JPH07509600A - ニューロトロフィン−４発現に基づく治療および診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ニューロトロフィン−４発現に基づく治療および診断法本願は１９９１年１１月 １４日出願で継続中の米国特許出願Ｎｏ、７９１．９２４の一部継続出願である １９９２年６月１２日出願の継続中の米国特許出願Ｎｏ、０７／８９８，１９４ の一部継続出願である。

■、序 本発明は、ＢＤＮＦ／ＮＧＦ／ＮＴ−３遺伝子フアミリーの新たに性状決定され たメンバーであるニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、ならびに神経障害の治 療に二二一口トロフィン−４を利用する治療および診断法に関する。

２、従来技術 神経成長因子ファミリーは、神経成長因子（ＮＧＦ）　、脳由来神経栄養因子（ ＢＤＮＦ）　、および海馬由来神経栄養因子（ＨＤＮＦ）としても知られる二二 一口トロフィン−３（ＮＴ−３）を含む。このタンパク質ファミリーは発生およ び成体を椎動物神経系の双方において重要な役割を果たしており、そこでニュー ロンの生存を支持する。

マウスＮＧＦタンパク質のアミノ酸配列（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ、。

１９７３、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２：１００−１１５）に基づいて、 マウスおよびヒトＮＧＦをコードするＤＮＡ配列が単離された（Ｓｃｏｔｔ　ｅ ｔ　ａｌ、。

１９８３、　Ｎａｔｕｒｅ　３０２：５３８−５４０；　Ｕｌｌｒｉｃｈ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：８２１−８２５）。マウスお よびヒトＮＧＦの比較から、このタンパク質が哺乳動物の間で保存されているこ とが示され、これを支持するように、ＮＧＦ様活性が幾つかの種から単離されて いる（Ｈａｒｐｅｒ　ａｎｄ　Ｔｈｏｅｎｅｎ、　１９８１．　Ａｎｎ、　Ｒｅ ｖ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｔｏｘｉｃｏｌ、　２１：２０５−２２９）　、 次いで、オウシ（Ｍｅｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　ＥＭＢＯＪ、　５ ：１４８９−１４９３）　；ヒナ（Ｍｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　 ＥＭＢＯＪ、　５：１４８９−１４９３；　Ｅｂｅｎｄａｌ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９８６．　ＥＭＢＯＪ、　５：１４８３−１４８７；　Ｗｉｏｎ　ｅｔ　ａｌ 、、　１９８６、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２０３：８２−８６）　；コブ ラ（Ｓｅｌｂｙ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅ ｓ、　１８：２９３−２９８）　；ラット（Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ 、。

１９８８、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅｓ、　２０：４０３−４１０）　 ；およびモルモット（Ｓｃｈｗａｒｚ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｎｅｕｒ ｏｃｈｅｍ、　５２：１２０３−１２０９）　ＮＧＦからのＤＮＡ配列も決定さ れた。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は最初ブタの脳から単離され（Ｂａｒｄ ｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２．　ＥＭＢＯＪ、　１：５４９−５５３）　、そ して次いでこの組織からのｃＤＮＡとしてクローン化された（Ｌｅｉｂｒｏｃｋ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９　Ｎａｔｕｒｅ　３４１：１４９−１５２）　ｏ　 ＮＴ　−３の遺伝子はマウス（Ｈｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｎａｔ ｕｒｅ　３４４：３３９−３４１）、ラット（Ｍａｉｓｏｎｐｔｅｒｒｅ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４４６−１４５１；　Ｅｒ ｎｆｏｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：５４５４−５４５８）　、および他の２つの因子 との間の配列類似性に基づく縮重オリゴヌクレオチドを用いてヒト（Ｒｏｓｅｎ ｔｈａｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０、　Ｎｅｕｒｏｎ　４ニア６アー７７３） から単離された。これら３つの因子は互いに約５５％のアミノ酸の類似性を示し 、各タンパク質に特徴的なアミノ酸モチーフを含む５つの領域中にほとんどの配 列の違いが存在している。これらタンパク質のうちの２つのインビトロにおける 神経栄養活性がこれらの可変領域の特定の組み合わせによって得られることが最 近水された。

ＮＧＦは末梢交換神経および神経堤由来感覚ニューロンの発生および維持を支持 する（Ｔｈｏｅｎｅｎ　ａｎｄ　Ｂａｒｄｅ、　１９８０．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、 　Ｒｅｖ、、６０：１２８４−１３２５；　Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ、 １９８７．　５ｃｉｅｎｃｅ　２３７：１１５４−１１６２にまとめられている ）。末梢交換神経ニューロンにはＢＤＮＦの活性が見られないが、この因子はプ ラコードおよび神経堤由来感覚ニューロンのインビボでの生存を支持する（Ｈｏ ｆｅｒ　ａｎｄ　Ｂａｒｄｅ、　１９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　３３１：２６１− ２６２）　、インビボでＮＴ−３に感受性なニューロンが同定されている。しか しながら、移植されたヒナ神経節または解離ニューロンのインビトロの培養では 、３つの因子はニューロン集団の重複した特徴あるセットを支持し、これはＮＴ −３がインビボでも特定かつ重複する神経栄養活性を示すことを示唆する（Ｈａ ｈｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｎａｔｕｒｅ　３４４：３３９−３４１； 　Ｍａｔｓｏｎｐｉｅｒｒｅ　ｅ４　ａｌ、、　１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２ ４７：１４４６−１４５１；　Ｉ！ｒｎｆｏｒｓ　ｅｔａｌ、、　１９９０．　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：５４５４−５ ４５８；　Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｎｅｕｒｏｎ　 ４ニア６アー７７３）　ｏこれら３つの因子はいずれも脳中のニューロンの特定 セットで発現しており、３つの因子のｍ　ＲＮ　Ａはいずれも海馬で最高濃度で ある（Ａｙｅｒ−ＬｅＬｉｅｖｒｅｅｔ　ａｌ、、　１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ 　２４０：１３３９−１３４１；　Ｅｒｎｆｏｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０ ゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：５４５４− ５４５８；　Ｅｒｎｆｏｒｓ　ｅｔ　ａｌ、。

１９９０、　Ｎｅｕｒｏｎ　５：５１１−５２６；　Ｗａｔｍｏｒｅ　ｅｔ　ａ ｌ、、　１９９１．　Ｎｅｕｒｏｌ、　１０９：Ｌｉ２−１５２：　１ｌｏｆｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　ＥＭＢＯＪ、　９：２４５９−２４６４；　 Ｐｈ１ｌｌｉｐｓｅｔ　ａｌ、、　１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２５０：２９０ −２９４）　。脳では、ＮＧＦは基底前脳コリン作動性ニューロンを支持するこ とが示されており（Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ　ａｎｄ　Ｓｅｉｇｅｒ、　１９８７ ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、、　４３４：４３９−４６４；　Ｔｈｏｅｎｅｎ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　 Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、　１０５：１４５−１７８；　Ｅｂｅｎｄａｌ、　１９ ８９．　Ｐｒｏｇ、　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｓ、　１：１４３：１ ５９）、またＢＤＮＦはこれらニューロンの生存をインビトロで刺激することが 示された（Ａｌｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｎｅｕｒｏｎ　５ ：２９７−３０６）。

３つのタンパク質の効果は、感受性細胞に存在する特定のレセプターとこれらと の相互作用によって媒介される。ラット、ヒトおよびニワトリＮＧＦレセプター （ＮＧＦ−Ｒ）の分子クローンが単離され、これらのクローンのヌクレオチド配 列分析は、ＮＧＦ−Ｒが１つの形質膜貫通ドメイン、細胞質領域、および細胞外 のシスティンに富むアミノ末端ドメインを含むことを示している（Ｊｏｈｏｎｓ ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４７：５４５−５５４；　Ｒａ ｄｅｋｅ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８７、　Ｎａｔｕｒｅ　３２５：５９３−５９ ７；　Ｌａｒｇｅ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８９．　Ｎｅｕｒｏｎ　２：１１２３ −１１３４）。ＮＧＦ−Ｒは腫瘍壊死因子のレセプターと低いが有意な類似性を 示しく５ｃｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｃｅ１ｌ　６１：３６１− ３７０）　、またリンパ球表面抗原ＣＤ　４０　（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ　ｅ ｔ　ａｔ、、　１９８９．　ＥＭＢＯＪ、　８：１４０３−１４１０）およびＯ Ｘ　４０　（Ｍａｌｌｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　ＥＭＢＯＪ、　９ ：１０６３−１０６８）とも類似性を示す。ＮＧＦ−Ｒは低親和性および高親和 性状態として知られる２つの明瞭な状態でありうる（Ｓｕｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ 、、　１９７９．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４：５９７２−５９８ ２；　Ｌａｎｄｒｅｔｈ　ａｎｄ　５ｈｏｏｔｅｒ、　１９８０．　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７：４７５１−４７５５；　 ５ｃｈｅｃｈｔｅｒ　ａｎｄ　Ｂｏｔｈｗｅｌｌ、　１９９１．　Ｃｅ１ｌ　２ ４：８６７−８７４）　、　ＮＧＦ−Ｒの遺伝子は、レセプターの低親和性およ び高親和性状態双方の一部を形成するタンパク質をコードするように思われる（ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：３ ７３−３７５）が、高親和性レセプターのみがＮＧＦの生物活性を媒介すると提 唱されている。

ＢＤＮＦ　（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｔｅｂａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　 Ｎｅｕｒｏｎ　４：４８７−４９２）およびＮＴ　−３（Ｅｒｎｆｏｒｓ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９９０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌ ＩＳＡ　８７：５４５４−５４５８）はいずれも低親和性ＮＧＦ−Ｒと相互作用 することができ、これは低親和性ＮＧＦ−Ｒが未知の方法によりこれら３つの因 子すべての生物効果の媒介に関与しているかも知れないことを示唆する。

発生中の神経系では、ＮＧＦおよびそのレセプターは、伸長する軸索がその標的 に到達するときに、標的域および応答ニューロンにおいてそれぞれ合成されるこ とが示されている（Ｄａｖｉｅｓ　ｅｔａｌ、、　１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　 ３２６：３５３−３５８）　。これと合致して、発生中のヒナ胚でのＮＧＦ　ｍ ＲＮＡの濃度は第８日胚（Ｅ８）に最高に達しくＥｂｅｎｄａｌ　ａｎｄ　Ｐｅ ｒｓｓｏｎ、１９８８．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０２：１０１−１０６） 、これは感覚神経分布時期と一致する。しかしながら、ヒナでは、ＮＧＦ−Ｒｍ ＲＮＡはニューロンの神経分布の前の初期胚期に最高に発現され（ｔ！ｒｎｆｏ ｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｎｅｕｒｏｎ　ｌ：９８３−９９６）、モ してＥ８ヒナ胚では高濃度のＮＧＦ−ＲｍＲＮＡが間葉、体節、および神経管細 胞で検出される（Ｈａｌｌｂｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０゜Ｄｅｖｅｌｏ ｐｍｅｎｔ　１０８：６９３−７０４；　Ｈｅｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９ ０．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１３７：２８７−３０４；　Ｈｅｕｅｒ　１９９ ０．　Ｎｅｕｒｏｎ　５：２８３−２９６）　、この知見と、ＮＧＦ　ｍＲＮＡ はＥ３ヒナ胚て比較的高濃度で発現されるという事実（Ｅｂｅｎｄａｌ　ａｎｄ 　Ｐｅｒｓｓｏｎ、　１９８８．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０２：１０１− １０６）とを考え合わせると、ＮＧＦはその神経栄養因子としての機能とは異な る初期発生に関与することを示唆する。この可能性と合致して、最近ＮＧＦは培 養中のＥ１４ラット胚性線状体前駆体細胞の増殖と分化を制御することが示され た（Ｃａｔｔａｎｓｏ　ａｎｄ　ＭｃＫａｙ。

１９９０、　Ｎａｔｕｒｅ　３４７：７６２−７６５）　。ヒナ胚では、ＢＤＮ ＦおよびＮＴ−３ｍ、ＲＮＡはＥ４．５で最高に発現され、またＢＤＮＦがイン ビトロで鳥類神経堤細胞の分化を制御することが示された（Ｋａｌｃｈｅｉｍ　 ａｎｄ　Ｇｅｎｄｒｅａｕ、　１９８８．　Ｄｅｖ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　 ４１ニア９−８６）。

さらに、ＮＧＦの非ニューロン機能も提示されている。雄マウス下顎腺に見られ る説明のできない高濃度のＮＧＦはＮＧＦの別の機能を示唆するものであるのか も知れない（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ。

１９８７、５ｃｉｅｎｃｅ　２３７：１１５４−１１６２）　、成体ラットにお いて、ＮＧＦはＤＮＡ合成を誘導し、Ｂ細胞におけるＩｇＭ分泌を刺激すること が示された（Ｏｔｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：１００５９−１００６３）　。さら に、ＲｕｂｉｎおよびＢｒａｄｓｈａｗ　（１９８１，Ｊ、　Ｎｅｕｒ、　Ｒｅ ｓ、　６：４５１−４６４）がこの外分泌組織から実質的に純粋なＮＧＦを単離 、性状決定することに成功したように、ＮＧＦはモルモット前立腺に十分量で存 在する。ブタ前立腺における高濃度のＮＧＦは、神経栄養因子が未だ解明されて いない非ニューロン作用として機能するという仮説を支持する（Ｂｒａｄｓｈａ ｗ、１９７８．　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、４７：１９１−２１６；　 ｔ（ａｒｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

１９７９、　Ｎａｔｕｒｅ　２７９＋１６０−１６２；　Ｈａｒｐｅｒ　ａｎｄ 　Ｔｈｏｅｎｅｎ、　１９８０．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　３４：８９３ −９０３）。

また、ＮＧＦ　ｍＲＮＡは成体ラット精巣中の精母細胞および初期精子細胞中で 発現しくＡｙｅｒ−ＬｅＬｉｅｖｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８Ｂ、　Ｐｒｏｃ 。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：２６２８−２６３２）　、 ＮＧＦタンパク質は精母細胞から精子にいたるすべての段階の生殖細胞に存在す る（０１ｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８７．　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅ ｓ、　２４８：２７５−２８６；　Ａｙｅｒ−ＬｅＬｉｅｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 、　１９８８ａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　 ８５：２６２８−２６３２）。ＮＧＦ−ＲｍＲＮＡも成体ラット精巣で検出され ており、そこではテストステロンのネガティブコントロール下でセルトリ細胞に おいて発現しており、精巣でＮＧＦは減数分裂および精子形成を制御することを 示唆する（Ｐｅｒｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：７０４ −７０７）。

３、発明の概要 本発明は、ＢＤＮＦ／ＮＧＦ／ＮＴ−３遺伝子フアミリーの新たに性状決定され たメンバーであるニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）に関する。

本発明は、ＮＴ−４をコードする核酸分子を提供する。このような分子は図１　 ［配列番号＋　１　（ＮＴ−４、クサリヘビ：ｖｉｐｅｒ）、配列番号：　２　 （ＮＴ−４、アフリカッメガエル：Ｘｅｎｏｐｕｓ）］、図４（配列番号：　４ ３）　、図８（配列番号＝４９）、図１４（配列番号：　６１）　、図１５（配 列番号：６３）、図１７（配列番号：６９）、図１８（配列番号：　７５）　、 図２０（配列番号：９３）および図２１（配列番号：１１６）のＮＴ−４に対す る実質的に示す配列を含むか、あるいはこのような配列と少なくとも７０％相同 な配列を含む。

本発明はまた、図２［配列番号：２２（ＮＴ−４、クサリヘビ〕、配列番号：　 ２３　（ＮＴ−４、アフリカッメガエル）コ、図４（配列番号　４４）、図８（ 配列番号：５０）、図１４（配列番号：　６２）　、図１５（配列番号：６４） 、図１７（配列番号ニア０）、図１８（配列番号：　７６）　、図２０（配列番 号：９４）または図２１　（配列番号：１１７）のＮＴ−４に対する実質的に示 す配列を含むか、あるいはこのような配列と少なくとも７０％相同な配列を含む タンパク質またはペプチド分子を提供する。

本発明はさらに、原核および真核系における生物活性なＮＴ−４分子の発現を提 供する。

本発明はさらに、治療および診断用途に十分な量のＮＴ−４の生産を提供する。

同様に抗ＮＴ−４抗体も治療および診断用途に利用できる。はとんどの目的には 、治療または診断用途に同種由来のＮＴ−４遺伝子または遺伝子産物を用いるこ とが好ましいが、本発明の特定の態様においてはＮＴ−４の異種のものも利用で きる。

本発明はさらに、ヒト骨格筋、前立腺、胸腺および精巣中での検出しつる濃度の ＮＴ−４発現を明らかにすることによるＮＴ−４発現に基づく治療および診断用 途を提供する。また、治療および診断用途は、ＮＴ−４の脳および網膜への結合 、ならびにＮＴ−４の逆行性輸送の証明、および各種ニューロン細胞集団の生存 を支持するＮＴ−４の能力に基づく。

４、図面の説明 図Ｉ：異なる種からのＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３および新規神経栄養因子ＮＴ −４をコードする単離断片のＤＮＡ配列を並べて示す。

（Ａ）マウスプレプロＮＧＦ分子の模式図を示す。斜線の箱はシグナル配列（Ｓ 　Ｓ）を表し、黒線はタンパク質切断部位を、陰をつけた箱は成熟ＮＧＦを表す 。縮重プライマーに用いた領域を矢印で示す。上流プライマーはリジン５０から スレオニン５６までをコードする領域であり、下流プライマーはトリプトファン ９９からアスパラギン酸１０５まてを含む。増幅領域は成熟ＮＧＦ分子の１６８ から２９４塩基対（ｂ　ｐ）のＤＮＡ配列を含み、これまてに記載したすべての ＮＧＦファミリーメンバーにおいてこの領域は１つのエキソン中に位置する。

（Ｂ）異なる種から単離したＮＧＦＳＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４のヌク レオチド配列を並べて示す。これらの断片は成熟マウスＮＧＦのアミノ酸５７か ら９８に対応する。同じ塩基は点で示しである。番号付はマウス成熟ＮＧＦの配 列中のヌクレオチドをいう（Ｓｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｎａｔ ｕｒｅ　３００：５３８−５４０）　ｏ配列番号：　ｌ　（ＮＴ−４、クサリヘ ビ）、配列番号：　２　（ＮＴ−４、アフリカッメガエル）、配列番号：３（Ｎ ＧＦ、ヒト）、配列番号：４（ＮＧＦ、ラット）、配列番号：　５　（ＮＧＦ、 ニワトリ）、配列番号＋６（ＮＧＦ、クサリヘビ）、配列番号ニア（ＮＧＦ、ア フリカッメガエル）、配列番号：８（ＮＧＦ、サケ）、配列番号：　９　（ＢＤ ＮＦ、ヒト）、配列番号：　１０　（ＢＤＮＦ、ラット）、配列番号：　１１　 （ＢＤＮＦ、ニワトリ）、配列番号＝１２（ＢＤＮＦ、クサリヘビ）、配列番号 ＋　１３　（ＢＤＮＦ、アフリカッメガエル）、配列番号：　１４　（ＢＤＮＦ 、サケ）、配列番号：　１５　（ＢＤＮＦ、エイ）、配列番号：　１６　（ＮＴ −３、ヒト）、配列番号＋　１７　（ＮＴ−３、ラット）、配列番号：　１８　 （ＮＴ−３、ニワトリ）、配列番号：　ｌ　９　（ＮＴ−３、アフリカッメガエ ル）、配列番号：２０（ＮＴ−３、サケ）、配列番号＝２１　（ＮＴ−３、エイ ）。

図２：異なる種からのＮＧＦ、ＢＤＮＦ、、ＮＴ−３およびＮＴ−４から波峰さ れるアミノ酸配列を並べて示す。アミノ酸（−文字表記）の番号付は成熟マウス ＮＧＦからとった（Ｓｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌｌ、１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ　３ ００：５３８−５４０）　、同じアミノ酸は点で示しであるミリ−の異なるメン バー間での進化関係の系統発生図を示す。デ。同じ因子のすべての種変異体にお いて保存されたアミノ酸を示す位置を下線で示す。破線は対応する配列が単離さ れなかったことを示す。直線は異なる分子中の可変領域を表す（Ｒ５９からＳ６ ７およびＯ９３からＡ９Ｂ）。配列番号：　２２　（ＮＴ−４、クサリヘビ）、 配列番号：　２３　（ＮＴ−４、アフリカッメガエル）、配列番号＋２４（ＮＧ Ｆ、ヒト）、配列番号：　２５　（ＮＧＦ。

ラット）、配列番号＋２６（ＮＧＦ、ニワトリ）、配列番号：２７　（ＮＧＦ、 クサリヘビ）、配列番号：　２８　（ＮＧＦ、アフリカッメガエル）、配列番号 ：２９（ＮＧＦ、サケ）、配列番号：３０　（ＢＤＮＦ、ヒト）、配列番号：　 ３１　（ＢＤＮＦ、ラット）、配列番号：　３２　（ＢＤＮＦ、ニワトリ）、配 列番号：３３（ＢＤＮＦ、クサリヘビ）、配列番号：　３４　（ＢＤＮＦ、アフ リカッメガエル）、配列番号：　３５　（ＢＤＮＦ、サケ）、配列番号；３６（ ＢＤＮＦ、エイ）、配列番号：　３７　（ＮＴ−３、ヒト）、配列番号：　３８ 　（ＮＴ−３、ラット）、配列番号：　３９　（ＮＴ−３、ニワトリ）、配列番 号：　４０　（ＮＴ−３、アフリカッメガエル）、配列番号：　４１　（ＮＴ− ３、サケ）、配列番号：４２ＣＮＴ−３、エイ）。

図３：ＮＧＦファミリーメンバーの波峰される系統発生。ＮＧＦ　（Ａ）　、Ｂ ＤＮＦ　（Ｂ）およびＮＴ−３（Ｃ）の分化を示す系統発生樹を、ヌクレオチド 配列の分析を用いて構築した。ヒトＮＴ−３を（Ａ）および（Ｂ）の参照点とし て用い、ヒトＮＧＦおよびヒトＢＤＮＦを（Ｃ）の参照点として用いた。（Ａ） 中の目盛りは相対差異スコア２０に対応する枝の長さを表す。同じ目盛りが（Ｂ ）および（Ｃ）で用いられている。（Ｄ）はＮＧＦファ相互作用。

一タは波峰されたアミノ酸配列に従った。目盛りは枝の長さ２０を表す。すべて の樹は根を付けずに示されているので、枝は外部基準なしに互いに相対的に測定 される。略号：ｃｈｌ、ニワトリ；ｈｕｍ、ヒト；ｓａＬサケ；ｖｉｐ、クサリ ヘビ；ｘｅｎ。

アフリカッメガエル。

図４＝アフリカッメガエルＮＴ−４の配列およびＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ− ３との比較。

（Ａ）可能性のある翻訳開始部位を箱で囲む。推定的シグナル切断部位をＳＣと 記載する矢印で示す。アフリカッメガエルＮＴ−４と、ブタおよびラットＢＤＮ Ｆとの間で同じであるシグナル配列中のアミノ酸を星印で示す。Ｎ−グリコジル 化のコンセンサス配列を下線で示し、また矢印は成熟ＮＴ−４タンパク質（配列 番号：４３および配列番号：４４）の推定的開始部位を表す。

（Ｂ）アフリカッメガエルＮＴ−４（配列番号：４５）と、マウスＮＧ　Ｆ　（ Ｓｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ　３００：５３８−５ ４０）　（配列番号：４６）、’７ウスＢＤＮＦ　（Ｈｏｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 、　１９９０．　ＥＭＢＯＪ。

９：２４５９−２４６４）　（配列番号：　４７）　、およびマウスＮＴ−３（ Ｈｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｎａｔｕｒｅ　３４４：３３９−３４ １）　（配列番号：４８）とのアミノ酸（−文字表記）配列の比較。ＮＴ−４ア ミノ酸配列と比較して同しアミノ酸置換体を点で示す。ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよび Ｎ　Ｔ−３の間で異なる配列は、ＮＴ−４タンパク質の配列中においても異なる 。

