ＣＡＴに融合したＧＡＰ−４３のアミノ末端は、
得られた融合蛋白をしてＧ Ａ Ｐ−４３自体の分布に
非常によく似た分布を獲得せしめた。 ＧＡＰ−４３およびキメラ蛋白双方の核周囲標識は低レ
ベルで検出され、これは天然ＧＡＰ−４３で観察された
ように（パン・ホー７・シイ・オー・エム、ホルスイス
・シイ・エム、エストライヘル・エイ・ビイ、フーンス
トラ・／Ｊ、イ、デ・グラン・ビイ・エヌ・イーおよび
ノスペン・ダブリュー・エイチ（Ｖａｎ Ｈｏｏｆｆ’
、Ｃ，Ｏ，Ｍ、、 ）ｌｏｌｔｈｕｉｓ、 Ｃ，Ｍ
Ｏｅｓｔｒｅｉｃｈｅｒ、 Ａ、 Ｂ、 、 Ｂｏｏｎ
ｓｔｒａＪ、 、 Ｄｅ Ｇｒａａｎ、 Ｐ、 Ｎ、
Ｅ＆ Ｇ１５ｐｅｎ、 Ｌ Ｈ，Ｊ、 ）、ンヤーナル
・イン・セル・バイオロジー（Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏ
ｌ、）１０８ ： １１１５＋〜１１２５（１９８９）
）、コルジへの局在のためであろう。グルタルアルデヒ
ド固定により、成長円錐の細い突起の良好な組織保存か
なされ、キメラ蛋白は特に糸状定向に蓄積することが明
らかとなった。 トランスフェクトしたＰＣ１２細胞におけるＣＡＴ、Ｇ
ＡＰ−４３および融合蛋白の細胞下位置決めは以下のご
とくに行った：ＰＣ１２細胞にお、ける（Ａ）ＣＡＴ、
（Ｂ）ＧＡＰ−４３、（Ｃ）ＧＡＰ４０ＣＡＴ、および
（Ｄ）ＧＡＰｌ ０ＣＡＴの共焦免疫蛍光により、ＧＡ
Ｐ−４３は斑点状で膜に局在し、成長円錐でいくらか豊
富であるのに対し、ＣＡＴ標識は散漫で細胞質ツルであ
ることか明らかとなった。アミノ末端の４０個のアミノ
酸（ＧＡＰ４０ＣＡＴ）または１０個のアミノ酸（ＧＡ
ＰｌｏＣＡＴ）いずれかをＣＡＴに融合させた場合、免
疫蛍光の分布は、成長円錐での富化を含めてＧＡＰ−４
３についての分布に似ていた。固定に先立ち、すべての
細胞をＮＧＦで２４時間処理した。 ＧＡＰ−４３については抗−ＧＡＰ−４３抗体を用いた
のに対し、ＣＡＴ、ＧＡＰ４０ＣＡＴおよびＧＡ、Ｐｌ
ｏＣＡＴについては抗−ＣＡＴ抗体を用いた。この変異
体の対照ＰＣ１２細胞は検出不可能なレベルのＧＡＰ−
４３およびＣＡＴ免疫反応性を発現した。５０μｇ／ｍ
Ｑの神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下で、免疫蛍光の２
４時間前に、ＰＣ１２細胞をポリーＤ−リジン被覆カバ
ーガラスに移した。３．７％ホルムアルデヒドで７分間
固定し、０１％トＩノトンーＸ−１００を３分間浸透さ
せた。試料をＰＢＳ中の４％ＢＳＡで１時間ブロックし
、−次抗体中で１時間インキュベートし、ＰＢＳてすす
ぎ、ＰＢＳ中の０．３％Ｈ，−０゜にて１５分間インキ
ュベートして（バックグラウンドを減少させ）、再度す
すぎ、二次抗体中で１時間インキュベートした。ＰＢＳ
て数回洗浄した後、カバーガラスを水ですすぎ、０，４
％没食子Ｍｎ−プロピルを含有するケルバトール（Ｇｅ
ｌｖａｔｏｌ）て処理して逝色を減少させた。細胞か特
異的抗原を含有しない場合、または−次または二次抗体
が省略された場合、免疫蛍光はバックグラウンドを超え
ては検出できなかった。 抗−ＣＡＴ抗体で標識し、／マルスキイ（Ｎｏｍａｒｓ
ｋｉ）のオプティックス・アンド・スキャンニング・コ
ンフォーカル・イミュノフルオレセンス（ｏｐｔｉｃｓ
ａｎｄ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍ
ｍｕｎ。 ｆ １ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）法で観察したＧＡＰ４０
ＣＡＴを発現するＰＣＩ２細胞の高出力比較を用いて、
ＰＣＩ２細胞の成長円錐内のＧＡＰ４０ＣＡＴの局在を
証明した。細胞はＮＧＦて７日間処理したものであった
。１の大きな成長円錐は明るく標識されて見えたが、小
さなものはそうてはながった。 たとえ同一の細胞であってもその異なる成長円錐で同等
でない標識がニューロン中の天然ＧＡＰ４３て起こる（
コスリン・ケイ、シュレイヤー・ティ・ジェイ、スケ不
・ジェイ・エイチ・ビイおよびバンカー・シイ（Ｇｏｓ
ｌｉｎ、 Ｋ、 、 ５ｃｈｒｅｙｅｒ、 Ｄ、 Ｊ、
。 ５ｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ，Ｐ、 ＆ Ｂａｎｋｅｒ、
Ｇ、 ）、不イチャ（Ｎａｔｕｒｅ）３３６ ： ６７
２〜６７４（１９８８））。ノマルスキイ（Ｎｏｍａｒ
ｓｋｊ）および免疫蛍光の像の比較により、糸状足は特
に標識されることか示された。同様の結果かＧＡＰ Ｉ
０ＣＡＴについて観察された。 高分解能共焦鏡検については、糸状足の細かい構造を保
存するのに必須の新たに作成した４％バラホルムアルデ
ヒドおよび０．５％グルタルアルデヒド、続いて、０１
％トゾトンーＸ−１００で３分間、ＰＢＳ中の２ ｍ
ｇ ／ ｍσホウ水素化ナトリウムで１０分間細胞を固
定した。共焦分析では、バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）の
ＭＲＣ−５００走査型共焦イメーンングンステムおよび
ツェイス・アキンオプラン（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌ
ａｎ）顕微鏡を使用した。 これらの実験は、ＧＡＰ−４３の最初の１０個のアミノ
酸が成長円錐蓄積を指令するのに十分であるという本発
明者らの驚くべき発見を確認するものである。本発明者
らは、成長円錐膜中に蓄積する少なくとも１の他の非細
胞膜内蛋白５ＣＧＩＯ（スティン・アール、モリ・エヌ
、マチユーズ・ケイ、ロー・エル・シイおよびアンター
ソン・ティ・シエイ（Ｓｔｅｉｎ、 Ｒ，、Ｍｏｒｉ、
Ｎ、 、 Ｍａｔｔｈｅｗｓ、 Ｋ、 、 Ｌｏ、
ＬＣ，＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、ＤＪ、）、ニーニーロン
位置２２および２４）にもかかわらず、ＧＡＰ−４３ア
ミノ末端に密接に関連する配列を有する他の蛋白を知ら
ない。 偏光をかけた上皮細胞において、異なる蛋白は、膜蛋白
および分泌蛋白の輸送をそれらの個々の目的場所に向け
て指令する信号と同様の、蛋白内の選別信号に依存する
と考えられる突起（ライフナ−・ダブりニー・ティおよ
びロデッシュ・エイチ・エフ（Ｗｉｃｋｎｅｒ、 Ｌ
Ｔ、 ＆ Ｌｏｄｉｓｈ、 Ｈ，Ｆ、 ）、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３０ ： ４００−４０７（１９
８５）；ヘルナー・ケイおよびシヤフラ・シイ（Ｖｅｒ
ｎｅｒ、 Ｋ。 ＆ ５ｃ−ｈａｔｚ Ｇ、 ）サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）２４１ ： １３０７〜１３１３（１９８８）；
フェファ−・ニス・アールおよびロスマン・シェイ・イ
ー（Ｐｆｅｆｆｅｒ、ＳＲ，＆ Ｒｏｔｈｍａｎ、 Ｊ
、 Ｅ、 ）、アヌ・レフ・バイオケム（Ａｎｎ、 Ｒ
ｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）５６ ： ８２９〜８５２（
１９８７乃を先端および基底外側原形質膜に（マｌ−１
１ン・ケイ・ニス（Ｍａｔｌｉｎ、 Ｋ、 Ｓ、 ）、
ジャーナル°イン・セル＋７’？イオロジ−（Ｊ、 Ｃ
ｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）１０３２５６５−２５６８（］
９８６）；ロンリケスホラン・イー・シェイおよびサハ
テーニ・デイ・デ４ （Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｂｏｕｌ
ａｎ、 Ｅ、 Ｊ、 ＆ ５ａｂａｔｉｎｉ、 Ｄ、
Ｄ、 ）、プロ／−ティングズ・イン・ナショナル・
アカテミー・イン・サンエンシス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）ＵＳＡ７５：５０７１
〜５０７５（１９７８）：ンモンズ・ケイおよびフレー
・ニス・ティ（Ｓｉｍｏｎｓ。 Ｌ ＆ Ｆｕｌｌｅｒ、 Ｓ、 Ｄ、 ）アヌ・レフ・
セル・ハイオル（Ａｎｎ Ｒｅｓ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ
、）１ ： ２４３〜２８８ （１９８５乃蓄積する。 上皮細胞の場合は、かかる信号は先端および基底外側と
しての原形質膜の異なる領域も認識するであろう。 ニューロンにおいては、成長円錐膜はその蛋白構造でも
区別される。１の興味深い可能性は、成長円錐膜かＧＡ
Ｐ−４３のパルミチル化アミノ末端を認識しそれを結合
させる結合部位を有することである。本発明者らはいず
れかの特定の説に拘束されるつもりはないか、パルミチ
ル化残基は脂質二層と直接相互作用するものではないら
しい。 何故ならば、それはＧＡＰ−４３についてのより均一な
膜分布を引き起こすようだからである。この線に沿って
、もう１つのアンル化蛋白の脂肪酸部位、ポリオウィル
スのＮ−ミリスチル化ＶＰ４は、Ｘ線回折によって、他
のウィルス蛋白の特異的アミノ酸残基と相互作用するか
脂質二重層とは相互作用しないことか示されている（シ
ュルツ・エイ・エム、ヘンターマン・エル・イーオヨヒ
オロスズランーエス（Ｓｃｈｕｌｔｚ、 Ａ、 Ｍ、
、 Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、 Ｌ、 Ｅ。 ＆ ０ｒｏｓｚｌａｎ＋ Ｓ、 ）、アヌ・レフ・セル
・ハイオル（Ａｎｎ、Ｒｅｓ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）
４ ： ６１１〜６４７（１９ｓｓ）；／ヨウ・エム、
ニューマン・ンエイ・エフ、フィルマン・デイ、ホグル
・ジェイ・エム、ロウランズ・デイ・シェイおよびブラ
ウン・エフ（Ｃｈｏｗ、 Ｍ、 、 Ｎｅｗｍａｎ、
Ｊ、 Ｆ、 、 Ｆｉｌｍａｎ、 Ｄ、 、 Ｈｏｇ
ｌｅ、 Ｊ、 Ｍ、 。 Ｒｏｔｖｌａｎｄｓ、 Ｄ、 Ｊ、 ＆ Ｂｒｏｗｎ、
Ｆ、 ）、ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ）３２７・４
８２〜４８６（１９８７））。ＧＡＰ４３およびＧＡＰ
−ＣＡＴ融合蛋白は非ニューロン細胞の膜に結有するの
で、同様のまたは同一の結合部位か他の細胞タイプに存
在しなければならないが、ＧＡＰ−４３はニューロン−
特異的である故に、これらの部位は恐らくは非ニューロ
ン細胞における異なる蛋白についての標的であろう。 ＧＡＰ〜４３の選別ドメインは特に糸状足における富化
を引き起こすことは注目される。電子顕微鏡検査によっ
て証明されたごとく（パン・ホーフ・シイ・オー・エム
、ホルスイス・シイ・工ｌ・、エストライヘル・エイ・
ビー、ブーンストラ参ンエイ、デ・グラーン・ビイ・エ
フ・イーおよびシスペン・ダブリュー・エイチ（Ｖａｎ
Ｈｏｏｈｈ、 Ｃ，０，Ｍ。 Ｈｏ１ｔｈｕｉｓ Ｃ，Ｍ、 ０ｅｓｔｒｅｉｃｈｅｒ
Ａ Ｂ Ｂｏｏｎｓｔｒａ ＪＤｅ Ｇｒａａｎ、
Ｐ、 Ｎ、 Ｅ、 ＆ Ｇ１５ｐｅｎ、 Ｗ、 Ｈ，
）、／ヤーナル・イン・セル・バイオロジー（Ｊ、 Ｃ
ｅｌ Ｉ Ｂｉｏｌ、 ） １０８１１１５〜１１２５
（１９８９戸、これは、これらの細胞におけるＧＡＰ−
４３の通常の位置である。トランスフェクトされたＧＡ
Ｐ−４３か本明細書中に記載するごとき糸状足を延長さ
せる非ニューロン細胞の性向を増強させる観察かあれば
、ＧＡＰ−４３の位置を特定の糸状足の運動活性と関係
付Ｉするのは興味深いであろう。 かくして、本発明は、もう］つの態様において、所望の
蛋白またはペプチドをニューロンまたは非ニューロン細
胞の股領域に導入する方法、および所望の蛋白またはペ
プチドをニューロン細胞の成長円錐領域へ定方向化する
方法を提供する。１の例示的具体例において、 （ａ） １ 、 ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳ ＭＥＴ Ａ
ＲＧ ＡＲＧ ＴＨＲＬＹＳ ＧＬＮ・Ｉｌ、 ＭＥＴ
ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳ ＭＥＴ ＡＲＧ ＡＲＧ
ＴＨＲＬＹＳＩＩｌ、 ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹ
Ｓ ＭＥＴ ＡＲＧ ＡＲＧ ＴＨＲ；ＩＶ、 ＭＥＴ
ＬＥｔｌ ＣＹＳ ＣＹＳ ＭＥＴ ＡＲＧ ＡＲＧ
；Ｖ、 ＭＥＴ ＬＥＤ ＣＹＳ ＣＹＳ ＭＥＴ
ＡＲＧ ＶＴ、 ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳ Ｍ
ＥＴ ；■ ＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹＳ ＣＹＳ およ
び■、その機能的誘導体 よりなる群から選択されるアミノ酸配列からなる膜−タ
ーケノテイングペプチトを所望の蛋白またはペプチドの
アミノ末端に結ひ９次いで、（ｂ）該膜−ターケノティ
ングトメインよりなる得られた蛋白またはペプチドを細
胞に導入することよりなり、 工程（ｂ）の得られた蛋白またはペプチドは該膜ターゲ
ツティングドメインにより該細胞の該膜へ定方向化され
ていることを特徴とする該所望の蛋白またはペプチドを
細胞の膜へ定方向化する方法が提供される。 もう１つの非限定的例示具体例において、本発明は、前
記アミノ酸配列またはそれらの機能的または化学的誘導
体よりなる膜−ターゲッティングペプチドをコード付け
するヌクレオチド配列、ならびによく知られた方法によ
るＧＡＰ’−４３以外の蛋白またはペプチド（ならびに
ＧＡＰ−４３自体）をコード付けするヌクレオチド配列
へのこれらの配列の付加、および当業者によく知られた
方法による得られた配列の原核生物または真核生物宿主
における発現を提供する。 勿論、本明細書中に記載するごとく、所望の蛋白または
ペプチドを診断用または治療用に標識することかでき、
本発明の本態様の組成物および方法の利用性は当業者に
明らかであろうし、単にルーチン的な技量の努力でもっ
て、ヒトを含めた動物において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉ
ｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ５ｉｔｕにての診断または
治療目的で容易に利用できる。 実施例■ 本明細書中に記載するごとき本発明者らの成果は、ＧＡ
Ｐ−４３調節が遺伝子発現のレベルで起こることを強く
示唆する。しかしながら、現在まで、その発現を調節し
得るシスまたはトランス作用要素については何も知られ
ていなかった。元来、その応答性を成長因子に付与する
ＧＡＰ−４３遺伝子の要素を定義し、発現の細胞制限を
引き起こし、および神経系の発育の間に該遺伝子を調節
するのは非常に興味深い。調節要素を同定するために、
ＧＡＰ−４３の全ラットゲノミックＤＮＡをクローン化
した。 従って、ゲノミックＧＡＰ−４３を単離し、そのイント
ロン−エクソン境界および転写スタート部位をマツプし
た。驚くへきことに、プロモーターはその構造かかなり
異常であり、異常なフンフォメーションを形成てきる反
復配列を含有し、いくつかの正準なプロモーター成分を
欠いている。転写は１を超える部位から開始でき、スタ
ート部位のうちいくつかは中枢および末梢神経系で異な
って利用される。 さらに、本発明者らは、ＧＡＰ−４３プロモーターが脳
−特異的核蛋白によって認識される領域を含有するか否
かを調べた。該ＧＡＰプロモーターの領域をゲル電気泳
動移動度シフトによって調べ、脳核抽出物には存在する
か肝臓核抽出物には存在しない蛋白（類）を結合させる
ドメインを同定した。結合活性は脳の成熟に伴って減少
する。結合部位は約２０ヌクレオチドのストレッチに限
定され、それはまた、脳核抽出物によるＤＮａ ｓ ｅ
保護アッセイにおいて特異的に保護されるか、肝臓抽出
物によるとそうではない。該領域はＰｏＵとして公知の
クラスのＤＮＡ結合蛋白によって認識される結合部位と
同様の配列を有する。 これらの結果は、脳−特異的核蛋白かＧＡＰ４３の上流
の特異的領域に結有することを示唆す実験手法 ゲノミッククローニングおよびマツピングクローニング
で用いたすべての方法はアウスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ
ｅｔ ａｌ）ｍ、カラント・プロトコルズ・イン・モ
レキュラー・バイオロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
）、７ヨン０ウイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｖ
ｉｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ）、出版者、（１９８７）によ
って記載されたものであった。すべての酵素は二ニー・
イングランド・バイオロジー（Ｎｃｖ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）から購入した。 ３つのＧＡＰ−４３エクソンを含有するゲ／ミ。 ククローンは、ラット・ゲノミノクＤＮＡのサイズ分画
５ａｕｌｌｌＡ部分消化物をバクテリオファージＥ Ｍ
Ｂ Ｊ、−３のＢａｍＨｌに挿入することによって構
築したライブラリーから単離した。 該ライブラリーを、まず、前記したごとく、コロニー・
プラーク・スクリーン・フィルター（テユポン（ＤｕＰ
ｏｎｔ／ＮＥＮ））、続いてのランタムに初回抗原攻撃
したＧＡＰ−４３ｃＤＮＡての標準的なプロトコルにて
