JPH09509314A - 神経ペプチドｙ／ペプチドｙｙ（ｙ２）受容体をコードした核酸、及び該核酸の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Y2受容体をコードする単離された核酸分子、Y2受容体である単離された蛋白質、Y2受容体をコードする単離された核酸分子を備えたベクタ、前記ベクタを備えた哺乳類、昆虫、細菌、及び酵母細胞、Y2受容体に対する抗体、Y2受容体をコードする核酸の検出に有益な核酸プローブ、Y2受容体をコードする核酸分子のユニークな配列に対して相補的であるアンチセンス・オリゴヌクレオチド、Y2受容体に関連した薬学的組成物、及び正常又は変異体のY2受容体をコードする核酸を発現するヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。本発明は更に、リガンド結合の決定、発現検出、薬剤スクリーニング、及びヒトY2受容体が関与する治療のための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の名称］ 神経ペプチドY／ペプチドYY（Y2）受容体をコードした核酸、及び該核酸の使 用 ［発明の背景］ 本願は、1994年2月3日に出願された合衆国特許出願第08/192,288号に関する 一部継続出願であり、その内容は、参照として本願に組み込まれる。 本願明細書の全体を通して、括弧のなかに数字を記載することにより種々の 刊行物を引用する。これらの引用文献は、請求の範囲の直前の、明細書の末尾に 記述する。これらの刊行物の開示は、本発明に関わる技術をより完全に記載する ために、参照として本明細書に組み込まれる。 神経ペプチドは、ペプチド性ニューロン及び内分泌／傍分泌細胞が合成する 、大型の前駆体蛋白質由来の小型ペプチドである。神経ペプチドは神経学的、精 神医学的、及び内分泌的疾患の治療に対して有望である（46）。当該前駆体は、 数種の生物学的活性をもつ数種のペプチドをもつことがよくある。脳内の神経ペ プチドには非常に大きな多様性があるが、これは遺伝子の初期転写物の二者択一 的(alternative)スプライシング及び、前駆体の異なるプロセッシングによって 生じるものである。神経ペプチド受容体はリガンド間の違いを区別したり、適当 なシグナルを活性化するのに役立っている。 神経ペプチドY（NPY）は、36アミノ酸からなるペプチドで、哺乳類の脳内で 同定される最も多い神経ペプチドである。NPYは中枢神経系及び末梢神経系にお ける重要な制御因子であり（47）、精神運動活性、食餌摂取、中枢内分泌物、循 環系における血管作動性を含む、非常に広い範囲で、生理学的要因に影響を与え る。環状動脈、大脳、及び腎臓の血管系に通じた交感神経には、NPYが高濃度で 存在し、血管狭窄を引き起こす。脾臓（48）、腸膜、脳（49）、大動脈平滑筋（ 50）、腎臓、睾丸、及び胎盤（2）といった種々の組織において、NPYの結合部位 が同定されている。更に、結合部位は数多くのラットやヒトの細胞株においても 報告されている（例えば、SK-N-MC、MC-IXC、CHP-212、及びPC12細胞中のY1；SK -N-Be(2)、CHP-234、及びSMS-MSN細胞中のY2）（51、5）。 神経ペプチドY（NPY）受容体の薬理学は、現在のところ膵臓のポリペプチド ファミリ内での構造-活性の相関関係によって定義される。このファミリには、 主として 神経細胞で合成されるNPY、主として腸の内分泌細胞で合成されるペプチドYY(PY Y)、及び主として膵臓の内分泌細胞で合成される膵臓ポリペプチド(PP)がある。 これら36アミノ酸からなるペプチドは、該ペプチドの中心において、PP-折畳み を含むコンパクトな螺旋構造をとる。特異的な特徴としては、アミノ酸残基1か ら8までのポリプロリンヘリックス、9から14までのベータ-ターン、15から30ま でのアルファ-ヘリックス、30から36までの外側に突き出したC末端、及び生物学 的活性に重要なカルボキシ末端アミド（3）がある。該ペプチドは、Y1、Y2、Y3 、及びPPとして知られる少なくとも4種類の受容体サブタイプを定義するのに使 われてきた。NPYによるY1受容体の認識には、該ペプチドのN末端及びC末端の領 域が関わり、Gln³⁴のPro³⁴への置換は十分に良く許容される（3、4、5）。NPYに よるY2受容体認識は主に、両親媒性αヘリックス（3、6、7）の後のC末端の4つ の塩基（Arg³³-Gln³⁴-Arg³⁵-Tyr³⁶-NH₂）に依存し、Gln³⁴のPro³⁴への置換は許 容されない(4、5)。Y3受容体認識は、PYYよりもNPYに対する強い優先度を有する ことで特徴付けられる（8）。Y3受容体はGln³⁴のPro³⁴への置換を許容するが、P PはPro³⁴を含んでいるのに良く結合しない（8）。PP受容体はPPに強く結合し、 ［Leu³¹,Pro³⁴］NPYに対してはより弱く、またNPYに対しては更に弱く結合する ことが報告されている（3、9）。現在までにクローニングされている唯一のNPY 受容体は、マウス（12）、ラット（52）、ヒト(10)のY1受容体のみである。Y1と Y2とを区別する主な薬理学的特徴は、Y1受容体（Y2受容体ではなくて）は31番目 と34番目とで修飾されたNPYの類縁体（Leu³¹,Pro³⁴］NPY）に応答するが、一方Y 2受容体（Y1受容体ではなくて）は、NPYペプチドのC末端断片のNPY-(13-36)に対 して高親和性であるという事実である（53、4）。 構造的に関連した他の二つのペプチドである、ペプチドYY（PYY）及び膵臓 ポリペプチド（PP）、に対する受容体遺伝子もまた、クローニングされていない 。ペプチドYYは主に下部消化器管の内分泌細胞内で存在する（54）。当初、PYY 受容体は、ラットの小腸で発見された（55）。この受容体はPYY-優先性であるが 、これはNPYに対する親和性よりもPYYに対する親和性の方が、5から10倍も高い ためである（55、56）。最近、腎臓の近位尿細管由来の細胞株、PKSV-PCTが、PY Y受容体を発現することが報告されている（57）。 この数年間の間にラットとヒトのY1 cDNAのみがクローニングされている（1 0、11）。この成功はランダムにクローニングされた「オーファン（孤児）受容 体」FC5 の同定に基づいている。我々は本願で、発現クローニングによる、ヒト海馬のY2 cDNAクローン1つ、及びラットY2クローン2つの分離と、それらの薬理学的特徴づ けについて報告する。 ［発明の要約］ この発明は、Y2受容体をコードする単離された核酸分子を提供する。 この発明はまた、Y2受容体である単離された蛋白質を提供する。 この発明は、Y2受容体をコードする単離された核酸分子を備えたベクタを提 供する。 この発明はまた、Y2受容体をコードする分子を備えた、細菌細胞内、酵母細 胞内、昆虫細胞内、又は哺乳類細胞内での発現に適用される、プラスミド様なベ クタであって、それぞれ細菌細胞内、酵母細胞内、昆虫細胞内、哺乳類細胞内で 発現するのに必要な制御配列を更に備え、該制御配列が、Y2受容体をコードする 核酸に対してその発現が可能なように連結されているベクタを提供する。 この発明は、Y2受容体をコードする核酸で形質転換されて、該受容体を発現 している細胞を提供する。 この発明は、核酸プローブであって、Y2受容体をコードした核酸分子中の配 列に含まれるユニークな配列と特異的にハイブリダイズすることができる、少な くとも15ヌクレオチドの長さの核酸分子を備えた核酸プローブを提供する。 この発明は、アンチセンスのオリゴヌクレオチドであって、Y2受容体をコー ドするmRNAのいかなる配列とも特異的にハイブリダイゼーションし、該mRNAの翻 訳を阻止するような配列を有するアンチセンスのオリゴヌクレオチドを提供する 。 この発明は、Y2受容体に対する抗体を提供する。 この発明は、Y2受容体をコードする核酸を発現する、ヒト以外のトランスジ ェニック哺乳動物を提供する。この発明は更に、ヒト以外のトランスジェニック 哺乳動物であって、そのゲノムがY2受容体をコードしたDNAに対して相補的なア ンチセンスDNAを備えており、該アンチセンスDNAは、Y2受容体をコードしたmRNA に対して相補的で且つ該受容体をコードしたmRNAにハイブリダイゼーションする ことによりその翻訳を減少させるアンチセンスmRNAへと転写されるように配置さ れている、ヒト以外のトランスジェニック哺乳類を提供する。 この発明は更に、相同組み換えによるY2受容体のノックアウトを含む、ヒト 以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。 この発明は、リガンドがY2受容体に特異的に結合するかどうかを決定する方 法で あって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している 細胞を、該受容体にリガンドが結合するような条件下で前記リガンドに接触させ ることと、該受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによっ て前記リガンドがY2受容体に特異的に結合するか否かを決定することを備えた方 法を提供する。 この発明はまた、リガンドがY2受容体の作用薬であるか否かを決定する方法 であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現してい る細胞を、該細胞からのY2受容体機能性応答の活性化を行わせる条件下で前記リ ガンドに接触させることと、セカンドメッセンジャ応答のようなバイオアッセイ によってY2受容体活性の上昇を検出し、それによって前記リガンドがY2受容体作 用薬であるかを決定することとを備えた方法を提供する。 この発明は更に、リガンドがY2受容体の拮抗薬であるか否かを決定する方法 であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現してい る細胞を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、NPYの様な既知のY2受 容体作用薬の存在下で前記リガンドに接触させることと、セカンドメッセンジャ 応答のようなバイオアッセイによりY2受容体活性の低下を検出し、それによって 前記リガンドがY2受容体拮抗薬であるか否かを決定することとを備えた方法を提 供する。 この発明は更に、細胞表面上のY2受容体に特異的に結合する薬剤を同定する ためのスクリーニング方法であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換され て、該受容体を発現している細胞を、薬剤が前記Y2受容体に結合する条件下で複 数の薬剤と接触させることと、該形質転換細胞に結合する薬剤を決定し、それに よってY2受容体に特異的に結合する薬剤を同定することとを備えた方法を提供す る。 この発明はまた、Y2受容体の拮抗薬として機能する薬剤をスクリーニングす る方法であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現 している細胞を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、NPYの様な既知 のY2受容体作用薬の存在下で複数の薬剤と接触させることと、セカンドメッセン ジャ・アッセイの様なバイオアッセイによって該受容体を活性化する薬剤を決定 し、それによってY2受容体拮抗薬を同定することとを備えた方法を提供する。 この発明はまた、Y2受容体をコードするmRNAを検出することにより、Y2受容 体の細胞での発現を検出する方法であって、細胞より全mRNAを分離することと、 得られ た該mRNAをハイブリダイゼーション条件下で、Y2受容体をコードした核酸分子中 の配列に含まれるユニークな配列と特異的にハイブリダイズすることができる、 少なくとも15ヌクレオチドの長さの核酸分子を備えた核酸プローブに接触させる ことと、該プローブにハイブリダイゼーションしたmRNAの存在を検出し、それに よって該細胞によるY2受容体の発現を検出することとを備えた方法を提供する。 この発明は、Y2受容体を種々のレベルで発現することの生理学的効果を決定 する方法であって、Y2受容体の発現を調節する誘導プロモータの使用により、Y2 受容体の発現レベルが変化するような、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物 を作り出すことを備えた方法を提供する。 この発明はまた、Y2受容体を種々のレベルで発現することの生理学的効果を 決定する方法であって、それぞれが異なる量のY2受容体を発現するヒト以外のト ランスジェニック哺乳動物のパネルを作り出すことを備えた方法を提供する。 この発明は、ヒトY2受容体の特異的対立遺伝子の作用に関わる疾患の疾病素 質を診断する方法であって、以下のステップを備えた方法を提供する： a)疾患をもつ患者より核酸を取得すること； b)一連の制限酵素を使って上記核酸の制限酵素による消化を行うこと； c)前記の消化済み核酸断片を分離ゲルを使って電気泳動的に分離すること； d)電気泳動の終了したゲルを、Y2受容体と特異的にハイブリダイゼーションす ることができ、且つ検出可能な標識でラベルされたプローブと接触させること； e)Y2受容体をコードした核酸にハイブリダイゼーションして検出可能な標識で ラベルされた標識済みバンドを検出し、前記疾患にかかった患者のDNAに特異的 なバンドバターンを作成すること； f)上記ステップa-eの方法による診断用に得た核酸を調製すること； g)ステップeの、前記疾患にかかった患者の核酸に特異的なバンドパターンを 、ステップfで、診断用に得た核酸いついてのパターンと比較して、両パターン が同じか異なるかを決定し、その結果同じであれば疾患の疾病素質ありと診断す ること。 この発明は、単離精製されたY2受容体を調製する方法であり、細胞内での発 現に適用されるベクタの構築であって、該ベクタはY2受容体を発現するように、 該受容体をコードしている核酸に対して機能可能なように連結された、細胞内で の核酸の発現に必要な制御配列を備えており、前記細胞は、細菌細胞、酵母細胞 、昆虫細胞、 及び哺乳類細胞からなる群から選ばれる、ベクタの構築と、前記のベクタを適切 な宿主細胞へ導入することと、前記の細胞を、Y2受容体の発現を許容する条件下 でインキュベーションすることと、上記のように発現された受容体を回収するこ とと、上記のようにして回収された受容体を精製することにより、単離精製Y4受 容体を調製することとを備えた方法を提供する。 ［図の簡単な説明］ 図1 ヒト海馬のY2 cDNAクローンのヌクレオチド配列（配列認識番号1）。開 始コドン及び終止コドンは太字で示したある。5′及び3’の非翻訳領域はその一 部のみを示してある。 図2 図1のヌクレオチド配列（配列認識番号1）がコードするヒト海馬Y2 cDNA クローンの推定アミノ酸配列。 図3-1から図3-4 ヒト海馬Y2（上側）とY1ヒトcDNAクローン（下側）との間の コードヌクレオチド配列の比較（48.5％のヌクレオチド相同性）。 図4-1から図4-2 ヒト海馬Y2（上側）とY1ヒトcDNAクローン（下側）との間の アミノ酸配列の比較（全体では31％、膜貫通領域では41％の相同性）。 図5A CG-13(●)及びヒトY1（○）を一過性発現しているCOS-7細胞由来の膜に 対する、¹²⁵I-PYYの平衡結合。100nMのヒトNPYの存在下または非存在下で、膜を 表示した時間だけ¹²⁵I-PYYとインキュベーションした。特異的結合Bを、時間tに 対してプロットして、平衡結合部位の最大数であるB₁及びB₂、観測結合速度であ るK_obs1及びK_obs2を、以下の方程式に基づいて求めた。 B=B₁*(1-e^-(Kobs1*t))+B₂(1-e^-(Kobs2*t)) 結合は、非線形回帰分析で決定した全平衡結合である、B₁+B₂に対する割合で 表示しである。データは各点につき3回測定した実験を3回行って得たものである 。 図5B CG-13(●)及びヒトY1（○）を一過性発現しているCOS-7細胞由来の膜に 対する、¹²⁵I-PYYの平衡結合（時間が180分まで延長したこと以外は図5Aと同じ 条件である）。 図6 CG-13受容体を一過性発現しているCOS-7細胞由来の膜に対する、¹²⁵I-PY Yの飽和可能な平衡結合。100nMのヒトNPYの存在下または非存在下で、膜を0.003 nMから 2nMの範囲の¹²⁵I-PYYとインキュベーションした。特異的結合を遊離型¹²⁵I-PYY 濃度[L]に対してプロットして、方程式、B=B_max[L]/([L]＋K_d)により、最大飽和 結合部位数B_max、及び¹²⁵I-PYYの平衡解離定数Kdを求めた。特異的結合を示して ある。データは各点につき3回測定した実験を3回行って得たものである。 図7A ヒトY1受容体を一過性発現したCOS-7細胞由来の膜上での、¹²⁵I-PYYの 競合的置換。膜を¹²⁵I-PYYとインキュベーションする際に、ペプチド競合剤を増 加させた異なる濃度で加えた。50％置換に対応するIC50を非線形回帰分析により 決定し、方程式Ki=IC50/(1+[L]/Kd)をもとにしてKi値に変換した（[L]は¹²⁵I-PY Yの濃度であり、K_dは¹²⁵I-PYYの平衡解離定数である）。データは、各点におい て1または2回測定した独立の実験を少なくとも2回行ったものである。これらの 化合物及びそのほかの化合物の親和性に関する順位序列の比較は、表2にそれぞ れ別にして示してある。 図7B ヒトY2受容体を一過性発現したCOS-7細胞由来の膜上での、¹²⁵I-PYYの 競合的置換。膜を¹²⁵I-PYYとインキュベーションする際に、ペプチド競合剤を増 加させた異なる濃度で加えた。50％置換に対応するIC₅₀を非線形回帰分析により 決定し、方程式K_i=IC₅₀/(1+[L]/K_d)をもとにしてK_i値に変換した（[L]は¹²⁵I-PY Yの濃度であり、Kdは¹²⁵I-PYYの平衡解離定数である）。データは、各点におい て1または2回測定した独立の実験を少なくとも2回行ったものである。これらの 化合物及びそのほかの化合物の親和性に関する順位序列の比較は、表2にそれぞ れ別にして示してある。 図8 rs5aがコードしているラットY2受容体のヌクレオチド配列（配列認識番 号3）及び推定アミノ酸配列（配列認識番号4）。ヌクレオチドは5′から3′への 方向に表示されていて、コード領域の番号は、仮の開始メチオニンから始まり終 止コドンで終わっている。長いオープンリーディングフレームの翻訳の推定アミ ノ酸配列を一文字表示で表した。 図9 rs26aがコードしているラットY2受容体のヌクレオチド配列（配列認識番 号5）及び推定アミノ酸配列（配列認識番号6）。ヌクレオチドは5′から3′への 方向に表示されていて、コード領域の番号は、仮の開始メチオニンから始まり終 止コドンで終 わっている。長いオープンリーディングフレームの翻訳の推定アミノ酸配列を一 文字表示で表した。 図10 ラットとヒトのY2を整列させた比較：ヌクレオチド配列。ヒトY2受容体 (HumY2)、rs5aがコードしているラットY2受容体(RatY2a)、及びrs26a(RatY2b)を 示してある；rs26a(RatY2b)のヌクレオチド配列はrs5a(RatY2a)と、示してある 部分以外は相同である。ラットとヒトのY2のヌクレオチドは、コード領域におい て約86％の相同性がある。 図11 ラットとヒトのY2を整列させた比較：アミノ酸配列。ヒトY2受容体(Hum Y2)、及びrs5aがコードしているラットY2受容体(RatY2a)の完全な推定アミノ酸 配列を示してある；rs26a(RatY2b)のアミノ酸配列はrs5a(RatY2a)と、示してあ る部分以外は相同である。ラットとヒトのY2のアミノ酸配列は全体で約94％、膜 貫通領域（括弧部分）で約98%の相同性がある。アミノ酸の一文字略記を示して ある。 図12 ラット中枢神経系における、ラットY2mRNAの局在下。放射性標識したオ リゴヌクレオチドとin situ ハイブリダイゼーション組織化学とで得た、神経ペ プチドYY2受容体のmRNAの局在化を表す、ラットの能の半冠状切片の概要図。星 印は標識されたニューロンのポピュレーションを示すが、それぞれの範囲で観察 できる細胞の数を示しているものではない。 図13 標識済みリガンドのY2受容体への結合にあたえる、Gpp(NH)pの影響。結 合データは、100nMのGpp(NH)pの存在下（●）または非存在下（○）での競合置 換アッセイより得た。対照の条件下では（Gpp(NH)pの非存在下）で検出された最 大特異的結合を使ってデータの標準化を行った。A)ヒトY2受容体を一過性発現し たCOS-7細胞、B)ラットY2a受容体を一過性発現したCOS-7細胞。 図14 ヒトY2受容体を安定発現したLM(tk-)生細胞における、フォルスコリン- 刺激性cAMP蓄積の阻止。5分間にわたって10μMのフォルスコリンで刺激した293 細胞中の、cAMPに関するラジオイミュノアッセイにより関数データを求めた。同 じ時間だけ、 ヒトPYYの作用剤としての活性を試験した。データは非線形回帰法により、4変数 ロジスティック（logistic）方程式に適合させた。安定発現した293細胞（●） 及び安定発現したNIH-3T3細胞（○）から求めたデータ。データは10（●）また は2つの（○）独立した実験を表している。 図15 ヒトY2受容体を安定発現している293生細胞中の細胞内遊離カルシウム 濃度の刺激。A)経時変化。1μMのヒトPYYを矢印で示した時間だけ刺激した時の 、生細胞中のFura-2/AM蛍光から機能データを求めた。B)経時変化。細胞外溶液 に1mMのEGTAを加えたこと以外はAと同様にして、細胞を1μMのヒトPYYで刺激し た。C)ヒトY2受容体の安定に発現した293細胞におけるPYY依存型の細胞内カルシ ウム動員の濃度/応答曲線。データは非線形回帰法により、4変数ロジスティック （logistic）方程式に適合させた。データは少なくとも2つの独立した実験を表 したものである。 図16 ヒトの脳の種々の領域のノーザン分析。実験の詳細な説明の項で示した ように、高厳密度条件下でハイブリダイゼーションを行った。プローブは、(図1 0に示した様に)ヒトNPY Y2受容体のコード領域全体に対応し、³²Pで標識された DNA断片（比活性は3 X 10⁹cpm/μg）である。BRL RNAラダーを分子量マーカーと して使った。 図17 ヒトNPYY2受容体サブタイプをコードしたゲノムDNAのサザン分析。実験 の詳細な説明の項で示したように、高厳密度条件下でハイブリダイゼーションを 行った。プローブは、（図11に示した様に）ヒトNPY Y2受容体のTM1-TM5領域に 対応し、³²Pで標識されたDNA断片（比活性は2.5 X 10⁹cpm/μg）である。λDNA のHIndIII消化物を分子量マーカーとして使った。 図18 NPY Y2オリゴヌクレオチドプローブの特異性のための幾つかの対照（A 、B）ラットの脳におけるハイブリダイゼーションシグナルの組織分布（C、D） を示す顕微鏡写真。A.ラットY2DNAで形質転換したCOS-7細胞上の、標識済みアン チセンスプローブを使って得た、ハイブリダイゼーションシグナルの暗視野顕微 鏡写真。B．形質転換したCOS-7細胞上の、標識済みセンスプローブでハイブリダ イゼーションした後に得た、ハイブリダイゼーションシグナル。アンチセンスの プローブのみが、形 質転換された細胞にハイブリダイゼーションした。C.ラット海馬のCA3領域で得 られたハイブリダイゼーションシグナルの明視野顕微鏡写真。銀色の粒子（矢印 ）が、錐体細胞層（sp）の神経細胞体全体に見られたが、透明層（slu）や放線 状層（sr）には見られなかった。D．視床下部の弓状核の神経細胞（矢印）全体 に、ハイブリダイゼーションシグナル。第三脳室の上皮層が、顕微鏡写真の左側 (星印)に見られる。 ［発明の詳細な説明］ この出願を通じて、以下の省略法によりヌクレオチドを記述する。 C=シトシン、A=アデニン、T=チミン、G=グアニン。 この発明は、Y2受容体をコードした分離核酸分子を提供する。一つの態様に おいて、コードされた該Y2受容体は、ヒトのY2受容体である。別の熊様において 、該Y2受容体はラットY2受容体である。ここで使用されるY2受容体という用語は 、表2から4、及び図5Aから7Bに示されるような、主題のヒトY2受容体と実質的に 同じ薬理学を有する何れのアミノ酸配列、ポリペプチド、または蛋白質をも包含 する。ここで記述されているように、我々がクローニングした受容体は、NPY受 容体サブタイプのY1及びY3）、PYY受容体、及びPP受容体とも異なるY2薬理学的 特徴を有し、そのためY2受容体と命名されている。 現在までにクローニングされている唯一のNPY受容体は、マウス（Evaら、19 92）、ラット（Evaら、1990）及びヒト(Larhammarら、1992)から単離したY1受容 体遺伝子である。該Y2受容体と、GenBank/EMBLデータベースに開示されている既 知の配列との間で最も相同性の高い配列は、ヒトY1受容体で、全体の相同性が42 ％である。 本発明は、Y2受容体をコードする単離された核酸分子を提供する。一つの態 様において該Y2受容体は、ヒトY2受容体である。ここで使用される「単離された 核酸分子」という用語は、自然界では発生しないような形態を有した分子である 核酸分子のことを意味する。該単離核酸分子の例は、Y2受容体をコードした、RN A、DNA、または単離されたゲノムDNA分子である。ヒトY2受容体は図2に示された 推定のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をしており、図2に示されたア ミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するヒト受容体はいかなるものでも 、ヒトY2受容体と定義ざれる。ラットY2受容体は図8または図9に示された推定の アミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をしている。ヒトY2受容体を単離する もう一つの方法は、当該分野でよく知られた方法により、ヒトゲノムライブラリ を、天然のまたは人工的に設計したDNAプローブで調べることである。この目的 のためには、ヒト受容体遺伝子Y2由来のDNAプローブは特に有用である。ヒトY2 受容体をコードしたDNA及びcDNA分子は、ヒト、哺乳類、またはその他の動物か ら、ゲノムDNA、cDNA、またはRNAを得るために、または以下に詳しく記述する方 法により、cDNAもしくはゲノムライブラ リのスクリーニングによって、関連したcDNAもしくはゲノムクローンを単離する ために使用することができる。それによって、単離したクローンの5’非翻訳領 域の転写制御配列、並びに単離遺伝子の3’及び5’非翻訳領域の安定性、プロセ ッシング、転写、翻訳、及び組織特異性決定の領域が得られる。核酸分子の例は 、Y2受容体をコードしたRNA、cDNA、または単離されたゲノムDNA分子である。該 分子は、図1、8または9に記載されたようなコード配列を有することが可能であ る。図1のDNAは、ヒトY2受容体蛋白質をコードしている。図8及び9のDNAは、ラ ットY2受容体のアミノ酸配列二つをコードしている。 本発明は更に、図1、8、及び9に記載のコード配列と実質的に同じコード配 列を有するY2受容体をコードしたDNAを提供する。これらの分子は上記した方法 により得ることができる。 本発明はまた、Y2受容体をコードした単離された核酸分子であって、前記核 酸分子が、膜貫通領域のアミノ酸配列で特徴付けされる受容体をコードしていて 、該アミノ酸配列が、図11に示されたヒトY2受容体の膜貫通領域のアミノ酸配列 と60%以上の相同性を有する、単離された核酸分子を提供する。 本発明は、Y2受容体である単離された精製蛋白質を提供する。一つの態様に おいて該Y2受容体は、ヒトY2受容体蛋白質である。別の態様において該Y2受容体 は、ラットY2受容体蛋白質である。ここで使用される「単離された蛋白質」とい う用語は、他の細胞構成物を含まない蛋白質分子を意味する。