図５：ＣＯ３細胞中におけるアフリカッメガエルＮＴ−４タンパク質の一過性発 現およびそのＰＣ１２細胞上のＮＧＦ−Ｒとの（Ａ）ラットＮＧＦ遺伝子、挿入 物を含まない対照プラスミド、またはアフリカッメガエルＮＴ−４遺伝子でトラ ンスフェクションしたインビボ標識したＣＯ８細胞培養からのならし培地の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ　（各レーンにｘｌｏ４ｃｐｍ）ｏＸ線フィルムに一晩露光した後 乾燥したゲルのオートラジオグラフを示す。

（Ｂ）等量のＮＴ−４（白丸）またはＮＧＦ　（黒丸）タンパク質を含むトラン スフェクションしたＣＯ８細胞培地の連続希釈物を用いて、それらのＰＣ１２細 胞上のレセプターからのＩｌｌ　１−ＮＧＦを置換しうる能力を検定した。結合 アッセイは、１．５×１０９Ｍの”’Ｉ−ＮＧＦおよびｌＸ１０４細胞／ｍｌを 用いて３７°Ｃで実施した。疑似トランスフェクションした細胞からの培地はＰ Ｃ１２細胞からの１２Ｊ−ＮＧＦの結合を置換しなかった。各点は３回の測定の 平均＋ＳＤを表す。

図６＝ニワトリ胚神経節からの神経突起伸長の刺激。

（ＡＳＢおよびＣ）組換えＮＴ−４タンパク質（Ａ）、組換えＮＧＦ　（Ｂ）お よびＢＤＮＦタンパク質（Ｃ）を用いて後根神経節において引き出された神経突 起伸長。

（Ｄ）疑似トランスフェクションした細胞からのならし培地に対する後根神経節 の応答。

（ＥおよびＦ）ＮＴ−４（Ｅ）またはＮＧＦ　（Ｆ）に応答する交換神経神経節 からの神経突起伸長の刺激。

（Ｇ、ＨおよびＩ）組換えＮＴ−４（Ｇ）　、ＮＴ−３（Ｈ）およびＢＤＮＦ　 （Ｉ）タンパク質で刺激した結節性神経節。すべての図は培養ｌ、５日後の神経 節の明視野顕微鏡写真である。

図７：異なるアフリカッメガエル組織中でのＮＴ−４ｍＲＮＡの検出。

（Ａ）成体雌アフリカッメガエルの表示組織からのＰｏ１ｙ（Ａ）＋ＲＮＡ　（ スロット当たり１０ｇ）をホルムアルデヒド含有アガロースゲルで電気泳動し、 ニトロセルロースフィルターにプロットし、アフリカッメガエルＮＴ−４遺伝子 の３°エキソンからの５００ｂｐのＨｉｎｄＩ断片とハイブリダイズさせた。比 較のため、フィルターをアフリカッメガエルＮＧＦ遺伝子（心臓、ＮＧＦと表示 されたレーン）からの１８０ｂｐのＰＣＲ断片ともハイブリダイズさせた。ＮＴ −４プローブとハイブリダイズさせたフィルターを２日間露光させ、ＮＧＦプロ ーブとハイブリダイズさせたフィルターは２週間露光した。ＮＴ〜４プローブと ハイブリダイズさせたフィルターの２週間に延長した露光では、各種段階の卵母 細胞を含む卵巣以外のどの組織にもＮＴ−４ｍＲＮＡの存在を示さなかった。Ｃ ＮＳと表示したレーンは脳およびを髄を含む。

（Ｂ）アフリカッメガエル卵巣からのＰｏ　１　ｙ　（Ａ）　十ＲＮＡ（１０ｇ ）を用いて、ＮＧＦファミリーの４メンバーの発現を分析した。各フィルターを それぞれのアフリカッメガエル遺伝子からのＰＣＲ断片を標識することによって 得られた表示のプローブとハイブリダイズさせた。遺伝子の３′エキソン中の標 識ＰＣＲ断片の位置を図ＩＡに示す。フィルターを高ストリンジエンシーで洗浄 し、Ｘ線フィルターに５日間露光した。

図８ニアフリカッメガエルＮＴ−４のヌクレオチド配列および制限酵素切断部位 （配列番号：４９および配列番号＝５０）。

図９ニアフリカッメガエル卵巣中でのＮＴ−４ｍＲＮＡの発現。成体アフリカッ メガエルからの卵巣を低温槽中でセクションに切断（１４μｍ厚さのセクション ）し、次いでセクションを、末端ジデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ を用いてｓｓ３〜ｄＡＴＰで標識した表示の４８−ｍａｒのオリゴヌクレオチド とハイブリダイズさせた。

（Ａ）以下の配列をもつアフリカッメガエルＮＴ−４ｍＲＮＡ特異的オリゴヌク レオチドを用いるハイブリダイゼーション：５°　ＣＣＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴ ＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＧＧＴＣＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＣＡＴＡＡＧＡＣＴＧＴＴ ＴＴＧＣ３’　（配列番号：９５）。

（Ｂ）類似の長さとＧ＋Ｃ含員の対照オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイ ゼーション。ハイブリダイゼーション後、セクションを５５℃、１×ＳＳＣで洗 浄し、次いでＸ線フィルムに１０日間露光した。現像したＸ線フィルムの写真を 図に示す。ＮＴ−４プローブを用いた方には多くの小細胞に強い標識が観察され 、対照プローブには標識が観察されないことに注意されたい。矢印は２つのプロ ーブのいずれでも標識されない大きい（第■ステージ）卵母細胞を示す。目盛り 棒は２ｍｍである。

図ＩＯニアフリカッメガエル卵巣中のＮＴ−４ｍＲＮＡを発現する卵母細胞を示 す明視野エマルジョンオートラジオグラフ。

図９で記載したようにアフリカッメガエルＮＴ−４ｍＲＮＡ特異的（Ａ、Ｂ）ま たは対照（Ｃ）プローブとハイブリダイズさせたセクションをＫｏｄａｋ　ＮＴ Ｂ２エマルジョンで被覆し、５週間露光し、現像し、クレシルバイオレットで軽 く対比染色した。この図は現像したセクションの明視野光学顕微鏡写真を示す。

パネルＡで、小さい卵母細胞（第１および■ステージ）には強いＮＴ−４ｍＲＮ Ａ標識が、また大きい卵母細胞（第Ｖおよび■ステージ）には標識のないことに 注意されたい。パネルＢはパネルＡの箱て囲んだ部分を高倍率にしたものを示す 。写真中にステージ■の卵母細胞の細胞質に強い標識のあることに注意されたい （Ｃ）対照プローブを用いると標識が見られない。略号；ｎ、核；ｆｃ、卵胞細 胞；ｐｌ、色素層。目盛り棒；Ａ、５０μｍ；ＢおよびＣ−１５ｕ　ｍ　。

図１１：非形成の各種ステージにおける卵母細胞中のＮＴ−４ｍＲＮＡの濃度。

アフリカッメガエルＮＴ〜４　ｍＲＮＡ特異的プローブとハイブリダイズしたセ クションのエマルジョンオートラジオグラフ（図１０に示す）を用いて単位面積 当たりの粒子を計数した。選択した単位面積はステージＩ卵母細胞の約１／１０ ０てあった。表示したステージの１０個の異なる卵母細胞において、１５単位面 積を分析した。誤差の棒はＳＤを示す。

図１２．アフリカッメガエルの非形成におけるＮＴ−４ｍＲＮＡ発現のノーザン プロット分析。２匹の成体アフリカッメガエルからの卵巣を切り出し、コラゲナ ーゼて処理し、卵胞細胞を除去して卵母細胞を放出した。次いて卵母細胞をＤｕ ｍｏｎｔ、　１９７２．　Ｊ。

Ｍｏｒｐｈｏｌ、　１３６：１５３−１８０に記載のステージに従って、表示し た群に分けた。全卵巣および放出した卵胞細胞も分析に含めた。次いて全細胞性 ＲＮＡを調製し、４０ｇ／スロットのＲＮＡをホルムアミド含有１％アガロース ゲル中で電気泳動した。これをニトロセルロースフィルターにプロットし、アフ リカッメガエルＮＴ−４遺伝子の３°エキソンからの６００ｂｐのＨｉｎｃｌＩ 断片とハイブリダイズした。フィルターを高ストリンジエンシーで洗浄し、Ｘ線 フィルムに５日間露光した。ステージＶおよび■の卵母細胞ではＮＴ−４ｍＲＮ Ａの濃度が顕著に減少していることに注意されたい。

図１３　＋　（Ａ）ｘＮＴ−４の部分アミノ酸配列（配列番号：５１）。縮重オ リゴヌクレオチドを合成してポリメラーゼチェインリアクションによるヒトおよ びラットゲノムＤＮＡの増幅用プライマーとして用いた部分を示す。矢印はセン スおよびアンチセンスの縮重オリゴヌクレオチドを表すオリゴヌクレオチドを示 す。

プライマー２２の縮重オリゴヌクレオチドのセットはｒＢＤＮＦのアミノ酸１８ ４−１８９を表す（配列番号：５２）。表されるアフリカッメガエルＮＴ−４の 部分アミノ酸配列は上記図４に記載したアミノ酸１６７からアミノ酸２２３であ る。

（Ｂ）ヒトおよびラットＮＴ−４のクローニングに用いた縮重オリゴヌクレオチ ド。図１３のオリゴヌクレオチド３Ｚはセリンコドンの縮重を可能にするために 、３Ｚと３Ｚ”の混合物からなる。２Ｙ（配列番号：５３）、２Ｚ（配列番号： ５４）、３Ｙ（配列番号：５５）、３Ｚ（配列番号：５６）、（配列番号：５７ ）および４Ｚ（配列番号：５８）。

（Ｃ）縮重オリゴヌクレオチド３°　（配列番号＝５９）および５゛（配列番号 二６０）のためのクローニングチイル。

図１４・ラットＮＴ−４の一部をコードする単離断片のＤＮＡ配列（配列番号二 ６１）。ｒＮＴ−４核酸断片によってコードされるペプチドの予測されるオーブ ンリーディングフレームを一文字表記で表す（配列番号、６２）。括弧の中の配 列はＰＣＲプライマーの一部である。

図１５＝ヒトＮＴ−４の一部をコードする単離断片のＤＮＡ配列（配列番号−６ ３）。ｈＮＴ−４核酸断片によってコードされるペプチドの予測されるオープン リーディングフレームを一文字表記で表す（配列番号＝６４）。括弧の中の配列 はＰＣＲプライマーの一部である。

図１６二代表的ニューロトロフィンから波峰されるアミノ酸配列を並べた。アミ ノ酸は一文字表記で示す。同じアミノ酸を点で示す。破線はｒＮＴ−４（配列番 号二６２）とｈＮＴ−４（配列番号：６４）の両方の保存領域中の７アミノ酸の 挿入物を示す。

ｘＮＴ−４（配列番号：　６５）　、ｒＮＧＦ　（配列番号＝６６）、ｒＢＤＮ Ｆ　（配列番号：　６７）　、ｒＮＴ−３（配列番号二〇８）。Ｘ＝ニアフリカ ッメガエルｒ＝クラットｈ＝ヒト。括弧の中の配列はＰＣＲプライマーの一部で ある。

図１７：（Ａ）ヒトＮＴ−４の一部をコードする単離断片のＤＮＡ配列（配列番 号＝６９）。１９２ｂｐのｈＮＴ−４核酸断片によってコードされる予測ペプチ ドを一文字表記で表す（配列番号・７０）。括弧の中の配列はＰＣＲプライマー の一部である。

（Ｂ）ヒトゲノムＤＮＡの一次増幅に用いたｈＮＴ４−５”と名付けた５°末端 プライマー［ＥＴＲＣＫＡ、（配列番号＝７２）をコードする配列（配列番号＝ ７１）を含む］、ならびに４Ｚ（配列番号：５８）と名付けた３′末端プライマ ー［ＷＩＲＩＤＴをコードするヌクレオチド配列を含む］のオリゴヌクレオチド 配列。

（Ｃ）−次ＰＣＲ反応産物の増幅に用いた５′末端プライマーのオリゴヌクレオ チド配列。ｈＮＴ４−５°°゛と名付けたプライマー［ＤＮＡＥＥＧ　（、配列 番号＝７４）をコードする配列（配列番号ニア３）を含むコを３°プライマー４ ２（配列番号：５８）とともに用いて、１６２ｂｐの断片（プラスクローニング チイル）を得た。次いで１６２ｂｐのＰＣＲ断片を、上記で用いた上流ＰＣＲ断 片（２ＹＺ３Ｚ）を用イルバッチＰ　ＣＲｌ、：用いて、（Ａ）に示す１９２ｂ ｐプラスクローニングチイルの単一断片を得た。さらに、この断片のサブクロー ニングおよび配列決定によって３′伸長した核酸配列情報を得た。

図１８＝ヒトＮＴ−４をコードする単離ヒトゲノムファージクローン７−２の部 分ＤＮＡ配列（配列番号＝７５）。ゲノムクローン７−２によってコードされる 予測ｈＮＴ−４タンパク質をアミノ酸の一文字表記で表す（配列番号ニア６）。

箱で囲んだ領域はｈＮＴ−４プレタンパクの予測切断部位を表す。矢印はプレ配 列中の保存残基を示す。下線部（Ｎ−Ｒ−３）はＮ−グリコジル化のコンセンサ ス配列を表す。丸で囲んだ領域は開始メチオニンを表す。スプライスアクセプタ 一部位は配列番号ニア５の塩基対４６１−４６２（ＡＣ）に位置し、イントロン の３′末端を表す図１９二代表的ニューロトロフィンから波峰されるアミノ酸配 列を並べた（配列番号ニア７−９２）。アミノ酸は一文字表記で表す。ヒトゲノ ムファージクローン７−２（配列番号ニア７）によってコードされるアミノ酸と 同じアミノ酸を星印で示す。破線は配列番号＝７７によってコードされるタンパ ク質と比較したときの相同アミノ酸のブレークを表す。

図２０：ヒトゲノムファージクローン２−１の一部をコードする単離断片のＤＮ Ａ配列（配列番号＝９３）。この単離核酸断片によってコードされるペプチドの 予測オープンリーディングフレームを一文字表記で表す（配列番号＝９４）。

図２１＝ヒトゲノムファージクローン４−２の一部をコートスる単離断片のＤＮ Ａ配列（配列番号：１１６）。この単離核酸断片によってコードされるペプチド の予測オーブンリーディングフレームを一文字表記で表す（配列番号：１１７） 。

図２２＝ヒトＮＴ−４ｍＲＮＡ発現のノーザンプロット分析。ヒト由来の組織特 異的ｍ　ＲＮ　ＡはＣ１ｏｎｔｅｃｈから購入した。ＲＮＡ　（１０ｇ）を１％ アガロース−ホルムアミドゲルを用いる電気泳動で分画し、次いでｌ　０ＸＳＳ Ｃ（ｐＨ７）でナイロン膜（ＭａｇｎａＧｒａｐｈ、Ｍｉｃｒｏｎ　５ｅｐａｒ ａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ、）にキャピラリー転写した。ＵＶ光（Ｓｔｒａｒｌ　１ ｎｋｅｒ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ、）にさらすことによってＲＮＡを膜 にＵＶ架橋させ、０．５Ｍ　ＮａＰＯｔ　（ｐＨ７）、１％ウシ血清アルブミン （フラクション■、Ｓ　ｉ　ｇｍａ）、７％５ＤＳＳｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（Ｍ ａｈｍｏｕｄｉ　ａｎｄ　Ｌｉｎ、　１９８９、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 　７：３３１−３３３）　、および１００ｇ／ｍ！音波処理、変性サケ精子ＤＮ Ａの存在下に、６５°Ｃて放射性標識プローブ（ＨＯ２−２ＮＴ−４の完全コー ディング領域を含む６８０ｂｐのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片）（以下の実施例９を 参照）とハイブリダイズさせた。フィルターを６５℃、２ＸＳＳＣ，０，１％Ｓ ＤＳで洗浄し、７０℃で補強スクリーン（Ｃｒｏｎｅｘ、ＤｕＰｏｎｔ）および Ｘ線フィルム（ＸＡＲ−５、Ｋｏｄａｋ）を用いて一部オートラジオグラフィー に付した。ゲルを臭化エチジウム染色したところ、各種試料で等量の全ＲＮＡが アッセイされた（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．５ｃ ｉｅｎｃｅ　２４７：１４４６−１４５１に記載の結果と同じ）。

レーンｌ：胎児肝臓ｐ　ｏ　ｌ　ｙ　（Ａ）　＋ｍＲＮＡ　；レーン２：胎児脳 １）　ｏ　ｌ　Ｖ　（Ａ）　＋ｍＲＮＡ　；レーン３：前立腺ｐｏｌｙ（Ａ）＋ ｍＲＮＡ　；レーン４：筋肉ｐ　ｏ　ｌ　ｙ　（Ａ）　＋ｍＲＮＡ　；レーン５ ：腸ｐ　ｏ　Ｉ　ｙ　（Ａ）　＋ｍＲＮＡ　；レーン６：腎臓ｐｏｌｙ（Ａ）　 十ｍＲＮＡ　；レーン７：肝臓ｐｏ　ｌ　Ｖ　（Ａ）＋ｍＲＮＡ　；レーン８： 肺臓ｐ　ｏ　１　ｙ　（Ａ）　＋ｍＲＮＡ　；レーン９：胸腺ｐｏｌｙ　（Ａ） 　＋ｍＲＮＡ　；レーンｌＯ：卵巣ｐ　ｏ　１　ｙ　（Ａ）　＋ｍＲＮＡ：レー ン１１：精巣ｐ　ｏ　ｌ　ｙ　（Ａ）　＋ｍＲＮＡ　；レーン１２：胎盤１）　 ｏ　ｌ　Ｖ　（Ａ）　＋ｍＲＮＡ　；レーン１３：脳ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ 　；レーン１４：脳全ＲＮＡ。

図２３：トランスフエクションした細胞系からのＣＯ８上清。

Ｑｌ　（（ｐＣＭＸ−ＨＯ２−２Ｑ）　、Ｎ７　（ｐＣＭＸ−ｈＮＴ３／ｈＮＴ ４）およびＸｉ　（ｐＣＭＸ−ｘＮＴ４／ｈＮＴ４）を、１０μｌ、５０μｌお よび２５０μｌの用量でＤＲＧ移植物で神経突起伸長活性を試験した。疑似トラ ンスフェクションしたＣＯ８細胞系からの上清を対照として用いた。

図２４　：Ｑｌ　（ｐＣＭＸ−ＨＯ２−２Ｑ）およびＭ　（ｐＣＭＸ−ＨＯ２− ２Ｍ）細胞系からのＣＯＳ上清を用いて、ＤＲＧ関連細胞上におけるその生存促 進活性を試験した。試験用量は全量２ｍｌ中、５μｌから２５０μＩであった。

図２５：Ｅ１４ラット胚から単離した運動ニューロンに富む培養物を用いて、Ｍ 細胞系ＣｐＣＭＸ−ＨＯ２−２Ｍ）がらノｃ。

Ｓ細胞上清の２つの希釈物で試験した。生物活性は、Ｆｏｎｎｕｍ、　１９７５ 、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　２４：４０７−４０９の記載するコリンアセ チルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）によって測定した。疑似トランスフェクショ ンしたＣＯ８細胞系（ＭＯＣＣ０３）および非処理運動ニューロン（Ｃ−ＮＴ） を対照として示す。

図２６：ヒト、ラットおよびアフリカッメガエルＮＴ−４を含むＣＯ８上清を用 いて、ｔｒｋＡＳ　ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣのチロシンリン酸化を誘導する能力 を試験した。

図２７：（Ａ）各種濃度のヒトおよびアフリカッメガエルＮＴ−４によって誘導 されるｔｒｋＢのチロシンリン酸化。

（Ｂ）ヒトまたはアフリカッメガエルＮＴ−４を含む各種濃度のＣＯ８上清に対 するＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞発現ｔ　ｒｋＢの増殖応答。疑似トランスフェクシ ョンしたＣＯ８細胞系を対照として示す。

図２８：各種濃度のＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４精製調製物によ って誘導されるｔｒｋレセプターのチロシンリン酸化。（Ａ）ｔｒｋＡのリン酸 化；　（Ｂ）ｔｒｋＢのリン酸化；　（Ｃ）ｔｒｋＣのリン酸化。

各種濃度のＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４精製調製物の、（Ｄ）ｔ ｒｋＡ；　（Ｅ）ｔｒｋＢおよび（Ｆ）ｔｒｋＣを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の 細胞増殖に及ぼす効果。

図２９・各種濃度のＮＧＦＳＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４精製調製物の、 親ＰＣ１２細胞およびｔｒｋＢを発現するＰＣ１２細胞に及ぼす効果。（Ａ）神 経突起伸長によって示される分化：　（Ｂ）生存細胞数；　（Ｃ）チロシンリン 酸化アッセイ。

図３０：（Ａ）ヨウ素化ＮＧＦのＰＣ１２細胞およびラット生後７臼目の線条体 ホモジェネートへの架橋、ならびに冷ニューロトロフィンとの競合。

（Ｂ）ヨウ素化ＢＤＮＦの３Ｔ３　ｔｒｋＢ細胞およびラット生後７臼目皮質へ の架橋、ならびに冷ニューロトロフィンとの競合。（Ｃ）ヨウ素化ＮＴ−４の３ Ｔ３　ｔｒｋＢ細胞およびラット生後７臼目皮質および海馬との架橋、冷ニュー ロトロフィンとの競合。

図３１：ヒＩ−ＮＴ−４の増加濃度に応答する胚Ｅ１４ラットＤＲＧ移植物の細 胞生存性。

図３２：ＮＴ−４の存在下で生存する神経節ニューロン中のｔｒｋＢおよびｔｒ ｋＣｍＲＮＡの発現。

図３３：（Ａ）Ｄ１８ラット胚由来の海馬中での精製ニューロトロフィンによる ｆｏｓ　ｍＲＮＡの誘導。

（Ｂ）Ｄ１８ラット胚由来の海馬中での精製二二一口トロフィンによるｔｒｋの リン酸化。

図３４：（Ａ）海馬培養物中のカルビンジン（ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）−免疫陽性 細胞の数に及ぼすＮＴ−４の効果。

（Ｂ）海馬培養物中のアセチルコリンエステラーゼ陽性細胞の数に及はすＮＴ− ４およびＢＤＮＦの効果。

図３５＝基底前脳ニューロン培養物中でのコリンアセチルトランスフェラーゼ活 性に及ぼす精製ヒトＮＴ−４の用量依存効果。

図３６：ラツト胚黒質のチロシンヒドロキシラーゼ陽性ドーパミン作動性ニュー ロンに及ぼす増加濃度の精製ヒトＮＴ−４の効果。（Ａ）１８目にＮＴ−４添加 ；　（Ｂ）ｌ、４および７８目にＮＴ−４添加。

図３７＝インビトロでのＤ１７線条体８日間培養物におけるカルビンジン免疫反 応性ニューロンに及ぼすＮＴ−４処理の効果。

図３８＝インビトロでのＥ１７線条体８日間培養物における高親和性ＧＡＢＡ取 り込みに及ぼすＮＴ−４の効果。

図３９：Ｅ１４ラット運動ニューロンでのコリンアセチルトランスフェラーゼ活 性に及ぼす増加濃度の精製ヒトＮＴ−４の効果図４０：Ｅ１４ラット運動ニュー ロンでのコリンアセチルトランスフェラーゼ活性に及ぼすＣＮＴＦまたはＮＴ− ３単独、あるいはＮＴ−４との組み合わせの効果。