スクリーニングした。エクソン■を見つけるために、該
ライブラリーを再度平板培養し、ｃＤＮＡの最も５゛領
域に相補的な３のオリゴヌクレオチド（第１４図におい
て、＃４．−６８ないし−３９・＃２ −３８ないし−
９および＃５．＋１ないし−２０）で重複リフト（ｌｉ
ｆｔ）を順次プローブした。少なくとも２のオリゴヌク
レオチドについて陽性のクローンをさらなる分析用に選
択した。種々の制限酵素でのマツピングのために、陽性
ファージからのイン＋＋−トをｐＢｌｕｅｓｃｒ １ｐ
ｔ（ストラタンーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））の５ａ
１１部位に継代クローン化した。 Ｈ−Ｄ Ｎ Ａケル （酢酸でｐＨ７゜４またはｐＨ４，０に調整した）４５
ｍＭトリス塩基を緩衝液として用い、２の２５ｃｍ長の
１．４％アカロースケルを注いた。負伺’４Ｎ 衝’ｔ
ｆ＜は５％グリセロール、０．１％フロモフェノールブ
ルーおよび０１％キシレンンアノールを含有する電気泳
動緩衝液であった。第１５図の凡例に掲げたプラスミド
ｂｓ１．５ＲＩＸ４を含有するエクソンＩの消化物をケ
ルに負荷し、２０Ｖで１６時間泳動させ、ｐＨ９のトリ
ス酢酸塩中のエチジウムブロマイドで染色し、脱色し、
写真にとった。 配列決定 供給業者（ＵＳＢ）によって記載されているごとくにシ
クエナーセ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）を用い、サンガーら
（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ）、ブロンーディングズ・
イン・ナンヨナル・アカテミー・イン・サンエンメス、
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）Ｕ Ｓ
Ａ ７４ ： ５４６３〜５４６７（１９７７）のシ
ブオキ／法によってＧＡＰ−４３プロモーターを配列決
定した。二本鎖配列決定についてはｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ、（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））お
よび−水路配列決定についてはＭ１３ベクター（メ７ン
グ（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メス・エンサイモル（Ｍｅｔｈ
、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ） １０１ ： ２０〜７ Ｂ
（１９８３））での標準的な方法によって、ｉ？７１Ｊ
のエクソンを含有するパイテリオファ−シフローンの継
代クローンを構築した。 ＲＮＡ５ｅマノビング クソーグおよびノルトンＣＫｒｉｅｇ ａｎｄ Ｍｅｌ
ｔｏｎ）、メス・エンサイモル（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、 ） １５５ ： ３９７〜４ ］ ５（１９
８７）ｉこ記載されているこ゛とくにＲＮＡ５ ｅ保護
分析を行った。該保護については、翻訳スタート部位か
ら−４７５のＸｂａ １部位から＋８３の５ｓｐ１部位
（最初のイン）−ロン中）に至るＧＡＰ−４３のケノミ
、り片をｐＳＰ７２（プロメカ（Ｐｒｏｍｅｇａ））の
Ｘｂａ ｌおよびＥｃｏＲＶ部位にクローンした。 ＲＮＡ５ｅ保護分析は翻訳スタート部位から４７／４８
、−５１１５２および一７８塩基の３種の主要ＧＡＰ−
４３転写体を示した。新生児ラットの肺、抜根神経節、
および大脳皮質から調製したｔＲＮＡ、ＲＮＡについて
保護を行った。クローンは１訳スタート部位（Ｘｂａ１
部位）から４７５塩基」−流に伸ひるものであった。過
剰疑露は、ＤＲＧとは反対に、大脳皮質にかなり豊富な
長い転写体をさらに示した。マーカーはＭＳＰｎ消化の
ｐＢＲ３２２てあった。 他のＲＮＡ５ｅ保護は、神経系の異なる領域およびＰＣ
１２細胞でＧＡＰ−４３転写体の不均質性を示すよう行
った。対照ＰＣＩ２細胞からのＲＮＡをＮＧＦ処理のＰ
ＣＩ２細胞、ｔＲＮＡ、ＤＲＧ、小脳、皮質、および海
馬から得たものと比較した。ＣＮＳ由来の ＲＮＡ試料
はＤＲＧまたはＰＣ］２細胞からの試料よりも高い割合
の長い転写体を有していた。 もう１つのＲＮＡ５ｅ保護分析において、前記したプラ
スミドをＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、ＤＮ
Ａポリメラーシークレノー断片で満たすことによって、
−２３３のＮｄｅＩ部位から＋８３の同５ｓｐ１部位の
ＧＡＰ−４３のゲノミック片をクローン化した。Ｈｉｎ
ｄｌｌ）部位を再形成した。すべての場合において、ベ
クターをＨｉｎｄｌｌｌで直線化した後、転写体をＴ７
ポリメラーゼで延長した。かくして、この部位を超えて
伸びるすべての転写体は−２３４の単一バンドとして集
まる。新生児うｙトの心臓、肝臓、肺、小脳、を髄、皮
質、海馬、および後根神経節からのＲＮＡ試料を用いた
。群としてのより長い上流スタート部位は中枢神経系組
織においてＲＮＡの重要な画分を構成していたが、後根
神経節では構成していなかった。 糀釆 ＧＡＰ−４３ゲノミック配列のクローニング前記したご
とく、ＧＡＰ−４３ｃＤＮＡから得たプローブでラット
・ゲノミソタライブラリーをスクリーニングした。放射
能標識した全長ｃＤＮＡでの最初のスクリーニングによ
り２のクラスのファージが得られ、引き続いての分析に
より、遺伝子の第２および第３エクソンに対応すること
か示された。第１のエクソンは小さく、従って、該ｃＤ
ＮＡプローブでは十分に表されていないことが判明した
ので、該ｃＤＮＡの最も５′側領域からの３のオリゴヌ
クレオチドプローブを用いるさらなるラウンドのスクリ
ーニングが、該遺伝子の５”末端を含有するクローンを
得るために必要であった。 ＧＡＰ−４３遺伝子のマツプを第１３ａ図に示し、それ
をマツプするのに用いたファージも共に表示する。該遺
伝子は少なくとも ５０ｋｂにわたり、３つの小さいエ
クソンを含有する。最初のは約８０ｂｐ（５’末端の変
異性の記載については後記参照）、第２番目のは５６５
ｂｐであって、第３番目のは６７２ｂｐであり、それら
は、各々、２４ｋｂおよび２０ｋｂを越える２つのイン
トロンによって隔てられている。 第１のエクソンはｍＲＮＡの５°非翻訳配列を含有し、
蛋白の最初の１０個のアミノ酸をコード付けする。当該
蛋白のこの短いアミノ末端領域は、前記したごとく、Ｇ
ＡＰ−４３（および異種融合蛋白）の成長円錐膜への結
合を指令する［選別配列Ｊを含有する。第２のエクソン
は蛋白バルクをコード付けし、カルモジュリン結合部位
としてアレキサンダーら（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ
ａｌ）、ジャーナル・イン・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ、ＢｉｏｌＣｈｅｍ、）、２６３ ： ７５４
４〜７５４９（１９８Ｂ）によって同定された領域を包
含する。第３のエクソンはカルホキシ末端の２８個のア
ミノ酸をコード付けし、非翻訳配列の５８７塩基および
ポリＡ付加部位を含有する。 第１３ｂ図に示したイントロン−エクソン境界は配列決
定法によって同定したものであり、コンセンサススプラ
イス部位（マウント（Ｍｏｕｎｔ）、ヌクレイツク・ア
シノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
）１０：４５９〜４７２（１９８２））に適有する。 ここに示したポリアデニル化部位はＲＮＡ５ｅ保護によ
って確認したものであり、ローインクールら（Ｒｏｓｅ
ｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ）、イー・エム・ビイ・オー（
ＥＭＢＯ）６ ： ３６４１−３６４６（１９８７）に
よって主要部位として予測されたものである。しばしば
、ポリＡ付加部位の直ぐ３”側に見い出されるフンセン
サスモチーフ（ｍｏｔｉｆ）のタンテム対（ＹＧＴＧＴ
ＴＹＹ）（？クラウヒラン（ＭｃＬａｕｃｈ １ａｎ）
、ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、＾ａ
ｉｄｓＲｅｓ、）１３： １３４７〜１３６８（１９８
５））には図中で下線を引いた。 ＧＡＰ−４３プロモーターはＨ−ＤＮＡを含有する。 遺伝子の５“領域の配列を第１４図に示す。それは、Ｔ
ＡＴＡまたはＣＡＡＴボックスを含有しないが、コンセ
ンサスＰｉｔ−１結合部位と同一である配列ＴＡＴＴＣ
ＡＴＧ（上線）を含有する。 このオクタマーはプロラクチンおよび成長ホルモンを含
めていくつかの遺伝子の転写を調節すると考えられるク
ラスの蛋白を結合させる（ホンダ−ら（Ｂｏｎｄｅｒ
ｅｔ ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）、５５：５０５〜５１
８（１９８８）；インプラノ１ムら（ｌｎｇｒａｈａｍ
ｅｔａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）５５ ： ５１９〜５
２９（１９８８））。 プロモーター配列の驚（べき特徴は、８０％を超えるコ
ーティング鎖がプリン類よりなり（図中にて星印を下に
記す）、各々、−１１８ないし１８８、および−２３８
ないし−３７０にわたる２の連続プリンホモポリマース
トレッチかあることである。ＧおよびＡを単に変更しな
いこれらのホモポリマーストレッチのいつくかの領域は
、幾分鏡映対称性を持つタンデム反復を含有する（例え
ば、−１６８ないし一部１８）。−１１２，２３２およ
び−５０９に中心をもつ自己相補的配列を形成するヘア
ピンはホモポリマー領域の両側にあり、二次構造に影響
１２得る。 ブリンービリミジンホモポリマーストレソチ、特に鏡映
対称性を持つもの（ミルキン（Ｍｉｒｋｉｎ）、不イチ
＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）、３３０ ： ４９５〜４９７
（１９８７乃は、Ｈ−ＤＮＡなる語の３重鎖コンフォメ
ーションをとる可能性かある（レビューについては、ウ
ェルズら（簀ｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・イ
ン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 ＢｉｏｌＣ
ｈｅｍ、）２６３： １０９５−１０９８（１９８８）
フトーンおよびダルベルブ（Ｈｔｕｎ ａｎｄ Ｄａｈ
ｌｂｅｒｇ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４３
： １５７１〜１５７６（１９８９））。 ＧＡＰ−４３プロモーターがｉｎ ｖｉｔｒｏで強力な
一次構造を含有することかます示されたのは、それを配
列決定しているときてあった。配列決定は二本鎖シナオ
キ／法を用いてルーチン的に達成されるが、この技術を
ＧＡＰ−４３プロモーターに適用する場合、読み取り可
能な配列は−２５０におけるホモポリマー領域に到達す
ると突然止まる。 −車路配列決定のために小さな断片をＭ１３に継代クロ
ーニングした後でのみ、本発明者らは該配列に到達する
ことができた。 フトーンおよびダルベルブ（Ｉ（ｔｕｎ ａｎｄ Ｄａ
ｈｌｂｅｒｇ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４
１ ：１７９１〜１７９５（１９８８）は、Ｈ−ＤＮＡ
がＤＮＡ中にひどいもつれを導入することを証明する単
純なケル系を発明している。それらのアッセイは低ｐＨ
におけるＨ−ＤＮＡの安定性の促進に基づくものである
。Ｈ−形成領域を含有するＤＮＡの断片を低ｐｉ（で電
気泳動に付した場合、Ｈ−ＤＮＡ誘導のもつれは、Ｈ−
ＤＮＡ形成に好都合でないＴ）Ｈでの移動性と比較して
、移動を遅くする（フトーンおよびダルベルブ（Ｈｔｕ
ｎ ａｎｄ Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、（１９８８）、前掲
）。本発明者らは、ＧＡＰ−４３プロモーター中の−２
４０ないし−３７０からのプリンホモボマー領域かｉｎ
ｖｉｔｒｏで直線状ＤＮＡ中で安定なＨ−ＤＮＡ構造
を形成することかできることを証明するこの移動度シフ
ト法を開発した。 第１５図は後記するごとくゲル電気泳動によって分析し
たＧＡＰ−４３プロモーターの制限消化断片を表すもの
である。可能なＨ−Ｄ Ｎ Ａ形成ホモプリン−ホモピ
リミジン領域を太線て示す。ケル電気泳動を行うに際し
ては、第１５図に表した消化物の一部を、予めｐＨ７，
４または４０いずれかにてトリス−酢酸塩で平衡化しで
ある１４％アガロースゲル上に負荷し、平行して泳動さ
せた。ｐＨ４でシフトしたバンドはＢないしＩ」塩基転
位に由来する可能性かある塗抹を呈した（フトーンおよ
びダルベルブ（Ｈｔｕｎ ａｎｄ Ｄａｈｌｂｅｒｇ）
、サイエンス（Ｓｃ １ｅｎｃｅ）、２４１ ： １７
９１〜＋７９５（１９８８））。ホモポリマー領域■
（すなわち、上流（−２４０ないし−３７０）ホモプリ
ンストレッチを含有する断片）を含有するバンドのみか
本アッセイにおいてｐ）１４．０にて移動度の変化を示
した。マーカーまたはプロモーター領域の外部からのプ
ラスミド゛の断片、または領域Ｉから分離した場合の領
域■および■を含有する断片にあっても、観察可能な／
フトはなかった。かくして、上流領域のみがそれ自体に
ついてのシフトを示した。領域■および■を含有する断
片はｐＨ４ではシフトしなかったことに注意されたい。 ホモポリマー領域の外部のＤＮＡを徐々に除去すると、
移動度の相対的シフトが増加した。領域Ｉを同様のサイ
ズとした断片中に単独で存在させた場合よりも領域■を
領域Ｉと共に断片中に包含させた場合の方がかなり大き
な移動度のシフトが観察された。 本アッセイにおいては、領域■および■はそれら自体の
シフトに影響を与えることができなかったが、それらは
上流領域と協同して作用するかも知れない。 ＧＡＰ−４３転写開始の不均質性 ＧＡＰ−４３上流配列のもう１つの注目すべき特徴はＴ
ＡＴＡモチーフが存在しないことである。 転写の開始を指令するＴＡＴＡ配列を欠く遺伝子はしば
しば多重量ＲＮＡスタート部位を有する。 これはＧＡＰ−４３について当てはまることが判明した
。ＲＮＡ５ｅ保護分析を用いて、いつくかの組織で、Ｇ
ＡＰ−４３についての転写スタート部位を決定した。肺
、後根神経節（ＤＲＧ）および大脳皮質（ＣＴＸ）から
のＲＮＡを、翻訳スタート部位から一４７５塩基まで伸
びるプローブで分析した。このプローブを用い、−４７
／−４８，５１／−５２、および−７８の転写スタート
部位に対応させて、３つの主要バンドを保護した。 これらの同部位はブライマー伸長によって同一性を確認
した。さらに、従たるバンドは長時間の暴露の後、可視
化された。 ２３０あたりのいくつかの転写体は、後根神経節と比較
して、大脳皮質からのｍＲＮＡにおいて、かなりの程度
存在する。中枢神経系と末梢神経系におけるＧＡＰ−４
３遺伝子発現の調節は異なる（スケネら）Ｓｋｅｎｅ
ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー
（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）８９ ： ８６〜９５；
ジャーナル・イン・セル・バイオロジー（ＪＣｅｌｌ
Ｂｉｏｌ、）８９ ： ９６〜１０３（１９８１））こ
とを示唆する観察を考慮すると、これは興味深いことで
ある。よって、ＣＮＳの他の領域、ならびに（交感神経
副腎前駆細胞に由来すると信じられている）ＰＣＩ２細
胞からのＲＮＡを分析した。海馬、皮質および小脳から
のＲＮＡは、ＤＲＧまたはＰＣ１２細胞からのＲＮＡよ
りも、−２３０あたりの領域から開始する転写体の割合
が高い。しかしながら、これらのより長いメツセージの
各々の量は比較的少ない。−２３４を越えてスタートす
るすべてのメツセージをプールするプローブを用いた場
合、ＣＮＳとＰＮＳにおけるスタート部位間の差異はよ
り明確となった。この分析は、より長いＧＡＰ−４３転
写体は、現実に、−緒になって、全ＧＡＰ−４３転写体
の重要な両分を説明すること、およびこれらの転写体は
ＤＲＧまたはＰＣ１２細胞からのＲＮＡよりもＣＮＳか
らのＲＮＡにおいて普通であることを示した。要するに
、ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡの５°端部は異種起源であり、
上流スタート部位は、末梢神経系と比較すると、中枢神
経系で使用するのが普通である。 ４察 本発明の本具体例は、ＧＡＰ’−４３遺伝子を含有する
ケノミソク配列の単離および特徴付けに指向される。１
．５ｋｂ ｍＲＮＡに対応する３つの小さなエクソンは
、各々、少なくとも２４および２０ｋｂのイントロンに
よって隔てられている。 プロモーター領域はかなり異常である。３重鎖「Ｈ−Ｄ
ＮＡ」を潜在的に形成できる上流領域にはいくつかの長
いホモプリン−ホモピリミジン・ストレッチが存在する
（ウェルズら（Ｖｅｉｌｓ ｅｔ ａｌ）、エフ・エイ
・ニス・イー・ビイ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ Ｊ、
）２ ： ２９３９〜２９４９（１９８８））。 ここに、事実、これらの領域のうちの１つがｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでＨ−ＤＮＡを形成することが示される。 プロモーターは正準なＴＡＴＡポ、クスを欠き、多重転