そのような蛋白質 の例は、図2、8及び9に記載のヒトY2受容体のアミノ酸配列、及び二つのラットY 2受容体のアミノ酸配列と実質的に同じなアミノ酸配列を有する、単離された蛋 白質である。単離されたY2受容体を得る一つの方法は、該受容体をコードするDN Aを、当該技術分野で知られた方法で、細菌、酵母、昆虫または哺乳類細胞など の適切な宿主で発現し、該宿主で発現した該受容体蛋白質を再び、当該技術分野 でよく知られた方法により回収することである。該受容体はまた、それを発現し ている細胞、特に以下に詳しく記述した発現ベクタで形質転換した細胞から単離 することが可能である。 この発明は、Y2受容体をコードした、DNA、RNA、またはcDNAの様な単離され た核酸分子を備えたベクタを提供する。一つの態様において該Y2受容体は、ヒト Y2受容体である。別の態様において該Y2受容体は、ラットY2受容体である。ベク タの例は、バクテリオファージの様なウイルス（ラムダ・ファージの様な）、動 物ウイルス （ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、及びバキュロウイルスの様な）、 コスミド、プラスミド（Pharmasia，Piscataway，NJより入手可能なpUC18の様な ）、及びその他の組み換えベクタである。当該技術分野でよく知られた方法で、 核酸分子をベクタのゲノムへ挿入する。たとえば、挿入体及びベクタDNAを、共 にある制限酵素で処理して、互いに塩基対を形成するような相補的末端を両分子 に作り出すことが可能である。もう一方の方法では、ベクタの制限部位に対応し たリンカを、挿入体DNAに連結し、次に該連結体を、連結部で切断する制限酵素 で消化することが可能である。他の方法もまた可能である。該プラスミドの特定 な例としては、図1に記載のコード配列と実質的に同じコード配列を有するcDNA を備えて、CG-13クローンと命名されたもの（配列認識番号1）、または図8に記 載のコード配列と実質的に同じコード配列を有するゲノムDNAを備えて、rs5aと 命名されたもの（配列認識番号3）、または図9に記載のコード配列と実質的に同 じコード配列を有するゲノムDNAを備えて、rs26aと命名された（配列認識番号5 ）プラスミドがある。 この発明はまた、Y2受容体をコードする単離された核酸分子を備えた、細菌 細胞内、酵母細胞内、昆虫細胞内、又は哺乳類細胞内での発現に適用されるベク タであって、それぞれ細菌細胞内、酵母細胞内、昆虫細胞内、哺乳類細胞内で発 現するのに必要な制御配列を更に備え、該制御配列が、Y2受容体をコードするDN Aに対してその発現が可能なように連結されているベクタを提供する。図1に記載 のコード配列と実質的に同じコード配列を有する核酸は、該ベクタへ挿入されて ヒトY2を発現するのに有用に用いられる。図8及び9に記載のコード配列と実質的 に同じコード配列を有する核酸は、該ベクタへ挿入されてラットY2を発現するの に有用に用いられる。発現に必要な制御配列には、RNAポリメラーゼを結合する プロモータ配列、リボソームを結合する転写開始配列が含まれる。例を挙げると 、細菌性発現ベクタには、転写開始のための、lacプロモータの様なプロモータ 、及びシャイン−ダルガーノ配列及び開始コドンであるAUGが含まれる（Maniati sら、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory、1982）。同様に、 真核細胞発現ベクタには、RNAポリメラーゼ用の異種起源または相同起源のプロ モータ、下流のポリアデニレーション・シグナル、開始コドンAUG、及びリボソ ーム解離用の終止コドンが含まれる。更に、組み換えバキュロウイルスの様な昆 虫発現ベクタは、挿入遺伝子を昆虫細胞内で発現させるために、ポリヘドリン遺 伝子発現シグナルを利用する。このようなベクタは商業 的に入手可能であり、また当該技術分野においてよく知られた方法、たとえば上 記した一般的なベクタ作成方法によって、配列を組み立てて得ることも可能であ る。発現ベクタは、受容体を発現する細胞を作り出すのに有用である。このよう な細胞を使用の利用に関しては、以下に詳しく記載する。 この発明はまた、Y2受容体をコードする単離された核酸分子を備えた、細菌 細胞内、酵母細胞内、昆虫細胞内、又は特に哺乳類細胞内での発現に適用される プラスミドであって、それぞれ細菌細胞内、酵母細胞内、昆虫細胞内、哺乳類細 胞内で発現するのに必要な制御配列を更に備え、該制御配列が、Y2受容体をコー ドするDNAに対してその発現が可能なように連結されているベクタを提供する。 一つの態様において該Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様において該Y2 受容体は、ラットY2受容体である。哺乳類細胞での発現に適用されるプラスミド は、pSVL（Pharmnasia,Piscataway,NJより入手可能）、及びpcEXV-3（73）があ る。そのようなプラスミドの特定の例の一つとしては、哺乳類細胞内での発現に 適用されるプラスミドであって、図1に記載のコード配列と実質的に同じなコー ド配列と、哺乳類細胞内でのDNA発現に必要な制御配列とを備えたcDNAを有し、p cEXV-hY2と命名されて、1994年1月27日にATCC受入れ番号、75659のもとに寄託さ れたプラスミドがある。そのようなプラスミドの他の例としては、哺乳類細胞内 での発現に適用されるプラスミドであって、図8及び9に記載のコード配列と実質 的に同じなコード配列と、哺乳類細胞内でのDNA発現に必要な制御配列とを備え たcDNAを有し、pcEXV-rY2aと命名されて、1995年1月25日にATCC受入れ番号、970 35のもとに寄託されたプラスミド、及びpcEXV-rY2bと命名されて、1995年1月25 日にATCC受入れ番号、97036のもとに寄託されたプラスミドがある。当業者らは 、哺乳類細胞内での発現に適用される種々のプラスミドであって、Y2受容体をコ ードしたDNAと、該DNAを哺乳類細胞内で発現するために必要な制御配列とを備え たプラスミドは、すでに存在しているプラスミドを使って構築できるということ と、哺乳類細胞内でDNAを発現するのに必要な制御配列を含むように適用するこ ととが可能であるということを、評価するにあたって何ら問題はないであろう。 該プラスミドは、上記した方法により、発現及び一般的ベクタ用に構築すること が可能であり、また当該技術分野の他の方法によっても可能である。 上に議論した寄託物、及びここに議論する寄託物は、特許手続き上の微生物 の寄 託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じ、またこれを満たして、郵便番号 20852 メリーランド州ロックヴィル パークローン・ドライブ 12301 に所在 のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に奇託された。 本発明は、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現し ている細胞を提供する。一つの態様において該Y2受容体は、ヒトY2受容体である 。別の態様において該Y2受容体は、ラットY2受容体である。そのような細胞の例 としては、哺乳類細胞内での発現に適用されるプラスミドで形質転換された哺乳 類細胞であって、Y2受容体をコードした核酸分子と、該核酸分子の哺乳類細胞内 での発現に必要な制御配列で、それ自身の発現を許容するようにY2受容体をコー ドした核酸に連結されれいて、該蛋白質が細胞表面上で発現する様な細胞が挙げ られる。数多くの哺乳類細胞が宿主として用いられることが可能であるが、その 中には例として、マウス繊維芽細胞株であるNIH-3T3、CHO細胞、HeLa細胞、LM(t k-)細胞などがある。上述したような発現プラスミドは、リン酸カルシウム沈殿 法等の当該技術分野でよく知られた方法により、細胞を形質転換するのに用いる ことができるし、もしくはY2受容体をコードしたDNAを例えばマイクロインジェ クションによって細胞に導入し、Y2受容体をコードしたcDNA又はプラスミドの様 な核酸を具備した哺乳細胞を得ることができる。そのような特異的な例としては 、哺乳細胞内での発現に適応されたプラスミド、pcEXV-hY2を備えた細胞であっ て、Y2受容体をコードしたcDNAと、該DNAの哺乳類細胞での発現に必要な制御配 列とを備え、293-hY2-10と命名され、ATCC受入れ番号11837のもと1994年1月27日 に寄託されたものがある。そのような細胞の、別の特異的な例としては、哺乳細 胞内での発現に適応されたプラスミド、pcEXV-hY2を備えた細胞であって、Y2受 容体をコードしたcDNAと、該DNAの哺乳類細胞での発現に必要な制御配列とを備 え、N-hY2-5と命名され、ATCC受入れ番号CRL-11825のもと1994年1月25目に寄託 されたものがある。 本発明は、リガンドがY2受容体へ特異的に結合するか否かを決定する方法で あって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて該受容体を発現し、該蛋白 質を細胞表面に発現している細胞を、該受容体に結合することが知られているリ ガンドが結合する条件下で、リガンドと接触させることと、Y2受容体に結合する いかなるリガンドの存在をも検出し、それによって前記リガンドがY2受容体に特 異的に結合す るか否かを決定することとを備えた方法を提供する。一つの態様において該Y2受 容体は、ヒトY2受容体である。別の態様において該Y2受容体は、ラットY2受容体 である。 本発明は更に、リガンドがY2受容体へ特異的に結合するか否かを決定する方 法であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現して いる細胞を、該受容体にリガンドが結合するような条件下で前記リガンドに接触 させることと、該受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それに よって前記リガンドがY4受容体に特異的に結合するか否かを決定することとを備 えた方法であって、該Y4受容体が膜貫通領域のアミノ酸配列で特徴付けされ、該 アミノ酸配列が、図11に示されたヒトY2受容体の膜貫通領域のアミノ酸配列と60 %以上の相同性を有する方法を提供する。一つの態様において前記Y2受容体は、 ヒトY2受容体である。別の態様において前記Y2受容体は、ラットY2受容体である 。 本発明は、リガンドがY2受容体へ特異的に結合するか否かを決定する方法で あって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している 細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離すること と、該受容体にリガンドが結合するような条件下でリガンドを該膜画分に接触さ せることと、該Y2受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それに よって前記化合物がY2受容体に特異的に結合するか否かを決定することとを備え た方法を提供する。一つの熊様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。 別の態様において前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。 本発明は更に、リガンドがY2受容体の作用薬であるか否かを決定する方法を 提供する。ここでは、「作用薬」という用語は、Y2受容体の機能活性を上昇させ ることができるいかなるリガンドのことをも意味するものとして使われる。この 発明は、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している 細胞を、該細胞からのY2受容体機能性応答の活性化を行わせる条件下で前記リガ ンドに接触させることと、セカンドメッセンジャアッセイのようなバイオアッセ イによってY2受容体活性の上昇を検出し、それによって前記リガンドがY2受容体 作用薬であるかを 決定することとを備えている。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容 体である。別の態様において前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。 本発明は更に、リガンドがY2受容体の作用薬であるか否かを決定する方法で あって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している 細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離すること と、機能的Y2受容体活性を活性化するような条件下でリガンドを該膜画分に接触 させることと、セカンドメッセンジャの様なバイオアッセイによってY2受容体の 活性の上昇を検出し、それによって該リガンドがY2受容体作用薬であるかどうか を決定することを備えた方法を提供する。一つの態様において前記Y2受容体は、 ヒトY2受容体である。別の態様において前記Y2受容体は、ラットY2受容体である 。 本発明はまた、リガンドがY2受容体の拮抗薬であるか否かを決定する方法を 提供する。ここでは、「拮抗薬」という用語は、Y2受容体の機能活性を減少させ ることができるいかなるリガンドのことをも意味するものとして使われる。この 発明は、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している 細胞を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、NPYの様な既知のY2受容 体作用薬の存在下でリガンドと接触させることと、セカンドメッセンジャ・アッ セイの様なバイオアッセイにより、Y2受容体活性の減少を検出し、それによって 該リガンドがY2受容体拮抗薬であるかを決定することとを備えている。一つの態 様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様において前記Y2受容 体は、ラットY2受容体である。 本発明はまた、リガンドがY2受容体の拮抗薬であるか否かを同定する方法で あって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している 細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離すること と、該細胞抽出液の膜画分を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、NP Yの様な既知のY2受容体作用薬の存在下でリガンドと接触させることと、セカン ドメッセンジャ・アッセイの様なバイオアッセイにより、Y2受容体活性の減少を 検出し、それによって該リガンドがY2受容体拮抗薬であるか否かを決定すること とを備えた方法を提供 する。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様にお いて前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。 一つの態様において、セカンドメッセンジャアッセイは、細胞内cAMPの測定 を備えているものを言う。別の態様においては、セカンドメッセンジャアッセイ は、細胞内カルシウム動員の測定を備えている。 一つの態様において、上記した細胞中の核酸はY2受容体をコードし、図2に 示されたアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する。別の態様において は、上記した細胞中の核酸は図8又は図9に示されたアミノ酸配列と実質的に同じ アミノ酸配列を有する。一つの態様において、細胞は哺乳類細胞である。好まし くは、該哺乳類細胞は起源が非神経性である。非神経性の哺乳類細胞の例は、CO S-7細胞である。Y2受容体の機能アッセイに使うことができる、非神経性の哺乳 類細胞の他の例は、293ヒト胎児腎臓細胞、マウス胎児線維芽細胞のNIH-3T3、及 びLM(tk-)細胞である。 リガンドがY2受容体に結合するかどうかを決定する好ましい方法は、形質転 換されて、Y2受容体を発現している非神経性の哺乳類細胞（すなわち天然にはNP Y，PP，又はPYYのうちの何れも発現しなく、それゆえにそのような受容体は、細 胞に形質転換されたときのみに発現するような細胞）又はそのような細胞由来の 膜画分を、リガンドに、生体内でのリガンドのY2受容体への結合及び/又はY2受 容体の活性化を伴う、一般に行われている公知の条件下で接触させることと、該 細胞の表面のY2受容体へ結合した、調べたいかなるリガンドの存在も検出するこ と、又はY2受容体の活性化を検出することと、それにより、該リガンドが該受容 体に結合するか、Y2受容体の活性化を促すか阻害するかを決定することを備えて いる。Y2受容体の活性化は、セカンドメッセンジャアッセイで検出することがで きる。このような応答系は、フォスフォリパーゼC、アデニレートシクラーゼ、 グアニレートシクラーゼ、又はイオンチャンネルの様な所望のセカンドメッセン ジャ系を有する適切な宿主に、核酸を形質転換することで得られる。適切な細胞 系は、既存の細胞株から分離することが可能であり、又、セカンドメッセンジャ の適切な構成要素を既存の細胞株へ挿入することで作成することも可能である。 このような形質転換細胞は、上記した様なリガ ンドでY2受容体活性をアッセイしたり調査したりするのに完全な応答系を提供す る。形質転換系は、既存の又は候補の薬剤と、受容体に結合し放射性、分光学的 、又はそのほかの試薬で標識されたリガンドとの間の競合的結合アッセイ用の生 細胞培養として有益である。形質転換された細胞より分離され、受容体を含む膜 画分もまたY2受容体活性アッセイ及び競合的結合アッセイにとって有益である。 形質転換系におけるシグナル伝達系経路の機能的アッセイは、受容体を活性化す るリガンドの効率を決定する。形質転換系は、天然のもしくは合成の化合物であ って、更に修飾されるか、もしくはそのままで治療用化合物として、Y2受容体の 天然の機能を活性化、もしくは阻害する薬剤の開発の可能性のある化合物を同定 するのに役立つ「薬剤発見システム」を構成する。この形質転換系はまた、既知 の薬剤がY2受容体部位での親和性及び効率性を決定するのに有用である。 本発明は、薬学的組成物であって、上記した方法で決定されたのY2受容体作 用薬と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を提供する。ここで 使われる「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝塩液、水、並び に油／水、水／油エマルジョンの様なエマルジョン、及び種々のタイプの湿潤剤 を包含する。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態 様において前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。更に別の態様において前記 Y2受容体作用薬は、これまでに知られていない。 本発明は更に、薬学的組成物であって、上記した方法で決定された有効量の Y2受容体拮抗薬と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を提供す る。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様におい て前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。更に別の態様において前記Y2受容体 拮抗薬は、これまでに知られていない。 本発明は更に、細胞表面上のY2受容体に特異的に結合する薬剤を同定するた めのスクリーニング方法であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて 、該受容体を発現している細胞を、薬剤が前記Y2受容体に結合する条件下で複数 の薬剤と接触させることと、該形質転換細胞に結合する薬剤を決定し、それによ ってY2受容 体に特異的に結合する薬剤を同定することとを備えた方法を提供する。一つの態 様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様において前記Y2受容 体は、ラットY2受容体である。 本発明は更に、細胞表面上のY2受容体に特異的に結合する薬剤を同定するた めのスクリーニング方法であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて 、該受容体を発現している細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液 から膜画分を分離することと、薬剤が前記Y2受容体に結合する条件下で該膜分画 を複数の薬剤と接触させることと、該形質転換細胞に結合する薬剤を決定し、そ れによってY2受容体に特異的に結合する薬剤を同定することとを備えた方法を提 供する。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様に おいて前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。 本発明は更に、Y2受容体の作用薬として機能する薬剤をスクリーニングする 方法であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現し ている細胞を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、複数の薬剤と接触 させることと、セカンドメッセンジャ・アッセイの様なバイオアッセイによって 該Y2受容体を活性化する薬剤を決定し、それによってY2受容体作用薬を同定する こととを備えた方法を提供する。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受 容体である。別の態様において前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。更に別 の態様において前記Y2受容体作用薬は、これまでに知られていない。 本発明は、Y2受容体の作用薬として機能する薬剤をスクリーニングする方法 であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現してい る細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離するこ とと、該膜画分を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、複数の薬剤に 接触させることと、セカンドメッセンジャ・アッセイのようなバイオアッセイに よって該受容体を活性化する薬剤を決定し、それによってY2受容体作用薬を同定 することとを備えた方法を提供する。一つの熊様において前記Y2受容体は、ヒト Y2受容体である。別の態様において前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。更 に別の態様において前 記Y2受容体作用薬は、これまでに知られていない。 本発明は更に、Y2受容体の拮抗薬を同定するスクリーニングする方法であっ て、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞 を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、NPYの様な既知のY2受容体作 用薬の存在下で複数の薬剤に接触させることと、セカンドメッセンジャ・アッセ イのようなバイオアッセイにより、該受容体の活性化を阻害する薬剤を決定し、 それによってY2受容体拮抗薬を同定することとを備えた方法を提供する。一つの 態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様において前記Y2受 容体は、ラットY2受容体である。更に別の態様において前記Y2受容体作用薬は、 これまでに知られていない。 本発明は、Y2受容体の拮抗薬として機能する薬剤をスクリーニングする方法 であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現してい る細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離するこ とと、該膜画分を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、NPYの様な既 知のY2受容体作用薬の存在下で複数の薬剤に接触させることと、セカンドメッセ ンジャアッセイのようなバイオアッセイにより該受容体の活性化を阻止する薬剤 を決定し、それによってY2受容体拮抗薬である薬剤を同定することとを備えた方 法を提供する。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の 態様において前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。更に別の態様において前 記Y2受容体作用薬は、これまでに知られていない。 上記した方法の一つの態様において、セカンドメッセンジャアッセイは、細 胞内cAMPの測定を備えている。別の態様においては、セカンドメッセンジャアッ セイは、細胞内カルシウム動員の測定を備えている。 上記した細胞中の核酸は、図１、８、及び９に示されたコード配列と実質的 に同じコード配列を有することが可能である。好ましくは、哺乳類細胞は起源が 非神経性のものがよい。非神経性の哺乳類細胞の例はCOS-7細胞である。機能ア ッセイに使 用が可能なそのほかの例は、293ヒト胎児腎臓細胞、マウス胎児線維芽細胞のNIH -3T3細胞、及びLM(tk-)細胞がある。当該技術分野で良く知られた標識済みリガ ンド結合法（その例は本願に記載の結合アッセイ中で示されている）を使って、 形質転換された細胞内で発現しているY2受容体蛋白質に高親和性で結合する化学 的化合物を選択することにより、薬剤の候補を同定する。薬剤の候補はまた、Y2 受容体には高親和性で結合するが、そのほかのNPY受容体サブタイプや既知の受 容体部位には高親和性で結合しない化合物を同定することにより、選択性につい てスクリーニングされる。選択的な、高親和性化合物は、患者に投与された後、 主として標的のY2受容体と相互作用するので、この方法により、望ましくない副 作用を有する薬剤を製造する機会は最小限に抑えられる。 本発明は、薬学的組成物であって、上記した方法で決定された有効量の薬剤 と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を提供する。 ここで使われる「有効量」という語は、選択した投薬計画に従って投与した ときに、患者において所望の効果を生じさせるのに十分な量のことを意味する。 候補の薬剤が、経口投与や注射（作用部位において適切な期間、適切な治療濃度 が維持されて所望の治療の恩恵が得られなくてはならない）といったような特別 の投与経路に沿って、生体に適切に利用されることが示され、更に毒性がなく、 適切な疾患モデルにおいて治療効果を有することが示されれば、該薬剤は、生体 に利用されると決定された前記投与経路に従って、適切な固体または溶液の製剤 で患者に投与して所望の治療の恩恵を得ることが可能である。 本発明は更に、Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、 患者の異常を治療する方法であって、上記した薬学的組成物の有効量を患者に投 与して、それによって異常を治療することを備えた方法を提供する。一つの態様 において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様において前記Y2受容体 は、ラットY2受容体である。 