図４１　：ＧＡＢＡ作動性ニューロンの免疫細胞化学染色。細胞を上記のように 調製し、３５ｍｍ培養皿に５０，０００細胞／Ｃｍ２で播いた。３．６および１ ０日後（４１Ａ、４１Ｂおよび４１Ｃ）、培養物を組換えネコＣＡＤに対するポ リクローナル抗血清（Ａ、Ｔｏｂｉｎ博士（ＵＣＬＡ、ＣＡ）から恵与）を用い て免疫細胞化学染色用に処理した。４１Ｄ：抗体の非存在下での７日培養物にお ける染色欠如を示す対照。目盛り棒：１００μＭ０図４２＝中脳培養物でのＣＡ Ｄ活性に及ぼすニューロトロフィンの効果。細胞を上記のように調製し、３５ｍ ｍ培養皿に５０゜０００細胞／　ｃ　ｍ　”で播いた。最初の固着期間の後培地 を変え、培養物を増加濃度のＢＤＮＦ、ＮＴ−３またはＮＴ−４のいずれかにさ らした（各群ｎ＝５）。すべての培養物をインビトロで７日間維持し、次いで上 記のようにＣＡＤ測定用に処理した。ＣＡＤ活性は非処理培養物で測定される対 照値のパーセントとして表される。非処理対照試料におけるベースラインのＣＡ Ｄ活性は６．２３±０．３９ｐｍｏｌ／１２０分／μｇタンパク質＊＊、ｐ＜０ ．０１；５ｔｕｄｅｎｔｓ　を試験を用いると対照と比較して＊ｐ＜０．０５゜ 図４３．高親和性ＧＡＢＡ取り込みに及ぼすニューロトロフィンの効果。細胞を 上記のように調製し、３５ｍｍ培養皿に５０゜０００細胞／ｃｍ２で播いた。最 初の固着期間の後培地を血清不含培地に変え、増加濃度でＢＤＮＦ、ＮＴ−３ま たはＮＴ−４を添加した。７日後、培養物を次いで上記のように高親和性ＧＡＢ Ａ取り込み測定用に処理した。４３Ａ　：　ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４ の用量応答曲線。ＧＡＢＡ取り込み活性は対照培養物で測定されるＧＡＢＡ取り 込みのパーセントとして表される。４３Ｂ：２５ｎｇ／ｍｌ　ＢＤＮＦＳ　ｌｏ ｎｇ／ｍｌ　ＮＴ−３，２，５ｎｇ／ｍｌ　ＮＴ−４，５０ｎｇ／ｍｌ　ＮＧＦ 、あるいは同じ濃度のＢＤＮＦとＮＴ−３またはＮＴ−４との組み合わせの存在 下に維持した培養物中で測定したＧＡＢＡ取り込み活性。

非処理対照試料におけるベースラインのＧＡＢＡ取り込み活性は４１３５８±２ １６１　ｃｐｍ／１５分／皿。

図４４・ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４は中脳培養物のＧＡＢＡ含量を増加 する。培養物を上記のように調製し、３５ｍｍ培養皿に５０，０００細胞／ｃｍ ”で播いた。培地を血清不含培地に変え、ＢＤＮＦ　（５０Ｄｇ／ｍり、ＮＴ− ３（Ｌｏｎｇ／ｍり　、ＮＴ−４（２，５ｏｇ／ｍｌ）またはＮＧＦ（５０Ｄｇ ／ｍ１）を添加した（各群ｎ；６）。培養物を７日間維持し、次いで上記のよう にＧＡＢＡ測定用に処理した。ＧＡＢＡ含量はｐｇ／μｇタンパク質で表す。デ ータは平均上Ｓｅｍ）ｋ、５ｔｕｄｅｎｔｓ　を試験を用いると対照と比較して ｐ＜０．０５゜図４５：成体ラット黒質におけるｔｒｋＢおよびｔｒｋＣｍＲＮ Ａの分布。成体ラット脳の上部分セクションの暗視野顕微鏡写真は、ｔ　ｒｋＢ 　（４５Ｂ、４５ｃ）およびｔ　ｒｋＣ（４５Ｄ、４５Ｆ）をコードするｍＲＮ Ａに対するハイブリダイゼーションシグナルのオートラジオグラフによる分布を 示す。４５Ａ：パネルＢ−Ｆの脳セクションを表す中脳領域断面の模式図である 。低倍率（４５Ｂ）では、ｔｒｋＢ　ｍＲＮＡは腹側蓋領域（ＶＴＡ）および内 側黒質（ＳＮ）で検出された。４５Ｃ：Ｂに示す右半球、組織セクションの腹側 面の高倍率写真を示す。４５Ｄ：ｔｒｋＣｃＲＮＡとハイブリダイズした、Ｃに 示すものと対応する組織セクション。４５Ｅ、４５Ｆ：Ｄの組織セクションの対 応する明視野／暗視野顕微鏡写真の高倍率対であり、ニューロンと推定される大 きい細胞質（ｐｅｒｉｋａｒｙａ）とハイブリダイズしたｔｒｋＣのオートラジ オグラフによる分布を示す。目盛り棒＝Ｂては３１２５μｍ、ＣおよびＤでは２ １８！ｌｚｚｍ、ＥおよびＦでは５４６　ａｍ。

図４６：Ｅ１４腹側中脳に由来する培養物中におけるＴｒｋＢおよびＴｒｋＣの ノーザンプロット分析。細胞を６０ｍｍ皿に５ｏ、ｏｏｏ細胞／　ｃ　ｍ　２で 播いた。血清不含培地に７２時間維持した後、ＢＤＮＦ　（５０ｎ　ｇ／ｍ　１ ）またはＮＴ−３（２５Ｄｇ／ｍｌ）を添加し、５．１６．２４または２９時間 培養物を維持した。培養物から調製したノーザンプロットをＴｒｋＢまたはＴｒ ｋＣｍＲＮＡのためのプローブとした。４６Ａ：ＴｒｋＢプローブとのハイブリ ダイゼーション後のプロットのオートラジオグラフ；Ｃ＝対照、Ｂ＝ＢＤＮＦ、 ＴＢ＝全成体ラッう脳ＲＮＡ；４６Ｂ：（Ａに）対応する臭化エチジウム染色ゲ ル；４６Ｃ：ＴｒｋＣプローブとのハイブリダイゼーション後のプロットのオー トラジオグラフ；Ｃ＝対照、Ｎ＝ＮＴ−３、ＴＢ＝全成体ラッう脳ＲＮＡ；４６ Ｄ：　（４６Ｃに）対応する臭化エチジウム染色ゲル。

５、発明の詳細な説明 本発明は、ＮＴ−４遺伝子およびタンパク質を提供する。本発明は少なくともそ の一部はＮＴ−４遺伝子のクローニング、性状決定、および発現に基づく。

特に、本発明はＮＴ−４をコードする組換え核酸分子を提供する。このような分 子はクサリヘビについては図１　（配列番号：ｌ）、アフリカッメガエルＮＴ− ４については図１　（配列番号：２）、図４　（配列番号：４３）または図８（ 配列番号：　４９）　、ラットＮＴ−４には図１４（配列番号：　６１）　、ヒ トＮＴ−４については図１５（配列番号・６３）、図１７（配列番号二６９）ま たは図１８（配列番号ニア５）、ヒトＮＴ−４様配列については図２０　（配列 番号：９３）および図２１（配列番号二１１６）に実質的に示す配列、あるいは いずれかの配列と少なくとも約７０％相同な配列からなり、ここで相同性とは配 列同一性（例えば、第２配列と７０％相同な配列は第２配列と７０％の同じヌク レオチド残基をもつ）をいう。

実施例セクション８および図１５（配列番号：６３、配列番号６４）に詳述する 本発明の特定の面においては、ヒトニューロトロフィン分子の一部のヌクレオチ ドおよびアミノ酸配列が決定される。実施例セクション９および図１７（配列番 号：６９、配列番号ニア０）および図１８（配列番号ニア５：、配列番号ニア６ ）で詳述する本発明の別の面においては、全ヒトニューロトロフィン分子のヌク レオチドおよびアミノ酸配列が決定される。実施例セクション９および図２０（ 配列番号、９３、配列番号＝９４）および図２１（配列番号：１１６、配列番号 ：　１１７）で詳述する本発明の別の面においては、ヒトゲノムファージクロー ン２−１および４−２の一部のヌクレオチドおよびアミノ酸配列［図１８（配列 番号ニア５）に記載するヌクレオチドおよびアミノ酸配列と似ているが同一では ない］が詳述される。このようなヒトニューロトロフィン分子は本明細書中では ヒトニューロトロフィン−４という。このような分子は本明細書にいうアフリカ ッメガエルニューロトロフィン−４のヒト相同体であるか、あるいは異なってい るが相同なニューロトロフィン分子であると理解すべきである。同様に、本明細 書でラットＮＴ−４という分子は、ＮＴ−４のラット相同体であるか、あるいは 異なっているが相同なニューロトロフィン分子である。本発明の方法および組成 物は１つの命名法に左右されるものではない。

本発明はまた、実質的に精製されたＮＴ−４タンパク質またはペプチド分子を提 供する。このような分子はＮＴ−４に対する図２（配列番号＝１および配列番号 ＝２）、図４（配列番号：４４）、図８（配列番号：５０）、図１４（配列番号 ：６２）、図１５（配列番号＋６４）、図１７（配列番号ニア０）、図１８（配 列番号ニア６）、図２０（配列番号：９４）および図２１　（配列番号：１１７ ）に実質的に示す配列、あるいはいずれかの配列と少なくとも約７０％相同な配 列からなる。本発明の別の非限定的な態様においては、実質的に精製されたタン パク質またはペプチドは配列ＫＣＮＰＳＧＳＴＴＲ（配列番号＝９６）からなる 。本発明の別の態様では、実質的に精製されたペプチドまたはタンパク質は配列 ＲＧＣＲＧＶＤ　（配列番号：９７）からなる。本発明のさらに別の態様では、 実質的に精製されたペプチドまたはタンバク質は配列ＫＱＷＩＳ（配列番号：９ ８）からなる。本発明のさらなる態様では、実質的に精製されたペプチドまたは タンパク質は配列ＫＱＳＹＶＲ（配列番号：９９）からなる。本発明のさらに別 の態様では、実質的に精製されたペプチドまたはタンパク質は配列ＧＰＧＸＧＧ Ｇ　（配列番号：１００）からなり、ここでＸは２０のアミノ酸のセットのうち の１つを表す。本発明の関連態様では、実質的に精製されたペプチドまたはタン パク質は配列ＧＰＧＶＧＧＧ　（配列番号：　１０１）またはＧＰＧＡＧＧＧ　 （配列番号：１０２）からなる。本発明のさらなる態様では、実質的に精製され たペプチドまたはタンパク質は配列ＥＳＡＧＥ　（配列番号＋１０３）からなる 。本発明のさらに別の態様では、実質的に精製されたペプチドまたはタンパク質 は配列ＤＮＡＥＥ　（配列番号：１０４）からなる。

本発明のタンパク質およびペプチドは標準法を用いる化学合成により製造でき、 または本発明のＮＴ−４をコードする核酸分子を用い、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ ９０１０４９１６　（１９９０年８月２９日出願、Ｗ０９１１０３５６９として 公開、そのすべてを参照としてここに包含する）に記載の、あるいは以下にＣＯ ８細胞における一過性発現として実施例（セクション６．２．４および図５参照 ）に記載するような当業界で公知の原核または真核発現系を用いて製造すること ができる。

本発明はまた、神経系、特にドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニュー ロン、感覚ニューロン、線条体細胞、皮質細胞、線条、海馬、小脳、嗅覚法、水 管周囲灰質、核縫線、前送、後板神経節、神経プラコード誘導体、交換神経ニュ ーロンおよび上部および下部運動ニューロン（しかし、これに限定されない）の 細胞の成長および／または生存の促進へのＮＴ−４の使用を提供する。

本発明はさらに、実質的に同じ大きさのＢＤＮＦ、ＮＧＦまたはＮＴ−３の一部 と同一ではない図１．２．４．８．１４．１５．１７．１８．２０、または２１ 　（上記の配列番号）に実質的に示すＮＴ−４の核酸またはアミノ酸配列の一部 を提供する。

本発明はさらに、ＮＴ−４をコードする組換え核酸を含み、かつ組換えＮＴ−４ タンパク質を発現する原核または真核細胞を提供する。特定の態様では、細胞は ＣＯ８細胞などの真核細胞である。したがって、本発明はまた、ＮＴ−４をコー ドする組換え核酸を、ＮＴ−４を発現させる条件下に細胞に挿入しく例えば、ト ランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、マイクロインジェク ションなどにより）、次いで細胞からＮＴ−４を単離することによって製造され る組換えＮＴ−４タンパク質またはペプチドを提供する。

さらに、本発明は例えば以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、そ して適当なゲノムまたはｃＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲによって製造される 分子を提供する：ヒトＮＴ−４には５’　ＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＧＡＡＡＣ Ｃ（配列番号：１０５）および３’　ＧＴＣＴＴＧＴＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＡ　 （配列番号：１０６）、ならびにラットＮＴ−４には５’　ＣＡＧＴＡＴＴＴＴ ＴＡＣＧＡＧＡＣＧ　（配列番号：１０７）および３’　ＣＧＡＴＴＧＴＴＴＧ ＧＣＴＴＴＡＣＡ　（配列番号：１０８）。本発明の特定の態様では、これらの プライマーを鋳型としてのヒトＣＤＮＡとともに用いてクローニングに適したヒ トＮＴ−４遺伝子の断片を作製することができる。

ＮＴ−４に関連する誘導体、類似体およびペプチドの製造および使用も意図して おり、本発明の範囲内にある。所望の神経栄養活性、免疫原性または抗原性をも つこのような誘導体、類似体またはペプチドは例えば治療、またはイムノアッセ イ、免疫感作などに使用できる。ＮＴ−４に関連する誘導体、類似体またはペプ チドは当業界で公知の方法により所望の活性を試験できる。

本発明のＮＴ−４関連誘導体、類似体およびペプチドは当業界で公知の各種方法 により製造できる。その製造をもたらす操作は遺伝子またはタンパク質レベルで 行うことができる。例えば、クローン化ＮＴ−４遺伝子は当業界で公知の多数の 方法により修飾できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　１９８２．　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ。

ｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。ＮＴ−４配列はインビトロで適当な部位で制限酵素 により切断し、次いて所望の場合にはさらに酵素による修飾を行った後切断し、 単離し、そしてライゲートする。ＮＴ−４に関連した誘導体、類似体またはペプ チドをコードする遺伝子の作製においては、所望のＮＴ−４特異的活性がコード される遺伝子領域で、修飾遺伝子がＮＴ−４と同じ翻訳読み枠を保持し、翻訳停 止シグナルによって中断されないように注意すべきである。

さらに、ＮＴ−４遺伝子はインビトロまたはインビボで突然変異を起こさせて翻 訳、開始、および／または停止配列を創製および／または破壊し、あるいはコー ディング領域内で変異体を作製し、および／または新しい制限酵素部位を作製し 、または既に存在する該部位を破壊してさらにインビトロの修飾を容易にするこ とができる。当業界で公知のあらゆる突然変異誘発法を用いることができ、これ にはインビトロ部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、Ｃ，ｅｔ　ａ ｌ、、１９７８．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５３：６５５１）　、　ＴＡＢ 　リンカ−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用などを含むが、これに限定されない。

以下に記載するように、ＮＴ−４のプレプロまたは成熟コーディング領域を用い てニューロトロフィンに基づくキメラ遺伝子を構築できる。例えば、ＮＧＦ、Ｂ ＤＮＦおよびＮＴ−３を含む（しかし、これに限定されない）ニューロトロフィ ン遺伝子は、二二一口トロフィンプレブロ／ＮＴ−４成熟コーデイング領域キメ ラ遺伝子構築のためのプレプロ領域を提供することができる。

ＮＴ−４配列の操作はタンパク質レベルででも実施できる。臭化シアンによる特 異的化学切断、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｎ 　ａ　Ｂ　Ｈ＊、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在 下における代謝合成を含む（しかし、これに限定されない）公知の方法により多 数の化学修飾を実施できる。

さらに、ＮＴ−４関連の類似体およびペプチドは化学合成できる。例えば、所望 のニューロトロフィン活性を媒介するＮＴ−４の一部に対応するペプチドをペプ チド合成機を用いて合成できる本発明はまた、卵巣／卵母細胞の機能障害に関連 する受精障害の治療法を提供する。以下の実施例、特にセクション７に示すよう に、ＮＴ−４は卵母細胞の成熟に関与する。セクション７．３の考察から検証さ れるように、ＮＴ−４は卵母細胞によって生産され、成熟卵母細胞よりも未成熟 卵母細胞中で濃縮され、卵形成にある役割を果たすように思われる。卵巣におけ るＮＴ−４タンパク質の推定上の機能は、卵黄産生前および初期／中期の卵黄産 生卵母細胞において起こる現象と関連するように思われる。

ＢＤＮＦ／ＮＧＦ／ＮＴ−３遺伝子フアミリーの他のメンバー、特にＮＧＦが減 数分裂成熟に関与することが確立されている（Ｎｅｂｒａｄａ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９９１．５ｃｉｅｎｃｅ　２５２：５５８−５６３）　ｏ　ＮＴ　−４はＮ ＧＦと似た性質を示す（下記のセクション６参照）ので、卵母細胞の発生制御に 関与する因子として使用できる。これらのＮＴ−４の性質は受精障害および／ま たは卵形成に関連する他の卵巣障害の治療法の提供に利用できる。

したがって、本発明によると、薬理学的に有効な担体中の治療的有効量のＮＴ− ４またはＮＴ−４関連ペプチドを投与することからなる、受精障害および／また は他の卵巣障害の治療法を提供する。治療的有効量とは卵母細胞の正しい成熟お よび／または排卵を誘導する量である。例えば、治療的有効量は、約１〜ｌｏ。

Ｘｌ０−”Ｍの濃度でＮＴ−４の循環血清濃度を維持するのに十分な量である。

さらに有効な用量を樹立するのは当業者のなしうろことである。

本発明の各種態様においては、ＮＴ−４タンパク質、ペプチド断片または誘導体 が、外傷、手術、虚血、感染、代謝疾患、栄養失調、悪性腫瘍または毒物によっ て神経系が障害を受けた患者に投与される。本発明は特に、障害が基底前脳、海 鳥または線条体のニューロンで起こる症状の治療に使用できる。さらに、本発明 は、障害または変性がを髄感覚ニューロン、聴覚、味覚、視覚、平衡などに関与 する頭蓋感覚ニューロン、運動ニューロンまたは網膜細胞に起こる症状の治療に 、治療的有効量のＮＴ−４タンパク質またはペプチド断片または誘導体を投与す ることにより治療するのに使用できる。このような使用は網膜剥離、加齢による またはその他の黄斑障害、光調腹痛、手術誘導網膜症、未熟児網膜症、ウィルス 性網膜症、葡萄腹痛、静脈または動脈閉塞あるいはその他の血管障害による虚血 性網膜症、眼の外傷または穿通性障害による網膜症、末梢ガラス体網膜症または 遺伝的網膜変性を含むが、これに限定されない。

本発明の特定の態様では、ＮＴ−４を網膜の後板神経節中のニューロンを含む（ ただしこれに限定されない）障害を受けた感覚ニューロンに局部投与できる。Ｎ Ｔ−４関連ペプチドまたはＮＴ−４タンパク質を、障害を受けた神経の近くにう めこむように、膜（例えば、シラスティック（ｓ　ｉ　ｌａｓ　ｔ　ｉ　ｃ）　 Ｍ）への吸着により投与することが好ましい。本発明はまた、例えば末梢神経障 害に悩む患者の回復を速めるのにも使用できる。

本発明の別の態様では、ＮＴ−４タンパク質またはペプチド断片またはそれに由 来する誘導体は、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン−プラス症 候群（パーキンソン症候群がドーパミン作動性ニューロンの変性により出現した もの）、進行性核上麻痺（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−０１ｓｚｅｗ ｓｋｉ症候群）、オリブ橋小脳皮質萎縮（ＯＰＣＡ）、シャイードラガー症候群 （多発系萎縮）、およびグアマニアン・パーキンソン痴呆症候群、およびハンチ ントン舞踏病を含む（ただしこれに限定されない）先天性の疾患または神経変性 障害の治療に使用できる。特に本発明は、感覚神経機能障害および網膜の変性疾 患と関連する先天性または神経変性障害の治療に使用できる。例えば、本発明の ＮＴ−４タンパク質、またはペプチド断片、または誘導体は、幾つかの例を挙げ ると網膜病変を伴う遺伝性痙縮対麻痺（クジニリンおよびパーナート・ショルッ 症候群）、色素性網膜症、スターガルト病、アッシャ−症候群（先天性聴覚喪失 を伴う色素性網膜症）、およびレフサム症候群（色素性網膜症、先天性聴覚喪失 、および多発神経病）の治療に使用できる。ＮＴ−４合成または応答性の欠失が 、網膜病変とその他の感覚機能障害との組み合わせによって特徴づけられる症状 の潜在的病因である可能性がある。

本発明の特定の態様では、ＮＴ−４タンパク質、またはペプチド断片またはそれ に由来する誘導体は、アルツハイマー病および／またはパーキンソン病の治療時 に組織の外科移植とともに用いることができる。下記のセクション１８に議論す るように、ＮＴ＝４は用量依存的に黒質のドーパミン作動性ニューロンの生存を 促進するのに使用でき、これはパーキンソン病を含む（ただしこれに限定されな い）ＣＮＳドーパミン作動性ニューロンの障害治療にＮＴ−４が使用できること を支持する。さらに、ＮＴ−４はＣＮＳコリン作動性ニューロン、特に基底前脳 コリン作動性ニューロンの生存を維持する（セクション１７）ことが観察され、 これはＮＴ−４がアルツハイマー病を含む（ただしこれに限定されない）コリン 作動性ニューロンの障害治療に使用できることを示唆する。パーキンソン病患者 のうちの約３５％がアルツハイマー型の痴呆に悩んでいることが示されているが 、本発明で生産されるＮＴ−４がこの複合疾患の有用な単独治療剤であることが 証明される。同様に、本発明で生産されるＮＴ−４はダウン症候群と組合わさっ たアルツハイマー病の治療に使用することができる。

本発明で生産されるＮＴ−４は先天性学習障害ならびに各種痴呆症の治療に使用 できる。

本発明の特定の態様では、ＮＴ−４タンパク質またはペプチド断片またはそれに 由来する誘導体は、ハンチントン舞踏病、線条体黒質変性および脳麻痺を含む（ ただしこれに限定されない）線条体細胞の関与する疾患または障害の治療に使用 できる。このことは、カルビンジン免疫反応性の増加およびＧＡＢＡの高親和性 取り込みによって示されるように、線条体培養を支持するＮＴ−４の能力を示す 本明細書の開示（セクション１９）に基づく。ハンチントン舞踏病患者の線条体 では、カルビンジンおよびカルビンジンｍＲＮＡの劇的な減少が検出されている （Ｋｉｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、５２５：２０９−２１４　（１９９０）；　Ｉａｃｏｐｉ ｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８７ ：４０７８−４０８２　（１９９０））。

本発明の別の態様では、ＮＴ−４タンパク質またはペプチド断片またはそれに由 来する誘導体は、線条体または海鳥細胞の損傷または変性に関連するその他の疾 患または障害の治療に使用できる。このような疾患または障害は例えば発作、虚 血、低血糖症または低酸素症によって引き起こされる。

本発明のさらに別の態様では、ＮＴ−４はてんかん関連またはその他の急発作の 治療に投与できる。阻害性伝達体ＧＡＢＡ濃度の減少が急発作と関連することが 知られている。例えば、ＧＡＢＡ濃度を減少させる高用量のペニシリンを実験的 巣条てんかんを誘導するのに使用できる。線条体黒質領域へのＧＡＢＡアゴニス トであるマスシモル（ｍｕ　ｓ　ｃ　ｉｍｏ　１）の投与が、電気刺激によって 誘導された運動性および波性急発作を顕著に抑制する（電位測定法で測定して） ことが知られている（ＭａＮａｍａｒａ、　Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　 Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　４：２４１０−２４１７）　ｏ　したがって、本発 明は、ＧＡＢＡ濃度を増強しこれにより急発作の運動性発現の予防を行うために ＮＴ−４を含むニューロトロフィン類を使用することを意図する。