写開始部位を有する。これらの部位のいくつかの利用は
神経系の種々の部分で異なる。 う、）ＧＡＰ−４３遺伝子は、少なくとも５０ｋｂにわ
たる３つのエクソンと２つのイントロンよりなる単一コ
ピー遺伝子である。本発明者らは、該エクソンが該蛋白
における機能的ドメインに対応する証拠をいくつか得た
。最初の１０個のアミノ末端残基のみをコード付けする
第１のエクソンはＧＡＰ−４３の膜ターゲツティングの
原因となるストレッチを含有する。蛋白の３位おＪひ４
位のシスティンはアシル化されており、前記したごとく
、膜結合に関与し得る。アミノ末端はＧＡＰ−４３の膜
結合に必要であり、前記したごとく、異種蛋白を、成長
円錐のものを含めたＧＡＰ−４３と同一の膜ドメインへ
向けるのに十分な情報を含有する。 第２のエクソンはアミノ酸４３ないし５１からのカルモ
ジュリン結合領域（アレキサンダーら（Ａｌｅｘａｎｄ
ｅｒ ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・イン・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）
２６３： ７５４４〜７５４９（１９８８））ならひに
プロテインキナーセＣについての基質である４１位のセ
リン（コギングおよびツビエルズ（Ｃｏｇｇｉｎｓ ａ
ｎｄＺｗｉｅｒｓ）、ソサイエティ・イン・ニューロサ
イエンス（Ｓｏｃ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）アブストラ
クト（１９８８））を包含する。エクソンＩおよび■は
魚類およびいくつかの哺乳動物ＧＡＰ−４３蛋白の間で
よく保存されている領域を含有する（ラハテおよびスケ
不（Ｌａｂａｔｅ ａｎｄ ５ｋｅｎｅ）、（１９８９
乃。 ＧＡＰ”−４３のプロモーターは、配列および構造か異
常である。ＴＡＴＡホ、クスの欠如およびその結果とし
ての多重スタート部位の使用は、ＧＡＰ−４３プロモー
ターか、構成的に発現されるハウスキーピング（ｈｏｕ
ｓｅｋｅｅｐｉｎｇ）遺伝子のプロモーターに似る原因
となる。しかしながら、ＧＡＰ−４３プロモーターはハ
ウスキーピング（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ）遺伝子の
プロモーターに関係付けられてきたコンセンサスＳｐ−
１結合部位（ＧＧＧＣＧＧＧ）を欠く〈タイナン（Ｄｙ
ｎａｎ）、トレンズ・ジェネト（Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎ
ｅｔ、）２ ： ］ ９６〜１９７ （１９８６））。 さらに、発育におけるＧＡＰ−４３の密接に調節された
発現、ニューロンに対するその特異性、および特に成人
のニューロンにおけるその誘導可能性は、それかこのク
ラスの遺伝子に属しないことを示唆する。 ＧＡＰ−４３は中枢神経系と末梢神経系では異なって調
節される。例えば、哺乳動物中枢ニューロンの軸索切断
は、末梢神経の軸索切断かＧＡＪ）４３の発現および輸
送の増加を引き起こすのに対し、それを引き起こさない
（スケ不およびウィリアード（Ｓｋｅｎｅ ａｎｄ Ｙ
ｉｌｌａｒｄ）、ジャーナル・イン・セル・バイオロジ
ー（Ｊ、 Ｃｅｌ ｌ Ｂｉｏｌ、 ） ８９ ： ９
６〜１０３（１９８１）。前記したごとく、ＧＡＰ４３
はＣＮＳで不可逆的に抑制されるようには見えず、軸索
成長における以外の形成性で役割を演じ得るが（ベノウ
ィッツおよびロウテンベルブ（Ｂｅｎｏｖｉｔｚ ａｎ
ｄ Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅｒｇ）、ティーアイ・エヌφｘ
ス（Ｔ、 １．Ｎ、Ｓ、）１０：５２７〜５３２（１９
８７））、中枢的および末梢的調節においては差異が存
在することは明らかである。よって、異なるスターＩ・
部位の使用は、異なるニューロンからのｍＲＮＡはりホ
ソームの結合または安定性を調節する５端部で異なる可
能性を示唆する。 制限されるものではないが、ニューロンで発現される遺
伝子Ｔｈｙ−＋は、転写レベルにて、発育に付随して調
節され、組織特異的に発現されることが証明されている
ことに注目するのは興味深い（スバノポウロウら（Ｓｐ
ａｎｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ）、モレキュラー・ア
ンド・セリスター・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃ、Ｃｅ１
１．Ｂｉｏｌ、）８ ： ３８４７〜３８５６（１９８
Ｂ））。また、ＧＡｐ−４３のように、Ｔｈｙ１プロモ
ーターにおける転写スタート部位の選択は発現組織間で
変化し得、上流スタート部位が脳においてより顕著であ
る（同上）。これは、ＧＡＰ−４３およびＴｈｙ−１双
方についての膜対−他の組織における対照の付加レベル
を示唆する。 ＧＡＰ−４３プロモーターに存在する可能な上流調節要
素はコンセンサスＰｉｔ−１結合部位（ＴＡ、ＴＴＣＡ
ＴＧ）である。この配列および関連配列は、集合的にＰ
ＯＵ蛋白として公知の転写因子によって認識され結有す
る。この群は元来哺乳動物において、Ｐｉｔ−１，０ｃ
ｔ−１および０ｃｔ−２を、および線虫において、ｕｎ
ｃ８６を包含するものであり（ヘールら（Ｈｅｒｒ ｅ
ｔ ａｌ）、ジーンズ・デイベロブＣＧｅｎｅｓ Ｄｅ
ｖｅｌｏｐ、 ） ２°１５１３〜１５１６（１９８８
））、この科を特徴付ける２のペプチド領域を占める蛋
白をコード付けするｃＤＮＡの発見によって、最近、拡
大された（へら（Ｈｅ ｅｔ ａｌ）、ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）３４０ ： ３５〜４２（１９８９））。 以下の実施例に記載するごとく、本発明者らは、ＧＡＰ
−４３のこの領域を結合させ、その転写を調節し得る脳
−特異的蛋白を同定し、クローン化した。 ＧＡＰ−４３プロモーターのもう１つの顕著な特徴は、
長いホモプリン−ホモピリミジン・ストレッチの存在で
ある。これらは興味深いものである。何故ならば、それ
らはＧＡＧＡストレッチに特異的な蛋白を結合させ（ピ
キンおよびティヤン（Ｂｉｇｇｉｎ ａｎｄ Ｔｊｉａ
ｎ）、セル（Ｃｅｌｌ）５３ ： ６９９〜７１１（１
９８８）；キルムアら（Ｇｉｌｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ）
、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４５ ： １４８７
〜ｌ ４９０（１９８９乃、それらはＨ−Ｄ Ｎ、Ａと
呼ばれる３重鎖フンフォメーションをとる可能性を今す
るからである。かかるホモポリマー領域は真核生物遺伝
子および真核生物ウィルス遺伝子の５′端部において十
分に表わされることか判明しており、それらは転写制御
に幾分関与しているらしいことか推測される（ウェルズ
ら（Ｙｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ）、エフ・エイ・ニス・イ
ー・ビイ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ Ｊ、 ）２ ：
２９３９〜２９４９（１９８８）；フトーンおよびダー
ルベルグ（Ｈｔｕｎ ａｎｄ Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４３： １５７１〜１５
７６（１９８９））。例えば、恐らくは蛋白相互作用に
よって安定化されているＨ立体配置を採ると、ＤＮＡに
よじれを引き起こすと仮定されている。このよじれは、
よじれた領域からの締出しによってヌクレオチドムを順
応させ得、それにより、よじれの辺りのＤＮＡを転写因
子により接近させる（フトーンおよびタールベルブ（Ｈ
ｔｕｎ ａｎｄ Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）２４１ ： １７９１〜］ ７９５（１
９８Ｂ）；ハンおよびグルンステイン（ｌｌａｎ ａｎ
ｄＧｒｕｎｓｔｅｉｎ）、セル（Ｃｅｌｌ）５５ ：
１１３７〜１１４５（１９８８））。加えて、かかるよ
じれは上流の配列をそれらの下流により近く並置させ、
配列間またはそれらに結合した蛋白間の相互作用を可能
とするように働くであろう（フトーンおよびタールベル
ブ（Ｈｔｕｎ ａｎｄ Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４１：１７９１〜１７９５（１
９８８乃。 代わりに、Ｈ−ＤＮＡは、その直ぐ隣接するＤＮＡへの
接近を直接に遮断することによって、転写のリプレッサ
ーとして働くかも知れない（マヘールら（Ｍａｈｅｒ
ｅｔ ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４５
７２５〜７３０（１９８９））。 したがって、本発明のさらなる具体例は、内部領域、ゲ
ノミックＧＡＰ−４３をコードしている第１図に示すよ
うなヌクレオチド配列、またはその機能的もしくは化学
的誘導体、およびＧＡＰ４３プロモーターをコードして
いる第１４図に示すようなヌクレオチド配列またはその
機能的もしくは化学的誘導体からなる。本発明のＧＡＰ
−４３プロモーターかＧＡＰ−４３自体の活性を変形さ
せるだけではなく当業者に周知の方法を用いて他の構造
遺伝子の発現における所望の修正を達成する手段として
非常に有用性のあるものであるということか理解される
であろう。 さらに広（言えば、本発明のこの態様は、実質的には第
１４図に示されるようなプロモーターに関するものであ
り、Ｔ Ａ Ｔ Ａボックスおよび共通の５ｐ−１結合
部位を欠失しているか多重スタート部位および共通Ｐｉ
ｔ−１結合部位を含有していることを特徴とし、そして
二重鎖（Ｈ−ＤＮＡ）構造を取る能力かある長いホモプ
リン−ホモプリミジンストレッチからなることを特徴と
する。相中において、そのアミノ末端で、本明細書に記
載のＧＡＰ−４３プロモーターのヌクレオチド配列およ
びその機能的もしくは化学的誘導体からなる構造遺伝子
、またはそのフラグメントもまた、本発明の意図された
具体例を形成する。 さらなる具体例において、上記構造遺伝子からなるＤＮ
Ａ発現発現ツクターれらのベクターとトランスフェクト
する宿主細胞、およびそれによって産生される蛋白を提
供する。 実施例■ ニューロン成長円錐はミクロ環境からの信号を軸索また
は樹状突起の定方向成長に変換する特別の変換機構を持
つ。成長円錐膜中で豊富な新生児う、ト脳からの細胞下
画分は単純かつ区別される蛋白組成を有する。成長円錐
脱調製物中の２種の主要な非細胞骨格蛋白は４００００
および３５０００の分子量を有する。電気泳動的、免疫
学的および部分的な蛋白配列評価基準によって、これら
の蛋白はＧＴＰ結合蛋白Ｇ。のアルファおよびベータ・
サブユニットと同定された。ニューロン的に分化したラ
ット褐色細胞腫細胞の免疫組織学的染色により、細胞突
起の遠位端に高濃度のＧｏのアルファザブユニットか示
される。これらのテークは、成長円錐運動性の調節はＧ
。信号変換メカニズムを利用するらしいことを示唆する
。 脳発育の間に達成され、シナプス形成性を通して洗練さ
れるニューロン連結性の複合状態はニューロン軸索によ
る特異的標的の選択を要する。それによって、それらの
細胞外環境からの情報を軸索が定方向成長に変換するメ
カニズムはあまり理解されていない。ニューロン軸索の
遠位端は成長円錐なる語のユニークな超構造を有し、こ
れはこの突起について臨界的であると考えられている（
プレイ・デイら（Ｂｒａｙ、 Ｄ、 、 ｅｔ ａｌ）
、アヌ・レフ・セル・ハイオル（Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、
Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、 ）４°４３（１９８８））。幸
いなことに、軸索成長円錐の膜、および従ってその変換
系は他のニーロン構成から分画することができる（フェ
ニンゲル・レイ・エイチら（Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ、
Ｋ、 Ｈ，、ｅｔ ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）３５５７
３（１９８３）；ゴルドンーウイークス・ビイら（Ｇｏ
ｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓ、 Ｐ、 、 ｅｔ ａｌ）、ニ
ューロサイエンス（λｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）１３
： １１９（１９８４）；エリス・エルら（Ｅｌｌｉｓ
、Ｌ、、ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・セル・バイ
オロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）ｌ Ｏ１゜１９
７７（１９８５））。それは、はんの数種の主要蛋白よ
りなり、これらの蛋白のうちいつくかは同定されている
°チューブリン、アクチン、および神経−特異的、成長
−関連蛋白、ＧＡＰ−４３（フェニンケル・レイ・エイ
チら（Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ、 ＫＨ，、ｅｔ）、セル
（Ｃｅｌｌ）３５ ： ５７３（１９８３）；エリスー
ｘルら（Ｅｌｌｉｓ、Ｌ、ｅｔ ａｌ）、ンヤーナル。 オフ・セル・バイオロン−（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、
） Ｉ Ｏ１： １９７７（１９８５）；シムコビノツ
・ビイら（Ｓｉｍｋｏｗｉｔｚ、 Ｐ、 、 ｅｔ、
ａｌ）、ジャーナル・オフ・ニューロサイエンス（Ｊ、
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）９ ： １００４（１９８９）
；チョン・エフら（Ｃｈｅｕｎｇ、 Ｎ、 、 ｅｔ
ａｌ）、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミスト
リー（ＪＢｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６３ ： ３９３５
（１９８８）：メイノ・ケイ・エフら（Ｍｅｉｒｉ、
Ｋ、 Ｆ、 、 ｅｔ ａｔ）、プロンーティングズ・
オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）Ｕ
Ｓ Ａｓ２・３５３７（１９８６）；スケ不・シェイ
・エイチ・ビイら（Ｓｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ，Ｐ、 、
ｅｔ ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３
： ７８３（１９８６））。他の主要成長円錐膜構成
の特徴付けにより、細胞外キューに対する軸索の応答か
説明されるであろう。 新生児ラット脳から成長円錐膜画分を調製した（フェニ
ンケル・ケイ・エイチラ（Ｐｆｅｎ旧ｎｇｅｒ、 ＫＨ
，、ｅｔ ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）３５ ： ５７３
（１９８３）エリス・エルら（Ｅｌ ｌｉｓ、 Ｌ、
、 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・セルＨバイオロ
ジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）１０１１９７７（１
９８５）ニジムコビッツ・ビイら（Ｓｉｍｋｏｗｉｔｚ
、 Ｐ、 、 ｅｔ ａｌ）、／ヤーナル・オフ・ニュ
ーロサイエンス（Ｊ、 Ｎｃｕｒｏｓｃｉ、 ）９ ：
１００４ （１９８９）、チョンーｘヌら（Ｃｈｅｕ
ｎｇ、 Ｎ、 、 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅ
ｍ、）２６３ ： ３９３５（１９８８））。 この調製物は５ＤＳ−ＰＡＧＥによると単純な蛋白組成
を有する（エワス・エルら（Ｅｌｌｉｓ、Ｌ、、 ｅｔ
ａｌ）、ジャーナル・オフ・セル・バイオロジー（ｊ。 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）Ｉ ０１ ： １９７７（１９
８５）： ’／ムコビッツ・ビイら（Ｓｉｍｋｏｗｉｔ
ｚ Ｐ、、ｅｔ ａｌ）、ンヤーナル・オフ・ニューロ
サイエンス（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ）９ ： １
００４（１９８９）；チ舎ンーｊｌ−ヌら（Ｃｈｅｕｒ
＋ｇ。 Ｎ、、ｅｔ ａｌ）、／ヤーナル・オフ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６３
： ３９３５（１９８８））。５０〜５５０００タル
トンにて移動する最も強く染色されるハンドはチューブ
リンと同定された（シムコビノッ・ビイら（Ｓｉｍｋｏ
ｗｉ ｔｚ、 Ｐ、。 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・ニューロサイエンス
（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）９ ： １００４ （１９
８９）；チョン・エフら（Ｃｈｅｕｇ、 Ｎ、 、 ｅ
ｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６３ ：