ここで使われる「有効量」という語は、選択した投薬計画にしたがって投与 した ときに患者において所望の結果を生じさせることが可能な薬剤量のことを意味す る。典型的には、患者当り一日に約0.01mgから500mgの量が有効量である。更に 典型的には、この量は患者当り一日に約0.1mgから60mgである。最も典型的には 、この量は患者当り一日に約1mgから20mgである。最適の投薬量は、当業者らに よって決定されることが可能であり、使用する薬剤、調製の強度、投薬方法、及 び疾病状態の進行によっても変わる。治療を受ける特定の患者に依存した付加的 な因子は、結果として投与の調節が必要になるが、これには患者の年令、体重、 性別、食餌、及び投与期間等も含まれる。 本発明は、Y2受容体の活性を上昇させることにより軽減されるような、患者 の異常を治療する方法であって、上記した方法で決定したY2受容体作用薬の有効 量を患者に投与して、それによって異常を治療することを備えた方法を提供する 。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の熊様において 前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。 本発明は更に、Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、 患者の異常を治療する方法であって、上記した方法で決定したY2受容体作用薬の 有効量を患者に投与して、それによって異常を治療することを備えた方法を提供 する。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様にお いて前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。 本発明は更に、Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、 患者の異常を治療する方法であって、上記した方法で決定したY2受容体拮抗薬の 有効量を患者に投与して、それによって異常を治療することを備えた方法を提供 する。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様にお いて前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。 本発明は、核酸プローブであって、Y2受容体をコードした核酸分子中の配列 に含まれるユニークな配列、（例としては図1、8、及び9に示された配列に含ま れるコード配列）と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも15ヌ クレオチド の長さの核酸分子を備えた核酸プローブを提供する。ここで使われる「特異的に ハイブリダイズする」という語句は、核酸分子がそれ自身に対して相補的核酸配 列を認識でき、かつ、相補的塩基対の間の水素結合の形成により二本鎖のセグメ ントを形成できる能力を意味する。ここで使われる、「ユニークな配列」という 語句は、Y2受容体をコードした核酸のみに特異的な配列のことである。一つの態 様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様において前記Y2受容 体は、ラットY2受容体である。核酸プローブ技術は当該技術分野の者にはよく知 られており、当業者は、そのようなプローブは長さが異なり得ること、ラジオア イソトープや蛍光色素といった検出可能なラベルで標識して該プローブの検出を 容易にすることが可能である、ということを容易に承認するであろう。ヒトY2受 容体をコードした核酸を検出することは、対応するY2受容体の発現レベルが変化 するような疾患過程の診断にとって有益である。核酸プローブ分子は、Y2受容体 またはその断片をコードした核酸分子を、プラスミドやバクテリオファージの様 な適切なベクタへ挿入し、次に適切な細菌宿主へ導入し、該核酸プローブを複製 させて回収することによって作成する。なお、個々の工程は、全て当該技術分野 でよく知られた方法により行う。例として、核酸分子は、細胞抽出液よりフェノ ール及びエタノールを使用して抽出し、ベクタへ核酸を挿入した部位に対応した 制限酵素（上記で議論したもの）で消化し、電気泳動して、泳動済みゲルから切 り出すことができる。そのような核酸分子の例は、図1、8、及び9に示してある 。このプローブは、「in situ」のハイブリダイゼーション用、この遺伝子ファ ミリを発現する組織の特定用、または種々の生物学的組織におけるこの遺伝子群 とそのmRNAの存在を確かめるハイブリダイゼーションアッセイ用に、有益である 。更に、Y2受容体をコードしたDNA分子の配列と相補的な合成ヌクレオチド（DNA 合成機で作成した）は、これらの遺伝子、それに関連したmRNA、もしくはゲノム またはcDNAの相同スクリーニング、またはPCRの様な増幅技術を使った関連遺伝 子の単離、にとって有益である。上記した合成オリゴヌクレオチドは、in situ ハイブリダイゼーションによって該Y2遺伝子のmRNAを細胞内で位置づけるのに使 用することができる。 本発明はまた、Y2受容体をコードするmRNAの存在を検出して細胞表面にある Y2受容体の発現を検出する方法であって、当該技術分野でよく知られた方法を使 って細 胞より全mRNAを分離し、得られた該mRNAを、Y2受容体をコードした核酸分子中の 配列に含まれるユニークな配列と特異的にハイブリダイゼーションすることがで きる、少なくとも15ヌクレオチドの核酸分子を含んだ核酸プローブに、ハイブリ ダイゼーション条件下で接触させることと、該プローブにハイブリダイゼーショ ンしたmRNAの存在を検出し、それによって該細胞のY2受容体発現を検出すること を備えた方法を提供する。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体で ある。別の態様において前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。mRNA分子のよ うな核酸分子に対するプローブのハイブリダイゼーションは、当該技術分野でよ く知られた方法によった。この方法を実施する一つの可能な手段においては、核 酸を細胞抽出液より沈殿によって抽出し、mRNA分子のポリ-Aテイルと結合するカ ラムを使って、抽出物よりmRNAを分離する。該mRNAは次に、ニトロセルロース膜 上で放射性ラベルしたプローブにさらされて、該プローブが相補的なmRNA配列に ハイブリダイズし、それによって標識される。結合は、オートラジオグラフィー 、またはシンチレーションのカウントで決定することができる。しかし、該工程 を行うその他の方法は当業者によく知られており、上記の議論は単なる例である 。 本発明は、アンチセンスのオリゴヌクレオチドであって、Y2受容体をコード するmRNA分子と特異的にハイブリダイゼーションし、該mRNA分子の翻訳を阻止す るような配列を有するアンチセンスのオリゴヌクレオチドを提供する。該アンチ センスオリゴヌクレオチドは、配列が図1に記載されたcDNA分子、または図8、及 び9に示されたゲノムDNAと特異的にハイブリダイズすることができる配列を有す ることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の例としては、ヌクレオ チドの化学的類縁体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドがある。 本発明は更に、薬学的組成物であって、細胞膜を通過し、Y2受容体をコード した細胞内mRNAに特異的に結合してその翻訳を阻止することにより、Y2受容体の 活性を低下させるのに十分な量の上記オリゴヌクレオチドと、細胞膜を通過する ことができる、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を提供する。 該オリゴヌタレオチドは、リボザイムのような、mRNAを不活化させる物質と結合 させることができる。細胞膜を通過でき、薬学的に許容される担体はまた、選択 した細胞種に特 異的な受容体に結合する構造であって、故に細胞に取り込まれることができる構 造を備えている。該構造は、細胞種特異的な受容体に結合することが知られてい る蛋白質（例えば、膵臓細胞を標的とするインスリン分子）の一部であってもよ い。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様におい て前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。図1、8、及び9に示された配列と実 質的に同じ配列を有するDNA分子は、上記薬学的組成物のオリゴヌクレオチドと して利用することができる。 本発明は更に、Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、 患者の異常を治療する方法であって、上記の薬学的組成物の有効量を患者に投与 して、それによって異常を治療することを備えた方法を提供する。一つの態様に おいて前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様において前記Y2受容体は 、ラットY2受容体である。このような異常の幾つかの例は、高血圧、消化器系の 障害、てんかん、睡眠障害、認識障害がある（58-80）。 アンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤は、これらの受容体をコードしたmRNA の翻訳を阻害する。合成オリゴヌクレオチド、または他のアンチセンス化学構造 体はY2受容体をコードしたmRNAに結合して、mRNAの翻訳を阻止するように設計さ れていて、患者におけるY2受容体遺伝子の発現を阻止するのに有益である。この 発明は、ヒトY2受容体をコードしたmRNAの翻訳を阻止する合成アンチセンスオリ ゴヌクレオチド薬剤（SAOD）を使用して、該受容体の発現レベルを治療上変化さ せる方法を提供する。mRNAを認識して選択的に結合する様に設計された合成オリ ゴヌクレオチド、または他のアンチセンス化学構造体は、図1、8、及び9に記載 のDNA、RNA、または化学修飾された人工的核酸のヌクレオチド配列に対して相補 的となるように構築されている。該SAODは、患者に注射できるように血液内で安 定なように設計され、或いは患者より取り出した細胞に投与できるように細胞培 養条件下でも安定なように設計されている。該SAODは、細胞膜を通過することを 可能とする物理的及び化学的性質によるか（例として、小型の疎水性のSAOD化学 構造を設計することで）、または該SAODを認識して細胞内へ輸送する特異的な細 胞内輸送系によって、細胞の細胞質へ侵入するために、細胞膜を通過するように 設計される。更に該SAODは、該SAODを結 合してある特定の細胞群内のみに取り込む様な、特異的取り込み機構によって認 識される様にしむけることにより、ある特定の細胞群のみに投与されるよう設計 されている。例としては、該SAODは上記した様に、ある種の細胞でしか見いださ れない受容体に結合するよう設計されている。該SAODはまた、図1、8、及び9に 記載された配列に含まれた配列に対応する可能性のある標的mRNA配列を、該mRNA に対して塩基対を形成することにより、認識し、これと特異的に結合する様に設 計されている。最後に、該SAODは以下の3つの機序のうちどれかにより、標的mRN Aを不活化する： 1）標的mRNAに結合して、RNアーゼI消化の様な固有の細胞性機序によって該mR NAの分解を誘導する； 2）翻訳制御因子またはリボソームの結合を阻害して標的mRNAの翻訳を阻止す る；または 3）リボソーム配列または反応性化学基の様な、標的mRNAを分解または化学修 飾する、その他の化学構造を導入する。 合成アンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤は、標的mRNAに向けられると、上記 した性質を有することができることが示されている（74、75）。更に、リボザイ ムをアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合することは標的mRNAを不活化するの に有望な戦略である（76）。SAODは、注射により患者に投与するように設計され ているか、または患者の標的細胞を取り出して実験室内でSAODで処理し、患者に 戻すと、効果的な治療剤として働く。このようにしてSAODは、Y2受容体の発現減 少によって恩恵を被るいかなる臨床的症状の患者においても、その特定の標的細 胞における受容体発現を減少させるための療法として働く。 本発明は、Y2受容体に対する抗体を提供する。その例としては、細胞表面上 に存在するY2受容体のエピトープであって、図2、8、及び9に示されたY2受容体 のアミノ酸配列（配列認識番号はそれぞれ2、4、6）と実質的に同じアミノ酸配 列を持つエピトープに向けられたモノクローナル抗体である。一つの態様におい て前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様において前記Y2受容体は、ラ ットY2受容体である。アミノ酸配列を、当該技術分野でよく知られた方法により 分析して、該アミノ酸が構築する蛋白質が疎水性または親水性の領域を作るかど うかを決定することができる。細胞膜蛋白質の場合、疎水性領域は、細胞膜を形 成する脂質二重層に挿入 される蛋白質部分を形成し、一方親水性領域は、水性の環境下において細胞表面 に局在することがよく知られている。それゆえに、図2、8、及び9に示された親 水性のアミノ酸配列に対する抗体は、おそらく上述した様にY2受容体の表面エピ トープにそれぞれ結合するであろう。Y2受容体に向けられる抗体は、血清由来、 またはモノクローナルのどちらかであってもよく、当該技術分野でよく知られた 方法で調製される。例としてモノクローナル抗体は、免役した動物の抗体産生B 細胞を、ミエローマ細胞と融合させるハイブリドーマ技術を使い、その結果得ら れた、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択して調製する。ヒトY2受 容体をコードしたDNAを備え、該ヒトY2受容体を発現するCOS-7細胞、LM(tk-)細 胞、NIH-3T3細胞、または293細胞の様な細胞を、上記した様な抗体を産生させる ための免疫原として使うことが可能である。或いは、商業的に入手可能な機械並 びに図2、8、及び9に示されたアミノ酸配列（配列認識番号はそれぞれ2、4、6） を使って、合成ペプチドを調製することが可能である。更に別の方法として、cD NAまたはその断片の様なDNAのクローニング及び発現を行い、その結果得られる ポリペプチドを回収して免疫原として使うことも可能である。これらの抗体は、 該単離DNAにコードされるY2受容体の存在を検出すること、または生きている動 物、ヒト、または動物もしくはヒトから分離した生物学的組織もしくは体液中の 該受容体機能を阻害することに有用である。 本発明は、薬学的組成物であって、リガンドのY2受容体への結合を阻止する のに効果的な量の抗体と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を 提供する。細胞表面上に存在するY2受容体のエピトープであって、図2、8、及び 9に示されたY2受容体の細胞表面エピトープのアミノ酸配列と実質的に同じアミ ノ酸配列を持つエピトープに向けられたモノクローナル抗体は、この目的にとっ て有益である。 本発明はまた、Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、 患者の異常を治療する方法であって、上記の薬学的組成物の有効量を患者に投与 して、リガンドのY2受容体への結合を阻害して、それによって異常を治療するこ とを備えた方法を提供する。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体 である。別の態様において前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。抗体の受容 体への結合は、該抗体の機能を阻害して、それによってY4受容体活性の効果を中 和させる。上記し たモノクローナル抗体は、共にこの目的にとって有益である。異常のいくつかの 例としては、高血圧、消化器系の障害、てんかん、睡眠障害、認識障害がある（ 58-78）。 本発明は、細胞表面上のY2受容体の存在を検出するための方法であって、前 記細胞を、抗体の該受容体への結合を許容する条件下で、Y2受容体に向けられた 抗体に接触させすることと、該細胞へ結合した前記抗体の存在を検出し、それに よって該細胞表面上のY4受容体の存在を検出することとを備えた方法を提供する 。このような方法は、与えられた細胞がその表面上においてY2受容体の発現を欠 失しているかどうかを決定するのに有益である。結合した抗体は、当該技術分野 でよく知られた方法により検出され、例としては、蛍光標識を抗体に結合させて 、蛍光顕微鏡を使って細胞検体を調べ、抗体結合を示す細胞表面上の蛍光を検出 する方法がある。上記したモノクローナル抗体は、この目的にとって有益である 。 本発明は、Y2受容体をコードした核酸を発現する、ヒト以外のトランスジェ ニック哺乳動物を提供する。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体 である。別の態様において前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。本発明は更 に、天然Y2受容体の相同組み換えによるノックアウトを備えた、ヒト以外のトラ ンスジェニッタ哺乳動物を提供する。発明は更に、ヒト以外のトランスジェニッ ク哺乳動物であって、そのゲノムがY2受容体をコードしたDNAに対して相補的な アンチセンスDNAを備え、該アンチセンスDNAは、Y2受容体をコードしたmRNAに対 して相補的で、且つY2受容体をコードしたmRNAにハイブリダイゼーションするこ とによりその翻訳を減少させるアンチセンスmRNAへと転写されるように配置され ている、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。該DNAは更に、発 現が誘導されるか、または特異的細胞種において制限される、誘導性のプロモー タ、または組織特異的制御配列を備えることが可能である。核酸の例としては、 図1、8、及び9に示されたコード配列と実質的に同じコード配列を有するDNAまた はcDNA分子がある。トランスジェニック動物の例としては、トランスジェニック マウスがある。組織特異性決定領域の例としては、メタロチオネインプロモータ （77）及びL7プロモータ（78）がある。 Y2受容体の生理学的及び行動学的役割を解明する動物モデル系は、種々の技 術に よって、Y2受容体の活性が増加もしくは減少されているか、または発現するY2受 容休蛋白質のアミノ酸配列が改変されている、ヒト以外のトランスジェニック動 物を作り出すことで生産できる。これらの技術の例には、1）Y2受容体をコード した正常もしくは変異体DNA、またはこの遺伝子の他の動物の相同体を、マイク ロインジェクション、レトロウイルス感染、または当該技術分野でよく知られた 他の方法で、適切な受精卵へ挿入してトランスジェニック動物を作り出すこと（ 79）、2）ヒト及び動物における、これらの遺伝子の正常または変異体を、トラ ンスジェニック動物の天然の遺伝子座と相同組み換えすることにより、これらの Y2受容体の発現または構造を変化させること（80、81）、が含まれる。相同組み 換えの技術は、当該技術分野ではよく知られている。当該技術は、天然の遺伝子 を挿入遺伝子と入れ替えているから、天然の遺伝子は発現しないが、たとえば、 組み換えによって該動物のゲノム中の天然の受容体と入れ替わった、挿入された 変異受容体を発現するし、従って当該天然受容体の過小発現をもたらす動物を作 り出すのに有益である。マイクロインジェクションは遺伝子をゲノムに加えるが 、それらを取り除くことはできず、従ってもとの遺伝子と加えた遺伝子とを発現 し、その結果該受容体を過剰発現させる動物を作り出すのに有益である。トラン スジェニック動物を作り出す方法の一つは、マウスを一つの例とすると、以下の ようになる。雌のマウスを交配させ、受精卵を解剖により卵管より取り出す。該 受精卵をM2培地の様な適切な培地に保存する（79）。 ヒトY2受容体をコードしたDNAまたはcDNAを、ベクタ（例えば上記したプラスミ ドpcEXV-hY2、pcEXV-rY2、pcEXV-rY2a、またはpcEXV-rY2b）から当該技術分野で よく知られた方法で分離する。誘導プロモータを、該DNAと融合することにより 、導入遺伝子を制御するための実験的方法を提供することが可能である。上記方 法に代わるものとしてまたは上記方法に加えて、組織特異的制御配列をコード領 域に結合して、導入遺伝子の発現を組織特異的に制御させることが可能である。 該DNAを、適切な緩衝液中において、マイクロインジェクション針（ピペット・ プラー（pipet puller）を使用してキャピラリ管から作成できる）にいれ、また 注入を施すべき該受精卵を、くぼみのあるスライドに置く。針を該受精卵の前核 に注入し、該DNA溶液を注入する。次に、注入済みの卵は、疑似妊娠させたマウ ス（適切なホルモンで刺激して妊娠を維持するが実際には妊娠していないマウス ）の卵管に移され、該受精卵は子宮に到達し、着床し、発生して出産される。上 記した様にマイクロインジェクションは、 DNAを卵細胞へ挿入するための唯一の方法ではなく、ここにおいては例示的目的 のために使用している。 受容体特異的薬剤の正常な作用は、受容体作用を活性化するかまたは阻害す ることにあるので、上記したトランスジェニック動物モデル系は、これらY2受容 体に向けられた薬剤が手に入る前であっても、そのような薬剤の生物学的活性を 、試験するのに有益である。これらの動物モデル系は、天然のまたは導入した遺 伝子の発現を誘導または阻害して、生きた動物におけるY2受容体の正常体または 変異体の活性を増加または減少させる薬剤について、これを治療に用いることの 可能性を予測または評価するのに有益である。こうして、これらY2受容体に向け られた薬剤の生物学的活性を、該薬剤が手に入る前において評価するようなモデ ル系が作成される。Y2受容体活性が増加または減少したトランスジェニック動物 は、その生理学的状態によって、Y2受容体活性の増加または減少が、治療にとっ て有益であるかどうかを示す。それゆえに、トランスジェニックモデル系に基づ いて薬剤の作用を評価することは有益である。一つの使用法は、抗うつ剤の様な 薬剤は神経伝達物質の取り込みを阻害して、それによってシナプスの中裂におけ る神経伝達物質の量を増加させるという、当該技術分野ではよく知られている事 実に基づいている。この作用の生理学的な結果は、影響を受けた細胞内において 、より少ない受容体の生成を刺激し、結果的に該受容体の活性を減少させること である。それゆえに、受容体活性の減少した動物は、受容体活性の減少を起こす そのような薬剤の作用が、実際に治療効果があるかどうかを試験する系として有 益である。別の使用法は、増加した受容体活性が異常を導くならば、Y2受容体を 下方調節する薬剤か、またはY2受容体の拮抗薬として作用する薬剤は、開発する 価値のあることが示されることである。また、これらの動物モデル系によって有 望な治療への応用が明かになれば、Y2受容体活性の増加または減少は、該Y2受容 体に向けられた作用薬または拮抗薬を製造すること、またはこれらのY2受容体の 活性を増加または減少させる何らかの方法によって、治療的に成し遂げることが できることである。 本発明は、Y2受容体を種々のレベルで発現することの生理学的効果を決定す る方法であって、Y2受容体の発現を調節する誘導プロモータの使用により、ヒト Y2受容 体の活性が変化するような、ヒト以外のトランスジェニック動物を作り出すこと を備えた方法を提供する。この発明は更に、Y2受容体を種々のレベルで発現する ことの生理学的効果を決定する方法であって、それぞれが異なる量のY2受容体を 有するヒト以外のトランスジェニック動物のパネルを作り出すことを備えた方法 を提供する。一つの態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態 様において前記Y2受容体は、ラットY2受容体である。そのような動物はY2受容体 をコードした核酸を異なる量だけ、トランスジェニック動物を発生させる卵母細 胞に導入することで作り出すことができる。 本発明はまた、Y2受容体の活性を減少させることで軽減されるような、患者 の異常を軽減させることができるY2受容体拮抗薬を同定する方法であって、上記 したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に拮抗薬を投与することと、該拮抗 薬が、Y2受容体の活性の結果として現れる、ヒト以外のトランスジェニック哺乳 動物の肉体的及び行動的異常を緩和するか否かを決定し、それによってY2受容体 拮抗薬を同定することとを備えた方法を提供する。この発明は更に、上記した方 法により同定される拮抗薬を提供する。核酸分子の例は、図1、8、及び9に示し たコード配列と実質的に同じコード配列を持つDNA、またはcDNAがある。 本発明は、Y2受容体の活性を減少させることで軽減されるような、異常を治 療するのに有効な、上記の量の拮抗薬と、薬学的に許容される担体を含有する薬 学的組成物を提供する。 本発明は更に、Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、 患者の異常を治療する方法であって、上記した薬学的組成物の有効量を患者に投 与して、それによって異常を治療することを備えた方法を提供する。 本発明は、Y2受容体を活性させることで軽減されるような、患者の異常を軽 減させることができるY2受容体作用薬を同定する方法であって、該作用薬を、上 記したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に投与することと、該作用薬が、 ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の肉体的及び行動的異常を緩和するか否 かを決定し、 それによってY2受容体作用薬を同定することとを備えた方法を提供する。一つの 態様において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様において前記Y2受 容体は、ラットY2受容体である。本発明は更に上記した方法により同定された作 用薬を提供する。 本発明はまた、上記の方法で同定される量のY2受容体作用薬及び、薬学的に 許容される担体を含有する薬学的組成物を提供する。 本発明は更に、Y2受容体を活性化させることで軽減されるような、患者の異 常を治療する方法であって、上記した薬学的組成物の有効量を患者に投与して、 それによって異常を治療することを備えた方法を提供する。 本発明は、Y2受容体の特異的対立遺伝子の作用に関わる疾患の疾病素質を診 断する方法であって、以下のステップを備えた方法を提供する：a)疾患をもつ患 者より核酸を取得すること；b)一連の制限酵素を使って上記核酸の制限酵素によ る消化を行うこと；c)前記の消化済み核酸断片を分離ゲルを使って電気泳動的に 分離すること；d)電気泳動の終了したゲルを、Y2受容体と特異的にハイブリダイ ゼーションすることができ、且つ検出可能な標識でラベルされたプローブと接触 させること；e)Y2受容体をコードした核酸にハイブリダイゼーションして検出可 能な標識でラベルされた標識済みバンドを検出し、前記疾患にかかった患者のDN Aに特異的なバンドパターンを作成すること；f)上記ステップa-eの方法による診 断用に得た核酸を調製すること；g)ステップeの、前記疾患にかかった患者の核 酸に特異的なバンドパターンを、ステップfで、診断用に得た核酸についてのパ ターンと比較して、両パターンが同じか異なるかを決定し、その結果同じであれ ば疾患の疾病素質ありと診断すること。