適当な薬理学的担体中に製剤化されるＮＴ−４またはＮＴ−４関連ペプチドの有 効投与量を、注入（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下など）を含む（ただ しこれに限定されない）適当な経路により、上皮または皮膚の粘膜内膜（例えば 、口腔粘膜、直腸または腸粘膜など）を通しての吸収により投与できる。

さらに、ＮＴ−４またはＮＴ−４ペプチドは、担体または標的分子（例えば、抗 体、ホルモン、成長因子など）と結合した適当な薬理学的担体中に、および／ま たはインビボ投与の前にリポソーム、マイクロカプセル、および除放性製剤中に 導入することができる。

下記の「材料および方法」のセクション８に示す方法により、それぞれのゲノム およびｃＤＮＡクローンを単離するために、それぞれの哺乳動物ＮＴ−４ＤＮＡ 配列を２ｔｐ−標識プローブとして用いることができる。ラットＮＴ−４および ヒトＮＴ−４遺伝子断片を直接に（”Ｐ−標識プローブとして）または間接に（ 下記のＰＣＲ法を行うため）用いて、ｒＮＴ−４およびｈＮＴ−４コーデイング 領域の７アミノ酸挿入物の特有な性質、あるいはラットまたはヒトＮＴ−４コー ディング領域の別の特有な面に基づいて、他の哺乳動物のＮＴ−４ゲノムおよび ｃＤＮＡクローンを単離できる。

ラットおよびヒトＮＴ−４配列で開示された情報によって単離されたいかなる哺 乳動物ＮＴ−４遺伝子も、アフリカッメガエルＮＴ−４について論じられた各種 操作（ただしこれに限定されない）に用いることができる。例えば、実施例セク ション９に記載するように全長遺伝子の性状決定を行った後に、哺乳動物ＮＴ− ４のタンパク質およびペプチドを、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９０１０４９１６　 （１９９０年８月２９日出願、ＷＯ９１１０３５６９として公開）に記載される それぞれの哺乳動物ＮＴ−４分子を用いる原核または真核発現系により、あるい は以下（セクション６．２．４および図５参照）に記載のＣＯ８細胞中の一過性 発現により、生産できる。アフリカッメガエルＮＴ−４について以下に記載する ような哺乳動物ＮＴ−４の他の機能は、神経系細胞、特に後板神経節または神経 ブラコード誘導体の細胞（例えばセクション６、　２．　４および図６参照）（ ただしこれに限定されない）の成長および／または生存促進、卵巣／卵母細胞機 能障害に関連する受精障害の治療（セクション７参照）、非形成に関連する不妊 障害および／またはその他の卵巣機能障害の治療（セクション６参照）、運動ニ ューロン疾患の治療（セクション１０参照）、良性前立腺肥大などの上皮過形成 （セクション１０参照）、前立腺機能に関連するインポテンツの治療（セクショ ン１０参照）を含むが、これに限定されない。したがって、医薬組成物を提供す るために適当な薬理学的担体中に製剤され上記障害の治療に用いる治療的有効量 の哺乳動物ＮＴ−４を、注入（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下など）を 含む（ただしこれに限定されない）適当な経路により、上皮または皮膚粘膜内膜 （例えば、口腔粘膜、直腸または腸粘膜など）を通しての吸収により投与できる さらに、ラット、ヒトまたはその他の哺乳動物ＮＴ−４またはＮＴ−４ペプチド は、担体または標的分子（例えば、抗体、ホルモン、成長因子など）と結合した 適当な薬理学的担体中に、および／またはインビボ投与の前にリポソーム、マイ クロカプセル、および徐放性製剤中に導入することができる。

さらに、ＮＴ−４をコードする核酸、およびタンパク質、ペプチド断片、または それから生産される誘導体、ならびにＮＴ−４タンパク質に対する抗体、ペプチ ドまたは誘導体に関する本発明は、ＮＴ−４発現パターンの変調に関連する神経 系の疾患および障害の進展の診断またはモニターに利用できる。このような変調 は正常な患者、好ましくは患者から採取した試料、または同じ患者から以前に採 取した試料中の発現を減少または増加させる。

本発明の各種態様では、ＮＴ−４遺伝子および関連核酸配列およびサブ配列はそ の相補的配列も含めて診断用ハイブリダイゼーションアッセイに用いることがで きる。約１５アミノ酸からなるＮＴ−４核酸配列またはそのサブ配列をハイブリ ダイゼーションプローブとして使用できる。ハイブリダイゼーションアッセイは Ｎ　Ｔ　−４濃度の変化と関連する症状、障害または疾患状態の検出、予知、診 断またはモニターに使用できる。例えば、実施例セクション１０に示すデータは 、骨格筋ならびに前立腺、胸腺および精巣中のヒトＮＴ−４の組織特異的発現を 開示する。筋肉組織中のヒトＮＴ−４の発現レベルが神経障害の存在または不在 を示唆する。したがって、患者の組織試料からのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡまたは全 ＲＮＡを用いて骨格筋組織中のヒトＮＴ−４ｍＲＮＡの存在をアッセイできる。

さらに、実施例セクションＩＯに示すデータは、ヒト前立腺中のＮＴ−４の組織 特異的発現を開示する。

ＮＴ−４またはその一部をコードするＤＮＡ配列は、ＮＴ−４タンパク質または ペプチドと同様に前立腺疾患の治療薬として使用できる。

同様の方法において、診断アッセイは免疫アッセイであってもよい。したがって 、ＮＴ−４濃度の変化に関連する症状、障害または疾患状態の検出、予知、診断 またはモニターを行うために、患者からの試料中のＮＴ−４濃度を定量化するた めの免疫アッセイに抗体を使用できる。

使用できる免疫アッセイは、例を挙げるとラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（ 酵素結合イムノソルベントアッセイ）、サンドイッチイムノアッセイ、沈降反応 、ゲル拡散沈降反応、イムノ拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、 イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロティンＡイムノア ッセイ、およびイムノ電気泳動アッセイなどの方法を用いる競合および非競合ア ッセイ系を含むが、これに限定されない。

結合ドメインを含む抗ＮＴ−４抗体断片または誘導体もこのようなアッセイに使 用できる。

分子のイディオタイプを含む抗体断片を公知の方法で作製できる。例えば、この ような断片は、抗体分子のペプシン消化により作製されるＦ　（ａｂ’　）　２ 断片、ジスルフィド架橋の還元により作製されるＦａｂ’　断片、および抗体分 子をパパインおよび還元剤で処理することにより作製されるＦａｂを含むが、こ れに限定されない。

診断キットも提供する。例えば、このようなキットは適当な容器中にＮＴ−４特 異的プローブを含む。ある態様では、プローブはＮＴ−４に特異的な抗体である 。別の態様では、プローブはＮＴ−４核酸配列とハイブリダイズしつる核酸（分 子プローブ）である。プローブを検出可能なように標識するが、あるいはキット はさらにプローブの標識した特異的結合パートナ−を含む。

上記のハイブリダイ−ジョンアッセイおよびイムノアッセイは、障害、特に運動 ニューロン疾患の治療の前後における患者試料中の濃度と比較することにより、 治療効力の指標としてＮＴ−４濃度を定量化するのにも使用できる。

同様の方法で、骨格筋組織中のＮＴ−４ｍＲＮＡの発現は、そのような治療を必 要とする患者に、運動ニューロンの生存、成長および／または分化を支持するの に有効な量のＮＴ−４因子を投与することからなる運動ニューロン障害の治療法 を提供する。

ヒト筋肉中のＮＴ−４ｍＲＮＡの発現は、さらにニューロン障害の診断および治 療手段を示唆する。中枢および末梢神経系の双方でＮＴ−４の逆行性軸索輸送が 示されている（下記のセクション１４参照）。ＮＴ−４の特異的逆行輸送を、正 常または疾患状態においてニューロンがＮＴ−４に応答性であるが否かを示唆す るのに使用できる。したがって、本発明は検出しつるように標識されたＮＴ−４ タンパク質またはペプチドを神経に注入し、標識ＮＴ−４タンパク質またはペプ チドが逆行輸送されるが否かを判定し、ここで逆行性輸送の欠失はＮＴ−４への 応答性の欠失と正の相関関係にあり、そしてＮＴ−４関連の神経系障害の存在を 示唆することになる、ＮＴ−４関連運動ニユーロン、中枢および末梢神経系障害 の診断法を提供する。逆行輸送の評価は、ＭＲＩ、ＣＡＴ、またはシンチレーシ ョンスキャニングを含む（ただし、これに限定されない）公知の方法で実施でき る。逆行輸送は病変部に到達すると実質的に減少するので、このような方法を用 いて神経系病変部を同定できる。

本発明はさらに、容器中に検出しうるように標識されたＮＴ−４タンパク質、誘 導体または断片を含む逆行性評価のためのキットを提供する。このような標識は 放射性同位体または当業界で公知の他の標識である。

本発明は、ＮＴ−４発現のパターンの変調に関連する、あるいはＮＴ−４または 抗ＮＴ−４抗体（または結合ドメインを含むその断片）にさらすことにより改善 されつる神経系の疾患および障害の治療に使用できる。我々はヒトＮＴ−４が骨 格筋で発現されることを示す（以下の実施例セクション１０参照）。この発見に 基づき、本発明は運動ニューロン障害の治療法を提供する。広範囲の神経学的障 害が運動ニューロンに影響する。例えば、上部運動ニューロンは主として脳血管 性事故、新生物、感染および外傷によって影響を受ける。下部運動ニューロン、 または射角細胞はこれらの過程により二次的に影響されるが、さらに筋萎縮性側 索硬化症、幼児性および若年性を髄筋萎縮、灰白髄炎およびポリオ後症候群、遺 伝性運動および感覚神経障害、および毒性運動神経障害（例えば、ビンクリスチ ン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ））を含む、射角細胞欠失が主要な特徴である多数 の障害の対象ともなる。本発明によって治療しうる運動ニューロン障害は前記の ものを含むが、これに限定されない。使用しうるＮＴ−４タンパク質、誘導体、 断片またはこれに対する抗体の製剤化法および投与は前記のものまたは当業界で 公知のものを含むが、これに限定されない。

本発明はまた、５０歳以上の男性にょくみられるが、十分に解明されていない症 状である良性前立腺肥大（ＢＰＨ）の治療にも使用しうる。ＢＰＨの過程での前 立腺の増殖は、オートクリンルーブ現象によるＮＴ−４などの成長因子によって 誘導される。ＮＴ−４の合成と分泌に続いて前立腺細胞膜上の特異的レセプター を介してＮＴ−４が前立腺細胞に輸送される。オートクリンルーブが各種成長因 子分子および腫瘍細胞系で同定されている。ある場合には、これらのオートクリ ンルーブは、オートクリンループを破壊するためのアンチセンス法の使用によっ て実験的に同定されている。したがって、本発明の治療的応用はヒトＮＴ−４ま たはその一部に対する核酸アンチセンスを用いて前立腺中でのＮＴ−４ｍＲＮＡ の転写を阻害することを含む（使用する方法については、同時継続中の１９９１ 年７月３日出願の米国特許出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、０７／７２８．７８４−そ のすべてを参照としてここに包含する−を参照）。例えば、正常な患者の前立腺 中でのＮＴ−４遺伝子の転写レベルに比較して、前立腺組織中でのＮＴ−４遺伝 子の転写増大を特徴とする前立腺局在疾患に悩む患者に、前立腺疾患、好ましく は良性前立腺肥大を治療するための有効量のオリゴヌクレオチドを投与すること ができる。オリゴヌクレオチドは少なくとも６ヌクレオチドの長さであり、ＮＴ −４遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的であり、したがってＮＴ− ４転写物とハイブリダイズしうるものでなければならない。さらに、前立腺細胞 膜上の特異的レセプターとのＮＴ−４の結合を阻害するために、抗ＮＴ−４抗体 を使用できる。治療的有効量のＮＴ−４アンチセンス核酸または抗ＮＴ−４抗体 は上記したいずれの方法によって投与してもよい。

本発明はまた、前立腺関連の機能障害、特にインポテンツの治療にも使用できる 。このような疾患は直接または間接的に前立腺中でのＮＴ−４のレベルが不十分 な結果起こりうる。したがって、治療的有効量のＮＴ−４タンパク質または機能 的断片または誘導体の投与によるインポテンツ患者の機能障害の検出ならびに治 療は、上記したいずれの方法で投与してもよい。

本発明はヒト胸腺組織中でのＮＴ−４発現の検出を開示する。

じたがって、本発明は、重症性筋無力症、神経筋接合部での後シナプス皺襞中に おけるアセチルコリンレセプター（ＡＣｈＲ）と関連する後天性自己免疫疾患を 含む（ただしこれに限定されない）神経筋伝達体に影響する免疫学的障害の治療 にも使用できる。

この疾患は、ＡＣｈＲに特異的な抗体の結合による後シナプスＡＣｈＲまたは筋 膜の阻害による虚弱および筋肉疲労として現れる（例えば、Ｄｒａｃｈｍａｎ、 　１９８３．　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　６：４４６−４５１）　ｏ このような免疫的に媒介される神経障害の治療は、ＮＴ−４タンパク質またはＮ Ｔ−４の機能的断片または誘導体を上記したいずれかの方法によって投与する治 療用途を含む。

本発明はこのような治療を必要とする患者に、インビトロ培養系で示される運動 ニューロンの生存、成長および／または分化を支持できる有効量のＮＴ−４タン パク質、誘導体またはペプチド断片を投与することからなる運動ニューロン障害 の治療法を提供する。

異なる組織源由来の、または異なる種由来の運動ニューロンは神経栄養因子に対 して異なる感受性を示すので、インビトロの態様では、有効量の神経栄養因子は ケースバイケースで決定される。特定の培養では、神経栄養因子濃度と運動ニュ ーロン応答性とを相関させる用量応答曲線を作成することが好ましい。運動ニュ ーロンの生存、成長および／または分化を評価するには、例えば生存を評価する ためのバイタル染色、位相差顕微鏡および／または神経突起発芽を測定するため の神経フィラメント染色、あるいはコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ ）などの運動ニューロン関連化合物の生物活性を測定する方法、あるいは当業界 で公知の他の方法を用いて、ＮＴ−４タンパク質、誘導体またはペプチド断片に さらした運動ニューロンと、ＮＴ−４タンパク質、誘導体またはペプチド断片に さらさなかった運動ニューロンとを比較することができる。ＣＡＴ活性は例えば 、約０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ 　（ｐＨ８，６）溶液中で処理済みおよび未処理の運動ニューロンを回収および 溶解し、数μｌのアリコートをとり出し、そして０．　２ｍｌ［１−Ｃコアセチ ル−ＣｏＡ、３００ｍＭ　ＮａＣ１，８ｍＭ臭化コリン、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、 および５０　ｍＭ　Ｎ　ａ　ＨＩＰ　０４（ｐＨ７，４）バッファー中の０．１ ｍＭネオスチグミンを基質として用いて、Ｍｉｃｒｏ−Ｆｏｎｎｕｍ法（Ｆｏｎ ｎｕｍ、　１９７５．　Ｊ。

Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　２４：４０７−４０９　：そのすべてをここに包含する ）を用いて、ＣＡＴ活性を測定することができる。

本発明の特定のかつ非限定的態様によると、運動ニューロンを以下のようにイン ビトロで調製および培養できる。好ましくはラットなどの胚性動物由来の少なく ともを髄の一部を無菌的に得て、球、感覚神経節および付着髄膜がら分離する。

を髄の腹側切片を、を髄の腹側（前）角に運動ニューロンが位置するように単離 する。腹側を髄切片を小片に切り、カルシウムおよびマグネシウム不含リン酸塩 溶液（ＰＢＳ）中の約０．　１％トリプシンおよび０．０１％デオキシリボヌク レアーゼｌ型中で、３７℃、約２０分インキュベートする。次いでトリプシン溶 液を除去し、細胞をすすぎ、４５％イーグルの最少必須培地（ＭＥＭ）　、４５ ％Ｈａｍの栄養混合物Ｆ１２．５％熱不活性化ウシ胎児血清、５％熱不活性化ウ マ血清、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリンＧ（０，５Ｕ／ｍ＋）およびストレ プトマイシン（０，５ｇ／ｍｌ）などの新鮮培地中におく。組織をパスツールピ ペットでおだやかに機械的に砕いて解離させ、上清を集めてナイロンフィルター （例えば、Ｎ１ｔｅｘ、Ｔｅｔｋｏ：４０ｍ）で濾過する。濾過した細胞上清を 次いで５ｃｈｎａａｒおよび５ｃｈａｆ　ｆｎｅｒ　（１９８１゜Ｊ、　Ｎｅｕ ｒｏｓｃｉ、　１：２０４−２１７）の記載する方法の変法を用いて分画する。

すべての工程は４℃で行うのが好ましい。メトリザミド（ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄ ｅ）をＦ１２：ＭＥＭ培地（１：　Ｌ）中に溶解し、１８％メトリザミドクッシ ョン（例えば０．５ｍ１）、３ｍｌの１７％メトリザミド、３ｍｌの１２％メト リザミドおよび３ｍｌの８％メトリザミドからなる不連続グラジェントを作成す る。濾過した細胞上清（例えば２．５ｍ１）を段階的グラジェント上に重層し、 スイングアウトローター（例えばＳｏ　ｒｖａ　１１ＨＢ４）を用いてチューブ を２５００ｇ５１５分遠心する。遠心により細胞の３層が得られると予期される ：フラクションＩ　（０−８％の界面）、フラクションｎ（８−１２％の界面） およびフラクションＩ（１２−１７％の界面）。運動ニューロンに富むフラクシ ョンＩを少Ｊ！［（例えば約１ｍ１）取りだし、グルタミン（２ｍＭ）、インシ ュリン（５ｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００ｇ／ｍｌ）、プロゲステロン （２０ｎＭ）、プトレシン（１００Ｍ）および亜セレン酸ナトリウム（３０ｎ　 ＭＳＢｏｔｔｅｎｓｔｅｌｎ　ａｎｄ　５ａｔｏ、　１９７９．　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６：５１４−５１７参照）を補 充した５０％Ｆ１２および５０％ＭＥＭなどの血清不含規定培地で２回すすぐ。

次いでトリバンブルーの存在下で生存細胞数を血球針で計数する。運動ニューロ ンに富む細胞懸濁液を、ポリＬ−オルニチン（例えば１０ｇ／ｍｌ）およびラミ ニン（例えば１０ｇ／ｍｌ）でプレコートした組織培養皿（好ましくは６ｍｍ） 中に約１００，０００細胞／ｃｍ２の密度で播く。ＮＴ−４タンパク質、誘導体 またはペプチド因子を次いで加える。例えば特定の態様では、ＮＴ−４は最終濃 度が約０．０１から１１００ｎ／ｍｌ、好ましくは約５０　ｎ　ｇ／ｍ　Ｉとな るように加える。

次いで運動ニューロン培養物を３７℃、９５％空気５％ＣＯ２中、およそｌＯＯ ％相対湿度で血清不含規定培地中に維持する。

本発明の別の態様では、バクテリオファージＨＧ７−２、ＨＣ４−２および／ま たはＨＣ２−１などの中に含まれたＮＴ−４関連組換え核酸配列を用いてキメラ プレプロ／成熟ＮＴ−４遺伝子を構築できる。例えば、成熟ＮＴ−４タンパク質 、誘導体またはペプチド断片をインビボまたはインビトロで発現させることを望 む場合には、神経栄養遺伝子のプレプロ領域をＮＴ−４関連配列の成熟コーディ ング領域と融合させることができる。プレプロ領域を提供することができる神経 栄養遺伝子は、ＮＧＦＳＢＤＮＦおよびＮＴ−３を含むが、これに限定されない 。このようなキメラ構築物は野生型ＮＴ−４ｍＲＮＡ転写物と比較してキメラｍ ＲＮＡ転写物の安定性増強を促進し、翻訳効率を増加し、あるいは成熟で生物活 性なニューロトロフィンタンパク質またはペプチド断片へとタンパク質分解プロ セシングを受けるためにより適した鋳型を作製し、それによって発現を増強する ことができる。ＮＧ　Ｆ　（Ｓｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｎａｔ ｕｒｅ　３０２：５３８−５４０；　Ｕｌｌｒｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８ ３．　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：８２１−８２５）　、ＢＤＮＦ　（Ｌｅｉｂｒｏ ｃｋ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８９、　Ｎａｔｕｒｅ　３４１：１４９−１５２）およびＮＴ　−３（Ｈｏ ｈｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０、　Ｎａｔｕｒｅ　３４４：３３９−３４１； 　Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２ ４７：１４４６−１４５１；　Ｅｒｎｆｏｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：５４５４−５ ４５８；　Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｎｅｕｒｏｎ　 ４ニア６アー７７３）などのその他のニューロトロフィン遺伝子のＤＮＡ配列、 ならびに融合体を作製するための方法指針（例えば、Ｄａｒｌｉｎｇ　ｅｔａｌ 、、　１９８３．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕ ｍ　Ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４８：４２７−４３４；　Ｅｄｗ ａｒｄｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６ ３：６８１０−６８１５；　５ｕｔｅｒ　ｅｔ　ａｌｌ、　１９９１．　ＥＭＢ ＯＪ、　１０：２３９５−２４００）があれば、当業者はこのようなキメラ核酸 配列を構築するのに必要な知識を有している。別の態様では、バクテリオファー ジＨＧ７−２、ＨＯ２−２およびＨＯ２−１などの中に含まれるＮＴ−４関連組 換え核酸のプレプロ領域を、他のニューロトロフィンの成熟領域と融合するキメ ラ構築物も上記のように他の二二一口トロフィンの効率的な発現を促進するのに 使用できる。

本発明はＮＴ−４活性を検出または測定する方法も提供する。

実施例１２に記載するように、ｔｒｋＢがＮＴ−４の機能的受容体であることを 我々は見いだした。この知見に基づき、本発明は、ｔｒｋＢを発現する細胞を試 験薬剤にさらし、そして試験薬剤のｔｒｋＢへの結合を検出または測定すること からなり、ここでｔｒｋＢへの特異的結合が試験薬剤中のＮＴ−４活性と正に相 関する、ＮＴ−４活性の検出または測定法を提供する。特定の態様では、ｔｒｋ Ｂを発現する細胞は、細胞の生存がニューロトロフィン−４またはＢＤＮＦにさ らすことに依存性であるような、組換えｔ　ｒｋＢを発現する３Ｔ３繊維芽細胞 などのトランスフェクションされた細胞である。したがって試験薬剤の結合の検 出は、このようなトランスフェクションされた細胞の生存を観察することによっ て実施できる。

６、実施例：神経成長因子ファミリーの進化的研究がアフリカッメガエル卵巣に 多く発現する新規メンバーを解明するヒト白血球から、ならびにスブラーグ・ド ーレイラット、カエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ）およびエイ（Ｒａｊａ 　ｃＩａｖａｔａ）の肝臓から標準法（Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６ ．　”ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ ″、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）によってゲノムＤＮＡを単離し た。ゲノムＤＮＡはサケ（Ｓａｌｍｏｎ）およびエレファントスネーク（Ｖｉｐ ｅｒａ　１ｅｂｅｔｉｎａ）からも得た。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ガラ スフックで回収し、８０％エタノールで洗浄し、乾燥して水中に最終濃度が１ｍ ｇ／ｍｌとなるように溶解した。サケＤＮＡ　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、Ｓ　ｔ、Ｌｏ ｕ　ｉ　ｓ、ＭＯ）を水に溶解し、フェノールで２回、クロロホルムで１回抽出 し、エタノールで沈殿させた。