３９３５（１９８８））。また、ｐ３４およびｐ３８と
呼ばれ、特に成長円錐膜に豊富な約３５０００および４
００００のＭ、を有する重要な蛋白が存在する（シムコ
ビソツ・ビイら（Ｓｉｍｋｏｗｉｔｚ。 Ｐ、、ｅｔａｌ）、ジャーナル・サブ・ニューロサイエ
ンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）９ ： １００４ （
１９８９））。さらに特徴付けを行った２つの未同定蛋
白がある。 細胞骨格蛋白を除き、それらは成長円錐脱調製物中で最
も重要な蛋白である。 ｐ３４およびｐ３８はＧＴＰ−結合蛋白Ｇ。のアルファ
およびベータ・サブユニットと同様の分子量を有するこ
とか注目された（ストリニル・エルら（Ｓｔｒｙｅｒ、
Ｌ、 ｅｔ ａｌ、 ）、アヌ・レフ・セル・ハイオ
ル（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）２ ：
３９１ （１９８６）；キルマン・エイ・／イ（Ｇｉ
１ｍａｎ、 Ａ、 Ｇ、 ）、アヌ・レプ・ハイオケム
（Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）５６ ：
６ ］５（１９８７））。精製したランｇｒａｉｎＧ
ｏと成長円錐膜との共電気泳動により、ｐ３４はＧ。 のへ−タサブユニノトと共に移動し、ｐ３８はアルファ
サブユニットと共に移動することか示された。免疫プロ
ット法により、ｐ３４は抗−ベータサブユニット抗血清
と反応し、ｐ３８は抗−アルファサブユニットＧ。抗血
清と反応することか示された。 さらに、ｐ３８の顕著な蛋白種はアルファ。にちがいな
い。何故ならば、コーマンーブルー染色によって判断し
て、等しい濃度の蛋白濃度のｐ３８およびアルファ。は
同一の免疫反応性を示したからである。そのことはｐ３
４およびＧ。のベータサブユニットについても当てはま
る。アルファＬサブユニ・ノドはこの抗血清とはアルフ
ァ。の約１／１０の反応性であり（キルマン・エイ・ン
イ（Ｇｉｌｍａｎ、 Ａ、 Ｇ、 ）、アヌ・レフ・バ
イオケム（ＡｎｎＲｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）５６ ：
６１５（１９８７））、従って、アルファ。免疫反応
性の主要バーセンチ−／を説明できない。 これらの免疫学的および電気得泳動的データを確かめる
ために、電気泳動で精製したｐ３４およびｐ３８から部
分的な蛋白配列を得たく第１６図）。 ｐ３４およびｐ３８は共にアミノ末端はブロックされて
いた。ＨＰＬＣによって分離したトリプンンの断片から
、および５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したスタフィロ
コッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈａｕｒｅｕｓ）Ｖ
８プロテア一ゼ部分消化断片から配列を得た。ｐ３８か
らの３種の各ペプチドの配列はアルファ。のちのと同一
であり、アルファ。はｐ３８蛋白の主要成分であること
か確認された。他の公知のアルファサブユニットは同様
であるが独自の配列を有する。該３種のｐ３４蛋白はＧ
蛋白のベータサブユニットのものと同一の配列を有して
いた。２種のペプチドは、ベータ、およびベータ。 サブユニットが同一である領域からのものであり、第３
のものはベータ、およびベータ、についての配列の混合
物を含有していた。かくして、Ｇ、のアルファおよびベ
ータサブユニットは成長円錐膜細胞下画分の主要構成成
分である。 これらの調製物は実質的には成長円錐膜に豊富であるか
、それらは純粋ではない（フェニンゲル・ケイ・エイチ
ら（Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ、 Ｋ、 Ｈ，、ｅｔ ａｌ
）、セル（Ｃｅｌｌ）３５：５７３ （１９８３）；コ
ルトンーウィークス・ビイら（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋ
ｓ、 Ｐ、 、 ｅｔ ａｌ）、ニューロサイエンス（
Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ） ］ ３ ： ］ １９
（１９８４））。末画分組織の従前の免疫組織学は、Ｇ
ｏは成長したラット脳の神経網に濃縮されること（ウォ
ーリイ・ビイ・エフら（Ｗｏｒｌｅｙ、 Ｐ、 Ｆ、
、 ｅｔａｌ）、プロシーティングズ・サブ・ナンヨナ
ル・アカテミー・サブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔ ＩＡｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８３ ： ４５６
１（１９８６））、および関連Ｇ蛋白Ｇ。１．が成人に
おける一次嗅ニューロンの末端領域に位置すること（ン
ヨーンズ・ティ・ティら（Ｊｏｎｅｓ、 Ｄ、 Ｔ、
、 ｅｔ ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４
４ ： ７９０（１９８９））、およびＧｏは培養され
た一次ニューロン全体を染色するか細胞−細胞接触の領
域に濃縮される（ノヨーンズ・ティ・ティら（Ｉｏｎｅ
ｓ、 Ｄ、 Ｔ、 、 ｅｔ ａｌ）、サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）２４４ ： ７９０（］ ９８９））こ
とをボしている。これらの研究は成長円錐におけるＧ。 の局在と矛盾しないかそれを証明するものではない。従
って、ＮＧＦ＝処理ＰＣＩ２細胞に免疫組織学的方法を
使用して無傷細胞におけるＧ。の分孔を調へた。ＮＧＦ
は、これらの細胞が成長円錐を先端とした長い突起を伸
長させるのを可能とする。−次ニューロンのものにおけ
るごとく、ニューロン蛋白ＧΔＰ−４，３はこれらの成
長円錐で豊富である（パン・フープ・シイ・オー・エム
ら（Ｖａｎ Ｈｏｏｆ ｒ、 Ｃ，Ｏ，Ｍ、 、 ｅｔ
ａｌ）、ジャーナル・オフ・セル＋７’＋イオロン（
１，ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、）１０８ ： １１１５（１
９８９））。アルファ。の免疫蛍光はＰＣＩ２細胞のこ
れらの成長端て高濃度であった（そζで専ら見い出され
るのではなか−）だうり。 Ｘ！ｉ広 成長円錐膜の調製 従来法（フェニンケル・ケイ・エイチら（Ｐｆｃｎｎｉ
ｎｇｅｒ、 Ｋ、 Ｉｔ、 、 ｅｔ ａｌ）、セル（
Ｃｅｌｌ）３５ ： ５７３（１９８３）、ｆｆ−リス
・ｆｆ−ルら（Ｅｌｌｉｓ、Ｌ、 ｅｔａｌ）、／ヤ
ーナル・オフ・セル・ハイオロ／−（ｊＣｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ、）１０１ ： １９７７（１９８５）； ンｌ−
コビノツ−ｔｌ’イら（Ｓｉｍｋｏｗ・ｉｔｚ、 Ｐ、
、 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・ニューロづイ
エンス（Ｊ、 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 ）９ ： ］ ０
０４（１９８９）ニチオン・エヌら（ＣｈｅｕｎｇＮ、
ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・
ケミス）−リ−（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６３
： ３９３５ （１９８８））を少し修正して、成長円
錐膜を調製した。 ２４時間令未満のＳＤう、トの首を切り、０３２Ｍスク
ロース、１ｍＭトリス−ＨＣＣ，１，ｍＭＭｇＣ（！
、ｐＨ７，６の５倍容量中、カラス／テフロン製ホモケ
ナイザー中の６通路にて、脳を４００でホモジネートし
た。以下のプロテアーセ阻害剤を該手法の間に使用した
・ｌＱＯμｇ／ｍρ大豆トリブンン阻害剤、１）１ｇ／
ｍ１２ペプスタチンＡ、３０μＭ口イペブティン（Ｉｅ
ｕｐｅｐｔｉｎ） 、および１ｍＭ ＰＭＳＦ８０．７
５Ｍ、１．０Ｍおよび２．２Ｍのスクロースの段階グラ
ジェントの上にｆｆｌ 製瓶ホモジネートを重ねた。該
クラ／ユントを２５００００ｘｇで４０分間遠心し、０
３２／○ ７５Ｍ界面を成長円錐粒子画分として収集し
た。この両分を５ｍＭトリス−ＨＣ（ｌ！、ｐＨ７，６
中に溶解し、４０分間の２５００００ｘｇての遠心によ
って該膜を収集した。、該膜を２０１１ｇ／ｍＱサポニ
ンおよび０．３Ｍ Ｎａ、ＳＯ２中に再懸濁すること
によって洗浄し、遠心によって再度収集した。ウソ脳Ｇ
。を前記１．たごとくに調製した（プレイ・デイら（Ｂ
ｒａｙ、 Ｄ、 、 ｅｔ ａｌ）、アヌ・レフ・セル
・パイオル（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）
４：４３（１９８８））。 抗−血清の産生 つ号ギにおける抗−ウシ脳アルファ。および抗ベータ抗
血清の生産およびキャラクタライセーションハｉｔｓ
載されている（フッ・アール・エムら（）ｔｕｒｆ、
Ｒ，Ｍ、 、 ｅｔ ａｌ）、ツヤ−ナル・オフ・バイ
オロンカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、）２６０１０８６４（１９８５））。ＳＤＳを含む
１０％ポリアクリルアミドゲルに免疫プロット試料を通
して電気泳動を行い、次いて、電気泳動によりニトロセ
ルロースに移した。非特異的蛋白結合部位を１０ｍｇ／
ｍ（Ｊつ／血清アルブミンで遮断し、４°にて、該プロ
ットを１４００抗−アルファ抗血清またはｌ ： １０
０抗−ベータ抗面清と共に晩インキ−１へ−１・した（
フッ・アール・エムら（ｔ（ｕｌＴ、 Ｒ，Ｍ、 、
ｅｔ ａｌ）、／ヤーナル・オフ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） ２６
０１０８６４（１９８５））。ベルオキ／ターセ基質と
してテトラヘンン／ンを用い、アビノン・ビオチン複合
体法（ベクタスタチン（Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ）、パ
ーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）、カリフォルニ
ア州）によって結合抗体を検出した。 成長円錐膜蛋白のアミノ酸配列決定 前記したごとくに成長円錐膜を分画した。蛋白をポリビ
ニルフルオリンン（ＰＤＶＦ）膜に移しり場合、ｐ３４
およびｐ３８についてのスポットは配列を与えなかった
。何故ならば、恐らくは、該蛋白はアミノ末端か遮断さ
れているからであろう。従って、蛋白配列はｐ３４およ
びｐ３８についての蛋白分解断片から得た。トリプンン
消化については、蛋白をニトロセルロースに移し、ポン
ソーＳて染色し、適当なバンドを切り出した。バーバー
ド・マイクロケミストリー・ファンリティ（Ｈａｒｖａ
ｒｄ Ｍｉｅｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔ
のにおいて、トリブンン消化をニトロセルロース膜上て
行い、放出されたペプチドを逆相１−＋ Ｐ Ｌ Ｃに
よって分離し、気相自動配列決定器（モース・エムら（
Ｍｏｏｓ。 Ｍ、、ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・サブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６３
： ６００５（１９８８戸で配列決定した。さらに、
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ、 Ａｕ
ｒｅｕｓ） Ｖ ８プロテアーゼ（ヘーリンケル（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ）、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ乃
での部分的消化によりｐ３４についてアミノ酸配列を得
た。ｐ３４を含有するポリアクリルアミド立方体をＶ８
でｉｎ ５ｉｔｕ消化し、ＤＳＤ−ＰＡＧＥで分画し、
ＰＶＤＦ膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ベット
フォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、マサチューセッツ州）に
電気フロノドし、コーマシーブルーで可視化した（ケ不
テイ・ティ・イーら（ＫｅｎｎｅｄｙＴ、 Ｅ、 、
ｅｔ ａｌ）、プロシーテイングズ・サブ・ナショナル
・アカデミ−・サブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８５ ： ７００８（１９
８８））。 ペプチド断片を切り出し、コロンビア大学のノ・ウワー
ト・ヒユーケス・メテイカル・インステイテユート・フ
ロティン・ケミストリー・コア・ファシリイテイ（Ｈｏ
ｗａｒｄ ）ｌｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎ５ｔ
ｉｔｕｔｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｏ
ｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）にてアプライド・″イオシス
テムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（フ
ォスター・シイティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ１ｔｙ）、カリ
フォルニア州）の４７０Ａ気相シーケンサ−で配列決定
して配列ｐ３４−Ｂを得た。 ＰＣ１２細胞のアルファ。免疫染色 ］００ｎｇ／ｍｆｆ神経成長因子の存在下、ＰＣ１２細
胞をポリーＤ−リンン処理カバーガラス上で４８時間増
殖させた。該細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
中の３．７％ホルムアルテヒドで固定し、次いで、０１
％トリトン−Ｘ−１００を浸透させた。ＰＢＳ中の５
ｍ ｇ ／ ｍρウシ血清アルブミンでのインキュベー
ションの後、該細胞を２３°Ｃにて１：１０００抗−ウ
シ脳アルファ。 抗血清と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳですすぎ
、０３％Ｈ，Ｏ，と共に１５分間インキユヘートしてハ
ックグラウンドを減少させた。結合したウサキ免疫グロ
ブリンはテキサス・レッド・コンシュケート（Ｔｅｘａ
ｓ ｒｅｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ロバ抗つサキＩｇ
Ｇ（／ヤクソン・イミュノロ／カルズ（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ））の使用によって検
出した。 結果 かにする。 軸索成長円錐膜の蛋白をＤＳＤ−ＰＡＧＥによって同定
した。軸索成長円錐膜、精製したラン脳Ｇｏ、および粗
製瓶ホモジネートの２の別々の調製物を、ＳＤＳの存在
下、１０％ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動に
付し、コーマシーブルーで染色した。粗製瓶に対し成長
円錐膜調製物におけるｐ３４およびｐ３８と呼んだ２の
バンドの層化を観察した。これらの蛋白は精製したＧ。 のアルファおよびベータサブユニットと共に移動した。 これらの条件下、アクチンおよびＧＡＰ４３は見掛は分
子！１４３０００て移動した。 成長円錐膜の抗−Ｇｏ免疫プロットはＧ。反応性を示す
。 成長円錐膜調製物双方におけるアルファ・コーマシーブ
ルー染色の位置で移動するアルファ。免疫反応性を明ら
かにした。アルファ。のコーマシーブルー標識がＰ３８
のものと同一となるようにゲルを負荷し、同様に他の対
について適合させた。 コーマシーブルー染色ゲルを平行にて泳動させた。 全蛋白か増加するにつれ、該対は固定度に免疫染色され
、これはｐ３８がこの抗血清に対して標品アルファ。と
固定度に免疫反応性であることを示す。これは、はとん
どまたはすべてのＩ）３８かアルファ。であることを示
唆する。Ｇｏ試料にはアルファ。を越えて移動する少量
の免疫反応性かあり、これはアルファ、てのわずかな汚
染またはそれとの交差反応によるものであるようたった
。これは、以前、各々、ベータおよびｐ３４についてコ
ーマシーブルーで同一に染色することか示された成長お
よび成長円錐膜（Ａ）画分ては観察されず、また、抗−
ベータ抗血清との同様の免疫反応性か示された。 免疫プロット法は、精製したＧ。調製物およびはＧ。の
ものど同一である。 ｐ３４およびｐ３８についての部分的蛋白配列を第１６
図に示す。ｐ３８からの３種のペプチドの配列はラット
脳由来のアルファ。からの３種のペプチドの配列に調和
する（ゴー・ジェイ・タブリュー （Ｇｏｈ、 Ｊ、
Ｗ、 ）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４４９８０
（１９８９））。ｐ３４からの３種のペプチドの配列は
つ／脳からのベータ１およびヘータ２号ブユニソトと比
較される〈フイング・エイチ・ケイ・タブリューら（Ｆ
ｏｎｇ、 Ｈ，Ｋ、 １． 、 ｅｔ ａｌ）、プロシ
ーティングズ・イン・す、′ヨナル・アカテミー・イン
・サンエンンズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ）Ｕ ５Ａ８４・３７９２（＋９８７乃。 ２種のペプチドはベータおよびベータ、か同一である領
域に同一であることに／ｉはされたい。他のベプチ１−
はベータ、およびベータ、についての配列の混合物を含
有する。 アルファ、１免疫反応性はＰＣＩ２突起の先端に〆層線
される１、 神経成長因子で区別されるＰＣｌ、２細胞のアルファ。 染色により、細胞突起の遠位端における抗原の高濃度か
明らかとなった。また、核の回りの細胞質体の領域にお
１プる低レベルの散漫な染色もあった。抗体の特異性は
証明されている（フッ・アール・エムら（Ｈｕｆｆ、
Ｒ，Ｍ、、ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・イン・バイオロ
ンカル・ケミスｌ−’） −（Ｊ、 ＢｉｏｌＣｈｅｍ
、）２６０ ： １０８６４（１９８５）：ウオーレイ
・ビイ・エフら（Ｎｏｒ！ｅｙ、 Ｐ、 Ｆ、 、 ｅ
ｔ ａｌ）、プロ／−ティングズ・イン・す／ヨナル・
アカテミー・イン・サイエン／ズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）Ｕ ５Ａ８３：４５６
１（１９８６）か、さらに対、照として、過剰の精製し
たラン脳Ｇ。（３０ｔｔ ｇ／ｍｃ ）を、抗血清での
インキユベーシヨン、または抗血清の代わりに通常のウ
サキ血清で置き換えたインキュベーションに添加して同
一の試料を調製した。 これらの対照は実質的に細胞突起の染色を小さなかった
。 考察 本実施例で示された結果は、Ｇ蛋白、特にＧ。 は成長円錐膜の主要構成成分であることを／Ｊ’Ｃす。 事実、成長円錐膜には、他のいずれの非細胞骨格蛋白よ
りもＧ。が多くある。脳において第一に明らかにされた
ことだが、Ｇｏの役割は明瞭ではないにもかかわらず、
一般に、Ｇ蛋白は、膜内外レセプターを細胞内信号系に
カップリングさせるくストリニル・エルら（Ｓｔｒｙｅ
ｒ、 Ｌ、 、 ｅｔ ａｌ）、アヌ・レフ・セル＋ハ
イオル（Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、
）２ ： ３９１（１９８６）；ギルマン・エイ・シイ
（Ｇｉｌｍａｎ、 Ａ。 Ｇ、）、アヌ・レフ・ハイオケム（Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）５６・６１５ （１９８７）；
ネール・イー・／、。 イ（Ｎｅｅｒ、 Ｅ、 Ｊ、 ）、ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）３３３ ： １２９（＋９８８）；ロス・イー
・エム（Ｒｏｓｓ、 Ｅ、 Ｍ、 ）、ニューロン（Ｎ
ｅｕｒｏｎ）３ ： １４１ （１９８９乃。Ｇ。 は子数の細胞表面レセプターと相互反応し、ホスホリバ
ーセＣ、ホスホリバーセＡ７、カリウムチャネルおよび
カルシウムチャネルを含めた種々の細胞内信号系に影響
を与え得る（スケ不・ン・。−イ・エイチ・ビイら（Ｓ
ｋｅｎｅ、 Ｊ、 ＩＬ ｐ、 、 ｅｔ ａｌ）、サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３ ： ７８３（１９
８６） ニストリニル・エルら（Ｓｔｒｙｅｒ、 Ｌｌ
、ｅｔａｌ）、アヌ・レフ・セル・パイオル（八ｎｎ、
Ｒｅｖ、ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、）２ ： ３９１ （＋
９８６）：ネール・イー・／エイ（Ｎｅｅｒ、 Ｅ、
Ｊ、 ）、ネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ）３３３ ： １２
９（１９８８）：ロスφイーーエム（Ｒｏｓｓ、 Ｅ、
Ｍ、 ）、ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）３・１４１（
１９８９）ニブラウン・エイ・エムら（Ｂｒｏｗｎ、
Ａ、 Ｍ、 、 ｅｔ ａｌ）、アメリカン・ジャーナ
ル・イン・シイジオロン−（Ａｍ、 Ｊ、 Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、 ） ２５４Ｈ４０１（１９８８））。桿状体お
よび錐状体外部セグメントにおける網膜Ｇ蛋白トランス
トウノン（ｔ ｒａｎｓｄｕｃ ｉｎ）と匹敵する、成
長円錐膜におけるＧｏの驚くべき高しベルは、成長円錐
におけるＧ。 に基つく変換系を強く示唆する。 ｃ Ａ Ｍ Ｐに向かう化学走性かＧ蛋白を介して変換
される、枯菌ンクチオステリウム（Ｄｉｃｔｙ。 ５ｔｅｌ ｉｕｍ）における発育形態形成にとってＧ蛋
白は非常に重要であるこ七か判明している（スナールン
ヤカルスカ・ビイ・イーら（Ｓｎａａｒ−Ｊａｇａｌｓ
ｋａＢ、 Ｅ、 、 ｅｔ ａｌ）、エフ・イー・ビイ
・ニス・レターズ（Ｆ、Ｅ、Ｂ、Ｓ、Ｌｅｔｔ、）２３
２ ： ｌ ４８ （］ ９８８）スナールーンヤカル
ス力・ビイ・イーら（ＳｎａａｒＪａｇａｌｓｋａ、
Ｂ、 Ｅ、 、 ｅｔ ａｌ）、エフ・イー・ビイ・ニ
ス・レターズ（Ｆ、Ｅ、Ｂ、Ｓ、Ｌｅｔｔ、）２３６
： １３９ （１９８８）：ケスベケーｘフら（Ｋｅｓ
ｂｅｋｅ、 Ｆ、 、 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・イ
ン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）
１０７ ： ５２１（１９８８乃。同様に、発育神経系
における経路または標的からの信号は、成長円錐膜にお
ける、Ｇ、一連結レセプター、またはレセプターに結合
し得、それにより、細胞内二次メソセンジャーのレベル
、従って成長円錐移動度を変化させる。一般に、これら
の信号、レセプターおよび二次メツセンジャーは現在未
知である。１のクラスの候補レセプターは細胞粘着分子
、ＮＣＡＭおよびＬｌであり、ニューロン成長円錐に局
在する（ルトウルワーノ・ビイ・シイら（Ｌｅｔｏｕｒ
ｎｅａｕ、 Ｐ、 Ｃ，、ｅｔ ａｌ）、デイベロノブ
メント（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ） １０５ ： ５０
５ （１９８９））。これらの分子に対する抗体は、Ｐ
１２細胞におけるカルシウムレベルおよびホスホチシル
イノシトール代謝を変化させ、これらの抗体の影響はＧ
蛋白拮抗剤百日咳トキシンによって阻止される（ハン・
フーフー’ｉイ・オー・エムら（ｖａｎ ｔｌｏｏｆＴ
、 Ｃ，Ｏ，Ｍ、 。 ｅｔ ａｌ）、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー
（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）１０８ ： ｌ １１５
（１９８９））。 成人神経系におけるＧ。発現の持続性（ウォーレイ・ビ
イ・エフら（Ｗｏｒｌｅｙ、 Ｐ、 Ｆ、 、 ｅｔ
ａｌ）、プロシーディングズ・イン・ナショナル・アカ
テミー・イン・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）Ｕ ５Ａ８３ ： ４５６
１（１９８６））は、アキソノケネ／ス（ａｘｏｎｏｇ
ｅｎｅｓ ｉｓ）の調節以外の役割を意味する。 もう１つの成長円錐富化分子、ＧＡＰ−４３も成人脳の
不連続領域に存在する（ベノビノッ・エル・アイら（Ｂ
ｅｎｏｗｉｔｚ、Ｌ、 １．、 ｅｔ ａｌ）、トレン
ズ・二二一口サイ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、
）１０ ： ５２７（１９８７）；スケ不・エイチ・シ
ェイ・ビイ（ＳｋｅｎｅＨ，Ｊ、 Ｐ、 ）、アヌ・レ
フ・ニューロサイ・（Ａｎｎ、 ＲｅｖＮｅｕｒｏｓｃ
ｉ、）１２ ： １２７（１９８９））。ＧＡＰ４３の
局在、その遺伝子調節の性質、および特にそのホスホリ
ル化状態と海馬スライスにおける長期増強との関係（ロ
ウテンベルブ・エイ（Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅｒｇ、 Ａ、
）、ニューヨーク・アカデミ−・イン・サイエンシズ
（Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）４４４ ： ９８０（
１９８９）は、成人のシナプス形成性におけるＧ Ａ
Ｐ−４，３の役割を示唆している（ベノビッツ・エル・
アイら（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ、Ｌ、 １．、 ｅｔ ａｌ
）、トレンズ・二二一口サイ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ、）１０ ： ５２７（１９８７）；スケ不・
エイチ・ジエイ・ビイ（Ｓｋｅｎｅ、 Ｈ，Ｊ、 Ｐ、
）、アヌ・レフ・ニューロサイ（ＡｎｎＲｅｖ、Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉ、） １２ ： １２７（１９８９））。 百日咳トキンンが長期増強を阻止し、恐らくはやはりこ
の突起におけるＧ。を意味するものであることは注目に
値する（ゴー・ジェイ・ダブりニー（Ｇ ｏ ｈ ＋Ｊ
、 Ｌ ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４４
： ９８０ （１９８９））。よって、Ｇｏはニューロ
ン発育の間の軸索伸長および成人神経系におけるシナプ
ス形成性についての調節信号を変換し得る。 実施例■ ＧＡＰ−４３は蛋白結合の新規な内部調節器である。 もう１つの態様において、本発明は、ＧＡＰ４３か細胞
内てＧ。のちのを含めた他の細胞蛋白の結合能力を修飾
するように作用するという驚くへき発見に指向される。 本発明者らか知る限り、これは、外部細胞レセプターに
対する効果および利用性において匹敵する重要な新しい
クラスの内部調節蛋白（ｒｌＲＰＪＸそのうち、ＧＡＰ
−４３が代表的なものである）の最初の報告をなす。 当業者ならば、本発明の本態様のＩＲＰ組成物および方
法は、ニューロンおよび非ニューロン細胞において、蛋
白活性の内部変調を可能とし、それにより細胞の活性お
よび機能の内部変調を可能とする。 さらに、驚くべきことに、ＧＡＰ−４３のアミノ末端ア
ミノ酸よりなる合成ペプチドは、無傷ＧＡＰ−４３蛋白
によって引き起こされたＧ。によるＧＴＰ結合における
変調を正確に複製することが判明した。例えば、ＧＡＰ
−４３の最初の２４アミノ酸からなるペプチドは、ＧＡ
Ｐ−４３と同レベルにＧＴＰｕｓ結合を刺激し、十分な
ＧＡＰ−４３アゴニストとして作用する。短いペプチド
、例えば、アミノ酸１−１０からなるペプチドは、ＧＴ
Ｐｕｓ結合を刺激しないが、Ｇｏへの結合に関してＧＡ
Ｐ−４３と競合し、その結果、逆アコニスト（ｒｅｖｅ
ｒｓｅ ａｇｏｎｉｓｔ）として作用するらしい。周知
の方法を使用し゛Ｃ当業者によって慣例的にその固有の
作用が決定されるこのような生物学的に活性なペプチド
は、本発明のもう１つの態様を形成する。 本具体例による生物学的に活性な合成ＩＲＰペプチドは
、以下の配列 Ｉ Ｍｌ、ＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫ
ＩＥＱＤＧＶ；Ｉｌ、 ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶ
ＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱＤＧＩＩｌ、 ＭＬＣＣ
ＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱＤＩＶ、
ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱ ；
Ｖ ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩ
Ｅ ；■ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＩ’：ＤＱＫ
Ｉ；■、 ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＩ
’）ＱＫ〜’ｌ ＭＬＣＣＭＲＲＴＱＶＩＫＩＩ
ＤＩＤＱＩＸ、 ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮ
ＤＩミＤ＼ Ｍｌ、ＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥ
Ｘｌ、 ＭＬ、ＣＣＪＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤ■
ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＸ ＩＩｌ、
ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＸ ＩＶ 、 ＭＬ
ＣＣＭＲＲＴＱＶＥ ；Ｘ Ｖ 、 ＭＬＣＣＭＲ
ＲＴＫＱＶ ：Ｘ Ｖｌ 、 ＭＬＣＣＭＲＲＴＸ
ＱＸＶｌｌ、 ＭＬＣＣＭＲＲＴＫ Ｘ〜１． ＭＬＣＣＭＲＲＴ’ ＸＩＸ、 ＭＬＣＣＭＲＲ Ｘ Ｘ 、 ＭＬＣＣＭＲ； Ｘ Ｘ Ｉ 、 ＭＬＣＣＭ ＸＸＩｌ、 ＭＬＣＣ；および ＸＸ用 その機能的誘導体 よりなる。 本発明の関連具体例は、前記した合成ＩＲＰペプチドを
コー）・付けするヌクレオチド配列に指向され、その配
列は本発明の教示を理解した当業者によって容易に決定
されるであろう。 本発明のさらなる態様は、コンセンサスアミノ酸配列か
ＧＡＰ−４３およびベータアトレナリン作動性レセプタ
ーで見い出されるという発見に指向され、該配列は 疎水性−川ｅｕ −ｃｙｓ −ｃｙｓ −ｘ−塩基性−
塩基性またはその機能的誘導体よりなる。さらに、本発
明のＩＲＰ類およびＩＲＰペプチド類のンステインはバ
ルミチル化し易いことも理解されるであろう。 また、当業者ならば、本発明のＩＲＰ蛋白類およびペプ
チド類の構造を変化させることによって、標的蛋白活性
か増強され、所望ならば、前例のないことであるが抑制
され得ることを理解するであろう。かくして、もう１つ
の具体例におい°Ｃ１所望の蛋白およびその結合基質よ
りなる環境に有効量のＴＲＰペプチドを導入することを
特徴とする該所望の蛋白の結合活性を刺激する方法か提
供される。該所望の蛋白は、好ましくは、Ｇ蛋白であり
、最も好ましくはＧ。である。該環境は、好ましくは、
中枢神経細胞または末梢神経細胞であってよい生きた細
胞の内部の環境である。 当業者ならば、本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉ
ｎ ５ｉｔｕ、またはｉｎ ｖｉｖｏで実施することか
でき、ここに考察するごとく、当該分野でよく知られた
許容される投与原理を一峠に銘記すると、後者が最も好
ましいことを理解するであろう。 本発明の組成物および方法は、とりわけ、ニューロン成
長およびンナブス形成性に関与するメカニズムに指向さ
れるので、本発明の教示の利益を享受する当業者ならば
、蛋白ｌ舌件の内部調節はヒトを含めた哺乳動物におけ
る障害の効果的治療について重要な機会を提供すること
、およびかがる治療は神経の病気または機能障害の影響
を防止し、改善しまたは逆行させるのに特に価値がある
ことを理解するであろう。所与の薬効指示にとっては、
神経の成長または形成性を減少させならひに増強させる
のか望ましいてあろう。これは、例えば、本発明のｌ
ＲＰペプチド、またはかがるＩＲＰペプチドか生理学的
効果を有する部位へ定方向化された抗体を投与すること
によって達成できる。また、かかる手段によって、所望
の蛋白の活性を、かなりの制御度でもって調節すること
が呵能である。かくして、もう１つの態様において、本
発明は、本発明のＩＲＰペプチドへ定方向化された抗体
、好ましくはモノクローナル抗体、およびその機能的も
しくは化学的誘導体に指向され、該抗体またはその該誘
導体は所望により検出可能にまたは治療可能に標識され
たものでよい。 もう１つの態様において、本発明は、医薬上許容される
担体と共に本発明のＩＲＰペプチドよりなる、および所
望により１種またはそれ以上の治療上有効な剤よりなる
医薬組成物、ならびに、医薬上許容される担体と共に本
発明のＴＲＰペプチドへ定方向化された抗体よりなる、
および所望により１種またはそれ以上の治療上有効な剤
よりなる医薬組成物に指向される。本発明の医薬組成物
の使用は、本明細書中に記載されかつ当該分野でよく知
られた投与の原理を銘記しつつ、不都合な実験を行うこ
となく当業者によって達成れさるであろう。 もう１つの態様において、本発明は、本発明の組成物の
有効量を神経細胞に投与することを特徴とする該神経細
胞における構造再編成を変調する方法に指向される。 さらにもう１つの本発明の具体例において、本発明のＧ
ＡＰ−４３配列を用いて神経細胞からＧ様蛋白を単離し
た。ＧＡＰ−４３カラムを用い、ＭＷ３９０００の蛋白
は高親和性をもってＧＡＰ４３を特異的に結合させるこ
とが判明した。５０ｍＭ トリス、１ｍＭＣａ（Ｊｊ
、、および１ｍＭＩＶ１ｇｃＱｔよりなる緩衝液中にＧ
ＡＰ”４３を含有するカラムに細胞抽出物を導入した。 等モルのＥＤＴＡ緩衝液にて蛋白を単一ノクンドで溶出
させた。該蛋白はＧ蛋白に対するポリクローナル抗体と
反応しない。かくして、それは、成長ニューロンに関連
する独自で新規な蛋白であり、本発明のさらなる具体例
を形成する。 また、本発明のＩＲＰペプチドは、いずれの公知手段、
例えば前記した遺伝子組換え法によっても生産でき、本
発明のＩＲＰペプチドをコード付けするヌクレオチド配