この方法はまた、特異的Y2受容体の対立 遺伝子の発現に関連した疾患を診断するのに使うことが可能である。一つの態様 において前記Y2受容体は、ヒトY2受容体である。別の態様において前記Y2受容体 は、ラットY2受容体である。 本発明は、単離精製されたY2受容体を調製する方法であって、以下のステッ プを備えた方法を提供する：a)細胞内での発現に適用されるベクタを構築するス テップ であって、該ベクタはY2受容体を発現するように、該受容体をコードしている核 酸に対して機能可能なように連結された、細胞内での核酸の発現に必要な制御配 列を備えており、前記細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞 からなる群から選ばれる、ベクタ構築ステップ；b)ステップaのベクタを適切な 宿主細胞へ導入するステップ；c)ステップbの細胞を、Y2受容体の発現を許容す る条件下でインキュベーションするステップ；d)上記のように発現された受容体 を回収するステップ；e)上記のようにして回収された受容体を精製することによ り、単離精製Y2受容体を調製するステップ。単離されたY2受容体の例は、アミノ 酸配列が図2、8、及び9に示されたアミノ酸配列と実質的に同じである、単離さ れた蛋白質である。例えば、ホルモンのような物質に細胞を露出して受容体発現 の誘導を行わせることができる。該細胞は次に、ホモジナイズして、例えばPPま たは該受容体に結合することがわかっている別の物質からなるアフィニティーカ ラムを使って、該ホモジネートから受容体を単離する。得られた画分は次に、イ オン交換カラムにかけて、どの画分に受容体活性、または抗受容体抗体への結合 性が含まれるかを決定して精製する。 Y2受容体を調製する上記の方法は、当該技術分野でよく知られた組み換えDN A技術を使っている。例えばY2受容体をコードした単離核酸を、発現ベクタの様 な適切なベクタへ導入する。細菌細胞または酵母細胞のような真核細胞といった 適切な宿主細胞をベクタで形質転換する。Y2受容体を親和性精製、クロマトグラ フィー、または当該技術分野でよく知られた他の方法で培養液より単離する。 本発明は、新規の蛋白質、そのアミノ酸、及びそのヒト遺伝子をはじめて同 定している。更に、この発明は、以前は認識されていなかった、Y2受容体として 定義される受容体群を記述している。この発見によって提供される情報、および 実験的手法は、新規の治療剤、この新規蛋白質、関連したmRNA分子、または関連 したゲノムDNAに対する治療または診断のアッセイを作り出すことに有益である 。この発見によって提供される情報及び実験的手法は、新規の治療剤、この新規 蛋白質、関連したmRNA分子、または関連したゲノムDNAに対する治療または診断 のアッセイを作り出すことに有益となるであろう。 特に、本発明は、Y2受容体をコードしたヒトのゲノムクローンのはじめての 単離に関わる。ここでY2として同定された新規のヒト遺伝子を同定し、特徴づけ を行った。更に、ヒトY2受容体を293胎児腎臓細胞で発現した。コードされた蛋 白質の薬理学的結合性質を決定し、これらの結合性質によりこの蛋白質を、われ われがヒトY2受容体と命名した新規のヒトNPY/PYY受容体に分類した。このヒトY 2受容体を細胞表面で発現している哺乳類細胞株を構築し、それゆえにY2受容体 を研究するための、よく定義された、培養細胞株をはじめて樹立している。 本発明は、以下に続く実験の詳細を参照することによって、この発明をより 良く理解できるであろう。しかし、当該技術分野の熟練者らは、そこで詳述され る特定の実験は、後述の請求の範囲に完全に記載されている発明の単なる例示に 過ぎないということを容易に認めるであろう。 ［実験の詳細］ 〈cDNAクローニング〉 全RNAをグアニジンチオシアネート法（13）の改良法により、ヒトの海馬よ り６グラム調製した。ポリA+のRNAをFastTrackキット（Invitrogen Corp.，San Diego,CA）を使って精製した。二本鎖（ds）のcDNAをGoublerとHofflmanの方法 により、４μgのポリA+RNAより合成したが、リガーゼをcDNAの第二鎖合成時には 省いた。その結果得られたDScDNAをBstxI/EcoRIアダプタに連結し、余分なアダプタはSep hacryl500HR(Pharmasia-LKB)を使ったクロマトグラフィーで取り除き、ds-cDNA はSephacryl 1000(Pharmasia-LKB)でサイズを選択した。高分子量の画分を、Aru ffoとSeedが記載したBstxIで切断した、pcEXV.BS(OkayamaとBergの発現ベクタ) へ連結した。連結されたDNAを電気穿孔法で大腸菌(E.coli)、MC1061へ導入した （Gene Pulser，Biorad）。挿入部の平均サイズが3kbの、独立したクローンを全 部で2.2 X10⁶作成した。このライブラリを、0.4から1.2 X 10⁴のプールでペトリ 皿にまいた(アンピシリン選択)。18時間の増幅後、それぞれのプール由来の細菌 を削り取って4mlのLB培地に懸濁して、1.5mlをアルカリ法（16）によるプラスミ ド調製に供した。それぞれの細菌プールのうち1mlは、20％グリセロール中で-85 ℃で保存した。 〈ヒト海馬Y2受容体をコードしたcDNAの分離〉 約5000の独立したプールからのDNAを、DEAE-デキストラン法（17）の改変法 でCOS-7細胞へ形質転換した。COS-7細胞をダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） （10％牛胎児血清、100単位／mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン 、2mMのL-グルタミンを添加、(DMEM-C)）中で、37℃、5％CO₂で増殖させた。細 胞は形質転換の1日前に、30,000細胞/cm²の密度で6ウェルのプレート（Becton D ickinson,Lincoln Park,NJ）にまいた。翌日、細胞をリン酸緩衝塩液(PBS)で二 回洗浄し、それぞれのプールからのDNAの10分の1と、PBS中のDEAE-デキストラン （500μg/ml）とからなる形質転換用混合物、400μlを加えた。37℃で30分イン キュベーションした後、1.6mlのクロロキン（DMEM-C中、80μM）を加え、更に細 胞を37℃で2.5時間インキュベーションした。培養液をそれぞれのウェルから吸 引で取り除き、1mlの10％DMSO（DMEM-C中）を加えた。室温で2.5分間インキュベ ーション後、培養液を吸引で 取り除き、それぞれのウェルを1mlのPBSで洗浄し、DMEM-Cで24時間インキュベー ションした。該細胞をトリプシン処理し、Lab-Tekチャンバースライド（1チャン バー、Permnoxスライド、Nunc Inc.，Naperville，IL）にまき、2mlのDMEM-Cと ともに更に24時間インキュベーションして該スライド上で結合アッセイを行った 。 細胞をPBSで二回洗浄した後、緩衝液（20mM Hepes-NaOH pH7.4、CaCl₂ 1.26 mM、MgSO₄ 0.81mM、KH₂PO₄ 0.44mM、KCl 5.4、NaCl 10mM、0.1%ウシ血清アルブ ミン、0.1%バシトラシン（bacitracin））中の、1nMのブタ[¹²⁵I]-PYY（New Eng alad Nuclear;特異活性=2200Ci/mmol）と共に1時間室温でインキュベーションし て陽性プールを同定した。リガンドを含まない結合緩衝液で5秒間の洗浄を6回行 った後、単層の細胞をPBS中の2.5％のグルタルアルデヒドで室温で5分間固定し 、PBSで二回洗浄後、70、80、95、100％のエタノールでそれぞれ2分間ずつ脱水 し、風乾した。 ドライヤーライト（drierite）を含む耐光性の箱の中で、該スライドを100 ％のフォトエマルジョン（Kodak タイプNTB2）に42℃で浸して、遮光して4℃で4 8時間露出した。Kodak D19現像液（11の水当り32g）で3分間現像し、水で洗浄し た後、Kodak 固定液で5分間固定し、水で洗浄思、風乾してアクアマウント（Ler ner Laboratoroes，Pittsburgh,PA）でマウントした。スライドは25X全倍率でス クリーニングにかけた。 公表された（18）sib選択によって、単一クローン、CG-13を分離した。DS-D NAをシーケナーゼキット（US Biochemical，Cleveland，OH）を製造業者推奨の 方法で使って配列を決定した。ヌクレオチド及びペプチドの配列分析はGCGプロ グラム（Genetic Computer group，Madison，WI）を使って行った。 〈ノーザンブロット〉 ヒトの脳の種々の領域より精製したmRNAを有する多組織ノーザンブロットを 、製造業者添付の説明書に従って高厳密度でハイブリダイズさせた。プローブは 、図10に記載のヒトY2受容体の全コード領域に対応した、1.15kbのDNA断片であ った。 〈サザンブロット〉 5種類の異なる酵素で切断した、ヒトゲノムDNAを含んだサザンブロット（1 レーン当り8μgDNA）を、製造業者添付の説明書にしたがって高厳密度でハイブ リダイズさせた。プローブは、図11に記載のヒトY2受容体のTMI-TM5コード領域 に対応したDNA断片であった。 〈ラットNPY/PYY(Y2)受容体の二つのアイソフォームのクローニングと発現 〉 ヒトNPY/PYY(Y2)のラット相同体を得るために、図11に記載のヒトY2受容体 のアミノ酸配列（TM1-TM7）の膜貫通領域にほぼ対応した、ヌクレオチド配列由 来のオリゴヌクレオチドプローブを設計して合成した。使用した重複オリゴマー は以下のとおりである： プローブは、DNAポリメラーゼの大型断片を用いて合成し、［³²P］-ATPと［³² P］-CTPで標識した。 25％ホルムアルデヒド、10％硫酸デキストラン、5 X SSC(1 X SSCは0.15M 塩化ナトリウム、0.015M クエン酸ナトリウム)、1 X Denhardt′s(0.02%ポリヴ ィニルピロリドン、0.02％フィコール、及び0.02％ウシ血清アルブミン)、100μ g/mlの超音 波処理済みサケ精子DNAを含む溶液中で、40℃でハイブリダイゼーションを行っ た。0.1％のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む0.1 X SSC中で40℃でフィルタ を洗浄し、-70℃で1枚の増強スクリーン存在下でKodak XARフィルムに露出した 。プレーティング及び再スクリーニングを繰り返して、プローブにハイブリダイ ゼーションしたラムダファージをプラーク精製した。7つのTMプローブのうち6つ とハイブリダイゼーションしたゲノムクローンを上記の方法で単離し、rs5aと命 名した。rs5aの4.0kbのEcoRI断片を、pcEXV-3(73)を修飾してできた真核細胞発 現用ベクタである、EXJ.RHにサブクローニングし、配列分析と発現の研究に用い た。EXJ.RH中の断片のヌクレオチド配列を、シーケナーゼ（U.S．Biochemical C orp.，Cleveland，Ohio）を使ってサンガー・ジデオキシ・ヌクレオチド鎖終結 法（82）により、両方の鎖の配列を分析した。 rs26aと命名した第二のゲノムクローンは、上記したハイブリダイゼーショ ン条件下で単離され、またTMプローブとのハイブリダイゼーションに関して同じ 特徴を呈した。しかしながらこれとは対照的にrs5aは、他のクローンには含まれ ないEcoRI制限酵素部位を中に有していた。これら二つのクローンの潜在的な違 いを更に調べるために、rs26aの3.9kbのSalI/KpnI断片を、配列分析及び発現研 究用の発現ベクタ、EXJ.RHにサブクローニングした。該断片のヌクレオチド配列 を両方の鎖に関して、上記したサンガー・ジデオキシ・ヌクレオチド鎖終結法に より分析した。 〈細胞培養〉 COS-7細胞は、添加剤（10％コウシ血清、4mMグルタミン、100単位／mlのペ ニシリン／100μg／ストレプトマイシン）含有のダルベッコ改変イーグル培地(D MEM)を使い、150mmのプレートで、37℃、5％CO₂で増殖させた。COS-7の系統細胞 のプレートは3日から4日に一度トリプシン処理して1：6に分割した。 ヒト胎児腎臓細胞の293細胞は、添加剤（10％コウシ血清、4mMグルタミン、 100単位／mlのペニシリン／100μg／ストレプトマイシン）含有のダルベッコ改 変イーグル培地(DMEM)を使い、150mmのプレートで、37℃、5％CO₂で増殖させた 。293の系統細胞のプレートは3日から4日に一度トリプシン処理して1：6に分割 した。 マウス胎児線維芽細胞のNIH-3T3細胞は、添加剤（10％コウシ血清、4mMグル タミン、100単位／mlのペニシリン／100μg／ストレプトマイシン）含有のダル ベッコ改変イーグル培地(DMEM)を使い、150mmのプレートで、37℃、5％CO₂で増 殖させた。293の系統細胞のプレートは3日から4日に一度トリプシン処理して1： 15に分割した。 SK-N-Be(2)ヒト神経芽腫細胞は同様にして、225cm²のフラスコ中で、50％イ ーグル改変必須培地、50％ハム栄養素混合物F-12、15％ウシ胎児血清、2mMグル タミン、100単位／mlペニシリン／80単位／mlストレプトマイシン、及び1％非必 須アミノ酸を使って増殖させた。SK-N-Be(2)細胞は7日に一度トリプシン処理し て1：10に分割した。 〈薬理学的特徴付けのためのDNA形質転換〉 株化された受容体サブタイプで調べたもの全て（ヒトY1、ヒトY2、ヒトY4、 ラットY2a、ラットY2b）をDEAE-デキストラン法により、106細胞当り1μgのDNA を使用してCOS-7細胞へ一過性の形質転換を行った（17）。株化されたY4受容体 に対応しているcDNAは、1993年12月28日付けで出願された、現在係属中の米国特 許出願08/176,412に開示されている。 〈膜の調製〉 形質転換後48時間のCOS-7細胞及び、分割後7日間のSK-N-Be(2)細胞から膜を 調製した。付着細胞は氷冷したリン酸緩衝塩液(138mM NaCl、8.1mM Na₂HPO₄、2. 5mM KCl、1.2mM KH₂PO₄、0.9mM CaCl₂、0.5mM MgCl₂、pH7.4)で二回洗浄し、氷 冷した低張液(20mM Tris-HCl、5mM EDTA、pH7.7)中で超音波処理して破壊した。 大型の粒子及び破壊断片を低速の遠心(200 X g、10分、4℃)で取り除いた。膜は 、上清分画を高速で(32,000 X g、18分、4℃)遠心して回収し、氷冷した低張液 で洗浄し、もう一度高速で(32,000 X g、18分、4℃)遠心して回収した。最終膜 沈殿物を超音波処理により小量の(約500μl)氷冷済み結合緩衝液(10mM Nacl、20 mM HEPES、0.22mM KH₂PO₄、1.26mM CaCl₂、0.81mM MgSO₄、pH7.4)に再懸濁した 。蛋白質濃度は、Bio-Radの試薬を使い、ウシ血清アルブミンを標準試料として 使ったブラッドフォード法(19)によ り決定した。 〈放射性リガンドの膜懸濁液への結合〉：膜懸濁液を、0.1％の牛血清アル ブミン及び0.1％のバシトラシン(bacitracin)を添加した結合緩衝液で希釈し、 最適膜蛋白質濃度をヒトY1受容体に対しては約0.02mg/ml、CG-13に対しては約0. 003mg/ml、SK-N-Be(2)に対しては約0.25mg/mlとなるようにした(この条件下では 、アッセイで膜に結合した¹²⁵I-PYYは試料に入れた¹²⁵I-PYYの量の10％以下であ る)。¹²⁵I-PYY及び非標識ペプチド競合剤もまた添加済み結合緩衝液で所望の濃 度に希釈した。次に、膜懸濁液(200μl)、¹²⁵I-PYY(25μl)、及び非標識ペプチ ド又は添加済み結合緩衝液(25μl)を混合して、個々の検体を96穴のポリプロピ レン・マイクロタイター・プレートに調製した。検体を30℃の水浴中で常に震盪 して120分間インキュベーションした。Whatman GF/Cフィルタ(0.5％のポリエチ レンイミンで被膜して、使用前に風乾済み)を使ってろ過してインキュベーショ ンを終了させた。フィルタにトラップした膜の¹²⁵Iを、ガンマカウンタで計測し た。非特異的結合を、100nMのヒトNPYで求めた。経時変化及び競合実験における 特異的結合は概して80％であった；ほとんどの非特異的結合はフィルタに関わる ものであった。結合のデータは、GraphPAD InPlot パッケージ(San Diego、CA) の非線形の回帰分析と統計的技法により分析した。 〈定常発現する細胞株の作成〉 pcEXV-hY2DNAを、リン酸カルシウム法で293ヒト胎児腎臓細胞へ形質転換し た。この293細胞を、ハンタ塩、2mM グルタミン、100国際単位のペニシリン、10 0μg/mlのストレプトマイシン、10％ウシ胎児血清、を含む最小必須培地(MEM)中 で、37℃、5％CO₂存在下で増殖させた。安定に形質転換された細胞を、G-418（1 mg/ml）を含む培地中で2週間選択し、¹²⁵I-PYYへの結合能に関してのスクリーニ ングを行った。細胞密度の予備測定に基づき、幾つかのクローンを選択した。29 3-hY2-10と命名した一つの陽性クローンを選択して、更に結合及び機能アッセイ に供した。このクローンは、膜調製物中においての、¹²⁵I-ブタPYYの飽和性結合 を呈した：B_max=880fmol/mg膜蛋白質、K_d=3pM、（n=3）。種々の濃度のヒトPYY と共にインキュベーションすると、フォルスコリン-刺激性cAMP蓄積に関しての 濃度依存性の阻止が誘発することがラジオイミュノアッセイにより判明した。29 3-hY2-10クローンもまた、細胞内遊離カル シウムの濃度依存的増大を誘発することが、Fura-2蛍光によって判明した。カル シウム応答は、おそらく細胞内のカルシウム貯蔵の動員を反映しているが、これ は細胞を百日咳毒素の前処理することによって阻止される。cAMP及びカルシウム 応答両者のEC₅₀値は、現在調査中である。 pcEXV-hY2DNAもまた、上記した方法によりマウス胎児NIH-3T3細胞へ形質転 換し、ヒトY2受容体を定常に発現する細胞株を作成した。N-hY2-5と命名したク ローンを選択して、上記した様に特徴付けを行った。 〈組織の局在化及び遺伝子発現：逆転写酵素PCR〉 National Disease Research Interchangeより得たヒトの組織をホモジナイ ズして、全RNAをグアニジン／イソチオシアネート・クッション法により抽出し た。RNAをDNアーゼで処理して混在しているゲノムDNAを取り除いた。ランダム・ ヘキサヌクレオチド・プライマを逆転写酵素スーパースクリプトII（BRL,Gaithe rsburg，MD）と共に使い、cDNAを全RNAより調製した。第一鎖cDNAの一部（全RNA のうち250ng）を50μlのPCR反応溶液（200μMのdNTPs(最終濃度)、製造業者（Pe rkin-Elmer社）添付の緩衝液中の1.2単位のTaqポリメラーゼ、及び1μMのプライ マ）中で、以下のプログラムに沿って増幅させた。 プレインキュベーションを95℃で5分間、 （94℃を2分間、68℃を2分間、72℃を3分間）を30サイクル、 ポストインキュベーションを72℃で10分間。 ヒトY2のPCRプライマは、ヒトY2配列の第3細胞内ループ及びカルボキシ末端領 域に対してそれぞれ以下のように設計された： PCR産物を1.5%のアガロースゲルに流し、チャージ済ナイロン膜（Zetaprobe GT，BioRad）にトランスファーし、サザンブロットで分析した。PCRプライマで はさまれた該受容体領域に対応したハイブリダイゼーションプローブ、 を調製し、ヒトY1及びY4受容体サブタイプと交差反応しないことをプレスクリー ニングにかけて調べた。 フィルタはリン酸化したプローブとハイブリダイズさせ、高厳密度で洗浄し た。標識されたPCR産物は、X線フィルムで可視化した。ハウスキーピング遺伝子 （グリセルアルデヒド-3-フォスフェート デハイドロゲナーゼ(Clontech，Palo Alto,CA)）に向けられたプライマ、及びプローブを使って、同様のPCR、及びサ ザンブロットを行い、異なる組織から得た等量のcDNAを使ってY2受容体発現のア ッセイをしていたことが示された。 〈ラット中枢神経系におけるNPY Y2伝令RNAの局在化〉 ラットの脳のNPY Y2mRNAの分布を、in situ ハイブリダイゼーション組織化 学法により決定した。Spague-DawleyラットをCO₂で安楽死術を施し、断頭し、脳 をすぐに取り出してイソペンテン中で凍結した。低温槽（cryostat）上で11μm に冠状切断し、ポリ-L-リジンで表面処理されたスライドに解凍-マウントし、-8 0℃で使用するまで保存した。ハイブリダイゼーション前に組織を4％のホルムア ムデヒドで固定化し、5mMのジチオスレイトールで処理し、0.25％無水酢酸を含 む0.1Mのトリエタノールアミンでアセチル化し、クロロホルムで脱脂化し、更に 等級付けされたエタノールで脱水化した。 NPY Y2のmRNAの分布を特徴付ける為に用いたオリゴヌクレオチドプローブは 、Cyclone Plus DNA合成機（Milligen/Biosearch）で合成し、ゲルで精製した。 使用したプローブ及びその配列は表7に記載した。プローブの特異性は、以下に 示すin situ ハイブリダイゼーションプロトコールをラットNPY Y2DNA（前記） で形質転換された細胞に施すか、又は非形質転換の対照細胞に施して確立された 。更に、両方のセンス鎖及びアンチセンス鎖プローブを細胞及びラットの組織に 使った。 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Boehringer Mannheim;In diallapolis,In）を使用して、プローブの3′末端を、³⁵S-dATP(1200ci/mmol，N ew England Nuclear，Boston，MA)で標識して比放射能を10⁹cpm/μgにした。放射性 標識をしたプローブを、Biospin6クロマトグラフィーカラムで精製し、ハイブリ ダイゼーション緩衝液で希釈して濃度を1.5 X 10⁴cpm/μlにした。ハイブリダイ ゼーション緩衝液は50％ホルムアミド、4 X クエン酸ナトリウム緩衝液（1 X SS C=0.15M Nacl及び0.015Mクエン酸ナトリウム）、1 X Denhardt′s溶液（0.2%ポ リヴィニルピロリドン、0.2％フィコール、及び0.02％ウシ血清アルブミン）、5 0mMジチオスレイト−ル、0.5mg/mlのサケ精子DNA、0.5mg/ml酵母tRNA、及び10％ 硫酸デキストランからなる。希釈したプローブ100μlを各部分にのせて、次にPa rafilmカバースリップで覆った。ハイブリダイゼーションは、湿性チャンバー内 で一晩、40から55℃で行った。翌日、切片を室温で1時間の間に、2 X SSCで二回 洗浄し、次に0.1X SSCで30分間50から60℃で洗浄し、最後に0.1X SSCで30分間室 温で洗浄した。組織を、等級付けされたエタノールで脱水化して、３日から6週 間-20℃で、Kodak XAR-5フィルムのそばにおき、ついで0.2％のグリセロール水 で1:1に希釈した、Kodak NTB3オートラジオグラフィー・エマルジョンに浸した 。4℃で2から8週間露出した後、該スライドをKodakD-19現像剤で現像し、固定し 、ヘマトキシリンとイオシンとで対比染色した。 〈機能アッセイ：cAMPのラジオイミュノアッセイ〉 安定に形質転換された細胞を96穴のマイクロタイタプレートにまき、プレート 内に密集するまで培養した。受容体の機能消出の可能性を低減するため、培地中 の血消をアッセイ前4時間から16時間1.5％に減らした。細胞をHankの緩衝塩液ま たは0.1％のウシ血清アルブミンと5mM テオフィリン(theophyllin)を添加したHB S(150mM Nacl、20mM HEPES、1mM CaCl₂、5mM KCl、1mM MgCl₂、及び10mM ブドウ 糖)で洗浄し、同溶液中で20分間、5％CO₂中で37℃で前平衡化した(pre-equilibr ated)。次に細胞を5分間、10μMのフォルスコリン(forskolin)及び種々の濃度の 受容体選択的リガンドとインキュベーションした。HBSを取り除き、細胞を100mM のHClで酸性化してアッセイを終結させた。細胞内cAMPを抽出して、磁性ビーズ を使ったラジオイミュノアッセイ(Advanced Magnetics，Cambridge,MA)の改変版 により定量した。最終抗原／抗体複合体は、真空ろ過によりマイクロタイタプレ ート中のPVDFフィルタを通して遊離型の¹²⁵I-cAMPと分離した。フィルタを切断 してPackardガンマカウンタで¹²⁵Iを計測した。結合のデータは、GraphPAD Pris m パッケージ(San Diego、CA)の非線形の回 帰分析と統計的技法により分析した。 〈機能アッセイ：細胞内カルシウム動員〉 細胞内遊離カルシウムの濃度を蛍光支持染料Fura-2/AMを使って、マイクロ分 光蛍光光度法により測定した。安定に形質転換した細胞を、硝子のカバースリッ プを入れた35mmの培養用皿にまいた。細胞をHBSで洗浄し、次に100μlのFura-2/ AM(10μM)を20分から40分間加えた。HBSで洗浄してFura-2/AM溶液を除去した後 、細胞をHBSで10分から20分間平衡化した。次に細胞を、Leitz Fluovert FS 顕 微鏡で40Xの対物レンズを使って視覚化し、励起波長を340又は380nMとし、蛍光 発光を510nMで測定した。カルシウム濃度の標準曲線とソフトウェア分析技術と を使って蛍光の生データをカルシウム濃度に変換した。 〈試薬〉 細胞培養用の培地及び添加物は、Specialty Media(Lavallette,NJ)より入手 した。細胞培養皿は、Corning(Corning，NY)より入手した。細胞培養フラスコ（ 225cm²）及びポリプロピレン・マイクロタイタ・プレートはCo-Star（Cambridge ,MA）より入手した。ブタ¹²⁵I-PYYはNew England Nuclear(Boston，MA)より入手 した。Whatman GF/CフィルタはBrandel(Gathersburg，MD)より入手した。Bio-Ra d ReagentはBio-Rad（Herculus，CA）より入手した。ウシ血清アルブミン及びバ シトラシン（bacitracin）はSigma(St.Louis，MO)より入手した。その他のもの はすべて試薬グレードのものであった。 ［結果］ ヒト海馬Y2受容体をコードしたcDNAの単離 ヒトNPY受容体サブタイプ（Y2）をクローニングするために、COS-7細胞での発 現クローニング法を用いた（20、21、22）。このストラテジーを選択した理由は 、直接的顕微鏡オートラジオグラフィーで単一の受容体を検出できるほどに極度 に感度がよいからである。 Y2受容体はシナプス前性の受容体と説明されているから、実際にこの特異的mR NAを含んだ細胞体を脳の限定された領域に位置づけるのは難しい。ヒトの海馬は mRNAの良い供給源であると考えられるが、これは海馬には多くの介在ニューロン が含まれ、また非常に高密度でY2受容体を有していることが示されているからで ある（23、24、25、26）。平均で3kbの長さを有する、2.2X10⁶の独立した組み換 え体のヒト海馬cDNAライブラリを、約5000の独立した440のプールに分画した。 最初の200プールを試験して、スクリーニングアッセイで3つの陽性細胞が得られ た（#145、158、及び189）。最後の220プールを試験したが全て陰性であった。 Y1及びY2受容体サブタイプは海馬中で発現されるので（2）、Y1特異的プライ マを使ってPCRにより陽性プールのDNAを分析した。プール＃145及び＃158はY1受 容体をコードしたcDNAを含むが、プール＃189はPCRでは陰性で（データ非掲載） 、Y1以外のヒト海馬NPY受容体をコードしたcDNAを含んでいるらしことがことが 判明した。