アミノ酸ＫＱＹＦＹＥＴ　（配列番号：１１０）（５°−オリゴヌクレオチド） およびＷＲＦＩＲＩＤ（配列番号：１１１）（３゛−オリゴヌクレオチド）（図 ＩＡ）に対応するすべての可能なコドンを表す２８−ｍｅｒのオリゴヌクレオチ ドの６つの混合物をＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ａ３８１　ＤＮＡ合 成機で合成した。５′オリゴヌクレオチドは合成ＥｃｏＲＩ部位を含み、３゛オ リゴヌクレオチドは合成Ｈｉｎｄｌ１１部位を含んでいた（Ｋｎｏｔｈ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９８８．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６：１０９３； 　Ｎｕｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６ ３：３２４０−３２４９）　ｏオリゴヌクレオチドの各混合物をプライマーとし て用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒ ｏｍａｇａ）（Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２３ ０：１３５０−１３５４）によるゲノムＤＮＡ０．８ｇの増幅を行った。ＰＣＲ 産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、２％アガロースゲルで分析し 、プラスミ　ドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ”（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｓ　Ｌ ａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にクローン化した。増幅領域およびプラスミドの大きさ は、ＮＧＦでは１７９塩基対（ｂ　ｐ）　、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３では１８２ ｂｐであった。いくつかの場合において内部ＥｃｏＲＩ部位の結果として、１４ ４ｂｐおよび９５ｂｐの短い断片も単離した。クローン化ＤＮＡ断片を、Ｔ７　 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ）を用いるジデオキ シヌクレオチド鎖末端法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７７、　Ｐｒｏ ｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３−５４６７）によ り配列決定した。各遺伝子および種について２〜２０の独立クローンを配列決定 し、合計で２００以上の独立クローンを配列決定した。

ファージμＥＭＢＬ−３のＢａｍＨ１部位中のＭｂｏｌ消化したゲノムＤＮＡを 挿入することにより調製したアフリカッメガエルゲノムライブラリーからのおよ そ２，０００．０００クローンを、ニックトランスレーションにより約５　ｘ　 ｌ　Ｏ’　ｃ　ｐｍ／ｇの比活性に［３２Ｐ］　ｄＣＴＰで標識したアフリカッ メガエルＮＴ−４の１８２ｂｐのＰＣＲ断片を用いて定法でスクリーニングした ０ハイブリダイゼーシヨンは４ＸＳＳＣ（ＩＸＳＣＣは１５０ｍＭ　ＮａＣ１， １５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）である）、４０％ホルムアミド、１ ×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン中で４２℃で実施した。フィルター をＯ，ｌＸ５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ、５５℃で洗浄し、Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−５ フイルムに一７０°Ｃで露光した。８個のファージクローンを単離し、そのうち の１個からハイブリダイズする１、５ｋｂのＰｓｔＩ断片をプラスミドｐＢＳ− ＫＳ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。サブクローン化断片 のヌクレオチド配列をジデオキシ鎖末端法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９７７、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５ ４６３−５４６７）によって決定した。

６．１．３．配列データのコンピューター分析表１に示すＤＮＡおよびアミノ酸 配列の比較および並列化を、ＵＷＧＣＧソフトウェア（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８４．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　７２：３８７−３ ９５）を用いるＶＡＸ：Ｉンピューターで実施した。

ＵＷＧＣＧプログラムによるアミノ酸配列の比較の結果を、保存アミノ酸の変化 を考慮に入れながら、配列間のアミノ酸類似性またはヌクレオチド同一性のパー セントとして表した（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ　ａｎｄ　Ｂｕｒｇｅｓｓ、　１９８８ ．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：６７４５−６７６３；　Ｓｃｈ ｗａｒｔｚａｎｄ　Ｄａｙｈｏｆｆ、　１９７９．　”Ａｎ　Ａｔ１ａｓ　ｏｆ 　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ”、　Ｎａ ｔｌ、　Ｂｌｏｍｅｄ、　Ｒｅｓ、　Ｆｏｕｎｄ、、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　 Ｄ、Ｃ，、ｐ、３５３−３５８）。”Ｐａｒｓｉｍｏｎｙを用いる系統発生分析 ″　（ＰＡＵＰバージョン３．Ｏｆ）を用いて系統発生図を作製した（Ｆｅｉｓ ｅｎｓｔｅｉｎ、　１９８８；　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅ、　２２：５ ２１−５５５；　Ｓｗｏｆｆｏｒｄ　ａｎｄ　０１ｓｅｎ、　１９９０．　”Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ″、　Ｈｉｌｌｓ　ａｎｄ　Ｍｏｒ ｉｔｚ編集、　５ｕｎｄｅｒｌａｎｄ、　ＭＡ、、　５ｉｎａｖｅｒ　Ａｓ５ｏ ｃ、、　Ｉｎｃ、　ｐ、４４１−５０１）　ｏ最も可能性のある系統樹の検索は 、網羅的および発見的（樹の枝の交換）アルゴリズムを両方用いて行った。

６、　１．　４．組換えタンパク質の生産、ＰＣＩ２細胞への結合アＣｏＳ細胞 中で組換えタンパク質を一過性発現させるために、適当なりＮＡ断片をベクター ｐ　ＸＭ　（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｃｅ１１４７：３−１０ ）中にクローン化した。ＮＴ−４用にはアフリカッメガエルからの配列決定した １、５ｋｂのＰｓｔＩ断片をｐＸＭ中にクローン化し、ＮＧＦ用にはラットＮＧ Ｆ遺伝子の３′エキソンからの７７１ｂｐのＢｓ　ｔＥＩ　Ｉ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断 片を用いた（Ｈａｌｂｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８８．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍ ｅｎｔ　１０８：６９３−７０４）　。ＢＤＮＦタンパク質を発現させるため、 マウスＢＤＮＦ遺伝子（ｌ（ｏｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

、　１９９０．　ＥＭＢＯＪ、　９：２４５９−２４６４）からのブレプローＢ ＤＮＦを含むＰＣＲ増幅した断片をｐＸＭ中にサブクローン化した。ＮＴ−３用 には、１０２０ｂｐのラットｃＤＮＡをｐＸＭ中に挿入した（Ｅｒｎｆｏｒｓ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　８７：５４５４−５４６８）。

約７０％集密度に増殖したＣＯ８細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ、　１９８１．　Ｃｅ１ １３　：１７５−１８２）を、ＤＥＡＥ−デキストラン−クロロキンプロトコル （Ｌｕｔｈｍａｎ　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、　１９８３．　Ｎｕｃｌ、　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１７：１２９５−１３０５）を用いて１００ｍｍ皿当た り２５ｕｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクシ ョンした細胞を次に完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ３）で増殖させ、トランス フェクションの３日後にならし培地を回収した。並行してトランスフェクション した皿（３５ｍｍ）をトランスフェクション後３夜にわたり２００　Ｃｉ／ｍ　 １　［３ｓＳ］　システィン（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈａｍ、ＵＫ）の存在下に増殖 した。インビボ標識したならし培地のアリコート（各１Ｏ−２０ｕｌ）を１３％ ポリアクリルアミドゲル中の５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ゲルをＥｎＨａｎｃ ｅ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で処理 し、乾燥して、Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ５フィルムに増強スクーンを用いて２４−４ ８時間、８０℃で露光した。オートラジオグラフをＳｈｉｍａｄｚｕデンシトメ ーターでスキャンし、ラットＮＧＦと比較した各タンパク質に対応する領域を計 算することにより各種組換えタンパク質の相対量を評価した。ラットＮＧＦタン パク質の絶対量は、精製マウスＮＧＦの標準を用いるならし培地の定量イムノブ ロッティングにより算出し、その他の組換えタンパク質を含む試料中のタンパク 質濃度を決定するのに用いた。

ＰＣＩ２細胞（Ｇｒｅｅｎｅ　ａｎｄ　Ｔｉ５ｃｈｌｅｒ、　１９７６、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７３：２４２４−２４２ ８）　ヘの組換えタンパク質の結合アッセイのために、マウスＮＧＦをクロラミ ン−Ｔ法により平均活性７ｘｌＯ’ｃｐｍ／ｇに＋２５１で標識した。定常状態 結合は、■×１０’細胞／ｍ　Ｌ　１．　５　ｘ　１０−”Ｍ　＋２’Ｉ　−Ｎ ＧＦ　；および等量のＮＧＦまたはＮＴ−４を含むならし培地の連続希釈物を用 いて３７℃または０℃で行う競合アッセイで測定した。すべての成分を同時に添 加し、平衡に達した後（１−３時間インキュベーション）細胞を遠心で回収した 。疑似トランスフェクションしたＣＯ８細胞からの培地を用いる対照試験は、な らし培地中に存在する他のタンパク質が”Ｊ−ＮＧＦのＰＣ１２細胞への結合に 何ら影響を及ぼさないことを示した。少なくとも１０００倍過剰の非標識ＮＧＦ を添加した並行インキュベーションで非特異的結合を測定した。すべての結果を 、常に全結合の１０％以下である非特異的結合に補正した。

各種タンパク質の生物活性を、等量の組換えタンパク質を含むトランスフェクシ ョンしたＣｏＳ細胞ならし培地の、Ｅ９ニワトリ胚からの移植交換神経、節、お よび後板神経節からの神経突起伸長を刺激する能力によって測定した（Ｅｂｅｎ ｄａｌ、　１９８４．　”Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ 　Ｎｅｕｒａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、　Ｓ、　Ｓｈａｒｍｓ、編集、　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ；　Ｐｌｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、、　ｐ、９ ３−１０７；　Ｅｂｅｎｄａｌ、　１９８９．　”Ｕｓｅ　ｏｆ　ＣｏｌＣｏ１ １ａ　Ｇｅ１ｓ　ｔｏ　Ｂｉｏａｓｓａｙ　Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆｏｃ ｔｏｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ ”＋　Ｒ，Ａ、　Ｒｕｔｈ、編集、　Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ：Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌ ｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　ｐ、８ｌ−９３）　、ならし培地の連続希釈物をアッ セイして繊維の伸長をスコアにした。

６．１．５．ＲＮＡ調製およびプロット分析成体雌アフリカッメガエルからの標 記組織を切り出し、液体窒素中で凍結した。脳およびを髄を回収した。異なるス テージの卵母細胞を含む数葉の卵巣を切り出した。凍結組織試料を４Ｍグアニジ ンイソチオシアネート、０．ＩＭβ−メルカプトエタノール、０．０２５Ｍクエ ン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）中でホモジェナイズし、Ｐｏ１ｙｔｏｎで１５秒 、３回ホモジエナイズした。

各ホモジエネートを０．０２５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５゜５）中の５．７ Ｍ　ＣｓＣｌのクッション４ｍｌ上にのせ、Ｂｅｃｋｍａｎ　５Ｗ４１ｏ−ター て１５℃、３５．００Ｏｒｐｍで７６時間遠心した（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９７９．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７８：５２９４−５２９９ ）。オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィー（Ａｖｉｖ　ａｎｄ　Ｌｅ ｄｅｒ、　１９７２．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ　６９：１４０８−１４１２）によってポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製し、ＲＮＡ 回収物をＲＮＡプロット分析に用いる前に分光光度的に定量した。各試料からの ポリ（Ａ）　＋ＲＮＡ　（１０ｕ　ｇ）を０．　７％ホルムアルデヒドを含む１ ％アガロースゲルで電気泳動した。染色ゲルのＵＶ透視を用いてすべての試料が 似た量の全ＲＮＡを含むことを確認した。次いでゲルをニトロセルロースフィル ターに移した。フィルターを標記のＤＮＡプローブとハイブリダイズした。プロ ーブをニックトランスレーションにより約５ｘｌＯ’ｃｐｍ／ｇの比活性に［” Ｐ］　ａｃｒｐで標識し、またハイブリダイゼーションは以下のように実施した 。フィルターを高ストリンジエンシー（０，１％ｘｓｓｃ、０．１％ＳＤＳ、５ ４℃）で洗浄し、Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フイルムに露光した。

６．２．結果 ヒト、ラット、ヘビ、カエルおよびサカナ由来のＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ− ３をコードするＤＮＡ断片を、上流プライマーとしてリシン５０とスレオニン５ ６の間に、また下流プライマーとしてトリプトファン９９とアスパラギン酸１０ ５の間に位置するこれら３つのタンパク質の保存領域からの縮重プライマーを用 いるＰＣＲ法により単離した（図ＩＡ）。増幅された領域は６個のシスティン残 基のうちの３個を含み、成熟分子の約１／３をカバーする。異なる種由来の既に 性状決定されたＮＧＦ分子中の増幅領域の比較は、これが２つの可変領域、アル ギニン５９からセリン６７まてとアスパラギン酸９３からアラニン９８までを含 むことを示す。親水性配列が分子の表面にさらされると信じられており（Ｂｒａ ｄｓｈａｗ、　１９７８．　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４７：１ ９１−２１６）　、また高保存領域グリシン６８からトリプトファン７６までと スレオニン８５からスレオニン９１までも増幅領域に含まれる。ＢＤＮＦおよび ＮＴ−３分子はマウスＮＧＦタンパク質の９４と９５の間に余分のアミノ酸をも っており、これも増幅領域に含まれる。

マウスＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３タンパク質の全成熟分子の配列を比較し て、増幅領域がどの程度完全分子を表しているかを計算した。全成熟分子はＮＧ ＦとＢＤＮＦの間では６５１５７％類似性（アミノ酸配列類似性／ヌクレオチド 配列同一性）、ＮＧＦとＮＴ−３との間では７０／６１％の類似性、モしテＢＤ ＮＦとＮＴ−３の間では６８１５８％の類似性を示す。この研究で単離した領域 を比較すると、ＮＧＦとＢＤＮＦの間の類似性は６２１５３％、ＮＧＦとＮＴ− ３との間の類似性は６７１５８％、そしてＢＤＮＦとＮＴ−３との間の類似性は ６９／６０％である。これはこの研究で単離した領域が全分子の代表であること 、また各種因子の間の進化関係をモニターするのに用いうろことを示唆する。保 存性アミノ酸置換を考慮に入れ、かっＳ　ｃ　ｈｗａ　ｒｔｚおよびＤａＶｈｏ 　ｆ　ｆ　（１９７９，”Ｉｎ　Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕ ｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｍ、０．　Ｄａｙｈｏｆｆ、編集、 　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，、Ｎａｔｌ、　Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｒｅｓ、　 Ｆｏｕｎｄ、、　ｐ、３５３−３５８）の比較マトリックスを用いて対合配列比 較を行った（表Ｉ）。したがって、以下に記載し表１に示すアミノ酸配列の比較 は、同一性ではなく類似性のパーセントを示す。パーシモニー分析（Ｆｅｌｓｅ ｎｓｔｅｉｎ、　１９８８．　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　２２：５２ １−５６５；　Ｓｗｏｆｆｏｒｄ　ａｎｄ　０１ｓｅｎ、　１９９０．　”Ｉｎ 　Ｍｏ１ｅｃｕｊａｒ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ、　Ｄ、Ｍ、　Ｈｉｌｌｓ　ａ ｎｄ　Ｃ，Ｍｏｒｉｔｚ、編集、　５ｕｎｄｅｒｌａｎｄ　。

、　ＭＡ；　５ｉｎａｕｅｒ　Ａｓ５ｏｃ、、　Ｉｎｃ、、　ｐ、４１１−５０ １）を用いて系統発生相を作製した。以下に示すように、ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよ びＮＴ−３のアミノ酸配列と関連する予測されるアミノ酸配列をもつすべての単 離されたＤＮＡ断片は、保存性のシスティン残基を正しい位置に含んでいた。こ れを神経成長因子遺伝子ファミリーのメンバーとなるための配列の最初の基準と して用いた。

６．２．Ｉ　ＮＣＦ、ＢＤＮＦ及びＨＤＮＦ／ＮＴ−３は進化の間高度に保存さ れている ６、　２．１．　ｌ神経成長因子 ヌクレオチド配列（図ＩＢ［ヒト（配列番号３）、ラット（配列番号４）、ニワ トリ（配列番号５）、ヨーロッパクサリヘビ（配列番号６）、アフリカッメガエ ル（配列番号７）、サケ（配列番号８）］及びＮＧＦをコードする単離されたフ ラグメントの予測されたアミノ酸配列は魚からヒトにいたるまで（図２　［ヒト （配列番号２４）、ラット（配列番号２５）、ニワトリ（配列番号２６）、ヨー ロッパクサリヘビ（配列番号２７）、アフリカッメガエル（配列番号２８）、サ ケ（配列番号２９）　］　）高度に保存されている。はとんどの非保存アミノ酸 変化は可変領域アルギニン５９からセリン６７及びアスパラギン酸９３からアラ ニン９８に見られた（図２）。アフリカッメガエル及びヒトＮＧＦ配列の類似性 は９３／７９％である（表１）。アフリカッメガエル及びニワトリＮＧＦは、１ つのりジン６２からアルギニン６２への保存的変化を除いては同一である。ヨー ロッパクサリヘビ及びサケＮＧＦの配列は、ヒトＮＧＦと比較してそれぞれ１１ 及び１９のアミノ酸の違いを有している（４２中）が、その他の全ての種は４つ の相違を示したに過ぎない。単離されたＮＧＦアミノ酸配列配列ヒトＮＧＦ配列 のグルタミン酸９４とリシン９５との間においてＢＤＮＦ及びＮＴ−３に存在す る余分なアミノ酸残基が存在するものはなかった。

種々のＮＧＦ配列の種間相関を系統樹の構築により分析した（図３Ａ）。サケＮ ＧＦ配列は、その他の種から単離されたＮＧＦ配列よりも分岐が多いようである 。記載したＰＣＲ法によってはエイからＮＧＦ配列は単離できず、これはエイの ＮＧＦ配列が我々のＰＣＲプロトコルで使用したプライマーのミスマツチトレラ ンスを越えているかもしれないことを示唆している。あるいは、軟骨魚−におけ るＮＧＦの不存在が、ＮＧＦは硬骨魚類の進化を導く枝の分岐（約４億５千万年 前）の後であるが、両生類及びさらに高度なを推動物がこの枝から進化する（約 ４億年前）前に出現したことを示しているのかもしれない。

ヌクレオチドの同−性及びアミノ酸の類似性は、Ｓｃｈｗａｒｔｓ及びＤａｙｈ ｏｆｆ　（１９７９，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，Ｎａｔ’ｌ　Ｂｉｏｍ ｅｄ、　Ｒｅｓ、　Ｆｏｕｎｄ。

ｐｐ、　３５３−３５８）の比較マトリックスにより、保存的アミノ酸変化を考 慮に入れて、ＶＡＸコンピュータ（ＵＷＧＣＧからのソフトウェアパッケージ、 Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａ＋、、１９８４．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、１２：　３８９−３９５）により計算した。斜線の下の数字はヌクレオチド 同一性パーセントを示す。斜線の上の数字はアミノ酸類似性パーセントを示す。

×は、配列がそれらの種から単離されなかったことを示す（エイからのＮＧＦ及 びヨーロッパクサリヘビからのＮＴ−３）。Ｈｕｍはヒト、Ｃｈｉはニワトリ、 Ｖｉｐはヨーロッパクサリヘビ、Ｓａｌはサケ、Ｘｅｎはアフリカッメガエルを 示す。

６、２．１．２　脳由来神経栄養因子 ヒトＢＤＮＦのものに類似したＤＮＡ配列は調査した全ての種において発見され た（図ＩＢ［配列番号１〜２１、上記に挙げたもの）。調査した種で最も原始的 なものであるエイとヒトとの間のアミノ酸及びヌクレオチド配列における類似性 は９３／７７％である（表１）。２つの非保存的変化のみが可変領域の外部にお いて見られたが、２つの可変領域においてＩＯの類似した変化が発見された（図 ２）。アフリカッメガエル（配列番号３４）においては、ロイシン９０はコドン の第１の位置におけるＣからＴへの単一の塩基対変異の結果としてフェニルアラ ニンに置き換えられており、サケ（配列番号３５）においては、コドンがＴＧＧ からＴＡＴ　（図ＩＢ［配列番号１４］）に変化する二重の変異の結果として、 トリプトファン７７がチロシンに置き換えられている。全ての単離された配列は 、ＮＧＦ　（図２　［配列番号２４〜２９］）と比較して、９６位置において余 分のアミノ酸残基を含んでいた。最小法（ｐａｒｓ　ｉｍｏｎｙｍｅｔｈｏｄ） により分析すると、異なる種からのＢＤＮＦ配列は配列の均一な群であるようで あった（図３Ｂ）。

６、２．１．３　ニューロトロフィン−３ヒト（配列番号１６及び３７）、ラッ ト（配列番号１７及び３８）、ニワトリ（配列番号１８及び３９）、アフリカッ メガエル（配列番号１９及び４０）、サケ（配列番号２０及び４１）についての ヌクレオチド及び予測アミノ酸配列、及びエイＮＴ−３は高度に類似している（ 図ＩＢ、図２）。殆どの変化はコドンの３番目の位置の変化から生じるサイレン ト変異であり、通常塩基対のピリミジンあるいはプリンの特徴を維持する塩基転 位である。非保存的アミノ酸変化のみが２つの可変領域内に見られ、２つの可変 領域外にはアミノ酸置換は見られなかった。サケの配列は、その他の全てのＮＴ −３分子には存在するＡｓｐ−９４を欠き（図２）、他の種からのＮＴ−３配列 と比べて、系統樹における分岐点からより長い距離を有する（図３Ｃ）。

６、２．１．４　神経成長因子遺伝子ファミリーの新しいメンバー別のＤＮＡフ ラグメントがヨーロッパクサリヘビ（配列番号ｌ）及びアフリカッメガエル（配 列番号２）から単離され、予測アミノ酸配列（それぞれ配列番号２２及び２３） はこれらのフラグメントが、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３と同じ位置に全ての ３つのシスティン残基を含んでいることを明らかにした（図ＩＢ、図２）。アフ リカッメガエルのＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３との配列の比較によれば、この 新しい配列は、ＮＧＦファミリーの他のメンバーの配列と同一ではないものの関 連していることが示された。従って、この配列を含む遺伝子をニューロトロフィ ン−４（ＮＴ−４）と命名した。ヌクレオチド及びアミノ酸配列の比較では、ア フリカッメガエル及びヨーロッパグサリヘビＮＴ−４は９１／７３％類似である ことを示す。この類似性は、アフリカッメガエル及びヨーロッパクサリヘビＮＧ Ｆ及びＢＤＮＦの間に見られたものと同じ範囲にある（表１）。ＮＧＦファミリ ーの他のメンバーについてと同様に、非保存アミノ酸変化は２つの可変領域にお いてのみ見られた（図２）。

６、２．１．５　神経成長因子遺伝子ファミリー中のメンバーの比較及び系統学 ＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３についての系統樹の比較によりＮＧＦの系統樹に おいてより長い枝が示され、進化的変化のより高い速度を示している（図３Ａ〜 ３Ｃ）。ＮＧＦファミリーの各メンバーの他のメンバーに対する関係を、ファミ リーの４種のメンバーについて推定されるアミノ酸配列を比較する系統図（ｐｈ ｙｌ。

ｇｒａｍ）を構築することにより研究した。系統図によればＮＧＦはＢＤＮＦ及 びＮＴ−４よりもＮＴ−３により関連していることが示された（図３Ｄ）。ＮＴ −３はＢＤＮＦに対してと同様にＮＧＦに関連している。ＮＴ−４は、他の２種 のメンバーよりも明らかにＢＤＮＦに対してより関連している。

６．２．２　ＮＴ−４タンパク質の構造的特徴ＮＴ−４遺伝子及びその遺伝子産 物のより詳細な特定化を可能とするため、ＮＴ−４ＰＣＲフラグメントによりア フリカッメガエルのゲノムライブラリーをスクリーニングし、１６ｋｂインサー トを含むファージクローンを単離した。このインサートから、１．５ｋｂ　Ｐｓ ｔｌフラグメントをサブクローニングし、配列決定した。図４Ａ（配列番号４３ ）。このヌクレオチド配列は、２３６アミノ酸タンパク質をコードするオーブン リーディングフレームを含んでおり（配列番号４４）　、ＮＧＦファミリーの他 のメンバーに特徴的ないくつかの構造的特性を示した。予測されるＮＴ−４タン パク質のアミノ末端は１８アミノ酸の推定上のシグナル配列を含み、この中で４ アミノ酸の領域はブタ及びラットＢＤＮＦの対応する領域と同一である（Ｌｅｉ ｂｒｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ、　１９８９．　Ｎａｔｕｒｅ　３４１．１４９−１５ ２；　Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ 、　２４７．１４４６−１４５１）　ｏやはりＢＤＮＦ　（図４Ａ）について提 唱されているものと同一の、可能性のあるシグナル切断部位が続く。１２３アミ ノ酸成熟ＮＴ−４タンパク質についての可能性のある切断部位はプレプロＮＴ− ４タンパク質中アミノ酸１１３の後に見られる。単一の予測されるＮ−グリコジ ル化部位（Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）は、推定上の切断部位の８アミノ酸前に位 置する。