列は、単にルーチン的技量の努力てもって所望の宿主発
現系が推断され、最適化される。 Ｇｏのごとき細胞変換系の修飾における本発明の新規組
成物および方法の重要性は、Ｇｏがニューロン成長円錐
に存在する主要非細胞骨格蛋白であるという証明と結合
させて考えると増大する。 その機能は従前知られていなかったＧＡＰ−４３がＧ０
活性を変調するという発見は、ＧＡＰ−４３か細胞変換
系における第１および第２メツセンジャー間の長らく求
められてきた「欠けている部分」であるという証拠であ
る。いずれか特定の理論に拘束されるつもりはないが、
ＧＡＰ”４３によるＧ。の持続的活性化は細胞がその環
境を無視し、よって構成的に増殖するようにさせるであ
ろう。また、今回の成果は、ＧＡＰ−４３のアミノ末端
と同様の配列を含有し、よってＧ。を細胞の内部から調
節する一群の他の分子が存在することを示唆する。ＧＡ
Ｐ”４３のアミノ末端はいくつかの（ベータレセプター
のごとき）Ｇ蛋白−結合レセプターの細胞質ゾルドメイ
ンに対する大きな類似性を有することは非常に興味深い
。これは、Ｇ蛋白−結合レセプターの細胞質ゾルドメイ
ンがそうであるように、ＧＡＰ−４３は分子中の同様の
箇所でＧ。と相互反応し得ることを示唆する。 内部調節蛋白および内部調節ペプチド（本明細書中テは
、ｒｌＲＰペプチド」とも記す）の新規な変調効果は、
例えば刺激することまたは抑制することであるというこ
とかさらに理解されるであろう。すなわち、ＩＲＰｓお
よびＩＲＰペプチド、またはこのような内部調節作用を
有する他の物質は、当業者に知られており、かつ、例え
ば、レミングトン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）のファーマシ
ューティカル・サイエンシズ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ ５ｃｉｅｎｃｅｓ）、第１６版、マーク・パブ
リッシング・カンパニー（ＭａｒｋＰｕｂｌ ｉｓｈｉ
ｎｇ Ｃｏ、 ）、イーストン、ペンシルバニア（＋９
８０）ならひにグツトマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）およびギ
ルマン（Ｇｉｌｍａｎ）のす・ファーマコロジカル・ベ
インス・イン・セラビューティクス（Ｔｈｅ Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌｏｆｉｃａｌ Ｂａ５ｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃｓ）、第７版、マクミラン・パブリッシ
ング・カンパニー（ＭａｃｍｉｌｌａｎＰｕｂｌ ｉｓ
ｈｉｎｇ Ｃｏ、 ）、ニューヨーク（＋９８５）また
はそれらの現在の版を含む標準的な参考文献に開示され
ているＪ、うな、々１ｊ何なる可能な薬理学的効果をも
有し得る。このように、これらは、アコニスト、部分ア
コニスト、逆アゴニスト、アンタゴニストなどとして作
用する。当業者には、このような効果の特徴付けか、関
心のある如何なる結合蛋白に関しても、Ｇ （１に対す
るＧ’ｒＰ結合に関して本明細書中に記載した方法のよ
うな周知の標準的なアッセイ方法を用いて行われ得るこ
とは、認識されるであろう。 本発明によ・〕で、所望の蛋白およびその結合基質から
なる環境中にスクリーニングをしようとする物質を導入
し、該物質の非存在下での基質結合に関する基質結合の
増加または減少を測定することを特徴とする所望の蛋白
の結合活性を変調する能力を有する物質についてスクリ
ーニングする方法が提供される。所望の蛋白はＧ蛋白で
あり、好ましくはＧ。である。 ム仏扶夷μ結果 ＧＡＰ−４３はＧ。へのＧＴＰγＳ結合を刺激する。 同定された主要成長円錐膜蛋白に関し、本発明者らは、
これらの成分は分子間複合体を形成できるか否かを決定
することを追及した。特に、Ｇ。 およびＧＡＰ−４３を調べた。というのは、それらは、
成長円錐膜における主要な非細胞骨格蛋白だからである
。ゲル排除クロマトグラフィー、免疫沈澱およびアフィ
ニティークロマトグラフィーによってＧＡＰ−４３／Ｇ
ｏ複合体を物理的に単離する試みは不成功に終わった。 溶液中ての一時的Ｇ Ａ Ｐ−４３／ Ｇ ｏ相互作用
を同定するために、精製したＧ。に対する（３５Ｓ）Ｇ
ＴＰｕＳの結合を種々の濃度の精製したＧＡＰ４３の存
在下で測定した（フッ・アール・エムら０１ｕｆｆ、Ｒ
，Ｍ、、 ｅｔ ａｌ、）、ンヤーナル・インＩハイオ
ロ／カル・ケミストーリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、 ） ２６０： １０８６４−１０８７１（１９８
５）；ノースラップ・ノエイ・ケイら（Ｎｏｒｔｈｒｕ
ｐ、Ｊ、に、 ｅｔ ａｌ、）、／ヤーナル・イン・バ
イオロンカル・ケミストす（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、）２５７： １１４ ］ｆ３−］ １４２３（１９
８２））。ＧＡＰ−４３自体は、（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ
を結合させないか、ＧＡＰ−４３は、Ｇ （、に対する
特定の（３５５）ＧＴ Ｐ ｕ Ｓ結合を対照の３ ］
、 Ｏ＋ ４０％（ｎ＝＝７）レベルに刺激する（第１
７Ａ図を参照）。この効果は飽和し、１５０８００ｎＭ
ＧＡＰ−４３の存在下では最適の半分である。Ｇ Ｏ
およびＧＡＰ−４３が溶液中に含まれず、かつｉｎ ｖ
ｉｖｏて膜結合し、ないならば、それらのＩｆｆは、全
脳中約２μＭである。したかって、本明細書に記載され
たアッセイで測定されたＧｏに対するＧ Ａ、 Ｐ −
４３の親和性はｉｎ ｖｉｖｏ状態に矛盾［７ない。す
へてのアッセイは２００μｇ、／′ＴｎρＢＳＡの存在
下で行い、従−）で、Ｇ Ａ Ｐ−４３による非特異的
蛋白効果はＧＴＰｕＳ結合の刺激を説明し得ない。、Ｇ
ｏはＧ Ｔ Ｐ ｕ Ｓなくしての３（’）’Ｃにおけ
るブし・インキュヘーソヨンの間に部分的に不活性化さ
れることは公知である（オタウト・ビー−エフら（０’
Ｄｏｗｄ、Ｂ、’Ｆ、 ｅｊ ａｌ）、シャーノール・
フ６ブ・バイオロンカル・ケミストリー（ＪＲｉａｌ、
ＣＩ−＋０ｍ、 ）２６３ ： ］ ５９ε３５−１
５９９２（１９８８））、、ｃＡｐ−４３はＧ。のハネ
安定性の程度に影響を与えない。 様々な条件下で評価されるけれと、Ｇ蛋白と相性作用す
るりカント−レセプター複合体は、ＧＡｌ） −４３か
行うのとほぼ固定度のＧＴＰｕＳ結合を刺激する（フロ
リオ・ブイ・エイ・アン１−・スターンウェイズ・ピー
−／−（Ｆｌｏｒｉｏ、Ｖ、Ａ、 ＆Ｓｔｅｒｎｗｅｉ
ｓｅ Ｐ、 Ｃ，）、／ヤーナル・インφノクイオロシ
カル・ケミストリー（１，Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）
２６４３９０９−３９１５（１９８９））。 ＧＡＰ−４３デカペプチドはＧ。と相互作用する。 膜連結に対して臨界的であるアミノ末端テカベブチトの
ノステインがＧ０調節に関しても必要とされるかとうか
を判断するために、２個のノステインの代わりにスＩ／
オニンで置換したデカペプチドを合［戊した。このペプ
チドは、１−１０ペプチド効果の特巽性および／スティ
ンの必要性を示すＧｏに対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結
合への効果を有していなかった（第１７ｃ図）。 Ｇ蛋白へのＧＴＰｕＳ結合を刺激することか知られてい
る他の群の蛋白はホルモンおよび神経伝達物質レセプタ
ーである。全ホルモンおよび神経伝達物質レセプター構
造（例えば、大きい細胞外領域および７つの膜内外ドメ
イン）は、ＧＡＰ４３の構造とは非常に異なっている。 したかって、本発明者らは、Ｇ蛋白と相互に作用し合う
と思われるこれらのドメインに焦点を絞って、これらの
蛋白間の相同性について追及してきた。レセプターに関
し、位置特異的突然変異誘発およびペプチド競合研究は
、Ｇ−蛋白カノブリングにおいて、第３細胞質ループの
カルボキシル末端と細胞質テールの末端付近を関係させ
た（コニノブ・ビーら（Ｋｏｎｉｇ、Ｂ、 ｅｔ ａｌ
、）、プロ／−デインゲス・イン・ナショナル・アカテ
ミー・イン・サイエンス・ニー・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、
）８６・６８７８−６８８２（１９８９）；オタウト・
ビー・エフら（０’Ｄｏｗｄ Ｂ、Ｆ、 ｅｔ ａｌ、
）、ンヤーナル・イン・バイオロンカル・ケミストリー
（ＪＢｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２６３ ： ］ ５９８
５−］ ５９９２（１９８８）ニストレーター・ター・
ティーら（ＳｔｒａｄｅｒＣ，Ｄ、 ｅｔ ａｔ、）、
／ヤーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２６２ ： １６４３９
−１６４４３（１９８７））。Ｇｓとβ、−アドレナリ
ン作動性レしプター七の結合は、蛋白の細胞質テール中
のバルミチル化ンステインにおける点突然変異によって
最も特異的に妨害される（オダウド・ビー・エフら（０
’Ｄｏｗｄ、Ｂ、Ｆ、 ｅｔ ａｌ、）、ジャーナル・
イン・バイオロジカル・ケミストリー（ＪＢｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、）２６４ ： ７５６４−７５６９（１９８
９））。Ｇ、調節のために必要とされるＧＡＰ４３のア
ミノ末端におけるシスティンもｉｎ ｖｉｖ。 でパルミチル化される（ス牛−二・ジエイ・エイチ・ビ
ー・アント・ビラグ・アイ（Ｓｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ，
Ｐ＆ Ｖｉｒａｇ、 １． ）、／ヤーナル・イン・セ
ル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）１０８
二６１３−６２４（］９８９））。一連のレセプター
由来の細胞質テールのアミノ末端部分とＧＡ、Ｐ−４３
アミノ末端との比較によって、疎水性−］ ｅ ｕ−ｃ
ｙ ｓ−ｃ ｙ ｓＸ−塩基一塩基の共通の配列か判
明する（第１８図）。この配列内で、研究したシスティ
ンはバルミチル化される（スキｍ：・ジェイ・エイチ・
ビー・アンド・ビラグ・アイ（Ｓｋｅｎｅ、 Ｊ、 Ｈ
，Ｐ、 ＆Ｖｉｒａｇ、 １．）、ジャーナル・イン・
セル・バイオロジー（Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）１
０８ ： ６１３−６２４（１９８９）；オダウド・ビ
ーーｘフら（０’ Ｄｏｗｄ、 Ｂ、 Ｆｅｔａ＋、）
、ジャーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２６４ ： ７５６４
−７５６９（１９８９）；インキニコブ・ワイ・エイら
（Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ、Ｙ、Ａ、 ｅｔ ａｌ、）
、ＦＥＢＳ ［、ｅｔｔｓ。 ２３０ ： １−５（１９８８））。 Ｇ蛋白に対するＧＴＰｕＳ結合の他の内因性調節物は知
られていない。しかしながら、Ｇ蛋白を反対に活性化す
るペプチド毒素、マストパランがある（ヒカソジマ・テ
ィーら（Ｈｉｇａｓｈｉｊｉｍａ、Ｔ、 ｅｔａｌ、）
、ジャーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２６３ ： ６４
９１−６４９４（１９８８））。ＧＡＰ”４３は、この
ペプチド相同性ではない。 大きな細胞外領域および７つの膜内外ドメインをもつそ
れらの全構造はＧＡＰ−４３のものとかなり異なってい
たが、それらに拘わらず、本発明者らは、これらの蛋白
とＧＡＰ〜４３のアミノ末端間の相同性を追及してきた
。β、−アドレナリン作動性レセプターとＧｓとの相互
作用は蛋白の細胞質テール中のバルミチル化システィン
における点突然変異によって最も特異的に妨害される。 ＧＡＰ−４３のアミノ末端におけるシスティンもバルミ
チル化される。システィンがバルミチル化され易い疎水
性−ｌｅｕ−ｃｙｓ−ｃｙｓ−ｘ塩基性−塩基性よりな
る、ＧＡＰ−４３およびこれらのレセプターか共に有す
る共通の配列かある。 ＧＡＰ−４３かカルモジュリンと結合し、その相互作用
かカル７ウムの非存在下で増強されることは以前から知
られていた（アレキサンター・ケイ・エイら（ＡＩｅｘ
ａｎｄｅｒ、に、Ａ、 ｅｔ ａｔ、）ジャーナル・イ
ン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 ＢｉｏｌＣ
ｈｅｍ、）２６２：６］０８−６１１３（１９８７））
。 これに関する生理学的な重大問題は明らかではない。Ｇ
ｏに対する低ＩＩＩＡ度のＣｄ゛−カルモジュリンまた
はＥＧＴＡ−カルモジュリンの添加によって、ｃ Ａ
Ｐ−４３か（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結合を刺激する能力に
変化は生巳ない。しかしながら、より高濃度のカルモジ
ュリンは、ＧＡＰ−４３−刺激化（３５５）ＧＴ Ｐ
ｕ Ｓ結合を投与量に依存して減少させる（第１９図）
。 煮察 本テータは、ニューロン形態形成の間におはる細胞内成
長関連の発現に関する細胞外信号の協力についての成長
円錐メカニズムを提供する。成長円錐膜におけるＧ。の
アルファおよびベータザブユニットの驚くへき高レベル
は、神経突起ＸｆＭ］節におけるＧ。についての主要な
役割を示唆する。成長円錐膜中のＧ。２１ ｆｊｔは、
網膜光受容体細胞の高度に特殊化された外部セグメント
における、もう１つのＧ蛋白トランメンユ／ン（ｔｒａ
ｎｓｄｕｃｉｎ）の７ａ度を超える。 Ｇ蛋白機能か明瞭に定義される系において、そ１］は、
細胞外信号の膜内外レセプターへの結合と細胞内二次メ
ソセンンヤーを変調する酵素またはイオンチャネルの調
節との間の連動である。第にそのアルファサブユニット
で異なる多くのへテロ）・リマーのアルファーベーター
カンマＧ蛋白かある。一般に、アルファポリペプチドは
、作動剤レセプター複合体かＧＤＰの代わりにＧＴＰの
交換を引き起こすまでＧＤＰ−結合状態で存在する。次
いて、ＧＴＰ−結合活性化アルファサブユニットは二次
メツセン／ヤー系にその作用を及ぼす。内因性アルファ
サブユニノｈＧＴＰａ ｓ ｅ活性は信号変換を終始さ
せる。Ｇｏは顕著に脳で発現され、そこでは、それはＧ
蛋白の主要形態である。成人では、神経網＜−＞て見い
出され、本発明のテークは、それは主要非細胞骨格蛋白
である増殖細胞において神経突起の先端にＧ。を位置付
ける。Ｇｏは種々のレセプターに応答することができ、
カル／ラムチャ不ル、カリウムチャネル、ホスホリパー
ゼＧおよびホスホリパーゼＡ、を含めた多数の細胞内系
を調製する。 成長円錐に対するいくつかの基盤たるおよび解決できる
効果かＧ−蛋白変換を伴うという証拠かある。成長円錐
に局在する細胞粘着蛋白Ｎ−ＣＡＭおよびＬ＋に対する
抗体はＰＣＩ２細胞におけるカルシウムレベルおよびホ
スホチンルイノントール代謝を変化させる。これらの抗
体の効果はＧ ｏ／ Ｇ ＋抑制剤百日咳トキシンによ
って明１トされる（ンユーヒ・ニーら（Ｓｃｈｕｃｈ、
［１，、ｅｔ ａｌ）、ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）
３ ： １３（１９８９））。ある種のヘリオソーム（
ｈｅｌ ｉｏｓｏｍｅ）ニューロンにおいて、Ｇにカン
ブリングしたレセプターを介して作用するセロトニンは
神経突起延長の優れた抑制剤である。 Ｇｏの制限された局在は、蛋白の調節または作用か１種
またはそれ以上の二、−ロン−特に的分子によって媒介
されることを示唆する。ＧＡＰ４３はニューロンにおい
てのみ発現され、該蛋白は成長円錐に富化する。従って
、本発明者らは、Ｇ Ａ Ｐ −４３か６゜と相互作用
するか否がか不思議であった。ＧＡＰ）−４３はＧ。へ
のＧＴＰγＳ結合を増強する。さらに、合成テカペブチ
トによって定義されるＧＡＰ−４３の小さな領域はこの
作用を発揮する。ＧＡＰ−４３によるＧＴＰγＳ結合の
刺激は、作動剤−レセプター複合体によるそれに同様で
あり、該テカベブチド配列はこれらの１−セブターと千
日同性を有する。特定の理論に拘束されるつもりはない
か、最もありそうな解釈は、ｉｎ ｖｉｖｏにて、Ｇ
Ａ Ｐ −４３か膜内外レセプターを模擬し、Ｇ、を活
性化し、ＧＴＰ−結合アルファサブユニ、トを生じ、次
いで、それか細胞内二次メンセンツヤ−系の引金となる
ことである。あるいは、Ｇｏ／＼のＧＡＰ−４３結合は
ますＧ。−レセプターまたはＧ。−エフェクター相互作
用を破壊するように機能するかも知れない。また、Ｇ、
１）４３は、何等かのまた知られていない方法により、
レセプターによるＧ。活性化のエフェクターであるとい
うことも考えられる。 成長関連蛋白ＧＡＰ−４３によるＧ。円錐変換系の変調
は、細胞外信号をニューロン成長についての細胞内プロ
グラムと統有するメカニズムを提供する。さらに、該系
の調節はＢ Ａ ＲＫのごときレセプターキナーゼによ
るレセプターのホスホリル化、または蛋白キナーゼＣに
よるＧＡＰ−４３のホスホリル化のような他の修飾を介
して起こり得る。本モデルにおいて、ＧＡＰ−４３は細
胞外リガンドに対するＧ。の応答を相乗的に増強するか
、またはＧ。のレセプターへの依存性をくつがえすこと
によってリガンドに対する応答性を減少させるであろう
。後者の場合において、シナプス形成の間に起こるごと
く、ＧＡＰ−４３の除去は、細胞外リガンドに対する感