プール＃189をそれぞれ1000クローンからなる20のプールに分割し、 予備的薬理学的特徴付けを、第二プールから調製したDNAで形質転換したCOS-7細 胞で行った。この予備的分析により、100倍過剰量の非放射性の［Leu³¹-Pro³⁴］ NPYは、Y1遺伝子で形質転換された対照COS-7細胞への125¹²⁵I-PYYの結合を全面 的に阻止することがわかった。これとは対照的に、同じ実験を第二プールの＃18 9-17で形質転換したCOS-7細胞で行うと、顕著な結合阻止は起きなかった。＃189 に対して同胞（sib）選択を、単一コロニーが得られるまで行った（CG-13と命名 ）。 単離したコロニーは4.2kbのcDNAを有している。このcDNAは、1002番目から214 7番 目のヌクレオチドの間の381アミノ酸の蛋白質をコードしたオープンリーディン グフレームを含んでいる（配列認識番号2）。異常に長い5’の非翻訳領域が翻訳 の効率またはmRNAの安定性に関わる可能性がある。推定の開始コドンの周囲のフ ランキング配列は、適切な翻訳開始に関してのKozakの共通配列に一致している （27、28）。 疎水性プロットは、ヒト海馬Y2受容体の7つの疎水性推定膜貫通領域を示して おり、これにより該受容体は、G蛋白質結合スーパーファミリの一員になってい る。ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列をそれぞれ図1及び図2に示してある 。 多くのG蛋白質結合受容体のように、Y2受容体もN連結糖付加に対する共通配列 を、膜蛋白質の適切な発現に関わるアミノ末端（11位）に有している（29）。Y2 受容体は、二つの良く保存されたシステイン残基を、最初の二つの細胞外ループ 部分（ジスルフィド結合を形成し、機能蛋白質構造を安定化すると考えられてい る）に有している。Y2受容体は潜在的なリン酸化部位、すなわち11、27、64、14 5、188、250、及び340位に7つのプロテインキナーゼCのリン酸化部位、174、及 び358位に2つのカゼインキナーゼリン酸化部位、並びに146、及び350位に2つのc AMP-及びcGMP依存性プロテインキナーゼリン酸化部位を示している。この11の潜 在的リン酸化部位のうち7つは、細胞内ループ1、2、及び3と同様に受容体のカル ボキシ末端に位置していて、それゆえに該Y2受容体の機能的特徴の制御において 役割を演じていることに注意が必要である（30）。潜在的なパルミトイル化部位 が326位のシステインにある。多くのG蛋白質結合受容体は該位置にシステインを 有しており、オドウド(O′Dowd)らは、それがヒトβ₂-アドレナリン作用性受容 体の結合機能において重要な役割を担っていることを推測した（31）。この付加 的サイトゾル性ループの形成は、受容体の膜を横切る移動性に影響を与える可能 性がある（32）。 報告済みのヒトY1cDNAクローンと比較すると（10、11）、該Y2配列は、ヌクレ オチドレベル（48.1％、図3）及び全アミノ酸レベル（31%、図4）の両方におい て、驚くほど低い相同性を示す。ヒト海馬Y2受容体の膜貫通領域とその他の7つ のTM受容体との相同性を表1に示している。TMに関して、その他のG蛋白質結合受 容体ファミリ、その他のペプチド受容体及び、特にY1サブタイプとの相同性が低 いということは、 Y2受容体サブタイプが、7つのTMペプチド受容体のなかの新規の、別個なサブフ ァミリに属している可能性ある。逆に、NPY受容体サブタイプは、全体の相同性 が異常に低い構成員を持つサブファミリを形成するということができる。出願人 らはヒトY4受容体についてもクローニングしたが、この受容体もまたヒトY2受容 体との相同性が低い（表1）。マウスのオーファン受容体であるMUSGIR(マウス・ グルココルチコイド・誘導性受容体、33)が、本願のヒトY2受容体と最も高いTM 相同性（42%、表1）を有することは非常に興味深い。同様の比較をヒトY1とY2の TM領域について行うと、41％の相同性しかないことがわかる。仮にヒトY2受容体 と、MUSGIRのヒト相同体との間で比較を行うと、相同性のレベルはもっと高くな るであろう。それゆえに、MUSGIR受容体はNPY受容体と関連していて、膵臓ポリ ペプチドリガンドファミリの構成員に結合する可能性がある。ヒトGIR相同体の 完全な薬理学的評価を、NPY、PYY、及びPPと関連したリガンドと行って上記仮説 を検証することは現在進行中である。 前記ヒトY2プローブを使ってノーザンハイブリダイゼーションを行い、3日間 の露出後、ヒトの脳に特異的な4.3kbのバンドを検出した（図16）。これは発現 クローニングによって出願人らが単離した4.2kbのcDNAと良く一致し、今回のcDN Aは完全な長さを有するものであることを示している。上記ヒトY2受容体をコー ドしたmRNAは扁桃体、脳梁、海馬、及び視床下部の核に顕著な量で存在する。か すかなバンドは、尾状核、視床下部、及び黒質に検出される。視床にはシグナル を検出することはできなかった。Clontech社のMTNブロットは脳幹の皮質由来のm RNAが含まれていないことに注意が必要である。 ヒトのゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーションを行い、それに引き 続き高厳密度で洗浄を行うことによって（図17）、ヒトゲノムには単一のY2受容 体遺伝子があることが示唆される（EcoRI、HindIII、BamHI、PstIに関して単一 バンドである）。BglIIに関して観察された9及び12kbのかすかなバンドは、ヒト Y2受容体のコード領域には二つのBglII制限部位があることで説明がつくし、ま たこれはY2受容体遺伝子が一つであることとも一致する。 一過性発現させたヒトY2受容体の薬理学 元来全細胞オートラジオグラフィー技術によって同定された、CG-13のY2様薬 理学は更に、膜結合アッセイにより定義された。ヒト海馬Y2受容体の遺伝子をCO S-7細胞で一過性発現させて、完全な薬理学的評価を行った。¹²⁵I-PYYは、CG-13 構築物で一過性形質転換されたCOS-7細胞からの膜に特異的に結合した。特異的 結合の経時変化を0.06nMの¹²⁵I-PYYの存在下で測定した（図5）。会合曲線は、 初期の急激な相での特異的結合が約55％で、その後の緩やかな経時変化において は45％の、二相性であった。急激な相においては、観測された会合定数（K_obs） は1.28±0.02 min^-1で、t_1/2は0.5minであった；平衡結合は、2分以内に95%が完 了し、5分以内には100％完了した（ｎ=3）。緩やかな相では、K_obsは0.0.2±0.0 0min^-1で、t_1/2は37分であった；平衡結合は120分以内に90%が完了し、160分以 内に95%が完了し、280分以内に100％完了した（ｎ=3）。両方の相を含む、全平 衡結合は120分以内に95%が完了し、240分以内に100%完了した。二相の会合曲線 は、複雑な受容体表面の結合とそれに続く、深部の結合へのアクセスを反映して いる可能性があるが、これはSchwaltzと共同研究者らがY2受容体に関して示唆し ていることである（34）。比較のため、COS-7で一過性発現したヒトY1受容体の 結合の経時変化を測定した（図5）。会合曲線は単一相であり、K_obsは0.06±0.0 2min^-1、t1/2は12分;平衡結合は51分以内に95%が完了し、90分以内に100%完了し た（ｎ=3）。CG-13及びヒトY1の異なる会合パターンは、受容体/リガンドの新規 の相互作用について示唆する。 ¹²⁵I-PYYに対する飽和結合データを、見かけK_d=0.069±0.4nM及び、見かけB_{ma x} =7.8±0.4pmol/mgの膜蛋白質を使って、一部位モデルに適合させた（n=3;図6） 。形質転換効率が20-30%であるとすると（非掲載データ）、形質転換細胞上の該 受容体密度はおそらく3 X 10⁶/細胞に近い値であろう。CG-13で形質転換した細 胞を使ったときのように、疑似形質転換した細胞（mock transfected-cells）か ら膜を調製して分析すると、¹²⁵I-PYYの特異的結合は見られなかった。上記の条 件下での¹²⁵I-PYY結合部位は、CG-13構築物由来であると結論づけられる。 Y2受容体認識は主として両親媒性のα-ヘリックスの後にある、NPY(Arg³³-Gln³⁴ -Arg³⁵-Tyr³⁶-NH₂)のC末端の4残基に依存している。Gln³⁴のPro³⁴での置換は あまり許容されない（4、5）。故に出願人らは数種類のC末端断片、及びC末端 修飾ペプチドを競合結合研究用に選択した。選択した化合物に対する親和性の順 位序列は¹²⁵I-PYYの競合的置換より求めた（図7及び表3）。CG-13受容体を以下 の二つのモデル系と比較した：１）COS-7細胞中で一過性発現した、クローン化 ヒトY1受容体、２）ヒト神経芽腫細胞、SK-N-Be(2)で発現しているY2様受容体ポ ピュレーション（2、8）。わかっているかぎりでは、ヒトY3受容体及びヒトPP受 容体のモデルは提唱されていない。 CG-13は高親和性でヒトNPYへ結合し（K_i=0.69 nM）、ヒトPYYへは更に高親和 性で結合した（K_i=0.39 nM）。上記K_i値は、薬理学的に定義されているY2受容体 の、結合及び機能アッセイの研究に関する数多くの報告と一致する（2）。これ とは反対の順位序列が、より強い受容体／結合相互作用（ヒトNPYとヒトPYYに対 してそれぞれ、K_i=0.049、K_i=0.085）と共にヒトY1受容体に関して観測された。 この点においてCG-13が¹²⁵I-PYYに対して（K_d=0.069nM）、PYYに対するよりも(K_i =0.39nM)より高親和性で結合したことは興味深く、これはヨウ素化が受容体/リ ガンド複合体を安定化したことを示唆している。これとは対照的に、ヒトY1受容 体は¹²⁵I-PYYに対して（K_d=0.062+0.010nM）、及びPYYに対して（K_i=0.085nM） 匹敵する親和性で結合した。CG-13及びヒトY1受容体が異なる大きさ及び親和性 の順位序列で、NPY、PYY、及び¹²⁵I-PYYに対して結合したという事実は、サブタ イプ選択性の非ペプチドリガンドの開発に潜在的に役立つ可能性のある、明確な ペプチド認識機構を反映していると考えられる。 CG-13は高親和性でもってブタNPYにも結合し（K_i=0.86nM）、これはPP折畳み 部分にLeu¹⁷をMet¹⁷の代わりに含むヒトNPYとは異なっている。CG-13はNPY及びP YYのN末端欠失に対して相対的に感受性が低く、ブタNPY_22-36への親和性は、全 長ブタNPYに対する時のわずか5倍低い。αヘリックス構造の極度な欠失はあまり よくは許容されず、ブタNPY_22-36に対する親和性は全長プタNPYに対するときよ りも240倍低かった。Gln³⁴の代わりにPro³⁴を有する、ヒト［Leu³¹，Pro³⁴］NPY 及びヒトppは、あまり良く結合しなかった（K_i>300nM）。カルボキシ末端のアミ ドを加水分解して、NPY遊離酸の様に遊離カルボン酸にすると、CG-13への結合親 和性を低下させた（K_i＞300nM）。末端アミドは膵臓ポリペプチドファミリ/受容 体相互作用に取って必須の、共通した構造 であることがわかる。 競合的置換データは、CG-13がPYYに対して、NPYに対する結合と等しいか、又 はより大きい親和性で結合することを示している。NPYのC末端領域は主要な薬理 活性部である。ヒト［Leu³¹，Pro³⁴］NPY及びヒトppに対する低親和性から、CG- 13はGln³⁴のPro³⁴への置換を許容しないことがわかる。SK-N-Be(2)細胞受容体と は共通であるが、ヒトY1受容体とは共通でない結合プロファイルは、薬理学的に 定義されたY2受容体の特徴である（参考文献2、8；更に表2も参照されたし）。 よって膜結合研究は、CG-13がヒトY2受容体をコードしているという我々の判断 を確認し、敷衍する。 ヒトY2受容体の薬理学プロファイルを、NPY、PYY、及びPPに関連したペプチド 類縁体を使用して更に調査した（表4）。CG-13はヒトとカエルのNPY類縁体（そ れぞれK_i=0.74、0.87nM）、ヒトとブタのNPY_22-36類縁体（それぞれK_i=2.0、1.2 nM）、ヒトとブタの［Leu³¹，Pro³⁴］NPY類縁体（それぞれK_i＞130、＞540nM） 、またはヒトNPYとヒト［Tyr-O-Me²¹］NPY(それぞれK_i=0.74、1.6nM)を区別しな かった。NPYに関しては、ラットのCNSでは高結合親和性であるがラットの輸精管 では潜在性が低くて、選択的があるという提言に基づいて、この最後の誘導体は 、中枢のNPY受容体と末梢のNPY受容体に対して調べられている（83）。しかしな がら研究中の受容体に対して、［Tyr-O-Me²¹］NPY及びヒトNPYはほとんど同じ結 合プロファイルを示した。CG-13への選択性が最も大きいNPY受容体は、C2-NPY、 C²-C²⁷のジスルフィド結合で安定化したNPY誘導体で、8-アミノ-オクタノイック ・リンカでNPY_5-24を置換したものであった（Ki=3.5nM,Y1やY4に対するよりもCG -13に対する方が20倍以上選択性がある）。C2-NPYはY2-選択性化合物である報告 されている（3）。 更に3つのPYY誘導体には独特の結合プロファイルがあった。CG-13は最も高い 親和性及び最も大きい選択性でヒトPYY_3-36へ結合した（Ki=0.70nM,Y1やY4に対 するよりもCG-13に対する方が20倍以上選択性がある）。PYY_3-36は血液中の主要 な、PYY様免疫反応性体であり、それゆえに生体中のCG-13依存性過程を仲介する 可能性がある（84、85）。ブタPYYは相対的に、非選択的であり、ヒトPYYと結合 親和性は同様である（それぞれK_i=0.35nM,0.36nM）。ヒト［Pro³⁴］PYYはCG-13 への結合親和性を欠いてい て(K_i>310)、これにより、Pro³⁴がCG-13受容体への高親和性でのペプチド結合を 阻害するという議論を指示する。 更に6つのPP誘導体を調べた。これらのペプチドは、Pro³⁴を含む（ウシ、ラッ ト、ニワトリ、及びカエルPP）ということにおいてヒトPPと類似していて、CG-1 3結合アッセイにおいては活性を全く示さない。Gln³⁴を含むことで識別される、 サケPPに対してのみ（K_i=0.17nM）、高親和性が検出できた。ヒトPPのC末端を修 飾して、［Ile³¹,Gln³⁴］PPの時のようにヒトNPYにより似させると、CG-13への 結合親和性は劇的に上昇した（K_i=20nM）。［Ile³¹，Gln³⁴］PPは、Y2結合アッ セイ時にPPよりもより活性がある一方で、ラットの輸精管における推定PP受容体 に対しては作用強度が小さいことがすでに報告済みである（86）。 提案されている幾つかのNPY拮抗薬についてCG-13受容体への結合能を調べた。 これらには、NPY介在性の食餌及び神経伝達物質放出を拮抗することが報告され ている、NPYのC末端誘導体であるPYX-1及びPYX-2が含まれる（87、88、89）。合 成ペプチドは、高い親和性または選択性を伴って、CG-13へ結合することはなか った（PYX-1に対してK_i=684nM、PYX-2に対してK_i>1000nM）。［D-Trp³²］NPYは 、ラットの海馬に注射すると食餌行動を制御することが報告されているNPY誘導 体であり（90）、この類縁体はCG-13結合アッセイでは不活性である。別の不活 性物質としては、ラットの輸精管でNPYと拮抗することが報告されているペプチ ドであるNPY_1-24アミドがある（83）。 ヒト組織Y2受容体マクロ局在化：PCR ヒトY2mRNAをヒト組織の広い範囲からPCR技術により検出した（表5）。ハイブ リダイゼーションシグナルは、全脳、胸部動脈、冠状動脈、及び陰茎、において 相対的に強く、前頭脳、心室、腸間膜、胃、回腸、において中程度で検出された 。鼻粘膜及び膵臓においては、比較的低レベルで検出された。心房、肝臓、及び 子宮を含む他の幾つかの組織においては、本方法ではY2mRNAは陰性であった。 ラットNPY/PYY（Y2）受容体の二つのアイソフォームのクローニング及び発現 ヒトY2受容体との相同性を有する2つのラットクローンを単離し、rs5a（図8） 及 びrs26a（図9）と命名した。rs5aのヌクレオチド配列は、コード領域においてヒ トY2受容体のコード領域と86.5％の相同性を有し（図10）、ヒトY2のアミノ酸配 列と94.5％の相同性をもった381アミノ酸からなる蛋白質をコードすることが可 能である（図11）。推定の膜貫通領域(TM)において、rs5aがコードすると予想さ れる蛋白質は、ヒトY2受容体と98.2％の相同性を有している（図11）。一次配列 におけるこの高い相同性は、種間の相同体同士で良く見られることであり、rs5a がコードしている受容体はラットY2受容体であることを強く示唆している。しか しながら、一つのアミノ酸置換によっても受容体の機能的性質に影響を与えるこ とがある。すなわち、高い配列相同性を示す種間相同体であっても、異なる薬理 学的性質を示す可能性があり（以下参照）、その結果、薬剤開発に使用するため にラット受容体とヒト受容体の双方を取得することの重要性が過小評価されてい る。 第二ゲノムクローンの配列分析により、rs26aもまたラットY2受容体の全長を コードしていることがわかったが、rs5aの配列と比較すると、rs26aは二つのヌ クレオチドの変異を含んでいた。このヌクレオチド変異の双方は共に、推定のラ ットY2受容体蛋白質においてアミノ酸置換を生じさせている。二つのアミノ酸変 異を有する結果、rs26aがコードする蛋白質は、rs5aがコードする蛋白質に対し て99.7％相同である。ヒトY2受容体と比較すると、rs26aはヌクレオチド配列で8 5.2％、アミノ酸配列で98.2％の相同性を有する。故にこのクローンは、rs5aと は異なったラットY2受容体のアイソフォームをコードしている。アミノ酸置換の 位置（N末端及び5/6ループ、図3を参照）は、これらが潜在的に受容体機能に影 響を与えることを示唆している。rs5a、及びrs26aがコードしているY2受容体は 、同じ遺伝子座の対立遺伝子変異体であると思われるが、rs26aは第二のラットY 2遺伝子である可能性もある。よって、出願人らは、rs5aをコードしているアイ ソフォームをラットY2a受容体、及びrs26aがコードしているアイソフォームをラ ットY2b受容体と命名した。 ラット及びヒトのY2受容体の一次配列は互いに関連性が高いが、N連結型糖付 加、Nミリストイル化、及び蛋白質リン酸化において異なるパターンを示す。例 えば、ラットY2aは、プロテインキナーゼCによるリン酸化部位を他の部位に多く 有している点において、ラットY2bとは異なっている。更にヒトY2は、N連結型糖 付加部位を二つ、 cAMP-及びcGMP-依存性蛋白質リン酸化部位を二つ、カゼインキナーゼIIリン酸化 部位を一つ、プロテインキナーゼCリン酸化部位を一つ、それぞれ多く有し、ま たNミリストイル化部位は二つ少なく有している。これらの部位は、上記3つの受 容体の機能や制御において差を生じる可能性がある。Y2受容体に関して、二つの ラット相同体を単離することで、ラットとヒトとのY2受容体の薬理学的特徴を、 一次構造に関して見られる違いとの関係において比較する手段（以下を参照のこ と）が提供される。これらのデータは、これらの部位に作用する、ヒトの治療用 薬剤の設計及び試験にとって重要となるであろう。 ラットY2相同体を使った結合の研究 ラットY2a相同体に対応したDNAをCOS-7細胞で一過性発現して、膜結合研究に 用いた。¹²⁵I-PYYのラットY2a受容体への結合は、0.5から2.5nMの標識済みリガ ンド濃度の範囲で飽和性であった。結合データを、見かけK_d=0.26nM、及び受容 体密度を5100fmol/mg膜蛋白質として、一部位モデルに適合させた。膵臓ポリペ プチドファミリのペプチド類縁体を使って、ラットY2aの薬理学的プロファイル が、ヒトY2受容体のものに似ていることが判明した（表6）。それぞれの受容体 類縁体は比較的、リガンドのN末端欠失を許容し（ラットよりもヒトの方がより 許容する）、Pro³⁴や修飾したC末端を含んだものは非許容的である（NPY遊離酸 や［D-Trp³²］NPYのように）。 ラットY2bクローンは、N末端の最後部（Leu²⁰からPhe²⁰）と第三細胞内ループ （Thr²⁶⁶からMet²⁶⁶）においてそれぞれ一つずつ、合計の二つのアミノ酸変異に よってラットY2aとは異なっており、これは予備的調査のみに供した。ラットY2b 受容体で一過性の形質転換したCOS-7細胞からの膜を0.08nMの¹²⁵I-PYYとインキ ュベーションして、30℃120分のインキュベーション後の特異的結合について分 析した。形質転換した細胞からの膜は、mg膜蛋白質当り310fmolの¹²⁵I-PYYを結 合し、一方疑似形質転換細胞（受容体cDNA挿入部を含まないベクタのみを導入し たもの）からの膜は、mg膜蛋白質当りわずかに3fmolの¹²⁵I-PYYを結合した。ラ ットY2a受容体及びラットY2b受容体との間に薬理学的又は機能的差異が存在する かどうかについてはこれから決定する必要がある。 NPY Y2受容体伝令RNAのラット中枢神経系における局在化 対照実験において、ラットNPY Y2 mRNAのハイブリダイゼーションシグナルは 、アンチセンスプローブを使用したときのみに検出でき（プローブの配列は表7 を参照）、またラットY2DNAで形質転換した細胞に対して行ったときのみに検出 できた（図18）。プローブは、ラットY2a及びラットY2bの両方を認識する様に設 計した。非経質転換細胞や、ラットNPY Y1 mRNAで形質転換した細胞を使ったと きには共に、ハイブリダイゼーションシグナルは検出されなかった。ラットの脳 断片では、センスプローブでのハイブリダイゼーションシグナルは検出されず、 アンチセンスプローブを用いた時のみに検出された。 ラットの脳において、NPY Y2 mRNAの分布を体軸方向の範囲を通る冠状切片に おいて観察したものを図12及び表8に示してある。ラットの脳の多くの領域にお いてハイブリダイゼーションシグナルが検出され（図12）、これは顕微鏡レベル ではニューロン性質の細胞質に集中していた（データは非掲載）。終脳において 最も強いハイブリダイゼーションシグナルは、海馬のCA3領域（図12B-E）、及び 扁桃体の内側の核の前腹面（図12D）で観察された。嗅覚の結節、側方の中隔核 において（図12A）、また底内側（basomedial）核、及び扁桃体の後内側皮質性 核において、あまり強くないシグナルが観察された（図12D、E）。中枢扁桃様核 において、ハイブリダイゼーションシグナルを有し、分散したニューロンも観察 できた。皮質においては、梨型領域いおいて大型のニューロンの銀色の粒子がみ られた。 間脳構造の中では海馬の弓状核が、NPY Y2 mRNAの最も強いハイブリダイゼー ションシグナルを呈した（図12D、E）。この領域ではほとんどのニューロンが標 識されているようで、弓状核側方の灰白隆起領域においても多くのニューロンが 標識されていた。更に、背側正中及び腹側正中の視床下部の核は両方とも、ニュ ーロンの亜集団にかなりのハイブリダイゼーションシグナルを含んでいた（図12 C、D）。背側及び腹側の前乳頭核（Premammilary nuclei）では、多くのニュー ロンでハイブリダイゼーションシグナルが検出された（図 12E）。視床では、中 心正中核（centronledial）のニューロンが標識される一方で、脳室周囲の核で は、より小さくより弱く標識された細胞群が観察できた（図12D）。 中脳、髄質、及び脳橋では、アンチセンスオリゴヌクレオチドで標識される構 造はほとんどなかった。中程度のレベルのハイブリダイゼーションシグナルを呈 していたのは、背側及び尾側の線形縫線核（図12F）、脳橋核、及び後方背側表 層の核（図12G）であった。脊髄では、ラミナ9に散らばった大型のニューロンに 標識が観察された（図12H）。更に銀色粒子が背根神経節内の2、3のニューロン で見られた。 受容体／G蛋白質相互作用：グアニンヌクレオチドの効果 ある種のG蛋白質結合受容体では、膜抽出物中の受容体ポピュレーションの一 部が、、受容体／G蛋白質複合体として、リガンド高親和性状態で典型的に存在 している。GTP又は加水分解されない類縁体のG蛋白質への結合は、低親和性リガ ンド/結合状態を好むような、受容体のコンフォーメーション変化を生じさせる （110）。非加水分解性GTP類縁体であ、Gpp(NH)pが、ヒトNPY又は¹²⁵I-pYYの、C OS-7細胞中で一過性発現したY2受容体への結合を変化させるかどうかについて調 べた。ヒトNPYによる競合曲線を、100μMのGpp(NH)pの存在下及び非存在下にお いて評価した。ヒトY2受容体はラットのY2a受容体に比べてGpp(NH)pに対して比 較的非感受性であった（図13）。ヒトNPYのヒトY2受容体への結合に関するIC₅₀ は2.2nMから3.3nMへと上昇した。¹²⁵I-PYYの特異的結合はわずか4％だけ減少し た。ヒトNPYのラットY2a受容体への結合のIC₅₀は、ほんのわずかだけ変化した（ 0.7nMから1.2nM,n=2）。しかしながら¹²⁵I-PYYの特異的結合は23％減少した（n= 2）。Gpp(NH)pへの感受性の同様のパターンが、¹²⁵I-PYYのラットの脳への結合 に関して報告されている（91）。ラットとヒトとのY2受容体クローンの違いは幾 つかの因子によって説明がつく。それらに含まれるのは、1）COS-7細胞内にある G蛋白質のタイプ、2）COS-7細胞内の受容体の貯蔵レベル（ヒトY2受容体濃度は ラットY2a受容体の濃度よりも高いことに注意）、3）受容体／G蛋白質結合の効 率、である。 安定発現系：結合分析の特徴付け 非形質転換の293細胞及びNIH-3T3細胞を¹²⁵I-PYYの特異的結合でプレスクリ ーニングし、陰性であることがわかった（データは非掲載）。ヒトY2受容体cDNA とG-418抵抗性遺伝子での共形質転換、及びG-418での選択後に、¹²⁵I-PYYに対す る特異的結合に関して、生存細胞をスクリーニングにかけた。2つの陽性クロー ンを同定、単離し、 以降の研究に供した（293の#10クローン、NIH-3T3の＃5クローン）。¹²⁵I-PYYの 293安定クローンからの膜への結合は、0.5pMから2.5nMの標識済みリガンドの範 囲において飽和性であった。結合データは、見かけK_d=3±1pM、かつ受容体密度 をmg膜蛋白質当り880±50fmolとした、一部位結合モデルに適合していた（平均 ±s.e.m.,n=3）。安定に形質転換されたNIH-3T3細胞からの膜は、見かけK_dが8± 2pM、かつmg膜蛋白質当り160±60fmolの受容体密度で、同様の結合特性を有して いた（平均±s.e.m.,n=2）。安定クローンの両方からの膜を、100μMのGPP(NH)p の存在下、及び非存在下で0.08nMの¹²⁵I-PYYとインキュベーションした。293細 胞膜中の受容体への¹²⁵I-PYY受容体の特異的結合はグアニンヌクレオチドの存在 下では23％減少し、一方NIH-3T3細胞膜中のY2受容体への特異的結合は、同様の 条件下でわずかに6％のみ減少した。このデータは、与えられた受容体に対する 受容体／G蛋白質相互作用が、宿主細胞株中に存在するG蛋白質に依存して変化す るということを強調するのに役立つ（93）。受容体密度や受容体貯蔵といった別 の因子もまた、役割を演じている（92）。 機能アッセイ：cAMP ここまでに記載したY型受容体全ての活性化には、アデニレートシクラーゼ 活性を阻害する（G_i又はG₀）G蛋白質への結合が関わると考えられている(1)。こ れらすでになされた観察に基づいて、ヒトY2受容体で安定に形質転換された293 細胞での、PYYのフォルスコリン刺激性cAMP蓄積の阻止を調べた。ラジオイミュ ノアッセイで調べたところ、生細胞を10μMフォルスコリンと共にインキュベー ションすると5分の間にcAMPが10倍蓄積された。