成熟ＮＴ−４タンパク質の、マウスからのＢＤＮＦＳＮＴ−３及びＮＧＦタンパ ク質との比較により、それぞれ６０％、５８％及び５１％のアミノ酸同一性が判 明した。ジスルフィド架橋の形成に関与する全部で６つのシスティン残基が成熟 ＮＴ−４タンパク質に含まれる［図４Ｂ（配列番号４５〜４８）］。ＮＧＦ、Ｂ ＤＮＦ及びＮＴ−３の間で同一であった領域はＮＴ−４タンパク質においても同 様であった。ＮＴ−４とその他の３種のタンパク質との間の配列の相違の殆どは 、ファミリーの他のメンバーにおいて先に同定された同じ可変領域内で発見され た。

６．２．３　ＮＣＦ−Ｒに対する結合及びＮＴ−４の神経栄養活性１．５ｋｂア フリカツメガエルＰＳｔｌフラグメントを発現ベクターｐＸＭ　（Ｙａｎｇ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４７：３−１０）中にクローン化し、Ｃ Ｏ８細胞中で一時的に発現させた。３ＳＳシステインで標識したトランスフェク トした細胞からの馴らし培地の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、１４にのＭｒを有する ＮＴ−４タンパク質が示された（図５Ａ）。並行したディツシュで生産され、標 識されたＮＧＦタンパク質はＮＴ−４タンパク質よりもいくらか速く移動した。

この移動の差は、おそらく２つのタンパク質の電荷の相違によるものである可能 性が最も高い。同様な移動の差は、異なる種からの同一サイズのＮＧＦタンパク 質についても観察された。

等量のラットＮＧＦ及びアフリカッメガエルＮＴ−４タンパク質を含有するトラ ンスフェクトされたＣＯ８細胞からの馴らし培地を、１２″１−標識ＮＧＦのＰ Ｃ１２細胞上のその受容体に対する結合について競合するその能力について試験 した。結合アッセイは、３７℃で、及び細胞に結合した”Ｊ−ＮＧＦの８０％が 低親和性ＮＧＦ−Ｒに結合する条件下で行った（Ｓｕｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９７９．　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋＋、　２５４．３９７２）　、　ＰＣ１２細胞から５０ ％のｕｓ　Ｉ　ＮＧＦを排除するのに同様なＮＧＦ及びＮＴ−４濃度（６Ｘｌ０ −”Ｍ）が必要であり、これは２つのタンパク質が低親和性ＮＧＦ−Ｒに同様の 親和性で結合することを示している（図５Ｂ）。高い濃度においては、”’　Ｉ −ＮＧＦの排除においてＮＴ−４タンパク質はより効率が低く、この場合は細胞 と結合した残りの”’Ｉ−ＮＧＦは高親和性または内部化された受容体に結合し たことを示唆している。０℃で並行して行ったアッセイにおいては膜移動あるい は内部化が起こらず、上記の相違が観察されなかったという事実は、ＮＴ−４タ ンパク質は内部化、即ち高親和性受容体のみを介して媒介されるプロセス（Ｏｌ ｅｎｄｅｒ　ａｎｄ　５ｔａｃｈ、　１９８０．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 　２５５．９３３８−９３４３；　Ｂｅｒｎｄ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎｅ、　１９ ８４；　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９．１５５０９−１５５１６；　 ）ｌｏｓａｎｇ　ａｎｄ　５ｈｏｏｔｅｒ、　１９８７．　ＥＭＢＯＪ、　６゜ １１９７−１２０２）については、ＮＧＦと競合できないことを示唆している。

ＣＯ８細胞において一時的に発現されたＮＴ−４タンパク質を、その移植胚チッ ク神経節からの神経突起成長を促進する能力について試験した。移植ニワトリ抜 根神経節からの神経突起の成長の明らかな促進が見られた（図６Ａ）。等量のＮ Ｔ−４及びＮＧＦタンパク質を使用した投与量一応答曲線の比較により、ＮＴ− ４により得られた活性はＮＧＦで見られるものよりも低いことが明らかになった （図５Ａ及び５Ｂ）。組換えＮＴ−４及びＢＤＮＦタンパク質は抜根神経節から の神経突起の成長を同程度促進した（図６Ａ及び６Ｃ）。ＮＴ−４タンパク質は 、弱いが一定の節状神経節からの神経突起の成長を引き出したが（図６Ｇ）、交 感神経神経節においては活性は見られなかった（図６Ｅ）。これは交感神経神経 節からの神経突起成長を顕著に促進するＮＧＦ（図６Ｆ）、及び節状神経節にお いて明らかな活性を示すＮＴ−３（図６Ｈ）とは対照的である。ＮＴ−４につい てと同様に、節状神経節におけるＢＤＮＦの神経突起成長促進活性は（図６１） 、ＮＴ−３で見られたものよりも低い。

６、２．４　異なるアフリカッメガエル組織におけるＮＴ−４ｍＲＮＡの発現 １１の異なるアフリカッメガエルの組織がらポリアデニル化ＲＮＡを調製し、ノ ーザンプロット分析に使用した。アフリカッメガエルＮＴ−４プローブとのハイ ブリダイゼーションにより、卵巣における２、３ｋｂ及び６．　Ｏｋｂの２つの ＮＴ−４転写物の高いレベルが明らかとなった（図７Ａ）。これに対し、分析し た全てのその他の組織において、ＮＴ−４ｍＲＮＡのレベルは検出限界よりも低 いものであった。アフリカッメガエルＮＧＦプローブとのハイブリダイゼーショ ンにより、心臓（図７Ａ）及び脳における１、　３ｋｂ　ＮＧＦｍＲＮＡが示さ れた。しかし、これらの組織におけるＮＧＦｍＲＮＡの量は、卵巣におけるＮＴ −４ｍＲＮＡのレベルの１００分の１のオーダーで低いものであった。ＮＧＦｍ ＲＮＡも卵巣で検出されたが、ＮＧＦｍＲＮＡの量は、この組織におけるＮＴ− ４ｍＲＮＡのレベルの約１００分の１の低いものであった（図７Ｂ）。卵巣にお けるＢＤＮＦ及びＮＴ−３ｍＲＮＡのレベルはいずれも検出限界よりも低いもの であった（図７Ｂ）。

６．３　考察 我々はポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を、縮重オリゴヌクレオチ ドプライマーと組み合わせて使用し、異なる種からのＮＧＦファミリー中の異な るメンバーについての遺伝子を単離した。完全な成熟したＮＧＦＳＢＤＮＦ及び ＮＴ−３タンパク質のヌクレオチド及びアミノ酸配列の比較により、この研究に おいて分析した遺伝子の領域の比較により得られたものと同じ類似性が明らかに なった。従って、この領域は遺伝子の残りを代表するものであるとみられ、この ことから完全な成熟タンパク質の進化的保存の研究に使用できるものである。

異なる種からのＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３遺伝子は、魚類と哺乳類で完全な 同一性を示した領域、あるいは低い類似性の領域を含んでいる。異なる種からの ＮＧＦ配列を対応するＢＤＮＦあるいはＮＴ−３の配列と比較することにより、 ＮＧＦ遺伝子はを推動物においてＢＤＮＦ及びＨＤＮＦ／ＮＴ−３の両者よりも 保存されていないことが明らかになった。２つの後者の遺伝子は、ＮＴ−３がＢ ＤＮＦよりも保存されていないがサケを除く研究した全ての種において等しく保 存されているようである。この点、分子時計はある分枝、特にＮＧＦにおいては スピードアップするが、他のものにおいてはしなかったという事実について思索 することは興味深いことである。タンパク質の正しい３次構造を保存する選択力 が存在すると一般に考えられている（Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ。

１９７１、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｅｖｏｌ、　１．２６−４５ＨＫｉｍｕｒａ　＆ 　０ｈｔａ、　１９７４．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ、　７１：　２８４８−２８５２）。３つの因子の進化的保存における相違 は、ＮＧＦ遺伝子に対するのと比較して、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３に対してより高 い選択圧が存在したことを示唆している。環境的変化が、特異的遺伝子産物の達 成最適条件を変更する選択圧を変化させるものとして提案されている（Ｋｉｍｕ ｒａ　１９８３゜ｉｎ″Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒ ｏｔｅｉｎｓ″、　ｐｐ、２０８−２３３）。この意味において、ＢＤＮＦ及び ＮＴ−３に比較してＮＧＦにおいてより広範な進化的変化が見られるのは、ＮＧ Ｆの機能が進化の間に、更に変化してきたという事実を反映するものである可能 性がある。ＮＧＦの構造−機能解析によれば、この分子はその活性プロフィール を喪失したり改変されることなくかなりの構造変化を許容するものであることが 明らかになっており、ＮＧＦの進化的保存の低い程度はこのタンパク質のより安 定な構造によるものであり、従ってこのタンパク質は容易には置換により摂動す ることはないことによることを示唆するものである。また、異なる因子に対する 遺伝子が位置するゲノムの領域は、異なる全体的変異速度を有するという説明も 可能である。異なる変異速度は、ゲノムの非コード領域について示されている（ ＷｏＨｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｎａｔｕｒｅ、　３３７；　２８３ −２８５）が、これがコード領域に多くの数の変化をもたらすことができるかど うかはあまり明らかでない。

サケＮＧＦ及びＮＴ−３は、他の種のこれらの分子と比較した場合、特に異なる 度合いが高い。ＮＧＦにおけるスレオニン８２及び８５〜８７位置のヒスチジン −スレオニン−フェニルアラニンを含むいくつかのアミノ酸、並びに位置９４及 び９５の間のアミノ酸の欠失（２つの別のタンパク質と比較して）は、ＮＧＦタ ンパク質の一貫した特徴である。単離されたサケ配列がこれらのＮＧＦ特異的モ チーフの全てを含んでいるという事実は、それがファミリーのもう１つのメンバ ーではなく、サケＮＧＦを示しているということを示すものである。研究した他 のＮＴ−３の全てとは異なり、サケＮＴ−３は９５位置のアミノ酸を欠いている 。エイＮＴ−３には余分のアミノ酸が存在するので、エイとサケの共通の祖先は 、９５位置の余分のアミノ酸を含む祖先ＮＴ−３配列を有していたということが ありそうである。従って、このサケＮＴ−３分子の変化はこの遺伝子が共通の祖 先から別れた後に発生したものに違いないことになる。サケの配列のアミノ酸の 変化の殆どは同じ領域中にあるものであり、これはより低い程度であるが他の種 においても変化するものであり、このことは単離されたサケＮＧＦまたはＮＴ− ３配列が偽遺伝子ではないことを強く示唆している。他の種と比較した場合の、 サケＮＧＦ及びＮＴ−３のより大きな分岐は、おそらく硬骨魚類の進化的拡大の 高い程度を反映しているのであろう。

この研究の結果は、ＮＧＦファミリーは５億年前に、現在のより高等なを推動物 の祖先であった原始的な魚類におそらく存在していたものであろうことを示すも のである。この遺伝子ファミリーは遺伝子複製により形成されてきたものであろ うし、これは新しい遺伝子が進化するための最も一般的なメカニズムであると考 えられている（Ｌｉ、　Ｗ、、　１９８３．　ｉｎ″Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ 　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒ。

ｔｅｉｎｓ、　ｐｐ、　１４−３７）。生物学的に活性なタンパク質を合成する ために必要な情報の全ては３°エキソン内に含まれていることがら、機能的遺伝 子の複製は容易化されてきたのであろう（Ｈａｌｌｂｏｏｋ、　ｅｔ　ａｌ、、 　１９８８．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８：　４５２−４５６；　 Ｌｅｉｂｒｏｃｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｎａｔｕｒｅ、　３４１； 　１４９−１５２；　Ｈｏｈｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｎａｔｕｒｅ 、　３４４；　３３９−３４１）。ファミリーの形成にはいくつかの遺伝子複製 が関与してきたものである（図３Ｄ）。

ＮＴ−４は、ＮＴ−３あるいはＮＧＦよりもＢＤＮＦにより密接に関連している ので、ＮＴ−４及びＢＤＮＦは共通の祖先遺伝子から形成されたように思われる 。しかし、現状のデータからは４つ全ての因子について先祖的分子は識別されて いないので、推定上のＢＤＮＦ／ＮＴ−４祖先のＮＧＦ及びＮＴ−３の祖先に対 する進化的関連を明確に決定することができない。異なる種からのデータを使用 した系統図のトポロジーは、異なる種間の共通した進化的関連と一般に一致して いる。しかし、ＮＧＦ及びＢＤＮＦの両者については、ニワトリの配列が予想さ れるよりも早い系統図上の分岐を示している。ヨーロッパクサリヘビ及びアフリ カッメガエルからのＮＴ−４、ＮＧＦ及びＢＤＮＦの比較により、これらの種に おけるＮＴ−４配列は、ＮＧＦ及びＢＤＮＦ中におけるそれぞれ９及び８の置換 に対し、１１のアミノ酸置換を有していることが判った。これは、これらの種に おいては、ＮＧＦまたはＢＤＮＦの分岐の速度に匹敵するかあるいはそれよりも 早い速度で、ＮＴ−４が分岐したことを示唆している。

ＮＧＦ分子中の高度に保存されたアミノ酸の置換は生物学的活性を喪失させるも のではなかったが、多くの場合においては生産されたタンパク質の量に影響を及 ぼし、これは、生物学的活性以外の制限、例えばＮＧＦタンパク質の保存に重要 であり得るタンパク質の安定性のような制限が存在することを示している。さら に、ＮＧＦファミリーの全てのメンバーが低親和性ＮＧＦ−Ｒと反応し得るとい う事実は、これらの因子中のある領域の完全な保存は、ＮＧＦ−Ｒと反応できる タンパク質を維持するこれらの遺伝子に対する制限によるものであり得ることを 示唆している。胚の早期個体発生輪の基本的なメカニズム及び戦略は全てのを推 動物において同様なものであり、おそらくは全てのを推動物において保存されて いる遺伝子が関与するものであろう。従って、これらの神経栄養因子の進化的保 存は多くの異なる種における早期胚発生においてそれらが重要であろうという考 えに一致するものである。

海馬（ｈｉｐｐｏｃｕｍｐｕｓ）は、脳においてＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３ ｍＲＮＡの最も高いレベルを有する（Ｅｒｎｆｏｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９ ０Ｊ、　Ｄｅｖ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　９．５７−６６）　ａそれは両生類及 び爬虫類の脳に最初に出現した、舌皮質（ａｒｃｈｉｐａｌｌｉｕｍ）に由来す る高度に特殊化した構造である。哺乳類の海馬は、記憶、学習及び認識機能に重 要であり、高度なニューロン可塑性に関連していることが知られている（Ｃｒｕ ｔｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｃｏｆｆ１ｎｓ、　１９８２．５ｃｉｅｎｃｅ　２７７： ６７−６８）　。これらの必要性は、系統発生の間に、おそらくは神経栄養因子 によって媒介されるのであろう可塑性促進メカニズムのための選択圧を発生させ てきたのかもしれない。しかし、本研究の結果は、神経栄養因子の遺伝子の複製 というできごとは海馬の形成にはるかに先立つものであることを明確に示してい る。この発見は、神経栄養因子は海馬の形成の結果として進化したものではない ことを示すものであり、この脳の領域のニューロン可塑性は少なくとも部分的に はこれらの分子によるものであるという考えを支持するものである。

原始的なを推動物、即ち軟骨魚類の神経系の構成は、より高等なを推動物の神経 系に対するある程度の基本的な類似性を有している。軟骨魚類における脳神経、 体性感覚及び自律神経系は一般的により高等なを推動物のものに類似している（ Ｙｏｕｎｇ、　Ｊ、Ｚ、、　１９８１、　Ｔｈｅ　Ｌｉｆｅ　ｏｆ　Ｖｅｒｔｅ ｂｒａｔｅｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐ ｒｅｓｓ）。従って、神経栄養相互反応の原理は原始的及びより高等なを推動物 において同じである可能性が高い。原始的なを推動物にもあるＮＧＦ様神経栄養 因子の進化的保存は、これらの因子が最初は無を推動物において進化し、その後 を推動物の神経系の発生において機能するように適合させられたものであること を示唆するものである。

我々のＮＧＦファミリーの進化的保存の研究により、ニューロトロフィン−４、 即ちＮＴ−４と命名した、このファミリーの新しいメンバーが単離されたもので り、ＮＴ−４遺伝子からのＰＣＲフラグメントはアフリカッメガエル及びヨーロ ッパクサリヘビから単離し、その後ゲノムクローンはアフリカッメガエルから単 離した。このクローンのヌクレオチド配列解析により、２３６アミノ酸タンパク 質のオーブンリーディングフレームが明らかになり、ＮＧＦファミリーの３種の その他のメンバーのものに似たいくつかの構造的特徴を示す。これらは、推定上 のアミノ末端シグナル配列及び１２３アミノ酸成熟ＮＴ−４タンパク質を予測さ せるタンパク質分解切断部位に近い可能性のあるＮ−グリコジル化部位の存在を 含む。成熟ＮＴ−４タンパク質のサイズはＢＤＮＦ及びＮＴ〜３のものより４ア ミノ酸長く、成熟ＮＧＦタンパク質のものより５アミノ酸長い。成熟ＮＴ−４タ ンパク質中、ジスルフィド架橋の形成に関与する６つのシスティン残基は全て保 存されている。ＮＴ−４タンパク質は、その他の３種のファミリーのメンバーの 配列の間で変化するのと同じ領域においてファミリーのその他のメンバーと異な っている。ＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３についてと同様に、全ブレブローＮＴ −４タンパク質は単一のエキソン中にコードされている。従って、予測されるタ ンパク質の遺伝子の構成及び構造的特徴は、ＮＴ−４がＮＧＦファミリーのもう １つのメンバーであることを示している。ＮＴ−４遺伝子が爬虫類及び両生類の 両方から単離されたという事実は、それがいくつかの異なる種において存在する ことを示唆している。

ＢＤＮＦ及びＮＴ−３の両方が低親和性ＮＧＦ−Ｒと相互反応することが示され ている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｔｅｂａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｎｅ ｕｒ。

ｎ　４：４８７−４９２；　Ｅｒｎｆｏｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８７：５４５４−５４５８）。アフリカッメガエルＮＴ−４タンパク質 は、ＰＣ１２細胞上のその低親和性受容体からの１２’−ＮＧＦを置換し、これ はこのファミリーの４番目のメンバーも低親和性ＮＧＦ−Ｒと相互反応できるこ とを示している。３７℃及び０℃で得た置換曲線の比較により、ＮＴ−４タンパ ク質は高親和性ＮＧＦ−Ｒとの結合に対して競合できないことが示唆されている 。低親和性ＮＧＦ−Ｒ遺伝子によりコードされたタンパク質は、低及び高親和性 受容体の両方の部分を形成するようである（Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ　ｅｔ　ａｌ、 、　１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：３７３−３７５）　。２つの運動力学 的に異なる受容体が同一の受容体遺伝子から形成されるメカニズムは知られてい ないものの、２つの状態は受容体の細胞質領域と細胞内タンパク質との間で複合 体が形成されることにより発生するものであると提案されている（Ｒａｄｅｋｅ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３２５：５９３−５９７；　Ｍ ｅａｋｉｎ　ａｎｄ　５ｈｏｏｔｅｒ、　１９９１．　Ｎｅｕｒｏｎ　６：１５ ３−１６３）　ｏあるいは、高親和性受容体鎖は別の遺伝子によりコードされ得 、インターロイキン−２受容体（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ８９．５ｃｉｅｎｃｅ　７４４：５５１−５５６）及び血小板由来成長因子受容 体（Ｍａｔｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９゜５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：８０ ０−８０４）に類似しているかもしれず、この２つの受容体鎖は高親和性受容体 を構成するダイマーを形成し得る。ＮＧＦファミリーの４種のメンバーの全てが 低親和性ＮＧＦ−Ｒと相互反応できるという事実は、ＮＧＦ−Ｒの低親和性状態 が、いまだ未知の様式で、これらの因子の全ての生物的効果を媒介することに関 与しているのかも知れない。この点、低親和性ＮＧＦ−Ｒ遺伝子は、ＮＧＦに応 答することが知られていないニューロン及び非ニューロン両方の起源の種々の組 織中において発現されることが示されていることに注目するのは興味深い。これ らは、早期チック胚の間葉、体部及び神経管細胞（Ｈａｌｌｂｏｏｋ　ｅｔ　ａ ｔ、、　１９９０゜Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０８：６９３−７０４；　Ｈｅ ｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０ａ、　Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、　１３７：２８７ −３０４；　Ｈｅｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０ｂ、　Ｎｅｕｒｏｎ　５： ２８３−２９６）、並びに発生及び再生を髄運動ニューロン（Ｅｒｎｆｏｒ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｎｅｕｒｏｎ２：１６０５−１６１３；　Ｅｒｎｆ ｏｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１．　Ｊ、　Ｄｅｖ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　 ９：５７−６６）を含む。従って、ＮＴ−４タンパク質がこれらの組織あるいは ニューロン集団のいずれかにおいて機能上の重要性を、有するものであるかどう かを研究することは興味深いことであろう。

ＮＴ−４タンパク質の神経栄養活性を、移植チック胚神経節上でアッセイし、Ｎ ＧＦファミリーのその他の３種のメンバーについてと同様にＮＴ−４タンパク質 は後根神経節からの神経突起成長の明確な促進を示した。しかし、ＮＧＦと比較 した場合、ＮＴ−４タンパク質は後根神経節においてより低い活性を示した。Ｂ ＤＮＦ及びＮＴ−３の両者は、移植節状神経節において神経突起成長を容易に示 したが、ＮＴ−３による応答は一貫してＢＤＮＦによるものよりも強かった。Ｎ ＧＦは交感神経節において神経突起成長を強力に促進し、ＮＴ−３もまたこの神 経節において活性を有していたが、それはＮＧＦよりもずっと低いものであった （Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　５ｃｉｅｎｃｅ　 ２４７：１４４６−１４５１；　Ｅｒｎｏｆｏｒｓｅｔ　ａｔ、、　＋９９０． 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：５４５４−５ ４５８）。ＮＴ−４は、ＮＴ−３と比較して節状神経節によいでより弱い活性を 示し、交感神経節においては活性を示さなかった。末梢移植神経節に対するＮＴ −４の生物学的活性のスペクトルはＢＤＮＦのものと似ており、これはＮＴ−４ はＢＤＮＦに構造的に類似していることと一致する。