受性を回復させるであろう。ＧＡＰ”４３の作用がレセ
プターの効率に与える正味の効果は成分の相対的濃度に
依存するであろう。 ＧＡＰ−４３は、直接に細胞外リガンドに応答する公知
の能力を現在有していない細胞内蛋白である点で、Ｇ−
蛋白調節器の中でユニークである。 しかしながら、膜結合ＧＴＰａｓｅ蛋白の細胞内調節は
優位を有する。通常のＲＡＳ蛋白は、広範囲に分布した
１２０ＫＤ細胞内蛋白ＧＡＰによって刺激される。それ
らの名称の類似性に拘わらず、ＧＡＰ−およびＧＡＰ−
４３は無関係な蛋白である。 ＧｏへのＧＴＰγＳ結合を刺激するＧＡＰ−４３の領域
およびレセプターにおけるシスティンをパルミチル化に
付す。本発明の実験において、非バルミチル化状態にお
いては、アミノ末端ペプチドおよび恐らくは（膜のｐＨ
ＩＩ抽出によって調製した）ＧＡＰ−４３が存在する。 バルミチル化対−非バルミチル化ＧＡＰ−４３、および
Ｇ連結レセプターかＧ蛋白を刺激する相対的能力は知ら
れていない。急速なバルミチル化−説パルミチル化はこ
れらの蛋白についての調節の役割を演しることは可能で
ある。 成人神経系におけるＧ。発現の持続性（ウメ−レイ・ビ
イ・エフら（Ｗｏｒｌｅｙ、 ｐ、 Ｆ、 、 ｅｔ
ａｌ）、プロ７−チイングズ・イン・ナンヨナル・アカ
デミ−・イン・サイエンンズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１ｌ
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）Ｕ ５Ａ８３：４５６１（１
９８６）は、発育および再生の間の神経突起延長の調製
以外の役割を意味する。 また、ＧＡＰ−４３は成人脳の不連続領域に存在し、小
脳を除くと、２種の蛋白についての免疫組織化学的マツ
プは驚くほど類似している（ベノウソツ・アイ・アイら
（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ、 ｌ、１．、ｅｔ ａｌ）、トレ
ンズ＋＝、−ｏサイ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
、 ） １０ ： ５２７（１９８７）；スケ不・エイ
チ・ジェイ・ビイ（Ｓｋｅｎｅ、 Ｈ，Ｊ、 Ｐ、 ）
、アヌ・レフ・ニューロサイ（ＡｎｎＲｅｖ、Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ、）１２ ： １２７ （１９８９））。ＧＡ
Ｐ−４３の位置決め、その遺伝子調節の性質、および特
にそのホスホリル化状態と海馬スラトスにおける長期増
強との関係（ロウテンプルグ・エイ（Ｒｏｕｔｔｅｎｂ
ｅｒｇ、 Ａ、 ）、アヌ・ニューヨーク・アカテミー
・イン・サイエンシズ（Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、）４４４ ： ２０３（１９８５））は、成人
でのシナプス形成性におけるＧＡＰ−４３についての役
割を示唆している（ベノウッッら（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ、
１．１． 、 ｅｔａｌ）、トレンズ１ニューロサイ
（Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｊ、）１０・５２７（
１９８７）；スケ不・エイチ・ンエイ・ビイ（Ｓｋｅｎ
ｅ、 Ｈ，Ｊ、 Ｐ、 ）＋アヌ・レフ・ニューロサイ
（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）１２ ： １
２７（１９８９））。 Ｇ ｏ／ Ｇ ｌ拮抗剤、百日咳トキシンは長期増強を
阻止し、これは、恐らく同様にこの過程におけるＧｏを
意味する（ゴー・シェイ・タブリューら（Ｇｏｈ。 Ｊ、Ｗ、、ｅｔ ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
） ２４４ ： ９８０（１９８９））。よって、発育
間の神経突起延長についての、および成人神経系におけ
るシナプス形成性についての細胞内および細胞外信号を
変換し得る。 以上のことから、当業者は、本発明の特定の具体例か説
明のために本明細書に記載されているが、本明細書の意
図および範囲から逸脱せずに種々の変形を行い得るとい
うことを認識するであろう。 したかって、本発明は、特許請求の範囲による以外は制
限されない。
第１図は、ＧＡ Ｐ−４３ｃ ＤＮＡのハイブリット−
選択翻訳を示す図である。 第２図は、ＧＡＰ−４３のヌクレオチ！・配列および予
想されるアミノ酸配列を示す図である。 第３図は、ＰＣ］２細胞におけるＧ Ａ Ｐ −４３発
現の調節を示す図である。 第４図は、ＧＡＰ−４３遺伝子発現の発育調節および組
織時胃性を示す図である。 第５図は、ＡかヒトＧＡＰ−４３ｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列および帰結されるアミノ酸配列を、Ｂがヒト、ラ
ットＧＡＰ−４３およびマウスＰ５７アミノ酸配列を、
Ｃか予想される３゛−非翻訳領域におけるステム−ルー
プ構造を示す模式図である。 第６図は、成熟を伴うＧＡＰ−４３発現の領域制限を示
すノーサンプロットの図である。 、 第７図は、Ｇ Ａ Ｐ −４３発現か虚血事故のあ
とに増加することを示すノーサンプロットの図である。 （第８図は、ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイゼーンヨンに
よる高速に隣接する領域におけるＧＡＰ−４３発現の増
加を示す顕微鏡写真である。 第９図は、Φ症の低血圧症および低酸素症の発作の数［
（後における小脳皮質のニューロンにおけるｃＡｐ
４３発現の増強示す顕微鏡写真である。 第１０図は、ＣＩ−１０細胞系における突起形成に対す
るＧ Ａ、 Ｐ −４，３の影響を示すグラフである。 第１１図は、アミノ末端エクソンかＧＡＰ−４３蛋白を
細胞膜へ定力同化させる原因であること、およびそれは
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼノ膜
ターケノティングを指令することを証明する実験の模式
図である。 第１２図は、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした場合、
通常のＧＡＰｉ３は膜成分および細胞質ゾル成分を共に
有することを示すウェスタンプロ、トである。 第１３図は、ラフ１−ＧＡＰ−４３遺伝子の地図を示す
模式図である。 第１４図は、ＧＡＰ−４３プロモーター領域の配列を示
す模式図である。 第１５図は、Ｈ−ＤＮＡによって誘導された制限断片に
おける移動度ラットを示す図である。 第１６図は、ｐ３４およびｐ３８についての部分的蛋白
配列を示す模式図である。 第１７図は、ＧＡＰ−４３およびＧＡＰ−４３ペプチド
によるＧ。に対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結合の変調を
示すグラフである。 第１８図は、ＧＡＰｉ３アミノ末端およびＧ結合レセプ
ターの細胞質テール間の相同性を比較するだめの各々の
配列を示す模式図である。 第１９図は、ＧＡＰ−４３−刺激されたＧ。に対啜るＧ
ＴＰｕＳ結合のカルモジュリンによる投′〕量依存性減
少を示すグラフである。 特許出願人 ザ・ゼネラル・ホスピタル・ツー５ｆレイ
シコン
選択翻訳を示す図である。 第２図は、ＧＡＰ−４３のヌクレオチ！・配列および予
想されるアミノ酸配列を示す図である。 第３図は、ＰＣ］２細胞におけるＧ Ａ Ｐ −４３発
現の調節を示す図である。 第４図は、ＧＡＰ−４３遺伝子発現の発育調節および組
織時胃性を示す図である。 第５図は、ＡかヒトＧＡＰ−４３ｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列および帰結されるアミノ酸配列を、Ｂがヒト、ラ
ットＧＡＰ−４３およびマウスＰ５７アミノ酸配列を、
Ｃか予想される３゛−非翻訳領域におけるステム−ルー
プ構造を示す模式図である。 第６図は、成熟を伴うＧＡＰ−４３発現の領域制限を示
すノーサンプロットの図である。 、 第７図は、Ｇ Ａ Ｐ −４３発現か虚血事故のあ
とに増加することを示すノーサンプロットの図である。 （第８図は、ｉｎ ５ｉｔｕハイブリタイゼーンヨンに
よる高速に隣接する領域におけるＧＡＰ−４３発現の増
加を示す顕微鏡写真である。 第９図は、Φ症の低血圧症および低酸素症の発作の数［
（後における小脳皮質のニューロンにおけるｃＡｐ
４３発現の増強示す顕微鏡写真である。 第１０図は、ＣＩ−１０細胞系における突起形成に対す
るＧ Ａ、 Ｐ −４，３の影響を示すグラフである。 第１１図は、アミノ末端エクソンかＧＡＰ−４３蛋白を
細胞膜へ定力同化させる原因であること、およびそれは
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼノ膜
ターケノティングを指令することを証明する実験の模式
図である。 第１２図は、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした場合、
通常のＧＡＰｉ３は膜成分および細胞質ゾル成分を共に
有することを示すウェスタンプロ、トである。 第１３図は、ラフ１−ＧＡＰ−４３遺伝子の地図を示す
模式図である。 第１４図は、ＧＡＰ−４３プロモーター領域の配列を示
す模式図である。 第１５図は、Ｈ−ＤＮＡによって誘導された制限断片に
おける移動度ラットを示す図である。 第１６図は、ｐ３４およびｐ３８についての部分的蛋白
配列を示す模式図である。 第１７図は、ＧＡＰ−４３およびＧＡＰ−４３ペプチド
によるＧ。に対する（３５Ｓ）ＧＴＰｕＳ結合の変調を
示すグラフである。 第１８図は、ＧＡＰｉ３アミノ末端およびＧ結合レセプ
ターの細胞質テール間の相同性を比較するだめの各々の
配列を示す模式図である。 第１９図は、ＧＡＰ−４３−刺激されたＧ。に対啜るＧ
ＴＰｕＳ結合のカルモジュリンによる投′〕量依存性減
少を示すグラフである。 特許出願人 ザ・ゼネラル・ホスピタル・ツー５ｆレイ
シコン
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）組換え哺乳動物ＧＡＰ−４３、またはその機能的
誘導体。 （２）該哺乳動物ＧＡＰ−４３がラットＧＡＰ−４３で
ある請求項（１）記載の組成物。（３）該哺乳動物ＧＡ
Ｐ−４３がヒトＧＡＰ−４３である請求項（１）記載の
組成物。 （４）該ラットＧＡＰ−４３が第２図に示したアミノ酸
配列、または第２図に示したものと実質的に同様のアミ
ノ酸配列を有する請求項（２）記載の組成物。 （５）該ヒトＧＡＰ−４３が第５Ａ図に示したアミノ酸
配列、または第５Ａ図に示したものと実質的に同様のア
ミノ酸配列を有する請求項（３）記載の組成物。 （６）第２図に示したアミノ酸配列、または第２図に示
したものと実質的に同様のアミノ酸配列よりなるポリペ
プチド、またはその機能的誘導体。 （７）第５Ａ図に示したアミノ酸配列、または第５Ａ図
に示したものと実質的に同様のアミノ酸配列よりなるポ
リペプチド、またはその機能的誘導体。 （８）第２図に示したヌクレオチド配列、または第２図
に示したものと実質的に同様のヌクレオチド配列よりな
るｃＤＮＡ、またはその機能的誘導体。 （９）第５Ａ図に示したヌクレオチド配列、または第５
Ａ図に示したものと実質的に同様のヌクレオチド配列よ
りなるｃＤＮＡ、またはその機能的誘導体。 （１０）請求項（８）記載のｃＤＮＡよりなるＤＮＡ発
現ベクター。 （１１）請求項（９）記載のＣＤＮＡよりなるＤＮＡ発
現ベクター。 （１２）請求項（１０）または（１１）記載の該ベクタ
ーで形質転換した宿主細胞。 （１３）該細胞が原核生物細胞および真核生物細胞より
なる群から選択される請求項（１２）記載の宿主細胞。 （１４）請求項（１３）記載の細胞によって生産された
ＧＡＰ−４３、またはその機能的誘導体。 （１５）哺乳動物ＧＡＰ−４３をコード付けするｃＤＮ
Ａよりなるベクターで原核生物または真核生物宿主細胞
をトランスフェクトし、該哺乳動物ＧＡＰ−４３の発現
を可能とする条件下、適当な培地中で該宿主細胞を培養
し、次いで該哺乳動物ＧＡＰ−４３を該培地から分離す
ることを特徴とする哺乳動物ＧＡＰ−４３またはその機
能的誘導体を生産する方法。 （１６）受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ １０３１６を有する
ハイブリドーマ株Ｈ５、またはその機能性もしくは化学
的誘導体。 （１７）受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ １０３１６を有する
ハイブリドーマ株Ｈ５によって産生されるモノクローナ
ル抗体の特異性を実質的に有するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ。 （１８）ハイブリドーマ株Ｈ５によって産生されるモノ
クローナル抗体ＭＡｂ抗−ＧＡＰ−４３（Ｈ５）であっ
て、該ハイブリドーマ株が受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ １
０３１６を有することを特徴とするモノクローナル抗体
ＭＡｂ抗−ＧＡＰ−４３（Ｈ５）。 （１９）ＭＡｂ抗−ＧＡＰ−４３（Ｈ５）の特異性を実
質的に有するモノクローナル抗体またはその機能的もし
くは化学的誘導体であって、該ＭＡｂ抗−ＧＡＰ−４３
（Ｈ５）がハイブリドーマ株Ｈ５によって産生され、該
ハイブリドーマ株が受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ １０３１
６を有することを特徴とするモノクローナル抗体または
その機能的もしくは化学的誘導体。 （２０）該抗体が検出可能に標識された請求項（１９）
記載の抗体。 （２１）該抗体が治療可能に標識された請求項（１９）
記載の抗体。 （２２）医薬上許容される担体と共に、請求項（１）、
（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）また
は（１４）のいずれか１項に記載の組成物よりなる医薬
組成物。 （２３）さらに１種またはそれ以上の治療上有効な剤よ
りなる請求項（２２）記載の組成物。 （２４）ＧＡＰ−４３を含有する疑わしい試料を請求項
（２０）記載の抗体と接触させ、ＧＡＰ−４３抗体複合
体の形成を可能とするために該試料を該抗体と共にイン
キュベートし、複合体化抗体を未複合体化抗体から分離
し、次いで、標識した複合体化抗体を検出することを特
徴とする試料中の哺乳動物ＧＡＰ−４３を測定または検
出する方法。 （２５）１またはそれ以上の容器手段を閉じた区画に収
容するように仕切られた担体手段よりなり、１またはそ
れ以上の該容器手段が検出可能に標識された対ＧＡＰ−
４３抗体よりなることを特徴とするＧＡＰ−４３の測定
または検出で有用なキット。 （２６）該抗体がポリクローナルおよびモノクローナル
よりなる群から選択される請求項（２５）記載のキット
。 （２７）細胞を有効量の神経発育因子に暴露することを
特徴とする該細胞においてＧＡＰ−４３の発現を誘導す
る方法。 （２８）該細胞が神経細胞である請求項（２７）記載の
方法。 （２９）該細胞をｉｎ ｓｉｔｕにて該神経増殖因子に
暴露する請求項（２８）記載の方法。 （３０）ＧＡＰ−４３をコード付けするｃＤＮＡよりな
るＤＮＡ発現ベクターを細胞に導入することを特徴とす
る該細胞においてＧＡＰ−４３の発現を増強する方法。 （３１）トランスフェクション、形質導入、または直接
マイクロインジェクションによって該ベクターを該細胞
に導入する請求項（３０）記載の方法。 （３２）請求項（２８）、（２９）、（３０）または（
３１）のいずれか１項に記載の方法によって神経細胞に
おけるＧＡＰ−４３発現を誘導することを特徴とする該
細胞において構造再編成を促進する（３３）損傷した神
経組織中でまたはその周囲においてＧＡＰ−４３発現を
誘導することを特徴とする該損傷した神経組織の治癒を
促進する方法。 （３４）該神経損傷が虚血を伴う梗塞、梗塞なしの一時
的虚血、低酸素症、無酸素症、無酸素性脳症、ハイポパ
ーヒュージョン（ｈｙｐｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、また
は卒中によって引き起こされる請求項（３３）記載の方
法。 （３５）神経発育因子、ステロイドおよびそれらの機能
的誘導体よりなる群から選択される１種またはそれ以上
の物質の有効量にニューロン細胞を暴露することを特徴
とする該ニューロン細胞において構造再編成を変調する
方法。 （３６）神経発育因子、ステロイドおよびそれらの機能
的誘導体よりなる群から選択される１種またはそれ以上
の物質の有効量にニューロン細胞を暴露することを特徴
とする該ニューロン細胞においてシナプス可塑性を変調
する方法。 （３７）神経発育因子、ステロイドおよびそれらの機能
的誘導体よりなる群から選択される１種またはそれ以上
の物質の有効量にニューロン細胞を暴露することを特徴
とする該ニューロン細胞のミクロ環境を変調する方法。 （３８）哺乳動物ニューロン細胞を有効量の１種または
それ以上のステロイドに暴露することを特徴とする該哺
乳動物ニューロン細胞においてＧＡＰ−４３発現を抑制
する方法。（３９）十分に分化した哺乳動物ニューロン
細胞を有効量の１種またはそれ以上のステロイドに暴露
することを特徴とする該ニューロン細胞においてＧＡＰ
−４３発現を変調する方法。 （４０）該ステロイドがコルチコステロイドである請求
項（３５）、（３６）、（３７）、（３８）または（３