ヒトPYYと同時にインキュベーシ ョンすると、フォルスコリン刺激性cAMP蓄積が、安定に形質転換された293細胞 内で71％減少したが（図14）、一方非形質転換細胞では減少しなかった（データ 非掲載）。NPY介在性応答は濃度依存性（EC₅₀=0.25nM）であった。ヒトY2受容体 活性化は、cAMP蓄積の減少を、多分アデニレートシクラーゼ活性の阻止によって 引き起こすと結論した。同様の結果が、ヒトY2受容体で安定に形質転換されたNI H-3T3細胞に関しても得られたが、そのなかでは、0.21nMのEC₅₀でもって、ヒトN PYが形質転換細胞中でフォルスコリン刺激性のcAMP蓄積を50％減少させた（図14 ）。 一過性発現したヒトY2受容体の結合能に関して選択したペプチドを更に、安 定に 形質転換された293細胞を使って機能活性を調べた（表9）。測定可能な結合親和 性を有するペプチド全ては、PYYのcAMP蓄積への影響を模倣した。EC₅₀値はおお むねK_i値の10倍の範囲内にあり、しばしば大きさは小さかった（表9）。更に、 報告のある食餌行動調節剤である［D-Trp³²］NPYの機能活性も調べた。このペプ チドのヒトY2受容体に対する低結合親和性と一致して、0.3μMまでの濃度におい て、及び0.3μMで機能応答の拮抗作用を調べた時には、機能活性は全く検出され なかった（データは非掲載）。報告のあるNPY受容体拮抗剤である、PYX-1及びPY X-2もまた、同じ規範で調べると非活性であった。 機能アッセイ：細胞内カルシウム動員 1μMのヒトPYYヒトY2受容体で安定に形質転換した293細胞内において、細胞 内遊離カルシウム濃度が上昇した(Δ［Ca²⁺］_i=80nM,図15)。PYY介在性応答は濃 度依存性で、EC₅₀=39nM、n=2であった（図15）。PYY誘導性カルシウム動員は、1 mMの細胞外EGTA存在下では比較的維持されて（1μMのヒトPYYに対してΔ［Ca²⁺ ］_i=64nM）、細胞内カルシウム貯蔵は一過性カルシウム流動の主要源であること を示唆している。百日咳毒素（100ng/mlを24時間）で前処理すると、300nMのヒ トPYYに対する応答が93%減少し、故にG蛋白質関連シグナル伝達経路を支持して いる。非形質転換の293細胞はヒトPYYに応答しなかった（データ非掲載）。カル シウム動員アッセイはY2受容体活性化の測定を可能にする第二の経路を提供する 。 ［考察］ 配列相同性に基づいてNPY Y2受容体サブタイプを単離しようという試みはこれ までのところ、成功していない。故に高特異的ヨウ素化リガンドを使って、機能 性受容体が形質転換細胞表面上で実際に、鋭敏な感度で検出できる発現クローニ ングを選択した。この戦略により、薬理学的に定義されたY2受容体をコードして いるヒトcDNAを単離した。一つのクローンを見つけだすために、平均の長さが3k bの挿入部を有する2.2 X 10⁶の独立クローンをスクリーニングしなければならな かったという事実は、cDNAライブラリの構築工程においては、Y2cDNAクローニン グが非常不利であるか、またはY2mRNAがヒトの海馬組織内で非常に低いレベルで 発現していることを明かにしている。該cDNAのリーディングフレームのなかで最 も長いものは、推定の分子量が42kDの、381アミノ酸からなる蛋白質をコードし ている。アミノ末端にはN連結糖付加部位があるという事実によれば、見かけ分 子量は幾分大きく、ヒト海馬のY2受容体の分子量が50kDであるという報告済みの データ（36）と良く一致する。Y2受容体には、機能特性の制御に関わる可能性の ある、多くの潜在的なリン酸化部位がある。 ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の両方の分析は、ヒトY1及びY4を含む7-TM 受容体との相同性が低いことを明かにしている。膜貫通部のアミノ酸が最も相同 性が高いのは、マウスのMUSGIR受容体である。ヒトGIR相同体の薬理学的プロフ ァイルが、NPY、PYY、及び膵臓ポリペプチドに関連したリガンドと共に確立され れば、このオーファン受容体が、薬学的に定義された同じ神経ペプチドサブファ ミリに属するかどうかがわかるであろう。該ヒトY2受容体は、すでにクローニン グされているヒトY1受容体とは相同性が非常に低い（全体で31％、膜貫通領域で は41％）。該ヒトY2受容体はまた、ユニークな薬理学的プロファイル、及び¹²⁵I -PYYとの結合の経時変化を有する。ヒトY1とY2との間の、配列と薬理学的プロフ ァイルの劇的な差異は、これらが二つの関連性のない遺伝子によってコードされ ていて、その産物が同じリガンドファミリに結合するように進化したことを示唆 している。逆に言えば、進化の早い時期において、これらは共通の祖先より分岐 し、多数の変異が起こって別個の薬学的特徴を有するようになった。 ノーザン分析により、4.3kbのバンドがヒトの脳に検出されたことは、我々の4 .2kbのY2cDNAが全長であることを証明している。サザン分析は、単一のY2受容体 遺伝子を含むヒトゲノムに一致している。 出願人らの初期の特徴付けで確立された薬理学的プロファイルは主に、CG-13 をヒトY2受容体として確立するのに役立つ。ここに含まれる別のデータは、受容 体リガンド／相互作用についてのより深まった理解を反映している。例えば現在 において、C2-NPY及びPYY_3-36はY2受容体部位に対して、元来記述されたNPYのC 末端よりも高親和性及び高選択性で競合することがわかっている。更にある種の ペプチドで、［D-Trp³²］NPY、PYX-1、PYX-2の様に、NPY依存性効果と拮抗する ものは、ここに記載されたヒトY2受容体の結合に対して拮抗することができない こともわかっている。故に出願人らの有する証拠では、クローン化したY2受容体 が生体内又は試験管内でのこれらの特異的ペプチドの分子標的であることを支持 できない。 ヒトY2受容体mRNAを、広い範囲のヒト組織でPCR技術により検出した（表5）。 ハイブリダイゼーションシグナルは、全脳、胸部動脈、冠状動脈、及び陰茎、に おいて相対的に強く、前頭脳、心室、及び腸間膜において中程度で検出された。 この分布は、Y2受容体の局在化、並びにCNS、心血管、及び生殖の生理学の、受 容体依存性効果の証拠と一致している（94）。中程度のハイブリダイゼーション シグナルはまた、胃、回腸、に検出され、これは主細胞のcAMP蓄積、及び腸の電 解質流動へのY2介在性効果の証拠と一致している。Y2様受容体がそれぞれ、血管 収縮、膵臓分泌を制御すると報告されている二つの組織の鼻粘膜及び膵臓では、 レベルは比較的低かった（97、98、99）。Y2受容体mRNA及び受容体発現のより明 確な局在化（すなわち、ニューロン、腸細胞、血管平滑筋細胞等のどれであるか ）は、in situのハイブリダイゼーション及び受容体オートラジオグラフィー技 術によって調べられる。 ここに記載したNPY Y2mRNAのラットの脳における分布は、数多くの潜在的な示 唆に富んでおり、数多くの重要な問題を提起する。これらのなかには以下のもの がある：1）このmRNAの分布はどのようにNPY自身の分布と相関しているのか、2 ）以前の報告に記載されている、Y2受容体に関するオートラジオグラフィーによ る推定の局 在化に、Y2mRNAの分布がどのように関連しているか、3）Y2mRNAの分布の機能的 な意味は何なのか。 NPY免疫反応性との相関関係 神経ペプチドYは、哺乳類の脳において最も広く多量に分布しているペプチド の一つである（100）。ある領域においては、同じニューロン内での共局在化（c o-localization）については末だ確定していないものの、NPY Y2 mRNAはNPY-免 疫反応性（NPYir）ニューロンと共分布していることがわかっている。海馬の弓 状核及び扁桃体の中間核の両方において、Y2mRNAの分布はNPYirニューロンの分 布と重なり合っていて、これは免疫細胞化学的研究により証明されている（100 、101）。更にこれら両方の領域は、NPYir軸索の中程度の網状構造を含んでいる 。これらの観察は、Y2受容体のシナプス前性/シナプス後性の性質の問題を末解 決のままにする。脳のその他の領域の大部分では、Y2mRNAはNPYirニューロンと 共分布しないが、その代わりにNPYirの末端部分の分布とよりよく相関しており 、シナプス後性局在化を示唆している。 受容体オートラジオグラフィーとの比較 放射性標識したNPYリガンドの局在化のオートラジオグラフィーに基づき、数 多くの研究者らが、サブタイプ特異的置換体と組み合わせて、放射性標識したNP Yリガンドの中の［¹²⁵I］NPY、及び［¹²⁵I］ペプチドYY(PYY)の分布について記 述している。Y2受容体は、［¹²⁵I］PYYとY2選択性遮蔽剤であるNPY_13-36との組 み合わせにより、位置ずけられている（94）。このような研究の結果は、Y2受容 体がラットの脳で広く分布していて、海馬、嗅球、及び視床下部において最も富 んでいることを示唆している。NPY Y2mRNAは嗅球にはないが、海馬及び視床下部 においてはY2mRNAがあった。しかしながらNPY受容体サブタイプの薬理学的特徴 づけは現在において不完全であり、Y2様の結合の幾つかは、いわゆる非定型のY1 受容体に起因するか、その他の未発見のNPY受容体サブタイプに起因するもので ある可能性がある。本願のin situの結果は、該Y2受容体のオートラジオグラフ ィーによる特徴付けがある領域においてはおそらく正確であることを示唆してい る。Y2mRNAを含む、ニューロンの突出部分はこの点において重要である。故に、 海馬のCA3領域の錐体ニューロンは比較的強いY2ハイブ リダイゼーションシグナルを有していて、側方隔膜へトポグラフィー的な様式で 突き出ていて、この領域はY2受容体が高率でおそらく含まれている（103、23、9 4）。同様に、嗅球は主としてY2サブタイプのNPY受容体を含んでいるらしい。嗅 球にはY2mRNAはないが、一方梨状皮質は、Y2アンチセンスで標識されるニューロ ンを数多く含んでいて、嗅球求心性の主要な源を提供している。海馬の弓状核に おけるNPYY2mRNAの局在化は特に興味深いが、これはこの核のNPYirニューロンが 、パラ心室性核及び背内側核を含む、海馬の大部分のNPY神経支配を提供するか らである（104、105）。現時点においては、どの受容体サブタイプがパラ心室性 核において優勢であるかは不明であるが、本願のY2mRNAに関する結果とマイケル セン（Mikelsen）らのY1mRNAに関する結果とに基づけば（106、107）、Y1及びY2 の両方が存在するはずである。同様の議論は、Y2mRNAを含むほとんどの領域に関 してもなされるが、Y2受容体局在化の最終的プロファイルはY2選択的リガンドの 導入を待たなくてはならない。 機能的考察 神経ペプチドは、食餌摂取の制御、ニューロン興奮性、心血管制御、及び概日 周期を含む、数多くの生理学的機能に関わる。食餌摂取に関して、海馬のパラ心 室性核はかなり調べられた部位であり、NPYの食欲促進の顕著な作用部位である ことが示されている。弓状核におけるNPY Y2 mRNAの局在化、及びパラ心室性核 への弓状部の突出はこの受容体が食餌に関わることを示唆している。 海馬においてNPYの免疫反応性は、主として錐体細胞を神経支配する介在ニュ ーロンに見られる。本願では、NPYはCA1及びCA3領域においてシナプス興奮を減 少させることが証明された。これはY2受容体が仲介したとされているが（108） 、それはNPYのC末端断片はアッセイにおいて効果的であったためである。錐体細 胞のCA3でのY2mRNAの局在化は、この受容体がてんかんなどの痙攣性活性に関わ ることを示している。 ラットのY2a及びY2b受容体の類縁体は、薬の薬理学的開発に必須の道具となる 。主としてヒト受容体に対してスクリーニングされた薬剤候補は、生体内でのデ ータ を正確に解釈できるように、ラット（又はその他の関連した種の類縁）において 特徴付けられなくてはならない。現在の一連のペプチドによって、ヒトY2受容体 とラットY2a受容体との類縁体間の大きな違いは明かにはなっていないが、高い 相同性を示す受容体間の単一のアミノ酸の差異であっても、リガンド結合親和性 に劇的な影響を与えたかもしれない（109）。ラットY2b受容体は、リガンド結合 における種依存的差異を評価するための別の機会をあたえる。ラットY2b受容体 が、ラットY2受容体の薬理学において単一の役割を担っているかどうかについて はこれから決定しないがてはならなく、これはユニークなリガンド結合性又は独 特の局在化パターンの何れかによるためである。 293及びNIH-3T3細胞におけるヒトY2受容体活性化の機能アッセイを、受容体依 存性の、フォルスコリン依存性cAMP蓄積の阻害に基づいて確立した（表9）。こ のアッセイでの、ペプチドのEC₅₀値はおおむね対応したK_i値よりも小さく、これ は該受容体活性化が、該結合アッセイの条件下では優勢ではない受容体の高親和 性状態を通して起こることを示唆している。このような筋書きは、膜抽出物中の ヒトY2受容体への標識済みリガンド結合に対する、Gpp(NH)pの影響が弱いことと 一致するであろう。 本願における、293細胞内で安定発現したY2受容体の特徴付けはまた、Y2受容 体が単一細胞種におけるcAMP制御とカルシウム動員の両方に同時に共役すること が可能であることを決定的に示している。293細胞におけるカルシウム動員は、 少なくとも百日咳毒素感受性のG蛋白質を介在して起きるらしい。ヒトPYY介在性 のカルシウム応答のEC₅₀値は、同じ宿主細胞内でのcAMPのそれよりも顕著に大き い（それぞれ、39nM、0.31nM）。このことは、カルシウム動員には該受容体と、 シクラーゼ制御に関わるもの以外のG蛋白質との乱雑な共役が必須であることを 示唆している。これらの受容体の活性化を仲介するG蛋白質の正確な正体が、G_i 、G₀、G₂、又はその他のタイプであるかは、これから決定しなくてはならない。 現在、Y2受容体の発現系は数種類のなかより選択できるが、それぞれは異なる 使用にユニークに適している。例えば、COS-7細胞での一過性の発現系を使うと 、通常の構造／活性関係の測定のために十分な量の膜を調製することができる。 更に部位 特異的突然変異導入、または関連した酵素技術により受容体の変異体を作成する ことができ、またこれらをCOS-7細胞中で発現して野生型の受容体と薬理学的特 徴の比較を行うことができる。このようにして、受容体結合ポケット、リガンド 結合領域、及び活性化機序に関する知見を得ることができる。293及びNIH-3T3細 胞での安定発現系は、一回の形質転換と、それに続く通常の継代技術といった簡 便性を提供する。安定発現系は更に、受容体発現の最適レベル、G蛋白質ポピュ レーション、及びシグナル伝達経路を選択する機会を提供するが、これらはすべ て試験管内の機能アッセイに重大な要素である。そのようなアッセイを使って、 受容体選択性化合物中の作用薬活性又は拮抗薬活性を決定して、それによって薬 剤設計にとって重大な情報を得ることができる。 ヒトY2受容体クローニングによりはじめて、NPY受容体サブタイプ特異的薬剤 を開発することが可能となり、これはNPY仲介性の生理学工程の分析を大きく前 進させている。薬理学的に定義されたY2受容体は解剖学的に広く分布している（ 2）。脳においてNPYは優勢であり、海馬で最も密度が高く、嗅球、脳幹神経節、 扁桃様複合体（amygdaloid complex）、視床核及び視床下部核、脳下垂体、小脳 、並びに脳幹を含む、その他の領域全てにおいて比較的密度が高い。この分布は 、ノーザンブロット分析と一致しているが、この分析では、Y2mRNAが扁桃体、ca ndate nucleus、脳梁、海馬、視床下部、黒質、及び視床下部の核に存在するこ とを示している。周辺局在化には、交感神経細胞、背根神経節、胃主細胞、腸内 腸細胞、腎臓近位尿細管、気管、及び血管平滑筋が含まれる。故にY2受容体は潜 在的に、認識の増進、概日周期、EEG同期化、体温、血圧、歩行運動活性、神経 内分泌放出、交感活性化（sympathtic activation）、知覚伝達、消化器機能、 腸内分泌、腎臓吸収、及び心血管機能を含む種々の生理学的機能を制御する地位 にある（1、2）。 Y2受容体は薬剤設計において魅力的な標的である（1）。Y2受容体の制御は、 幾つかの病生理学的状態の治療にとって有益であるかも知れないが（1、2）、こ のなかには、記憶喪失（111）、てんかん発作（72）、痛み（64）、うつ病、高 血圧、歩行障害、睡眠障害、食餌障害、鼻のうっ血（97）、及び下痢（112）が 含まれる。Y2関連性病生理学の厳密な調査は、適切な非ペプチドがないことで妨 げられてきた。潜 在的薬剤候補としての、サブタイプ選択性作用薬及び拮抗薬の化学的合成は、ク ローン化されたヒトY2受容体の均一なポピュレーションに対するスクリーニング によっておおいに加速されるであろう。受容体機能の検査用の、更に特異的な薬 理学的手段が使えるようになると、別の治療兆候が発見されるようになるだろう 。 出願人らが発見したヒト及びラットのY2受容体が、既知の薬理学的Y2受容体全 てを説明することができるのか、またはY2ポピュレーションが更に独立した受容 体サブタイプへと分類できるかどうかについてはわからない。実際、Y2受容体ポ ピュレーション内の不均一性に関しての示唆が幾つかある（2）。ヒトY2受容体 のヌクレオチド配列を、in situ局在化、アンチセンス戦略、相同性クローニン グ、及び関連技術の基礎として使って、現在解決できる問題がある。このような 方法は、ヒト及びその他の種において、付加的な薬理学的及び治療的重要性をも って、潜在的に新規のNPY受容体サブタイプの存在を調べることを可能にする。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年２月５日 【補正内容】 ［請求の範囲］ 以下のものを請求ずる。 １．Y2受容体をコードする単離された核酸分子。 ２．前記核酸分子がDNA分子である、請求項１に記載の単離された核酸分子。 ３．前記DNA分子がcDNA分子である、請求項２に記載の単離された核酸分子。 ４．前記DNA分子がゲノムDNA分子である、請求項２に記載の単離された核酸分子 。 ５．前記核酸分子がRNAである、請求項１に記載の単離された核酸分子。 ６．前記核酸分子がヒトY2受容体をコードしている、請求項１に記載の単離され た核酸分子。 ７．前記核酸分子が、膜貫通領域のアミノ酸配列で特徴付けされる受容体をコー ドしていて、且つ該アミノ酸配列が、図11に示されたヒトY2受容体の膜貫通領域 のアミノ酸配列と60%以上の相同性を有する、請求項6に記載の単離された核酸分 子。 ８．前記ヒトY2受容体が、図2に示されたアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ 酸配列を有する、請求項6に記載の単離された核酸分子。 ９．前記ヒトY2受容体が、図2に示されたアミノ酸配列を有する、請求項6に記載 の単離された核酸分子。 10．前記核酸分子がラットY2受容体をコードしている、請求項1に記載の単離さ れた核酸分子。 11．前記ラットY2受容体が、図8に示されたアミノ酸配列と実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する、請求項10に記載の単離された核酸分子。 12．前記ラットY2受容体が、図8に示されたアミノ酸配列を有する、請求項10に 記載の単離された核酸分子。 13．前記ラットY2受容体が、図9に示されたアミノ酸配列と実質的に同じアミノ 酸配列を有する、請求項10に記載の単離された核酸分子。 14．前記ラットY2受容体が、図9に示されたアミノ酸配列を有する、請求項10に 記載の単離された核酸分子。 15．精製された組み換え体Y2受容体蛋白質。 16．請求項1の核酸分子を備えたベクタ。 17．請求項6の核酸分子を備えたベクタ。 18．請求項10の核酸分子を備えたベクタ。 19．細菌細胞内での発現に適用されるベクタであって、細菌細胞内で核酸を発現 するのに必要な制御配列を備え、該制御配列が、Y2受容体をコードする核酸に対 してその発現が可能なように連結されている、請求項16に記載のベクタ。 20．酵母細胞内での発現に適用されるベクタであって、酵母細胞内で核酸を発現 するのに必要な制御配列を備え、該制御配列が、Y2受容体をコードする核酸に対 してその発現が可能なように連結されている、請求項16に記載のベクタ。 21．昆虫細胞内での発現に適用されるベクタであって、昆虫細胞内で核酸を発現 するのに必要な制御配列を備え、該制御配列が、Y2受容体をコードする核酸に対 してその発現が可能なように連結されている、請求項16に記載のベクタ。 22．前記ベクタがバキュロウイルスである、請求項21に記載のベクタ。 23．哺乳類細胞内での発現に適用されるベクタであって、哺乳類細胞内で核酸を 発現するのに必要な制御配列を備え、該制御配列が、Y2受容体をコードする核酸 に対してその発現が可能なように連結されている、請求項16に記載のベクタ。 24．哺乳類細胞内での発現に適用されるベクタであって、哺乳類細胞内で核酸を 発現するのに必要な制御配列を備え、該制御配列が、Y2受容体をコードする核酸 に対してその発現が可能なように連結されている、請求項17に記載のベクタ。 25．前記ベクタがプラスミドである、請求項24に記載のベクタ。 26．pcEXV-hY2と命名された、請求項25に記載のベクタ（ATCC受入れ番号75659） 。 27．哺乳類細胞内での発現に適用されるベクタであって、哺乳類細胞内で核酸を 発現するのに必要な制御配列を備え、該制御配列が、Y2受容体をコードする核酸 に対してその発現が可能なように連結されている、請求項18に記載のベクタ。 28．前記ベクタがプラスミドである、請求項27に記載のベクタ。 29．pcEXV-rY2aと命名された、請求項28に記載のプラスミド（ATCC受入れ番号97 035）。 30．pcEXV-rY2bと命名された、請求項28に記載のプラスミド（ATCC受入れ番号97 036）。 31．請求項24又は28のベクタを備えた細胞。 32．前記細胞が哺乳類細胞である、請求項31に記載の細胞。 33．前記哺乳類細胞が神経起源でない、請求項32に記載の細胞。 34．前記の神経起源でない哺乳類細胞がCOS-7細胞である、請求項33に記載の細 胞。 35．前記の神経起源でない哺乳類細胞がNIH-3T3細胞である、請求項33に記載の 細胞。 36．N-hY2-5と命名された、請求項35に記載のNIH-3T3細胞（ATCC受入れ番号CRL- 11825）。 37．前記の神経起源でない哺乳類細胞が293ヒト胎児腎臓細胞である、請求項33 に記載の細胞。 38．293-hY2-10と命名された、請求項37に記載の293ヒト胎児腎臓細胞。 39．Y2受容体をコードした核酸分子中の配列に含まれるユニークな配列と特異的 にハイブリダイズすることができる、少なくとも15ヌクレオチドの長さの核酸分 子を備えた核酸プローブ。 40．前記核酸がDNAである、請求項39に記載の核酸プローブ。 41．前記核酸分子がヒトY2受容体をコードしている、請求項39に記載の核酸プロ ーブ。 42．前記核酸分子がラットY2受容体をコードしている、請求項39に記載の核酸プ ローブ。 43．Y2受容体をコードしたmRNA分子と特異的にハイブリダイゼーションし、該mR NA分子の翻訳を阻止するような配列を備えたアンチセンスのオリゴヌクレオチド 。 44．請求項3に記載のcDNA分子と特異的にハイブリダイゼーションする配列を有 するアンチセンスのオリゴヌクレオチド。 45．ヌクレオチドの化学類縁体を備えた、請求項43又は44に記載のアンチセンス のオリゴヌタレオチド。 46．Y2受容体に向けられた抗体。 47．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項46に記載の抗体。 48．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項46に記載の抗体。 49．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項46に記載の抗体。 50．Y2受容体を発現する細胞の表面に存在する、Y2受容体のエピトープを指向す る、請求項49に記載のモノクローナル抗体。 51．薬学的組成物であっで、細胞膜を通過し、Y2受容体をコードした細胞内mRNA に特異的に結合してその翻訳を阻止することにより、Y2受容体の活性を低下させ るのに十分な量の請求項43に記載のオリゴヌクレオチドと、細胞膜を通過するこ とがで きる、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物。 52．前記オリゴヌクレオチドが、mRNAを不活化する物質に結合されている、請求 項51に記載の薬学的組成物。 53．mRNAを不活化する前記物質がリボザイムである、請求項52に記載の薬学的組 成物。 54．前記の薬学的に許容される担体が、細胞表面の受容体に結合する構造を有し 、該構造への結合後に細胞に取り込まれることができる、請求項51に記載の薬学 的組成物。 55．前記の薬学的に許容される担体の構造が、特定の細胞種に特異的な受容体と 結合できる、請求項54に記載の薬学的組成物。 56．薬学的組成物であって、リガンドのY2受容体への結合を阻止するのに効果的 な量の請求項46に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組 成物。 57．Y2受容体をコードした核酸を発現する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳 動物。 58．天然Y2受容体の相同組み換えによるノックアウトを含む、ヒト以外のトラン スジェニック哺乳動物。 59．ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、そのゲノムが請求項1に 記載のY2受容体をコードしたDNAに対して相補的なアンチセンスDNAを備え、該ア ンチセンスDNAは、Y2受容体をコードしたmRNAに対して相補的で、且つ該受容体 をコードしたmRNAにハイブリダイゼーションすることによりその翻訳を減少させ るアンチセンスmRNAへと転写されるように配置されている、ヒト以外のトランス ジェニック哺乳動物。 60．Y2受容体をコードした前記核酸が、更に誘導プロモータを備えた、請求項57 又は59の何れか一項に記載の、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。 61．Y2受容体をコードした核酸が、更に組織特異的制御配列を備えた、請求項57 又は59の何れか一項に記載の、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。 62．前記ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物がマウスである、請求項57、58 、59何れか一項に記載の、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。 63．リガンドがY2受容体に特異的に結合するかどうかを決定する方法であって、 Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、 該受 容体に前記リガンドが結合するような条件下で前記リガンドに接触させることと 、該受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによって前記リ ガンドがY2受容体に特異的に結合するか否かを決定することとを備えた方法。 64．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項63に記載の方法。 65．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項63に記載の方法。 66．