アフリカッメガエルからの１１の異なる組織のノーザンブロ・ソト分析により、 卵巣におけるＮＴ−４の高いレベルが示されたが、ＮＴ−４ｍＲＮＡのレベルは 試験したその他の組織の全てにおいて検出限界以下であった。２．３ｋｂ及び６ ．　Ｏｋｂの２種のＮＴ−４ｍＲＮＡが卵母細胞において見られた。同じ遺伝子 からの２種の転写物の存在はＢＤＮＦについて前に観察されたが、この場合はラ ットの脳において１．４ｋｂ及び４．　Ｏｋｂの２種のｍＲＮＡが存在するもの である（Ｌｅｉｂｒｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｎａｔｕｒｅ　３４ １：１４９−１５２；　Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ　ｅｔ　ａｔ、、１９９０． 　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４４６−１４５１；　Ｅｒｎｆｏｒｓ　ｅｔ　ａ ｌ、、　１９９０ａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩ ＳＡ　８７：５４５４−５４５８）　。アフリカッメガエルＮＧＦプローブに対 するハイブリダイゼーションにより、アフリカッメガエル心臓におけるＮＧＦｍ ＲＮＡが明らかにされ、これはニューロン神経支配に対する標的組織中でのＮＧ ＦｍＲＮＡ発現の結果である可能性が最も高い。しかし、心臓におけるＮＧＦｍ ＲＮＡのレベルは、卵巣におけるＮＴ−４ｍＲＮＡのレベルに比較して１００倍 以上低いものであった。卵巣におけるＮＴ−４ｍＲＮＡの高いレベルは、ニュー ロン神経支配と相関するものではないことから、ＮＴ−４タンパク質がこの場合 に神経栄養機能のみを有するものではないようである。そうではなく、アフリカ ッメガエル卵巣におけるＮＴ−４ｍＲＮＡの豊富な発現は、ＮＴ−４タンパク質 についての別の重要な非神経栄養機能を意味しているのである。ＮＧＦｍＲＮＡ もアフリカッメガエル卵巣において検出されたが、ＮＴ−４ｍＲＮＡのレベルに 比べて殆ど１００倍低いものであり、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３ｍＲＮＡはこの組織 において検出されなかった。

２種の成長因子についてのｍＲＮＡはアフリカッメガエル卵母細胞における母性 ｍＲＮＡとして記載されてきた。これらのｍＲＮＡの１つは塩基性繊維芽細胞増 殖因子に対する強い類似性を持ったタンパク質をコードしくＫｉｍｅｌｍａｎ　 ａｎｄ　Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ、　１９８７．　Ｃｅ１１５１：８６９−８７７） 　、他のｍＲＮＡはトランスフォーミング増殖因子に相同なタンパク質をコード する（Ｗｅｅｋｓ　ａｎｄ　Ｍｅｌｔｏｎ、　１９８７．　Ｃｅ１１５１：８６ １−８６７）。これらの因子は、中胚葉の形成とそれに続くこの組織の神経管へ の誘導についてのモルフオゲン（Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ）として機能すると提唱さ れてきた。ラットにおいて、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼ一シヨン分析により 、２次及び３次濾胞の上皮におけるＮＴ−３ｍＲＮＡが明らかにされ、卵子発生 におけるＮＴ−３の役割が提唱されている（Ｅｒｎｆｏｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９９０．　Ｎｅｕｒｏｎ　５：５１１−７、　実施例＋　ＩＮ　５ＩＴＵハイ ブリダイゼーシヨンによるアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ ）卵巣においてＮＴ−４ｍＲＮＡを発現する細胞の同定 ７．１　材料及び方法 ７、１．１　アフリカッメガエル卵母細胞、胚及び細胞の単離、取り扱い及び培 養 雄及び雌のアフリカッメガエル（Ｘ、　１ａｅｖｉｓ　）を１９℃において研究 室で飼育した。０．２５％トリ力インメタンスルホネート（Ｓａｎｄ。

ｚ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）中への動物の浸漬麻酔の後、卵巣葉を外科的に 取り出し、改変バルト生理食塩水ヘペス（ＭＢＳＨ）（Ｇｕｒｄｏｎ　ａｎｄ　 Ｗｉｃｋｅｎｓ、　１９８３．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１： ３７０−８６）で洗浄し、２ｍｇ／ｍｌ　：１ラゲナーゼを含むカルシウム非含 有ＭＢＳＨ中、２０℃で一部インキユベートして分離した。前卵黄形成及び卵黄 形成卵母細胞の粗製分離物を分画沈降により得、卵母細胞をさらに解剖用顕微鏡 の下で手作業によりＤｕｍｏｎｔ（１９７２、前出）により記載された発生段階 に分類した。

実質的にＮｅｗｐｏｒｔ　ａｎｄ　Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ　（１９８２）により記 載された方法によるインビトロの受精により同調分裂した胚を得た。

Ａ６アフリカツメガエル腎臓細胞を、蒸留水で６０：４０（ｖ／ｖ）に希釈し、 １０ｍＭヘペス、　ｐＨ７，３５，１０Ｍヒポキサンチン（Ｓｉｇｍａ）　、４ 　ｍＭグルタミン及び１０％牛脂児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＬｅｉｂｏｗ ｉｔｓ　Ｌ１５培地中、２０℃で培養した。培養物を空気で平衡化し、暗所に置 いた。

７、１．２　ＩＮ　５ＩＴＵハイブリダイゼーシヨン成熟アフリカツメガエル（ Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ）からの新鮮凍結卵巣をクリオスタット（Ｌｅｉ ｔｚ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）中で切断しく１４）、切断物をポリ−ローリジン（５ ０ｇ／ｍｌ）で前処理したスライド上に解凍し、その後１０％ホルマリン中で３ ０分間固定し、ＰＢＳ中で２回濯いだ。クロロホルム中での５分間のインキュベ ーションを含め階層化した一連のエタノール中で脱水を行い、その後スライドを 風乾した。２種の５３−マーオリゴヌクレオチド、即ちアフリカッメガエルＮＴ −４ｍＲＮＡに特異的な１種（５’ＣＣＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＣＡＴＣ ＴＡＴＧＧＴＣＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＣＡＴＡＡＧＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣ３’　 ［配列番号１０９］　）　、及び対照としての他の１種、ニワトリＢＤＮＦｍＲ ＮＡに特異的なもの（成熟ニワトリＢＤＮＦタンパク質のアミノ酸６１〜７７に 対応する（Ｈａｌｌｂｏｏｋｅｔ　ａｌ、、　１９９１．　Ｎｅｕｒｏｎ　６： ８４５−５８　［配列番号１１及び３２に含まれているコ）を、末端デオキシリ ポヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ＩＢＩ、　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ）を用い て”５−ｄＡＴＰで３゛末端を標識し、約Ｉ　Ｘ　１０＠ｃｐｍ／の比活性とし た。５０％ホルムアミド、４ＸＳＳＣ。

Ｉ×デンハー）　（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）溶液、１％　サルコシル（Ｓａｒｃｏ ｓｙｌ）、０．０２Ｍ　ＮａＰＯ５（ｐＨ７，０）、　１０％デキストランスル フェート、０．５ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、０．０６　Ｍ　ＤＤＴ、　Ｏ，ｌ　 ｍｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡ及び＋ｉ３−標識オリゴヌクレオチドプローブの ｌ　ｘｌＯ’　ｃｐｍ／ｍｌ中で、４２℃において１６時間、ハイブリダイゼー ションを行った。断片をその後リンスし、ｌ　Ｘ５ＣＣ中で５５℃で４回（各１ ５分）洗浄し、水中でリンスし、階層化した一連のエタノール中で脱水し、風乾 した。断片をＸ線フィルムに露出し、コダックＮＴＢ−３写真乳剤（水中ｌ：ｌ に希釈）でコーティングし、−２０℃で５〜６週間露出し、現像し、定着し、ク レシルバイオレットによりカウンター染色した。

７．１．３　ＲＮＡプロット分析 示した試料を４Ｍグアニジンイソチオシアネート、０．ＩＭ　β−メルカプトエ タノール、０．０２５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ）１７．０中でホモジナイズし 、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎｅ）で３回１５秒間ホモジナイズした。各ホモ ジネートを０．０２５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５，５中の５．７　Ｍ　ＣｓＣ １のクッション上に積層し、Ｂｅｃｋｍａｎ　５Ｗ４１　ｏ　−ター中で３５． ００Ｏｒｐｍで１６時間１５℃で遠心分離した（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ 、、　１９７９．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７８：　５２９４−５２９９） 　、ポリアデニル化ＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ）をオリゴ（ｄＴ）セルロー スクロマトグラフィー（Ａｖｉｖ　ａｎｄ　Ｌｅｄｅｒ、　１９７２．　ＰＮＡ Ｓ　６９：　１４０８−１４１２）により精製し、ＲＮＡの回収物（４０ｇ）は ＲＮＡプロット分析に使用する前に分光分析により定量した。全細胞ＲＮＡ（４ ０ｇ）または示した場合は各試料からのポリ（Ａ）　＋　ＲＮＡ（５ｇ）を０． ７％ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル中で電気泳動した。染色ゲルの ＵＶ透過により、全部の試料が同様な量そのままのＲＮＡを含んでいることを確 認した。その後ゲルをニトロセルロースフィルターに転写した。次にフィルター をアフリカッメガエルＮＴ−４遺伝子の３゜エキソンからの３５０ｂｐ　Ｈｉｎ ｃ１１フラグメントとハイブリダイズさせた（Ｈａｌｌｂｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、 、　１９９１．　Ｎｅｕｒｏｎ　６：８４５−８５８）　、このフラグメントは ニックトランスレーションにより比活性的５　Ｘ　１０”　ｃｐｍ／ｇまで”Ｐ −ｄＣＴＰにより標識されており、ノ）イブリダイゼーションは記載されている ように行った（Ｅｒｎｆｏｒｓ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８８．　Ｎｅｕｒｏｎ　 １：９８３−９６）　ｏフィルターを高ストリンジエンシー（０，ｌＸ５ＳＣ， ０，１％ＳＤＳ、５４℃）で洗浄し、コダ・ツクＡＲ−５フィルムに一７０℃で 露出した。

７．２　結果 成熟アフリカッメガエル卵巣を通る組織切断物をアフリカッメガエルＮＴ−４ｍ ＲＮＡに特異的な”５−ｄＡＴＰ標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダ イズさせた。ハイブリダイゼーションの特異性の対照として、同じ長さで、ニワ トリ脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のｍＲＮＡに相補的なＧＣ含有量のオリ ゴヌクレオチドプローブに、隣接する切断物をハイブリダイズさせた。ＮＴ−４ ｍＲＮＡ特異的プローブにより、卵発生の初期ステージの卵母細胞に対応する大 きさく直径５０−４００μｍ）の、卵巣全体に分散した多くの細胞上に強い標識 がされていることが明らかになった（図９Ａ）。成熟した卵黄形成ステージ■後 の卵母細胞にはＮＴ−４ｍＲＮＡは検出されなかった（図９Ａ中の矢印）。

ニワトリＢＤＮＦｍＲＮＡ特異的対照プローブはアフリカッメガエル卵巣中の細 胞を標識巳なかった。

ハイブリダイズされた断片からのエマルジョンオートラジオグラフ分析により、 Ｄｕｍｏｎｔ　（１９７２、上記）によるステージＩの卵母細胞に対応する５０ −２００μｍの直径を有する卵母細胞の細胞質上の強い標識が明らかになった（ 図１０Ａ及びｌ０Ｂ）。ＮＴ−４ｍＲＮＡ特異的プローブは、ステージ■〜■に 対応するより大きな直径の卵母細胞も標識したが、これらの細胞に対する標識の 強度はステージＩ卵母細胞上に見られたものよりも低いものであった。低倍率暗 視野照明の分析（図９）と一致して、エマルジョンオートラジオグラフは、ステ ージＶ及び■のより成熟した卵母細胞には標識を示さなかった。対照ＢＤＮＦプ ローブとのハイブリダイゼーションの後には標識を示した細胞はなかった（図１ ０Ｃ）。卵子発生の間のＮＴ−４ｍＲＮＡのレベルのより詳細な決定を可能とす るため、任意に選択した面積単位の粒子の数を計測した。選択した面積単位は、 ステージＩの卵母細胞の断面の約１００分の１に対応する。この分析の結果、ス テージ■の卵母細胞上の標識の強度は、ステージＵ／ｍ及び■の卵母細胞よりも 、それぞれ１．７倍及び４．３倍高いことが示された（図１１）。ステージＶ及 び■の卵母細胞上の単位面積当たりの粒子の数は、バックグラウンド標識のレベ ルより有意に高いものではなかった。

７、２．　ｌ　アフリカッメガエル卵子発生及び初期発生の間のＮＴ−４ｍＲＮ Ａ発現のノーザンプロット分析異なるステージの卵母細胞、並びに濾胞細胞から 濃縮した分画から調製した、全細胞ＲＮＡ（４０ｇ）の固定した量を、アフリカ ッメガエルＮＴ−４特異的プローブ（Ｈａｌｌｂｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ９１．上山）を使用してノーザンプロットにより分析した。ｉｎ　５ｉｔｕハイ ブリダイゼーシヨンの結果と一致して、２．３ｋｂ及び６．　Ｏｋｂのサイズの ＮＴ−４転写物の最も高いレベルが、最も小さい卵母細胞に存在した（ステージ Ｉ及びＩｆ）　（図１２）。さらにより成熟したステージＶ及び■の卵母細胞に おいてはＮＴ−４ｍＲＮＡのレベルは急激に減少した。濾胞細胞調製物中には弱 いハイブリダイゼーション信号が見られたが、これはおそらく少数のステージェ 及び■の卵母細胞のコンタミネーションによるものであろう。ポリアデニル化Ｒ ＮＡの固定した量（５ｇ）を図１２に示した種々の試料から分析した場合、同じ 結果が得られた。

卵巣におけるＮＴ−４ｍＲＮＡ発現の分析の結果は、ＮＴ−４ｍＲＮＡは未成熟 卵母細胞に限定されているものであることを示した。ＮＴ−４ｍＲＮＡの発現が 受精の後に誘導されている可能性を試験するために、ポリアデニル化ＲＮＡのノ ーザンプロットにより、発生中のアフリカッメガエル胚中のＮＴ−４ｍＲＮＡの レベルを調べた。やはり分析に含まれていた、アフリカッメガエル体性Ａ６培養 腎臓細胞に、低いレベルのＮＴ−４ｍＲＮＡが見られた。しかし、神経胚への分 裂分割の開始ステージからの初期胚にはＮＴ−４ｍＲＮＡは検出されなかった。

７．３　考察 アフリカッメガエル卵巣におけるＮＴ−４ｍＲＮＡの豊富な発現は（Ｈａｌｌｂ ｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１．上山）、このＮＧＦファミリーのメンバー が卵子発生及び／または初期の胚発生において何らかの役割を果していることを 示している。ＮＴ−４ｍＲＮＡを発現する細胞が卵巣に局在化することは、卵巣 中のＮＴ−４タンパク質の推定上の機能への推測を与える。両生類においては、 他の全てのを椎動物と同様に、卵の受精が急速な細胞分裂期間の引き金となる。

この事象は、卵子発生の間に発現され、以降の発生のために未受精卵に貯蔵され ているある種の可溶性の母性ｍ　ＲＮ　Ａにより制御される（Ｄａｖｉｄｓｏｎ 、１９８６．　Ｇｅｎｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　Ｅａｒｌｙ　Ｄｅｖｅｌ。

ｐｍｅｎｔ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ））　、こ の母性ｍＲＮＡの種類は、２種の成長因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子（Ｋｉｍ ｅｉｍａｎ　ａｎｄＫｉｒｓｃｈｎｅｒ、　１９８７．　Ｃｅ１ｌ、　５に８６ ９−７７）及びトランスフォーミング増殖因子−１（Ｗｅｅｋｓ　ａｎｄ　Ｍｅ ｌｔｏｎ、　１９８７．　Ｃｅ１１．５１：８６１−６７）、並びにｃ−ｍｙｃ 　（Ｇｏｄｅａｕ　ｅｔ　ａｔ、、１９８６．　ＥＭＢＯＪ、、　５：３５７１ −７７）；　（Ｖｒｉｚ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９．　ＥＭＢＯＪ、　８：４０ ９１−９７）、　ｃ−ｆｏｓ　（Ｍｏｈｕｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９、　Ｄｅ ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１０７：８３５−４６）、　ｒａｓ　（Ａｎｄｅｏｌ　ｅ ｔ　ａｌ、、１９９０．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、、１３９：２４−３４）、　ｅ ｔｓ−２（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ、　２５０： １４１６−１８）及びｃ−ｍｏｓ　（Ｓａｇａｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８ ．　Ｎａｔｕｒｅ、　３３５：５１９−２５）のようないくつかの癌原遺伝子を 含む。未成熟のステージ■のアフリカッメガエル卵母細胞は、減数分裂の前期Ｉ に停止され、ｃ−ｍｏｓ　（Ｓａｇａｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）及びｅ ｔｓ−２（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０）の両者は減数分裂の再開始の 間に機能することが示されている。ステージＩ及び■の卵母細胞において高いレ ベルのＮＴ−４ｍＲＮＡが見いだされたが、ステージＶ及び■の卵母細胞におい てはノーザンプロット及びｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンの両者におい て検出限界以下の低いレベルであることが見いだされたことは、ＮＴ−４ｍＲＮ Ａが母性ｍ　ＲＮ　Ａの種類に属していないことを強く示唆するものである。こ の結果はまた、減数分裂の再開始あるいは初期の胚発生におけるＮＴ−４タンパ ク質の役割を示すものである。これと一致して、ｉｎ　Ｖｉｔｒｏにおいて未成 熟のステージ■の卵母細胞に組み換えＮＴ−４を添加すると、胚胞の破壊を誘導 することになり、アフリカッメガエルの初期の胚にはＮＴ−４ｍＲＮＡは検出さ れなかった。そのかわり、卵巣における推定上のＮＴ−４の機能は、前卵黄形成 期及び初期の卵黄形成期中の卵母細胞に起こるできごとと結び付けられるようで ある。両方のＮＧ　Ｆ（Ａｙｅｒ−ＬｅＬｉｅｖｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８ ８．　ＰＮＡＳ　８５：２６２８−２６３２）７５ｋＤ低親和性ＮＧＦ受容体（ Ｐｅｒｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７：　７ ０４−７０７）及びＮＧＦ受容体のｔｒｋＡ高親和性成分（Ｊ、、ＰｏＭｅｒｌ 。

ａｎｄ　ＨｌＰｅｒｓｓｏｎ、未刊行）は精巣において発現し、ＮＧＦが減数分 裂の開始においてＤＮＡの合成を刺激することが最近示された（Ｐａｒｖｉｎｅ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１．提出済）。従って、ニューロトロフィンは神経 栄養因子として機能するだけではなく、生殖組織においても重要な役割を果たし ているようである。

８、　実施例：＠乳類ＮＴ−４をコードする核酸フラグメントの単離及び特徴づ け ８．１　材料及び方法 ８．１．１　ＤＮＡ調製 上記６．１．１に記載したようにしてゲノムＤＮＡを単離した。

８、１．２　ポリメラーゼチェーンリアクション、分子クローニング及びＤＮＡ 配列決定 上記６．１．２に記載したようにして、アミノ酸配列ＱＹＦＦＥＴ（配列番号５ １に含まれる）及びＱＹＦＹＥＴ　（配列番号５２）　（５’オリゴヌクレオチ ド）、及びＷＩ　５ＥＣＫ、ＣＫＡＫＱＳ及びＷＩＲＩＤＴ（それぞれ配列番号 ５１に含まれる）（３′オリゴヌクレオチド）（図１３）に対応する全ての可能 なコドンを表す３４−マーオリゴヌクレオチド（末尾（ｔａｉｌ）を含む）の混 合物をリンカ−と共に合成した。２Ｙ（ｘＮＴ−４［配列番号５０コから誘導） 及び２Ｚ　（ＢＤＮＦ／ＮＴ−３［配列番号５１コから誘導）は、共に、この領 域における全ての種からのニューロトロフィンについての知られている配列の全 てを表す。ラット及びヒトゲノムＤＮＡの１次槽幅は、９５℃で１分、４３℃で ２分及び７２℃で２分のサイクルで、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ）により 行った。１次ＰＣＲ反応からのアリコートをさらに、１次槽幅と同じプライマー 、あるいは予測されるサイズ変化をもたらす新たな縮小縮重オリゴヌクレオチド プライマーのいずれかを用いて、再増幅した。再増幅工程からのＰＣＲ生成物を 以下のようにして精製した。即ち、見込みのあるサイズのバンドをゲル精製し、 再増幅し、そしてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ″ｐｒｉｍｅｒａｓｅ″カラムを用いて カラム精製した。これらはＥｃｏＲＩ及び５ａｌｌで完全に消化し、Ｐｒｉｍｅ ｒａｓｅカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて分析及び再精製し、ＥｃｏＲ Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ消化Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ（−）に結合した。形質転換 体は、はぼ予測されるサイズのインサートを含むｐＢＳ−ＫＳについてスクリー ニングした。クローン化されたフラグメントを、上記６．１．２に記載したよう にしてＤＮＡ配列分析にかけた。

８．１．３　ｒＮＴ−４及びＮＴ−４をコードする完全長のゲノム及びｃＤＮＡ クローンの単離 μｃ’ｒ−ｔｏ中のヒト卵巣ｃＤＮＡライブラリーをＣ１ｏｎｔｅｃｈから得た 。μ：ＺＡＰＩＩ中のヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをＳｔｒａｔａｇｅｎｅか ら得た。ＥＭＢＬ３／ＳＰ６／Ｔ７中のヒトゲノムＤＮＡライブラリーをＣ１ｏ ｎｔｅｃｈから得た。μｍＺＡＰ中のラット脳ｃＤＮＡライブラリーをｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅから得た。

ＮＴ−４クローンの単離は以下のようにして行うことができる： ｒＮＴ−４７ラグメント（図１４　［配列番号６１］）またはｈＮＴ−４フラグ メント（図１５［配列番号６３コ）をコードするクローン化インサートを、ＰＣ Ｒで約５×１０°ｃｐｍ／ｎｇの比活性に標識した。０．５　ｍｇ／ｍｌのサケ 精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、６０℃でハイブリダイゼーシ ョンを行う。フィルターを６０℃で２×５ＳＣ１０，１ＸＳ　Ｄ　Ｓ中で洗浄し 、コダックＸＡＲ−５７イｔＬｔムに一７０℃で露出する。あるいは、その配列 が正確に所望の哺乳類ニューロトロフィンに対応するオリゴヌクレオチドをプロ ーブを生成するのに使用することができ（例えばキナーゼ標識）、また慣用の方 法により同じライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。陽 性ファージをプラーク精製し、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）により記載されたように、液 体ブロス中の適当な大腸菌株に低多重度で感染させる。ＧＴ−１０及び［！ＭＢ Ｌ３／ＳＰ６／Ｔ７フアージは以下のようにして調製する：培養物を３７℃で震 盪しながら１晩インキユベートした。１晩の懸濁物にＬＭ　ＮａＣ１及び８％Ｐ ＥＧを加え、よく混合して１晩４℃でインキュベートしてバクテリオファージを 沈降させる。バクテリオファージを遠心分離により沈殿させ、７Ｍバッファー（ １０ｍＭトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５；　１０＋＋＋Ｍ　ＭｇＣ１２）中に再 懸濁し、ＣｓＣ１段階的勾配上に積層し、適当な速度及び時間で遠心分離してバ クテリオファージをバンド化する。バクテリオファージを取り出し、新しいエツ ペンドルフ管に移し、ｌ容量のホルムアミドを加えることにより溶解する。１０ ０％エタノールの２容量を加えることにより、ＥＭＢＬ−３Ｄ　Ｎ　Ａを沈降さ せる。Ｉｌ：ＭＢＬ−３Ｄ　Ｎ　Ａを微量遠心分離により回収し、７０％エタノ ール中で洗浄し、ＴＥバ・ソファ−（ＩＯ＋ｎＭ　トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７， ５；　１ｍＭ　Ｎａ２−ＥＤＴＡ）中に再懸濁する。ＤＮＡをフェノール：クロ ロホルム：イソミルアルコール（２４：２４　：ｌ）で数回抽出し、エタノール 沈降し、ＴＥバッファー中に再懸濁し、種々の制限酵素で消化し、１％アガロー スゲルを通して電気泳動させる。電気泳動に続いて、制限ＤＮＡをニトロセルロ ースに移し、上記した条件下でＩｍｐ標識ｒＮＴ−４またはｈＮＴ−４プローブ にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズするバンドをｐＢＳ−ＫＳプラスミド ベクター中にサブクローン化し、ジデオキシチェーンターミネーション法（Ｓａ ｎｇｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９７７、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４：　５４６３−５４６７）によりＤＮＡ配列 分析にかける。