９）のいずれか１項に記載の方法。 （４１）該コルチコステロイドが鉱質コルチコイドおよ
び糖質コルチコイドよりなる群から選択される請求項（
４０）記載の方法。 （４２）該鉱質コルチコイドがデキサメタゾン、コルチ
コステロン、アルドステロンおよびプロゲステロンより
なる群から選択される請求項（４１）記載の方法。 （４３）ステロイドに暴露した哺乳動物ニューロン細胞
を有効量のシクロヘキシイミドに暴露することを特徴と
する該ニューロン細胞においてＧＡＰ−４３発現のステ
ロイド抑制を増大させる方法。 （４４）該細胞が非ニューロン細胞である請求項（３０
）または（３１）記載の方法。 （４５）ヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 またはその機能的誘導体よりなる膜−ターゲッティング
ペプチドをコード付けするｃＤＮＡ。 （４６） I 、【遺伝子配列があります】； II、【遺伝子配列があります】； III、【遺伝子配列があります】； IV、【遺伝子配列があります】； Ｖ、【遺伝子配列があります】； VI 【遺伝子配列があります】； VII、【遺伝子配列があります】；および VIII、その機能的誘導体 よりなる群から選択されるアミノ酸配列よりなる膜−タ
ーゲッティングペプチド。 （４７） I 、【遺伝子配列があります】； II、【遺伝子配列があります】； III、【遺伝子配列があります】； IV、【遺伝子配列があります】； Ｖ、【遺伝子配列があります】； VI、【遺伝子配列があります】； VII、【遺伝子配列があります】；および VIII、その機能的誘導体 よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコード付けす
るヌクレオチドよりなる膜−ターゲッティングペプチド
をコード付けするＤＮＡ配列。 （４８）そのアミノ末端において、同相にて、請求項（
４６）記載の配列を有する膜−ターゲッティングペプチ
ドをコード付けするヌクレオチドよりなる構造遺伝子ま
たはその断片。 （４９）そのアミノ末端にて、請求項（４６）記載の配
列よりなる膜−ターゲッティングペプチドからなる蛋白
またはペプチド。 （５０）（ａ）所望の蛋白またはペプチドのアミノ末端
に請求項（４６）記載のアミノ酸配列よりなる膜−ター
ゲッティングペプチドを結び；次いで （ｂ）得られた該膜−ターゲッティングドメインよりな
る蛋白またはペプチドを細胞に導入することよりなり、 工程（ｂ）の得られた蛋白またはペプチドは該膜−ター
ゲッティングドメインによって該細胞の膜に対し定方向
化されていることを特徴とする該所望の蛋白またはペプ
チドを細胞の膜に対し定方向化する方法。 （５１）該細胞がニューロンおよび非ニューロン細胞よ
りなる群から選択される請求項（５０）記載の方法。 （５２）該ニューロン細胞において、工程（ｂ）の該得
られた蛋白またはペプチドが該細胞の成長円錐領域に対
し定方向化されている請求項（５１）記載の方法。 （５３）請求項（４６）記載のペプチドに対してまたは
請求項（４９）記載の蛋白もしくはペプチドに対して定
方向化された抗体、またはその機能的もしくは化学的誘
導体であって、該抗体またはその誘導体が所望により検
出可能にもしくは治療可能に標識されたことを特徴とす
る抗体またはその機能学的もしくは化学的誘導体。 （５４）抗体がモノクローナル抗体である請求項（５３
）記載の抗体。 （５５）ＭＡｂ抗−ＧＡＰ−４３（Ｈ５）またはその機
能的もしくは化学的誘導体の特異性を実質的に有し、該
ＭＡｂ抗−ＧＡＰ−４３（Ｈ５）がハイブリドーマ株Ｈ
５によって産生され、該ハイブリドーマ株が受託番号Ａ
ＴＣＣ ＨＢ １０３１６を有するモノクローナル抗体
。 （５６）受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ １０３１６を有する
ハイブリドーマ株Ｈ５、またはその機能的もしくは化学
的誘導体。 （５７）ゲノミックＧＡＰ−４３をコード付けする第１
３図に示したヌクレオチド配列、またはその機能的もし
くは化学的誘導体。 （５８）ＧＡＰ−４３プロモーターをコード付けする第
１４図に示したヌクレオチド配列、またはその機能的も
しくは化学的誘導体。 （５９）多重スタート部位およびコンセンサスＰｉｔ−
１結合部位を含有するが、ＴＡＴＡボックスおよびコン
センサスＳｐ−１結合部位を欠くことを特徴とし、さら
に３重鎖（Ｈ−ＤＮＡ）コンフォメーションを採ること
ができる長いホモプリン−ホモピリミジンストレッチよ
りなることを特徴とする実質的に第１４図に示したプロ
モータ（６０）そのアミノ末端において、同相で、請求
項（５７）または（５８）記載のヌクレオチド配列より
なる構造遺伝子またはその断片、またはその機能的もし
くは化学的誘導体。 （６１）請求項（６０）記載の構造遺伝子よりなるＤＮ
Ａ発現ベクター。 （６２）請求項（６１）記載の該ベクターで形質転換し
た宿主細胞。 （６３）内部調節蛋白（ＩＲＰ）。 （６４） I 、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱ
ＤＧＶ；II、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫ
ＩＥＱＤＧ；III、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥ
ＤＱＫＩＥＱＤ；IV、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤ
ＥＤＱＫＩＥＱ；Ｖ、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤ
ＥＤＱＫＩＥ；VI、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥ
ＤＱＫＩ；VII、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤ
ＱＫ；VIII、ＭＬＣＣＭＲＲＴＱＶＥＫＮＤＥＤＱ；I
X、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤ；Ｘ、ＭＬＣ
ＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥ； Ｘ I 、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤ； ＸII、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮ； ＸIII、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫ； ＸIV、ＭＬＣＣＭＲＲＴＱＶＥ； ＸＶ、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶ； ＸVI、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱ； ＸVII、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫ； ＸVIII、ＭＬＣＣＭＲＲＴ； ＸIX、ＭＬＣＣＭＲＲ； ＸＸ、ＭＬＣＣＭＲ； ＸＸ I 、ＭＬＣＣＭ； ＸＸII、ＭＬＣＣ；および ＸＸIII、その機能的誘導体 よりなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＩＲＰ
ペプチド。 （６５）請求項（６４）記載のＩＲＰペプチドをコード
付けするヌクレオチド配列。 （６６）コンセンサスアミノ酸配列： 疎水性−ｌｅｕ−ｃｙｓ−ｃｙｓ−ｘ−塩基性−塩基性
を有するＩＲＰペプチドまたはその機能性誘導体。 （６７）該システインがパルミチル化し易い請求項（６
４）または（６６）記載のＩＲＰペプチド。 （６８）所望の蛋白およびその結合基質よりなる環境に
有効量のＩＲＰペプチドを導入することを特徴とする該
所望の蛋白の結合活性を変調する方法。 （６９）該所望の蛋白がＧ蛋白である請求項（６８）記
載の方法。 （７０）該Ｇ蛋白がＧ＿０である請求項（６９）記載の
方法。 （７１）該ＩＲＰペプチドが請求項（６４）、（６６）
または（６７）記載のペプチドである請求項（６８）記
載の方法。 （７２）該環境が生きた細胞の内部である請求項（６８
）記載の方法。 （７３）該細胞が中枢神経または末梢神経細胞である請
求項（７２）記載の方法。 （７４）該結合基質がＧＴＰである請求項（６９）記載
の方法。 （７５）請求項（６４）または（６６）記載のＩＲＰペ
プチドに対し定方向化された抗体、またはその機能的も
しくは化学的誘導体であって、該抗体またはその該誘導
体か所望により検出可能にまたは治療可能に標識された
ことを特徴とする当該抗体、またはその機能的もしくは
化学的誘導体。 （７６）抗体がモノクローナル抗体である請求項（７５
）記載の抗体。 （７７）医薬上許容される担体と共に、請求項（６４）
または（６６）記載のＩＲＰペプチドよりなり、かつ、
所望により、１種またはそれ以上の治療上有効な剤より
なる医薬組成物。 （７８）医薬上許容される担体と共に、請求項（７５）
記載の抗体よりなり、かつ、所望により、１種またはそ
れ以上の治療上有効な剤よりなる医薬組成物。 （７９）請求項（７７）または（７８）記載の組成物の
有効量を神経細胞に投与することを特徴とする該神経細
胞において構造再編成を変調する方法。 （８０）所望の蛋白およびその結合基質からなる環境中
にスクリーニングしたい物質を導入し、該物質の非存在
下での基質結合に対する基質結合の増加または減少を測
定することを特徴とする所望の蛋白の結合活性を変調す
る能力を有する物質に関するスクリーニング方法。 （８１）所望の蛋白がＧ蛋白である請求項（８０）記載
の方法。 （８２）Ｇ蛋白がＧ＿０である請求項（８１）記載の方
法。 （８３）ＧＡＰ−４３に特異的に結合し、３９０００の
分子量を有し、５０ｍＭトリス緩衝液中のＥＤＴＡの適
用で単一のハンドにて溶出し、かつ対Ｇ＿０ポリクロー
ナル抗体と非反応性であることを特徴とする神経成長関
連蛋白。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US54645390A | 1990-07-02 | 1990-07-02 | |
| US546453 | 1990-07-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0466595A true JPH0466595A (ja) | 1992-03-02 |
Family
ID=24180485
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2290615A Pending JPH0466595A (ja) | 1990-07-02 | 1990-10-26 | 哺乳動物ｇａｐ―４３組成物および使用方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0466595A (ja) |
| KR (1) | KR920002779A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009005694A (ja) * | 2000-10-13 | 2009-01-15 | Xigen Sa | 新規なトランスポーターペプチド配列による生物学的エフェクターの細胞内送達 |
| US8183339B1 (en) | 1999-10-12 | 2012-05-22 | Xigen S.A. | Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway |
-
1990
- 1990-10-26 JP JP2290615A patent/JPH0466595A/ja active Pending
- 1990-10-26 KR KR1019900017212A patent/KR920002779A/ko not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8183339B1 (en) | 1999-10-12 | 2012-05-22 | Xigen S.A. | Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway |
| US8278413B2 (en) | 1999-10-12 | 2012-10-02 | Xigen Sa | Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway |
| JP2009005694A (ja) * | 2000-10-13 | 2009-01-15 | Xigen Sa | 新規なトランスポーターペプチド配列による生物学的エフェクターの細胞内送達 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR920002779A (ko) | 1992-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Honda et al. | The coxsackievirus-adenovirus receptor protein as a cell adhesion molecule in the developing mouse brain | |
| Sekine et al. | A novel microtubule-based motor protein (KIF4) for organelle transports, whose expression is regulated developmentally. | |
| ES2329635T3 (es) | Secuencias de nucleotidos y proteinas de los genes nogo y metodos basados en estas. | |
| EP0813545B1 (en) | Nucleotide and protein sequences of vertebrate serrate genes and methods based thereon | |
| Velichkova et al. | A human homologue of Drosophila kelch associates with myosin‐VIIa in specialized adhesion junctions | |
| JP4216326B2 (ja) | ヒト神経ペプチドｙ／ペプチドｙｙ／膵臓ポリペプチド受容体（ｙ４）をコードしたｄｎａ、及び該ｄｎａの使用 | |
| JPH09509314A (ja) | 神経ペプチドｙ／ペプチドｙｙ（ｙ２）受容体をコードした核酸、及び該核酸の使用 | |
| JPH09509570A (ja) | Ｍｔｓ−１遺伝子により転移性癌の診断 | |
| JP2001517075A (ja) | 組換え血管内皮細胞増殖因子ｄ（ｖｅｇｆ―ｄ） | |
| JPH10510709A (ja) | 摂食行動を変える方法、該方法に有用な化合物、および視床下部の異型神経ペプチドｙ／ペプチドｙｙ受容体（ｙ５）をコードするｄｎａ | |
| WO1998057621A1 (en) | Angiogenic modulation by notch signal transduction | |
| JP2002514055A (ja) | ガラニンｇａｌｒ３受容体をコードするｄｎａおよびその使用 | |
| AU672768B2 (en) | DNA encoding a human 5-HT-1E receptor and uses thereof | |
| JP2000516456A (ja) | 視床下部特異的ポリペプチド | |
| JPH07509600A (ja) | ニューロトロフィン−４発現に基づく治療および診断法 | |
| WO1992018138A1 (en) | Mammalian gap-43 compositions and methods of use | |
| WO1994004562A9 (en) | Mammalian gap-43 compositions and methods of use | |
| WO1994004562A1 (en) | Mammalian gap-43 compositions and methods of use | |
| JPH03169896A (ja) | 脳因子 | |
| JPH0466595A (ja) | 哺乳動物ｇａｐ―４３組成物および使用方法 | |
| CA2389662A1 (en) | Pentraxin i and pentraxin receptor, inhibitors of said proteins and pharmaceutical compositions containing said compounds | |
| JPH08511432A (ja) | Ｃｒｆ（副腎皮質刺激ホルモン放出因子）レセプターのクローニングおよび組換体の産生 | |
| Rushlow et al. | Characterization of CArG-binding protein A initially identified by differential display | |
| JPH06509940A (ja) | ボンベシン様ペプチドに対するレセプター | |
| JP2001522228A (ja) | 活性依存性向神経第▲ｉｉｉ▼因子（ａｄｎｆ▲ｉｉｉ▼） |