リガンドがY2受容体に特異的に結合するかどうかを決定する方法であって、 Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、 該受容体に前記リガンドが結合するような条件下で前記リガンドに接触させるこ とと、該受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによって前 記リガンドがY2受容体に特異的に結合するか否かを決定することを備え、前記Y2 受容体が、その膜貫通領域のアミノ酸で特徴付けされ、該アミノ酸配列が、図11 に示されたヒトY2受容体の膜貫通領域のアミノ酸配列と60％以上の相同性を持っ ている方法。 67．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項66に記載の方法。 68．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項66に記載の方法。 69．リガンドがY2受容体へ特異的に結合するか否かを決定する方法であって、Y2 受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞から細 胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、該受容 体にリガンドが結合するような条件下でリガンドを該膜画分に接触させることと 、該Y2受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによって前記 化合物がY2受容体に特異的に結合するか否かを決定することとを備えた方法。 70．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項69に記載の方法。 71．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項69に記載の方法。 72．前記リガンドが既知ではない、請求項63、64、65、66、67、68、69、70、又 は71の何れか一項に記載の方法。 73．請求項72に記載の方法で決定したリガンド。 74．リガンドがY2受容体の作用薬であるか否かを決定する方法であって、Y2受容 体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、該細胞 からのY2受容体機能性応答の活性化を行わせる条件下で前記リガンドに接触させ ることと、セカンドメッセンジャ応答のようなバイオアッセイによってY2受容体 活性の上昇を検出し、それによって前記リガンドがY2受容休作用薬であるかいな かを決定す ることとを備えた方法。 75．リガンドがY2受容体の作用薬であるか否かを決定する方法であって、Y2受容 体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞から細胞抽 出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、Y2受容体機 能性応答の活性化を行わせる条件下で前記リガンドに接触させることと、セカン ドメッセンジャ応答のようなバイオアッセイによってY2受容体活性の上昇を検出 し、それによって前記リガンドがY2受容体作用薬であるいなかを決定することと を備えた方法。 76．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項74又は75の何れか一項に記載の 方法。 77．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項74又は75の何れか一項に記載 の方法。 78．リガンドがY2受容体の拮抗薬であるか否かを決定する方法であって、Y2受容 体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、Y2受容 体機能性応答を活性化させる条件下で、PPの様な既知のY2受容体作用薬の存在下 で前記リガンドに接触させることと、セカンドメッセンジャ応答のようなバイオ アッセイによりY2受容体活性の低下を検出し、それによって前記リガンドがY2受 容体拮抗薬であるか否かを決定することとを備えた方法。 79．リガンドがY2受容体の拮抗薬であるか否かを決定する方法であって、Y2受容 体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞から細胞抽 出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、Y2受容体機 能性応答を活性化させる条件下で、PPの様な既知のY2受容体作用薬の存在下で前 記リガンドに接触させることと、セカンドメッセンジャ応答のようなバイオアッ セイによってY2受容体活性の低下を検出し、それによって前記リガンドがY2受容 体拮抗薬であるかいなかを決定することとを備えた方法。 80．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項78又は79の何れか一項に記載の 方法。 81．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項78又は79の何れか一項に記載 の方法。 82．前記セカンドメッセンジャアッセイが細胞内のcAMPを測定することを備えた 、請求項74、75、78、又は79の何れか一項に記載の方法。 83．前記セカンドメッセンジャアッセイが細胞内のカルシウム動員（calcium mo bilization）を測定することを備えた、請求項74、75、78、又は79の何れか一項 に記載の方法。 84．前記細胞が哺乳類細胞である、請求項63、64、65、66、67、68、69、70、71 、72、73、74、75、76、77、78、79、80、又は81の何れか一項に記載の方法。 85．前記哺乳類細胞が神経起源でない、請求項84に記載の方法。 86．神経起源でない哺乳類細胞がCOS-7細胞である、請求項85に記載の方法。 87．神経起源でない哺乳類細胞が293ヒト胎児腎臓細胞である、請求項83に記載 の方法。 88．293-hY2-10（ATCC受入れ番号11837）と命名された、請求項87に記載の細胞 。 89．神経起源でない哺乳類細胞がLM(tk-)細胞である、請求項85に記載の方法。 90．神経起源でない哺乳類細胞がNIH-3T3細胞である、請求項83に記載の方法。 91．N-hY2-5（ATCC受入れ番号CRL-11825）と命名された、請求項90に記載の細胞 。 92．請求項74、75、76、78、79、80、又は81の何れか一項に記載の方法で検出さ れるリガンド。 93．前記リガンドが未知である、請求項92に記載のリガンド。 94．薬学的組成物であって、Y2受容体の活性を減少させるのに効果的な量の、請 求項74又は75の何れか一項に記載の方法で決定されたY2受容体作用薬と、薬学的 に許容される担体とを含有する薬学的組成物。 95．前記Y2受容体作用薬が未知である、請求項94に記載の薬学的組成物。 96．薬学的組成物であって、Y2受容体の活性を減少させるのに効果的な量の、請 求項78又は79の何れか一項に記載の方法で決定されたY2受容体拮抗薬と、薬学的 に許容される担体とを含有する薬学的組成物。 97．前記Y2受容体拮抗薬が未知である、請求項96に記載の薬学的組成物。 98．細胞表面上のY2受容体に特異的に結合する薬剤を同定するためのスクリーニ ング方法であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発 現している細胞を、薬剤が前記Y2受容体に結合する条件下で複数の薬剤と接触さ せることと、該形質転換細胞に結合する薬剤を決定し、それによってY2受容体に 特異的に結合する薬剤を同定することとを備えた方法。 99．細胞表面上のY2受容体に特異的に結合する薬剤を同定するためのスクリーニ ン グ方法であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現 している細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離 することと、該膜分画と複数の薬剤とを、該薬剤のY2受容体への結合を許容する 条件下で接触させることと、該形質転換細胞に結合する薬剤を決定し、それによ ってY2受容体に特異的に結合する薬剤を同定することとを備えた方法。 100．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項94又は95の何れか一項に記載 の方法。 101．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項98又は99の何れか一項に記 載の方法。 102．Y2受容体の作用薬として機能する薬剤をスクリーニングする方法であって 、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を 、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、複数の薬剤と接触させることと 、セカンドメッセンジャ・アッセイの様なバイオアッセイによって該受容体を活 性化する薬剤を決定し、それによってY2受容体の作用薬として機能する薬剤を同 定することとを備えた方法。 103．Y2受容体の作用薬として機能する薬剤をスクリーニングする方法であって 、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞か ら細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、該 膜画分を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、複数の薬剤に接触させ ることと、セカンドメッセンジャ・アッセイのようなバイオアッセイによって該 受容体を活性化する薬剤を決定し、それによってY2受容体の作用薬として機能す る薬剤を同定することとを備えた方法。 104．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項102又は103の何れか一項に記 載の方法。 105．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項102又は103の何れか一項に 記載の方法。 106．Y2受容体の拮抗薬として機能する薬剤を同定するスクリーニングする方法 であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現してい る細胞を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、NPYの様な既知のY2受 容体作用薬の存在下で複数の薬剤に接触させることと、セカンドメッセンジャ・ アッセイの ようなバイオアッセイにより、Y2受容体の活性化を阻害する薬剤を決定し、それ によってY2受容体の拮抗薬として機能する薬剤を同定することとを備えた方法。 107．Y2受容体の拮抗薬として機能する薬剤をスクリーニングする方法であって 、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞か ら細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、該 膜画分を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、NPYの様な既知のY2受 容体作用薬の存在下で複数の薬剤に接触させることと、セカンドメッセンジャア ッセイのようなバイオアッセイによりY2受容体の活性化を阻止する薬剤を決定し 、それによってY2受容体拮抗薬である薬剤を同定することとを備えた方法。 108．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項106又は107の何れか一項に記 載の方法。 109．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項106又は107の何れか一項に 記載の方法。 110．前記セカンドメッセンジャ・アッセイが、細胞内cAMPを測定することを備 えた、請求項102、103、106、又は107の何れか一項に記載の方法。 111．前記セカンドメッセンジャ・アッセイが、細胞内カルシウム動員を測定す ることを備えた、請求項102、103、106、又は107の何れか一項に記載の方法。 112．前記細胞が哺乳類細胞である、請求項98、99、100、101、102、103、104、 105、106、107、108又は109の何れか一項に記載の方法。 113．前記哺乳類細胞が神経起源でない、請求項112に記載の方法。 114．神経起源でない前記哺乳類細胞がCos-7細胞である、請求項113に記載の方 法。 115．神経起源でない前記哺乳類細胞が293ヒト胎児腎臓細胞である、請求項109 に記載の方法。 116．293-hY2-10（ATCC受入れ番号11837）と命名された、請求項115に記載の細 胞。 117．神経起源でない前記哺乳類細胞がLM(tk-)細胞である、請求項113に記載の 方法。 118．神経起源でない前記哺乳類細胞がNIH-3T3細胞である、請求項113に記載の 方法。 119．N-hY2-5（ATCC受入れ番号CRL-11825）と命名された、請求項118に記載の細 胞。 120．請求項102又は103の何れか一項に記載の方法で同定される、効果的な量の 薬 剤と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物。 121．請求項106又は107の何れか一項に記載の方法で同定される、効果的な量の 薬剤と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物。 122．Y2受容体をコードするmRNAを検出することにより、Y2受容体の発現を検出 する方法であって、細胞より全mRNAを分離することと、得られた該mRNAと請求項 39に記載の核酸プローブとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させること と、該プローブにハイブリダイゼーションしたmRNAの存在を検出し、それによっ て該細胞によるY2受容体の発現を検出することとを備えた方法。 123．Y2受容体の活性を上昇させることにより軽減されるような、患者の異常を 治療する方法であって、請求項94又は120の何れか一項に記載の薬学的組成物の 有効量を患者に投与して、それによって異常を治療することを備えた方法。 124．Y2受容体の活性を上昇させることにより軽減されるような、患者の異常を 治療する方法であって、請求項74、75、102又は103の何れか一項に記載の方法で 決定した、有効量のY2受容体作用薬を患者に投与して、それによって異常を治療 することを備えた方法。 125．Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、患者の異常を 治療する方法であって、請求項96又は121の何れか一項に記載の方法で決定した 、有効量の薬学的組成物を患者に投与して、それによって異常を治療することを 備えた方法。 126．Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、患者の異常を 治療する方法であって、請求項78、79、106又は107の何れか一項に記載の方法で 決定した、有効量のY2受容体作用薬を患者に投与して、それによって異常を治療 することを備えた方法。 127．前記の異常な状態が認知障害である、請求項125又は126の何れか一項に記 載の方法。 128．前記の異常な状態が胃腸障害である、請求項125又は126の何れか一項に記 載の方法。 129．前記の異常な状態が睡眠障害である、請求項125又は126の何れか一項に記 載の方法。 130．前記の異常な状態がてんかんである、請求項125又は126の何れか一項に記 載 の方法。 131．前記の異常な状態が高血圧である、請求項125又は126の何れか一項に記載 の方法。 132．前記の異常な状態が記憶喪失である、請求項123又は124の何れか一項に記 載の方法。 133．前記の異常な状態が下痢である、請求項123又は124の何れか一項に記載の 方法。 134．前記の異常な状態が鼻のうっ血である、請求項123又は124の何れか一項に 記載の方法。 135．前記の異常な状態が痛みである、請求項123又は124の何れか一項に記載の 方法。 136．Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、患者の異常を 治療する方法であって、Y2受容体へのリガンドの結合を阻止するのに有効な量の 、請求項56に記載の薬学的組成物を患者に投与して、それによって異常を治療す ることを備えた方法。 137．Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、患者の異常を 治療する方法であって、有効量の請求項51に記載の薬学的組成物を患者に投与し て、それによって異常を治療することを備えた方法。 138．前記の異常な状態が認知障害である、請求項136又は137の何れか一項に記 載の方法。 139．前記の異常な状態が胃腸障害である、請求項125又は126の何れか一項に記 載の方法。 140．前記の異常な状態がてんかんである、請求項136又は137の何れか一項に記 載の方法。 141．前記の異常な状態が高血圧である、請求項136又は137の何れか一項に記載 の方法。 142．前記の異常な状態が睡眠障害である、請求項136又は137の何れか一項に記 載の方法。 143．細胞表面上のY2受容体の存在を検出するための方法であって、前記細胞を 、詰求項46に記載の抗体の該受容体への結合を許容する条件下で、該抗体に接触 させ することと、該細胞へ結合した前記抗体の存在を検出し、それによって該細胞表 面上のY2受容体の存在を検出することとを備えた方法。 144．Y2受容体を種々のレベルで発現することの生理学的効果を決定する方法で あって、Y2受容体の発現を調節する誘導プロモータの使用により、ヒトY2受容体 の発現レベルが変化するような、請求項55に記載のヒト以外のトランスジェニッ ク哺乳動物を作り出すことを備えた方法。 145．Y2受容体を種々のレベルで発現することの生理学的効果を決定する方法で あって、それぞれが異なる量のY2受容体を発現する、請求項55に記載のヒト以外 のトランスジェニック哺乳動物のパネルを作り出すことを備えた方法。 146．Y2受容体の活性を減少させることで軽減されるような、患者の異常を軽減 させることができるY2受容体拮抗薬を同定する方法であって、該拮抗薬を、請求 項57、58、又は59の何れか一項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物 に投与することと、該拮抗薬が、Y2受容体の活性の結果として現れる、ヒト以外 のトランスジェニック哺乳動物の肉体的及び行動的異常を緩和するか否かを決定 し、それによってY2受容体拮抗薬を同定することとを備えた方法。 147．請求項146に記載の方法で同定される拮抗薬。 148．請求項146に記載の方法で同定される拮抗薬及び、薬学的に許容される担体 を含有する薬学的組成物。 149．Y2受容体の活性を減少させることで軽減されるような、患者の異常を治療 する方法であって、請求項148に記載の薬学的組成物の有効量を患者に投与して 、それによって異常を治療することを備えた方法。 150．Y2受容体の活性を上昇させることで軽減されるような、患者の異常を軽減 させることができるY2受容体作用薬を同定する方法であって、該作用薬を、請求 項57、58、又は59の何れか一項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物 に投与することと、該作用薬が、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の肉体 的及び行動的異常を緩和するか否かを決定し、それによってY4受容体作用薬を同 定することとを備えた方法。 151．請求項150に記載の方法で同定される作用薬。 152．請求項150に記載の方法で同定される、有効量の作用薬及び、薬学的に許容 される担体を含有する薬学的組成物。 153．Y2受容体を活性化させることで軽減されるような、患者の異常を治療する 方法であって、請求項152に記載の薬学的組成物の有効量を患者に投与して、そ れによって異常を治療することを備えた方法。 154．Y2受容体の特異的対立遺伝子の作用に関わる疾患の疾病素質を診断する方 法であって、 a)疾患をもつ患者より核酸を取得することと、 b)一連の制限酵素を使って上記核酸の制限酵素による消化を行うことと、 c)前記の消化済み核酸断片を分離ゲルを使って電気泳動的に分離することと、 d)電気泳動の終了したゲルを、Y2受容体と特異的にハイブリダイゼーションする ことができ、且つ検出可能な標識でラベルされたプローブと接触させることと、 e)Y2受容体をコードした核酸にハイブリダイゼーションして検出可能な標識でラ ベルされた標識済みバンドを検出し、前記疾患にかかった患者のDNAに特異的な バンドパターンを作成することと、 f)上記ステップa-eの方法による診断用に得た核酸を調製することと、 g)ステップeの、前記疾患にかかった患者の核酸に特異的なバンドパターンを、 ステップfで、診断用に得た核酸についてのパターンと比較して、両パターンが 同じか異なるかを決定し、その結果同じであれば疾患の疾病素質ありと診断する こととを備えた方法。 155．請求項154に記載の方法であって、前記疾患がヒトY2受容体の特異的対立遺 伝子の作用に関わる疾患である方法。 156．単離精製された請求項13に記載のY2受容体を調製する方法であって、 a)細胞内での発現に適用されるベクタを構築するステップであって、該ベクタは Y2受容体を発現するように、該受容体をコードしている核酸に対して機能可能な ように連結された、細胞内での核酸の発現に必要な制御配列を備えており、前記 細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞からなる群から選ばれ る、ベクタ構築ステップと、 b)ステッブaのベクタを適切な宿主細胞へ導入するステップと、 c)ステップbの細胞を、Y2受容体の発現を許容する条件下でインキュベーション するステップと、 d)上記のように発現された受容体を回収するステップと、 e)上記のようにして回収された受容体を精製することを備えた方法。 【図２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＣＪ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 9356−4Ｈ 16/28 16/28 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/566 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ブランチェック、テレサ アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07666、ティーネック、スタンディッシ ュ・ロード 518 (72)発明者 ウェインシャンク、リチャード アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10024、 ニューヨーク、ウエスト・エイティーセブ ンス・ストリート 302

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 以下のものを請求する。 １．Y2受容体をコードする単離された核酸分子。 ２．前記核酸分子がDNA分子である、請求項1に記載の単離された核酸分子。 ３．前記DNA分子がcDNA分子である、請求項2に記載の単離された核酸分子。 ４．前記DNA分子がゲノムDNA分子である、請求項2に記載の単離された核酸分 子。 ５．前記核酸分子がRNAである、請求項1に記載の単離された核酸分子。 ６．前記核酸分子がヒトY2受容体をコードしている、請求項1に記載の単離さ れた核酸分子。 ７．前記核酸分子が、膜貫通領域のアミノ酸配列で特徴付けされる受容体をコ ードしていて、且つ該アミノ酸配列が、図11に示されたヒトY2受容体の膜貫通領 域のアミノ酸配列と60%以上の相同性を有する、請求項6に記載の単離された核酸 分子。 ８．前記ヒトY2受容体が、図2に示されたアミノ酸配列と実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する、請求項6に記載の単離された核酸分子。 ９．前記ヒトY2受容体が、図2に示されたアミノ酸配列を有する、請求項6に記 載の単離された核酸分子。 10．前記核酸分子がラットY2受容体をコードしている、請求項1に記載の単離 された核酸分子。 11．前記ラットY2受容体が、図8に示されたアミノ酸配列と実質的に同一のア ミノ酸配列を有する、請求項10に記載の単離された核酸分子。 12．前記ラットY2受容体が、図8に示されたアミノ酸配列を有する、請求項10 に記載の単離された核酸分子。 13．前記ラットY2受容体が、図9に示されたアミノ酸配列と実質的に同じアミ ノ酸配列を有する、請求項10に記載の単離された核酸分子。 14．前記ラットY2受容体が、図9に示されたアミノ酸配列を有する、請求項10 に記載の単離された核酸分子。 15．精製されたY2受容体蛋白質。 16．請求項1の核酸分子を備えたベクタ。 17．請求項6の核酸分子を備えたベクタ。 18．詰求項10の核酸分子を備えたベクタ。 19．細菌細胞内での発現に適用されるベクタであって、細菌細胞内で核酸を発 現するのに必要な制御配列を備え、該制御配列が、Y2受容体をコードする核酸に 対してその発現が可能なように連結されている、請求項16に記載のベクタ。 20．酵母細胞内での発現に適用されるベクタであって、酵母細胞内で核酸を発 現するのに必要な制御配列を備え、該制御配列が、Y2受容体をコードする核酸に 対してその発現が可能なように連結されている、請求項16に記載のベクタ。 21．昆虫細胞内での発現に適用されるベクタであって、昆虫細胞内で核酸を発 現するのに必要な制御配列を備え、該制御配列が、Y2受容体をコードする核酸に 対してその発現が可能なように連結されている、請求項16に記載のベクタ。 22．前記ベクタがバキュロウイルスである、請求項21に記載のベクタ。 23．哺乳類細胞内での発現に適用されるベクタであって、哺乳類細胞内で核酸 を発現するのに必要な制御配列を備え、該制御配列が、Y2受容体をコードする核 酸に対してその発現が可能なように連結されている、請求項16に記載のベクタ。 24．哺乳類細胞内での発現に適用されるベクタであって、哺乳類細胞内で核酸 を発現するのに必要な制御配列を備え、該制御配列が、Y2受容体をコードする核 酸に対してその発現が可能なように連結されている、請求項17に記載のベクタ。 25．前記ベクタがプラスミドである、請求項24に記載のベクタ。 26．pcEXV-hY2と命名された、請求項25に記載のベクタ（ATCC受入れ番号75659 ）。 27．哺乳類細胞内での発現に適用されるベクタであって、哺乳類細胞内で核酸 を発現するのに必要な制御配列を備え、該制御配列が、Y2受容体をコードする核 酸に対してその発現が可能なように連結されている、請求項18に記載のベクタ。 28．前記ベクタがプラスミドである、請求項27に記載のベクタ。 29．pcEXV-rY2aと命名された、請求項28に記載のプラスミド（ATCC受入れ番号 97035）。 30．pcEXV-rY2bと命名された、請求項28に記載のプラスミド（ATCC受入れ番号 97036）。 31．請求項24又は28のベクタを備えた細胞。 32．前記細胞が哺乳類細胞である、請求項31に記載の細胞。 33．前記哺乳類細胞が神経起源でない、請求項32に記載の細胞。 34．前記の神経起源でない哺乳類細胞がCOS-7細胞である、請求項33に記載の 細 胞。 35．前記の神経起源でない哺乳類細胞がNIH-3T3細胞である、請求項33に記載 の細胞。 36．N-hY2-5と命名された、請求項35に記載のNIH-3T3細胞（ATCC受入れ番号CR L-11825）。 37．前記の神経起源でない哺乳類細胞が293ヒト胎児腎臓細胞である、請求項3 3に記載の細胞。 38．293-hY2-10と命名された、請求項37に記載の293ヒト胎児腎臓細胞。 39．Y2受容体をコードした核酸分子中の配列に含まれるユニークな配列と特異 的にハイブリダイズすることができる、少なくとも15ヌクレオチドの長さの核酸 分子を備えた核酸プローブ。 40．前記核酸がDNAである、請求項39に記載の核酸プローブ。 41．前記核酸分子がヒトY2受容体をコードしている、請求項39に記載の核酸プ ローブ。 42．前記核酸分子がラットY2受容体をコードしている、請求項39に記載の核酸 プローブ。 43．Y2受容体をコードしたmRNA分子と特異的にハイブリダイゼーションし、該 mRNA分子の翻訳を阻止するような配列を備えたアンチセンスのオリゴヌクレオチ ド。 44．請求項3に記載のcDNA分子と特異的にハイブリダイゼーションする配列を 有するアンチセンスのオリゴヌクレオチド。 45．ヌクレオチドの化学類縁体を備えた、請求項43又は44に記載のアンチセン スのオリゴヌクレオチド。 46．Y2受容体に向けられた抗体。 47．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項46に記載の抗体。 48．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項46に記載の抗体。 49．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項46に記載の抗体。 50．Y2受容体を発現する細胞の表面に存在する、Y2受容体のエピトープを指向 する、請求項49に記載のモノクローナル抗体。 51．薬学的組成物であって、細胞膜を通過し、Y2受容体をコードした細胞内mR NAに特異的に結合してその翻訳を阻止することにより、Y2受容体の活性を低下さ せる のに十分な量の請求項43に記載のオリゴヌクレオチドと、細胞膜を通過すること ができる、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物。 52．前記オリゴヌクレオチドが、mRNAを不活化する物質に結合されている、請 求項51に記載の薬学的組成物。 53．mRNAを不活化する前記物質がリボザイムである、請求項52に記載の薬学的 組成物。 54．前記の薬学的に許容される担体が、細胞表面の受容体に結合する構造を有 し、該構造への結合後に細胞に取り込まれることができる、請求項51に記載の薬 学的組成物。 55．前記の薬学的に許容される担体の構造が、特定の細胞種に特異的な受容体 と結合できる、請求項54に記載の薬学的組成物。 56．薬学的組成物であって、リガンドのY2受容体への結合を阻止するのに効果 的な量の請求項46に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的 組成物。 57．Y2受容体をコードした核酸を発現する、ヒト以外のトランスジェニック哺 乳動物。 58．天然Y2受容体の相同組み換えによるノックアウトを含む、ヒト以外のトラ ンスジェニック哺乳動物。 59．ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、そのゲノムが請求項1 に記載のY2受容体をコードしたDNAに対して相補的なアンチセンスDNAを備え、該 アンチセンスDNAは、Y2受容体をコードしたmRNAに対して相補的で、且つ該受容 体をコードしたmRNAにハイブリダイゼーションすることによりその翻訳を減少さ せるアンチセンスmRNAへと転写されるように配置されている、ヒト以外のトラン スジェニック哺乳動物。 60．Y2受容体をコードした前記核酸が、更に誘導プロモータを備えた、請求項 57又は59の何れか一項に記載の、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。 61．Y2受容体をコードした核酸が、更に組織特異的制御配列を備えた、請求項 57又は59の何れか一項に記載の、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。 62．前記ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物がマウスである、請求項57、 58、59何れか一項に記載の、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。 63．リガンドがY2受容体に特異的に結合するかどうかを決定する方法であって 、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を 、該受容体に前記リガンドが結合するような条件下で前記リガンドに接触させる ことと、該受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによって 前記リガンドがY2受容体に特異的に結合するか否かを決定することとを備えた方 法。 64．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項63に記載の方法。 65．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項63に記載の方法。 66．リガンドがY2受容体に特異的に結合するかどうかを決定する方法であって 、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を 、該受容体に前記リガンドが結合するような条件下で前記リガンドに接触させる ことと、該受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによって 前記リガンドがY2受容体に特異的に結合するか否かを決定することを備え、前記 Y2受容体が、その膜貫通領域のアミノ酸で特徴付けされ、該アミノ酸配列が、図 11に示されたヒトY2受容体の膜貫通領域のアミノ酸配列と60％以上の相同性を持 っている方法。 67．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項66に記載の方法。 68．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項66に記載の方法。 69．リガンドがY2受容体へ特異的に結合するか否かを決定する方法であって、 Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞から 細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、該受 容体にリガンドが結合するような条件下でリガンドを該膜画分に接触させること と、該Y2受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによって前 記化合物がY2受容体に特異的に結合するか否かを決定することとを備えた方法。 70．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項69に記載の方法。 71．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項69に記載の方法。 72．前記リガンドが既知ではない、請求項63、64、65、66、67、68、69、70、 又は71の何れか一項に記載の方法。 73．請求項72に記載の方法で決定したリガンド。 74．リガンドがY2受容体の作用薬であるか否かを決定する方法であって、Y2受 容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、該細 胞からのY2受容体機能性応答の活性化を行わせる条件下で前記リガンドに接触さ せるこ とと、セカンドメッセンジャ応答のようなバイオアッセイによってY2受容体活性 の上昇を検出し、それによって前記リガンドがY2受容体作用薬であるかいなかを 決定することとを備えた方法。 75．リガンドがY2受容体の作用薬であるか否かを決定する方法であって、Y2受 容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞から細胞 抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、Y2受容体 機能性応答の活性化を行わせる条件下で前記リガンドに接触させることと、セカ ンドメッセンジャ応答のようなバイオアッセイによってY2受容体活性の上昇を検 出し、それによって前記リガンドがY2受容体作用薬であるいなかを決定すること とを備えた方法。 76．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項74又は75の何れか一項に記載 の方法。 77．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項74又は75の何れか一項に記 載の方法。 78．リガンドがY2受容体の拮抗薬であるか否かを決定する方法であって、Y2受 容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、Y2受 容体機能性応答を活性化させる条件下で、PPの様な既知のY2受容体作用薬の存在 下で前記リガンドに接触させることと、セカンドメッセンジャ応答のようなバイ オアッセイによりY2受容体活性の低下を検出し、それによって前記リガンドがY2 受容体拮抗薬であるか否かを決定することとを備えた方法。 79．リガンドがY2受容体の拮抗薬であるか否かを決定する方法であって、Y2受 容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞から細胞 抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、Y2受容体 機能性応答を活性化させる条件下で、PPの様な既知のY2受容体作用薬の存在下で 前記リガンドに接触させることと、セカンドメッセンジャ応答のようなバイオア ッセイによってY2受容体活性の低下を検出し、それによって前記リガンドがY2受 容体拮抗薬であるかいなかを決定することとを備えた方法。 80．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項78又は79の何れか一項に記載 の方法。 81．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項78又は79の何れか一項に記 載 の方法。 82．前記セカンドメッセンジャアッセイが細胞内のcAMPを測定することを備え た、請求項74、75、78、又は79の何れか一項に記載の方法。 83．前記セカンドメッセンジャアッセイが細胞内のカルシウム動員（calciumm obilization）を測定することを備えた、請求項74、75、78、又は79の何れか一 項に記載の方法。 84．前記細胞が哺乳類細胞である、請求項63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、又は81の何れか一項に記載の方法。 85．前記哺乳類細胞が神経起源でない、請求項84に記載の方法。 86．神経起源でない哺乳類細胞がCOS-7細胞である、請求項85に記載の方法。 87．神経起源でない哺乳類細胞が293ヒト胎児腎臓細胞である、請求項83に記 載の方法。 88．293-hY2-10（ATCC受入れ番号11837）と命名された、請求項87に記載の細 胞。 89．神経起源でない哺乳類細胞がLM(tk-)細胞である、請求項85に記載の方法 。 90．神経起源でない哺乳類細胞がNIH-3T3細胞である、請求項83に記載の方法 。 91．N-hY2-5（ATCC受入れ番号CRL-11825）と命名された、請求項90に記載の細 胞。 92．請求項74、75、76、78、79、80、又は81の何れか一項に記載の方法で検出 されるリガンド。 93．前記リガンドが未知である、請求項92に記載のリガンド。 94．薬学的組成物であって、Y2受容体の活性を減少させるのに効果的な量の、 請求項74又は75の何れか一項に記載の方法で決定されたY2受容体作用薬と、薬学 的に許容される担体とを含有する薬学的組成物。 95．前記Y2受容体作用薬が未知である、請求項94に記載の薬学的組成物。 96．薬学的組成物であって、Y2受容体の活性を減少させるのに効果的な量の、 請求項78又は79の何れか一項に記載の方法で決定されたY2受容体拮抗薬と、薬学 的に許容される担体とを含有する薬学的組成物。 97．前記Y2受容体拮抗薬が未知である、請求項96に記載の薬学的組成物。 98．細胞表面上のY2受容体に特異的に結合する薬剤を同定するためのスクリー ニング方法であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を 発現している細胞を、薬剤が前記Y2受容体に結合する条件下で複数の薬剤と接触 させる ことと、該形質転換細胞に結合する薬剤を決定し、それによってY2受容体に特異 的に結合する薬剤を同定することとを備えた方法。 99．細胞表面上のY2受容体に特異的に結合する薬剤を同定するためのスクリー ニング方法であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を 発現している細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を 分離することと、該膜分画と複数の薬剤とを、該薬剤のY2受容体への結合を許容 する条件下で接触させることと、該形質転換細胞に結合する薬剤を決定し、それ によってY2受容体に特異的に結合する薬剤を同定することとを備えた方法。 100．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項94又は95の何れか一項に記 載の方法。 101．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項98又は99の何れか一項に 記載の方法。 102．Y2受容体の作用薬として機能する薬剤をスクリーニングする方法であっ て、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞 を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、複数の薬剤と接触させること と、セカンドメッセンジャ・アッセイの様なバイオアッセイによって該受容体を 活性化する薬剤を決定し、それによってY2受容体の作用薬として機能する薬剤を 同定することとを備えた方法。 103．Y2受容体の作用薬として機能する薬剤をスクリーニングする方法であっ て、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞 から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、 該膜画分を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、複数の薬剤に接触さ せることと、セカンドメッセンジャ・アッセイのようなバイオアッセイによって 該受容体を活性化する薬剤を決定し、それによってY2受容体の作用薬として機能 する薬剤を同定することとを備えた方法。 104．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項102又は103の何れか一項に 記載の方法。 105．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項102又は103の何れか一項 に記載の方法。 106．Y2受容体の拮抗薬として機能する薬剤を同定するスクリーニングする方 法 であって、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現してい る細胞を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、NPYの様な既知のY2受 容体作用薬の存在下で複数の薬剤に接触させることと、セカンドメッセンジャ・ アッセイのようなバイオアッセイにより、Y2受容体の活性化を阻害する薬剤を決 定し、それによってY2受容体の拮抗薬として機能する薬剤を同定することとを備 えた方法。 107．Y2受容体の拮抗薬として機能する薬剤をスクリーニングする方法であっ て、Y2受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞 から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、 該膜画分を、Y2受容体機能性応答を活性化させる条件下で、NPYの様な既知のY2 受容体作用薬の存在下で複数の薬剤に接触させることと、セカンドメッセンジャ アッセイのようなバイオアッセイによりY2受容体の活性化を阻止する薬剤を決定 し、それによってY2受容体拮抗薬である薬剤を同定することとを備えた方法。 108．前記Y2受容体がヒトY2受容体である、請求項106又は107の何れか一項に 記載の方法。 109．前記Y2受容体がラットY2受容体である、請求項106又は107の何れか一項 に記載の方法。 110．前記セカンドメッセンジャ・アッセイが、細胞内cAMPを測定することを 備えた、請求項102、103、106、又は107の何れか一項に記載の方法。 111．前記セカンドメッセンジャ・アッセイが、細胞内カルシウム動員を測定 することを備えた、請求項102、103、106、又は107の何れか一項に記載の方法。 112．前記細胞が哺乳類細胞である、請求項98、99、100、101、102、103、104 、105、106、107、108又は109の何れか一項に記載の方法。 113．前記哺乳類細胞が神経起源でない、請求項112に記載の方法。 114，神経起源でない前記哺乳類細胞がCos-7細胞である、請求項113に記載の 方法。 115．神経起源でない前記哺乳類細胞が293ヒト胎児腎臓細胞である、請求項10 9に記載の方法。 116．293-hY2-10（ATCC受入れ番号11837）と命名された、請求項115に記載の 細胞。 117．神経起源でない前記哺乳類細胞がLM(tk-)細胞である、請求項113に記載 の 方法。 118．神経起源でない前記哺乳類細胞がNIH-3T3細胞である、請求項113に記載 の方法。 119．N-hY2-5（ATCC受入れ番号CRL-11825）と命名された、請求項118に記載の 細胞。 120．請求項102又は103の何れか一項に記載の方法で同定される、効果的な量 の薬剤と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物。 121．請求項106又は107の何れか一項に記載の方法で同定される、効果的な量 の薬剤と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物。 122．Y2受容体をコードするmRNAを検出することにより、Y2受容体の発現を検 出する方法であって、細胞より全mRNAを分離することと、得られた該mRNAと請求 項39に記載の核酸プローブとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させるこ とと、該プローブにハイブリダイゼーションしたmRNAの存在を検出し、それによ って該細胞によるY2受容体の発現を検出することとを備えた方法。 123．Y2受容体の活性を上昇させることにより軽減されるような、患者の異常 を治療する方法であって、請求項94又は120の何れか一項に記載の薬学的組成物 の有効量を患者に投与して、それによって異常を治療することを備えた方法。 124．Y2受容体の活性を上昇させることにより軽減されるような、患者の異常 を治療する方法であって、請求項74、75、102又は103の何れか一項に記載の方法 で決定した、有効量のY2受容体作用薬を患者に投与して、それによって異常を治 療することを備えた方法。 125．Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、患者の異常 を治療する方法であって、請求項96又は121の何れか一項に記載の方法で決定し た、有効量の薬学的組成物を患者に投与して、それによって異常を治療すること を備えた方法。 126．Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、患者の異常 を治療する方法であって、請求項78、79、106又は107の何れか一項に記載の方法 で決定した、有効量のY2受容体作用薬を患者に投与して、それによって異常を治 療することを備えた方法。 127．前記の異常な状態が認知障害である、請求項125又は126の何れか一項に 記 載の方法。 128．前記の異常な状態が胃腸障害である、請求項125又は126の何れか一項に 記載の方法。 129．前記の異常な状態が睡眠障害である、請求項125又は126の何れか一項に 記載の方法。 130．前記の異常な状態がてんかんである、請求項125又は126の何れか一項に 記載の方法。 131．前記の異常な状態が高血圧である、請求項125又は126の何れか一項に記 載の方法。 132．前記の異常な状態が記憶喪失である、請求項123又は124の何れか一項に 記載の方法。 133．前記の異常な状態が下痢である、請求項123又は124の何れか一項に記載 の方法。 134．前記の異常な状態が鼻のうっ血である、請求項123又は124の何れか一項 に記載の方法。 135．前記の異常な状態が痛みである、請求項123又は124の何れか一項に記載 の方法。 136．Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、患者の異常 を治療する方法であって、Y2受容体へのリガンドの結合を阻止するのに有効な量 の、請求項56に記載の薬学的組成物を患者に投与して、それによって異常を治療 することを備えた方法。 137．Y2受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、患者の異常 を治療する方法であって、有効量の請求項51に記載の薬学的組成物を患者に投与 して、それによって異常を治療することを備えた方法。 138．前記の異常な状態が認知障害である、請求項136又は137の何れか一項に 記載の方法。 139．前記の異常な状態が胃脳障害である、請求項125又は126の何れか一項に 記載の方法。 140．前記の異常な状態がてんかんである、請求項136又は137の何れか一項に 記載の方法。 141．前記の異常な状態が高血圧である、請求項136又は137の何れか一項に記 載の方法。 142．前記の異常な状態が睡眠障害である、請求項136又は137の何れか一項に 記載の方法。 143．細胞表面上のY2受容体の存在を検出するための方法であって、前記細胞 を、請求項46に記載の抗体の該受容体への結合を許容する条件下で、該抗体に接 触させすることと、該細胞へ結合した前記抗体の存在を検出し、それによって該 細胞表面上のY2受容体の存在を検出することとを備えた方法。 144．Y2受容体を種々のレベルで発現することの生理学的効果を決定する方法 であって、Y2受容体の発現を調節する誘導プロモータの使用により、ヒトY2受容 体の発現レベルが変化するような、請求項55に記載のヒト以外のトランスジェニ ック哺乳動物を作り出すことを備えた方法。 145．Y2受容体を種々のレベルで発現することの生理学的効果を決定する方法 であって、それぞれが異なる量のY2受容体を発現する、請求項55に記載のヒト以 外のトランスジェニック哺乳動物のパネルを作り出すことを備えた方法。 146．Y2受容体の活性を減少させることで軽減されるような、患者の異常を軽 減させることができるY2受容体拮抗薬を同定する方法であって、該拮抗薬を、請 求項57、58、又は59の何れか一項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動 物に投与することと、該拮抗薬が、Y2受容体の活性の結果として現れる、ヒト以 外のトランスジェニック哺乳動物の肉体的及び行動的異常を緩和するか否かを決 定し、それによってY2受容体拮抗薬を同定することとを備えた方法。 147．請求項146に記載の方法で同定される拮抗薬。 148．請求項146に記載の方法で同定される拮抗薬及び、薬学的に許容される担 体を含有する薬学的組成物。 149．Y2受容体の活性を減少させることで軽減されるような、患者の異常を治 療する方法であって、請求項148に記載の薬学的組成物の有効量を患者に投与し て、それによって異常を治療することを備えた方法。 150．Y2受容体の活性を上昇させることで軽減されるような、患者の異常を軽 減させることができるY2受容体作用薬を同定する方法であって、該作用薬を、請 求項57、58、又は59の何れか一項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動 物に投 与することと、該作用薬が、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の肉体的及 び行動的異常を緩和するか否かを決定し、それによってY4受容体作用薬を同定す ることとを備えた方法。 151．請求項150に記載の方法で同定される作用薬。 152．請求項150に記載の方法で同定される、有効量の作用薬及び、薬学的に許 容される担体を含有する薬学的組成物。 153．Y2受容体を活性化させることで軽減されるような、患者の異常を治療す る方法であって、請求項152に記載の薬学的組成物の有効量を患者に投与して、 それによって異常を治療することを備えた方法。 154．Y2受容体の特異的対立遺伝子の作用に関わる疾患の疾病素質を診断する 方法であって、 a)疾患をもつ患者より核酸を取得することと、 b)一連の制限酵素を使って上記核酸の制限酵素による消化を行うことと、 c)前記の消化済み核酸断片を分離ゲルを使って電気泳動的に分離することと、 d)電気泳動の終了したゲルを、Y2受容体と特異的にハイブリダイゼーションす ることができ、且つ検出可能な標識でラベルされたプローブと接触させることと 、 e)Y2受容体をコードした核酸にハイブリダイゼーションして検出可能な標識で ラベルされた標識済みバンドを検出し、前記疾患にかかった患者のDNAに特異的 なバンドパターンを作成することと、 f)上記ステップa-eの方法による診断用に得た核酸を調製することと、 g)ステップeの、前記疾患にかかった患者の核酸に特異的なバンドパターンを 、ステップfで、診断用に得た核酸についてのパターンと比較して、両パターン が同じか異なるかを決定し、その結果同じであれば疾患の疾病素質ありと診断す ることとを備えた方法。 155．請求項154に記載の方法であって、前記疾患がヒトY2受容体の特異的対立 遺伝子の作用に関わる疾患である方法。 156．単離精製された請求項13に記載のY2受容体を調製する方法であって、 a)細胞内での発現に適用されるベクタを構築するステップであって、該ベクタ はY2受容体を発現するように、該受容体をコードしている核酸に対して機能可能 なように連結された、細胞内での核酸の発現に必要な制御配列を備えており、前 記細胞 は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞からなる群から選ばれる、 ベクタ構築ステップと、 b)ステップaのベクタを適切な宿主細胞へ導入するステップと、 c)ステップbの細胞を、Y2受容体の発現を許容する条件下でインキュベーショ ンするステップと、 d)上記のように発現された受容体を回収するステップと、 e)上記のようにして回収された受容体を精製することを備えた方法。