μｍＺＡＰプラスミド調製物は以下のようにして作成する：０Ｄ６００＝１．Ｏ ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞の２００μ、高力価相ストックの２００μ及びＲ４０８へ ルバーファージの１μ（ｌ×１０分ｐｆｕ／ｍｌ）を合わせる。陰性対照につい てはファージストックを添加しない。１５分間３７℃でインキュベートする。５ ｍｌの２ＸＹＴ培地を加え、３時間３７℃で震盪する。３時間の終了時には、対 照は濁るが、試料は透明である。

試料を６５℃で３０分加熱し、４０００ｇで５分間回転させる。上清はファージ ミドストックを含む。ファージミドを回収するため、ストックの０．５μをＸＬ Ｉ−ブルー細胞（ＯＤ６００＝１）の２００μに添加する。

１５分間３７℃でインキュベートする。ＬＢアンピシリンプレート上に１−１０ ０μ（好ましくは１０μ）プレート化する。３７℃で１晩インキユベートし、大 きなコロニーを釣り上げる。プラスミドＤＮＡを精製した後、上記のように配列 決定する。

λファージｃＤＮＡライブラリーを上記のように標準的な方法（Ｍａｎｉａｔｉ ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、上山）によりスクリーニングする。

陽性のプラークを精製し、再単離し、上記したようにＤＮＡ配列分析にかける。

８．２　結果及び考察 アフリカッメガエルＮＴ−４コード配列の領域を縮重オリゴヌクレオチドブライ マーの合成のモデルとして使用した。図１３は、５°オリゴヌクレオチドブライ マー２Ｙ［配列番号５３］　（ＱＹＦＦＥＴ）及び３゛オリゴヌクレオチドブラ イマー３Ｙ［配列番号５５］（ＷＩＳＥＣＫ）　、３Ｚ　［配列番号５６］　（ ＣＫＡＫＱＳ）及び４Ｚ［配列番号５８］　（ＷＩＲＩＤＴ）がｘＮＴ−４アミ ノ酸配列から誘導されたことを示す。５゛オリゴヌクレオチドブライマー２Ｚ［ 配列番号５４］　（ＱＹＦＹＥＴ）は、ｒＢＤＮＦの均質領域から誘導されたも のである。これらの縮重オリゴヌクレオチドの全ての可能な組み合わせを、ラッ ト及びヒトのゲノムＤＮＡライブラリーの両方からのＤＮＡ増幅に使用した。ｘ ＮＴ−４の３Ｙ［配列番号５５］及び３Ｚ［配列番号５６］により示されるプラ イマーは、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ／ＮＴ−３遺伝子フアミリーに保存されておらず、 従ってＮＧＦ、ＢＤＮＦあるいはＮＴ−３を増幅しそうにないので、これらの２ 種のプライマーは再増幅、即ち２次ＰＣＲに使用した。

以下のプライマーの組み合わせを使用した場合、ラット及びヒトの両方のゲノム ライブラリーのＰＣＲ増幅及び再増幅から、はぼ予想されたサイズのＤＮＡフラ グメントが得られた。

（１）　２Ｙ／３Ｚ　（１次ＰＣＲ）：　２Ｙ、　２Ｚ／３Ｙ　（２次ＰＣＲ） （２）　２Ｙ／３Ｚ　（１次ＰＣＲ）：　２Ｙ、　２Ｚ／３２　（２次ＰＣＲ） （３）　２Ｙ／４Ｚ　（１次Ｐ　ＣＲ）：　２Ｙ、　２Ｚ／３２　（２次ＰＣＲ ）（４）　２Ｚ／４Ｚ　（１次ＰＣＲ）：　２Ｙ、　２Ｚ／３Ｚ　（２次ＰＣＲ ）はぼ予測されたサイズの２次ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルを通して電気泳 動にかけ、標準法により溶出し、ｔ！ｃｏＲＩ及び５ａｉｌで消化し、ＥｃｏＲ Ｉ−Ｘｈｏｌ消化ｐＢＳ−ＫＳ　ＤＮＡに結合した。陽性形質転換体を選択し、 挿入されたフラグメントをジデオキシチェーンターミネーション法によるＤＮＡ 配列決定にかけた（Ｓａｎｇｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、上山）。

ラットＮＴ−４（図１４　［配列番号６２］）及びヒトＮＴ−４（図１５［配列 番号６４コ）アミノ酸コード配列の部分についてオープンリーディングフレーム が推定された。図１６は、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ／ＮＴ−３遺伝子フアミリーの代表 的メンバーに対する、ｒＮＴ−４（配列番号６２）及びｈＮＴ−４（配列番号６ ４）フラグメントの均質領域を示すものである。

図１５に開示されたものより大きいヒトＮＴ−４の部分をコードするオープンリ ーディングフレームが図１７Ａに示される（配列番号６９及び配列番号７０）。

図１７Ａは３′ヒトＮＴ−４コード領域の別の３°配列情報を示す。１９２　ｂ ｐ核核酸フラグメント上上記図面の説明の項に記載したようにして単離した。

再増幅工程から回収されたＰＣＲ産物の実際の大きさは、ラットＮＴ−４におけ る（ＧＰＧＶＧＧＧ）［配列番号１０１］及びヒトＮＴ−４における（ＧＰＧＡ ＧＧＧ）［配列番号１０２］　ＤＮＡフラグメントの追加の７アミノ酸のために 予測されたものよりも大きかった。

ｒＮＴ−４及びｈＮＴ−４の７アミノ酸挿入物は、ＧＰＧＸＧＧＧ［配列番号１ ００］　（ここでｒＮＴ−４についてはｘ＝ｖ、ｈＮＴ−４についてはＸ＝Ａで ある）と記載される。バリン及びアラニンは非極性Ｒ基を有する。他の哺乳動物 ＮＴ−４タンパク質において位置４に非極性Ｒ基が含まれるように位置４が保存 されるかどうか、あるいは７ｂｐ挿入物自体が他の哺乳動物ＮＴ−４遺伝子の特 徴であるかどうかは現在のところ明らかではない。本発明において記載したよう に魚類ＮＧＦは同じ領域に２２アミノ酸の挿入物を有することは興味深い。

９、実施例：　ＮＴ−４ヒトゲノムクローンの単離と特性決定ＥＭＢＬ３　ＳＰ ６／Ｔ７（クローンチク、に８０２を宿主とする）でヒト胎盤ゲノムライブラリ ーをスクリーニングした。総量１．２５Ｘ１０６　ｐｆｕを大型ＮＺＹプレート に塗布した。シュレイチャーとシュエル（ＳｃｂＩｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕ ｅｌｌ）のニトルセロースフィルターを用いて二重釣り上げ（ｄｕｐｌｉｃａｔ ｅ　１ｉｆｔｓ）を行い、そしてオリゴヌクレオチドブライマー２Ｚ／３Ｚを使 用してＰＣＲで標識した（２Ｚ３Ｚが続くプライマー２Ｚ４Ｚを使用してヒトゲ ノムＤＮＡから得られたｈＮＴ−４クローン１７Ｂからの）１２０　ｂｐプロー ブにハイブリッド形成させた。フィルターを以下のハイブリッド形成の条件下で ６０℃で放射能標識プローブ（１０’　ｃｐｍ／ｍｌ）とハイブリッド形成させ た：　０．５　Ｍ　ＮａＰ（Ｌ　、１％ＢＳＡ、７％ＳＤＳ、　１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ、および１００　ｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、次いでフィルターを６０℃で２ｘ ＳＳＣおよび０．ｌＸ５ＤＳで洗浄し、そしてオートラジオグラフィーを行った 。４日間感光させた後、二重釣り上げで陽性のシグナルを同定した。全部で７個 のプラグを拾い、１　ｍ１５Ｍ緩衝液に入れ、２時間振盪し、そして以下のよう に再びプレートに塗布した：１）　１ｏ−３希釈液（１ｍｌ中に１　μｍ）１０ ０　μｌを細胞１００μｌと混合し、そしてプレートに塗布した；はぼ集密的な プレートが得られた；２）　１ｏ−ｓ希釈液２００μｌで単離プラークを得た。

二重釣り上げを行い、そしてｈＮＴ−４１２０ｂｐプローブを用いて上記のよう にスクリーニングした。２日間の感光後、多数の陽性がプラグＨＧ２．．４およ び７について集密的プレート上で同定された。良好に単離された陽性をＨＯ２− ２とＨＯ２−２の両方のプレート上で同定した。ＨＯ２−２とＨＯ２−２につい て単一プラークを拾い、３Ｍ緩衝液５００μｌに入れ、そして２時間振盪し、そ の後溶出液１００μｌを細胞１００μｌと混合しプレートに塗布した。次いでプ レートをＳＭ緩衝液３ｍｌで満たし、そして上澄みを第一高力価原液として集め た。この第一原液を細胞１００μｍと混合したものを使用して３枚のプレートを 作った。それらのプレートをＳＭ　３　ｍｌで満たし回転機で室温で３時間振盪 した。上澄み液を取り出し、回転して残骸を除去し、その後クロロホルムを添加 し、そしてこれを第二高力価原液として使用した。ＨＯ２−２とＨＯ２−２高力 価原液２μｌをシュレイチャーとシュエルのニトロセルロースフィルターにスポ ットし、ソシテ［アミノ酸ＧＥＬＳＶＣＤ　配列同定番号（ＳＥＩＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ）：１１２）（縮重プライマー）とＫＡＢＳＡＧ（配列同定番号：１１３）（ 完全プライマー）をコードするわれわれのラットＮＴ−４クローン配列に基づい てデザインされたプライマーを使用してラットゲノムＤＮＡからＰＣＨにより得 られた挿入断片を有するプラスミツドから単離された］ｒＮＴ−４１８０ｂｐプ ローブにハイブリッド形成することが見いだされた。プレート溶解物と液体溶解 物をＨＯ２−２、ＨＯ２−２およびＨＯ２−１について調製した。ファージＤＮ Ａを作成し、そのアリコートをアガロースゲルに流し、モしてサザン分析を実施 した。ＨＯ２−２、ＨＯ２−２およびＨＯ２−１がｒＮＴ−４１８０ｂｐプロー ブ（上記のようにＮａＰＯ、ハイブリッド形成、６５°Ｃ）およびヒトファージ クローン１７Ｂ（６ｘｓｓｃ、４５℃ハイブリッド形成）によってコードされる アミノ酸ＧＧＧＣＲＧＶＤＲＲＨＷＶＳＥ［配列同定番号：１１５］に相当する ４５ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブ（ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＧＧＧ ＡＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＴＡＴＣＴＧＡＧ）　［配列同定番 号：１１４］にハイプツト形成することが見いだされた。これらの３種のゲノム クローンの挿入断片の大きさは約９−２３　ｋｂである。これらは共に、スクリ ーニングに使用するプローブ、ｈＮＴ４（１２０ｂｐ）およびｒＮＴ４（１８０ ｂｐ）に緊密に関連している遺伝子のコードエキソンを含有している。ゲノムク ローンのファージＤＮＡを数種の制限酵素で消化し、モしてサザン分析を実施し た。プローブｒＮＴ４（１８０ｂｐ）にハイブリッド形成する適切な断片はブル ースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベクターにサブクローン化できる。

サブクローン化するＤＮＡ断片の大きさは以下の通りである：クローン２−１（ １，Ｏｋｂ　Ｘｈｏｌ断片）、クローン４−２（４、Ｏｋｂ　Ｘｈｏｌ断片）お よびクローン７−２（５、Ｏｋｂ　Ｂａｍ旧断片）。完全コード配列が得られ、 この情報を使用してエキソン境界を同定し、この遺伝子を適切な発現ベクターに サブクローン化させることができる。

この末端に、ヌクレオチド配列分析をヒトゲノムファージクローン７−２につい て実施したが、これはＸｅｎｏｐｕｓ　ＮＴ−４のＤＮＡ配列の縮重オリゴヌク レオチドを使用する、ヒトゲノムＤＮＡに由来するＰＣＲ断片を用いたヒトゲノ ムライブラリーのスクリーニングにより得られた（上記の考察を参照されたい） 。配列分析によりヒトファージクローン７−２はゲノムライブラリーをスクリー ニングするためのプローブとして使用したＰＣＲ断片の配列と同一の配列を含む ことが明らかにされた。この配列は、新規な神経栄養因子（図１８、配列同定番 号ニア５および配列同定番号＝７６）をコードするエキソンと見られるものに含 まれる。

このエキソン（図１９、配列同定番号＝７７）によりコードされるタンパク質を 既知の神経栄養物質と共に並べると、全ての既知の神経栄養物質に見いだされる 特徴を共有することが明らかになった（図１９、配列同定番号ニア８−９２）。

これは、以前に同定された神経栄養物質のプレプロ領域に保存されているものと 同一のアミノ酸の多くが保存されているプレプロ領域を含む。さらにこのプレプ ロ領域は他の神経栄養遺伝子と同一の領域に局在するスプライス受容体部位に先 行される。プレプロ領域は適切な位置にコンセンサスグリコジル化部位も含有し 、そして他の神経栄養物質で見いだされる切断部位と非常に類似している切断部 位で終結している（図１８）。しかしながら７−２のプレプロ領域は、既知の神 経栄養物質のプレプロ領域と比較して長さが短いために特異である。プレプロ領 域のＮ末端部分に長さの減少が生じるが、その部分はプレプロの、ファミリーメ ンバーの間に最も保存されることが少ない部分である。成熟領域は、これまでに 同定された全ての神経栄養物質で見いだされた全ての６システインを保持してい る。神経栄養物質ファミリーの種々のメンバーで共有している残基の多くもまた 保存されている。ヒト７−２クローンによりコードされるタンパク質のラット等 傷物に相当する、ラットゲノムＤＮＡに由来するＰＣＲ断片により共有される広 範囲の配列類似性を除外してコンピュータ配列をすると、７−２フアージクロー ンによりコードされる神経栄養物質はＸｅｎｏｐｕｓ　ＮＴ−４のものに最も類 似していることが明らかになった。これはプレプロおよび成熟領域の両者にあて はまる。７−２クローンによりコードされるタンパク質は、既知の神経栄養物質 と比較して、成熟領域の第二と第三システィンの間に位置する挿入物が存在する ので特異である。

配列分析を、クローン７−２を生成したのと同様のスクリーニング手順で単離さ れた別の２種のヒトクローンについても実施した（上記の考察を参照されたい） 。これらのクローンの配列はクローン７−２から得られたものと、同一ではない が類似していて、これらは、他の既知の神経栄養物質より７−２に、より密接に 関係している新規な神経栄養物質をコードしている可能性が生じてきた。これら のクローンの１種、クローン２−１１の部分配列を図２０に示す（配列同定番号 ＝９３および配列同定番号＝９４）。示された配列は、図１９に示す配列のアミ ノ酸番号５０に相当する位置で始まる。

他のクローン、クローン４−２、の部分配列を図２１に示す（配列同定番号：ｌ １６および配列同定番号：１１７）。

１０、実施例：ヒ）ＮＴ−４の組織特異性発現ヒトゲノムＮＴ−４クローンの完 全コード領域、ＨＯ２−２、を含む６８０　ｂｐ　Ｘｈｏｌ−Ｎｏｔｌ断片を放 射能標識し、種々のヒト組織特異性Ｐｏ１ｙＡ＋ＲＮＡのノーザン分析に利用し た。ヒト組織特異性ｍＲＮＡを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルで電気泳 動により分画し、続いてＩＯＸ　ＳＳＣを用いたナイロン膜へ毛細管移動させた 。ＲＮＡを、紫外線照射により膜に架橋結合させ、そして０．５Ｍ　ＮａＰＯ４ （１）Ｈ７）　、１％ウシ血清アルブミン（画分ｖ１シグマ社）、７％ＳＯ３， １ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１００　ｎｇ／ｍｌ超音波処理変性サケ精子ＤＮＡの存 在下で６５℃で６８０　ｂｐ　Ｘｈｏｌ−Ｎｏｔｌ放射能標識ＮＴ−４プローブ とハイブリッド形成させた。フィルターを６５℃で２Ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤ Ｓを用いて洗浄し、そして増感スクリーンとＸ線フィルムを用いて７０℃で一部 オートラジオグラフィーを実施した。ゲルを臭化エチジウム染色すると、種々の 試料について総ＲＮＡが等レベルで分析されることが示された。

ヒトＮＴ−４プローブは骨格筋、前立腺、胸腺、精巣および胎盤の＋ｎＲＮＡに 強くハシブリッド形成した（図２２）。ＮＴ−４プローブは前立腺ｍＲＮＡより も大きい骨格筋の転写物にハイブリッド形成した。このデータにより、種々の発 現レベル並びに転写サイズを有する小型ヒトＮＴ−４多重遺伝子族が存在し得る ことが示唆される。

筋肉組織でのヒトＮＴ−４が高度に発現することから、本発明は神経系の障害、 特に運動ニューロンに影響する広範囲の神経性障害群の治療に利用し得ることが 示唆される（上記の考察を参照されたい）。さらに、前立腺組織中でヒトＮＴ− ４が高度に発現することから、本発明は前立腺疾患、好ましくはＢＰＨおよび陰 萎の治療に利用し得ることが示唆される（上記の考察を参照されたい）。最後に 、胸腺組織でのヒトＮＴ−４の発現により、本発明は、制限されるものではない が重症筋無力症を含む神経および筋肉組織の免疫学関連疾患の治療に利用し得る ことが示唆される（上記の考察を参照されたい）。

１１、実施例：真核発現ベクターでのヒトＮＴ−４の構築と組換えヒトＮＴ−４ の生物活性の測定 １１．１材料と方法 １１、１．１．ヒトＮＴ−４をコードする真核発現ベクターの構築ヒトゲノムク ローンＨＧ７−２のプレプロ前駆体コード領域を含む２つの真核発現ベクターを ｐＣＭＸ（ＮＲＲＬ　承認番号Ｂ−１８７９０）テ構築り。

た。第１の構築ではｐＣＭＸ（ｐＣＭＸ−ＨＯ２−２０）の正常翻訳開始部位を 利用し、一方、他はＫｏｚａｋ　：ｌンセンサス翻訳開始部位（ｐＣＭＸ−ＨＯ ２−２Ｍ）を利用した。ブルースクリプトのＢａｍＨ１部位にクローン化された 完全コード領域を含むＨＯ２−２の５　ｋｂゲノム断片を以下のオリゴヌクレオ チドを利用してＰＣＲで増幅した：ｈＮＴ４−５’　ＸｈｏＭ：ＣＧＧＴＡＣＣ ＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＡ［配列同定番号 ＋１１８］ ｈＮＴ４−３’　Ｎｏｔ：ＣＧＧＴＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＴＧＧＧ ＣＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧ［配列同定番号＋ｌ１９コ ｈＮＴ４−５’　ＸｈｏＱ：ＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＴ ＧＣＴＣＣＧＡＧＡＧＡＴＧ［配列同定番号：１２０］ ｈＮＴ４−５’　ＸｈｏＭとｈＮＴ４−３’　Ｎｏｔのオリゴヌクレオチドブラ イマーの組み合わせを使用してｐＣＭＸ−ＨＯ２−２Ｍを構築し、一方オリゴｈ ＮＴ４−５’　ＸｈｏＱとｈＮＴ４−３’　Ｎｏｔを使用してｐＣＭＸ−ＨＯ２ −２Ｑを構築した。ｐｃＲ断片をＸｈｏ１／Ｎｏｔｌを用いて消化し、そしてＸ ｈｏｌ／Ｎｏｔｌ消化ｐＣＭＸにサブクローン化した。

１１．１．２　神経栄養物質プレプロ領域をヒトＮＴ−４の成熟コード領域に融 合させるキメラ遺伝子の構築ヒトＮＴ−４の成熟部分をコードする別の２つの真 核発現ベクターを構築した。第一に、ヒトＮＴ−４のプレプロ領域をＸｅｎｏｐ ｕｓ　ＮＴ−４のプレプロ領域で置き換えた（ｐＣＭＸ−ｘＮＴ４／ｈＮＴ４） 。第二に、ヒトＮＴ−４のプレプロ領域をヒトＮＴ−３のプレプロ領域で置き換 えた（ｐＣＭＸ−ｈＮＴ３／ｈＮＴ４）。以下のオリゴヌクレオチドをｐＣＭＸ −ｘＮＴ４／ｈＮＴ４とｐＣＭＸ−ｈＮＴ３／ｈＮＴ４の構築に利用した： （１）　５　’　００Ｍ８：ＧＡＧＡＣＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣ ［配列同定番号：１２１］（２）　ｂＮＴ３／ｈＮＴ４融合（′υＳ′オリゴヌ クレオチド）：ＴＧＣＡＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＴＣＣＧＣＣ ＧＴＧＡＴＧＴ　［配列同定番号二１２２コ（３）　ｈＮＴ３／ｈＮＴ４融合（ ’　ＤＳ’オリゴヌクレオチド）：ＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＡＣＧＧＧＧ ＧＧＴＧＡＧＣＧＡＡＡＣＴＧＣＡ　［配列同定番号：１２３］（４）　ｘＮＴ ４／ｈＮＴ３融合（’　ＤＳ’オリゴヌクレオチド）：ＡＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴ ＡＡＡＡＣＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＧＡＡＡＣＴＧＣＡ　［配列同定番号：　１ ２４］（５）　ｘＮＴ４／ｈＮＴ４融合（’　ＵＳ’オリゴヌクレオチド）：Ｔ ＧＣＡＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＣＣＣ，ＣＣＣＧＴＴＴＴＡＧＣＣＧＧＧＡＡＧＴ 　［配列同定番号：１０９］プラスミドベクター（ｐＣ８−ｈＮＴ３）を含むｈ ＮＴ−３を、プライマーとして５’　００Ｍ８およびｈＮＴ３／ｈＮＴ４融合オ リゴヌクレオチドを用いてＰＣＲテ増幅シタ。プラスミド（ｐＣＭＸ−４１Ｇ？ −２０）を含有するｈＮＴ−４を、ｈＮＴ３／ｈＮＴ４融合’　ＤＳ’オリゴヌ クレオチドとｈＮＴ４−３’　Ｎｏｔｌオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲで増 幅した。得られたＰＣＲ断片をゲルから切り取り、５　’　００Ｍ８およびｈＮ Ｔ４−３’　Ｎｏｔｌオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲで再増幅した。次いで 、生成物を旧ｎｄｌｌｌとＰｓｔＩを用いて消化し、ＨｉｎｄＩＩ［／Ｐｓｔ　 Ｉ消化ｐＣＭＸ−ＨＯ２−２Ｑにサブクローン化した。それ故、発現プラスミド ｐＣＭＸ−ｈＮＴ３／ｈＮＴ４はヒトＮＴ−４の成熟コード領域に融合している ｈＮＴ３プレプロ領域を含んでいた。同様にヒトＮＴ−４発現プラスミド（ｐＣ ＭＸ−ＨＯ２−２Ｑ）を、プライマーとして５’　００Ｍ８およびｘＮＴ４／ｈ ＮＴ４／融合’　ＵＳ’オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲで増幅し、一方ｐＣ ＭＸ−ＨＧ７−２ＱをｘＮＴ４／ｈＮＴ４−融合’　ＤＳ’オリゴヌクレオチド およびｈＮＴ４〜３’　Ｎｏｔｌオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。ＰＣＲ 断片をケルから切り取り、そして５’　００Ｍ８およびｈＮＴ４−３’　Ｎｏｔ オリゴヌクレオチドを用いて再増幅した。次いで生成物を旧ｎｄｌ［［とＰｓ目 を用いて消化し、そして旧ｎｄｌｌｌ／Ｐｓｔｌ消化ｐＣＭＸ−ｔ（Ｇ７−２０ にサブクローン化した。それ故、生じた真核発現プラスミド、ｐＣＭＸ−ｘＮＴ ４／ｈＮＴ４は、ヒトＮＴ−４の成熟コード領域に融合しているＸｅｎｏｐｕｓ 　ＮＴ−４プレプロ領域を含む。

１１、１．３．　ＣＯ５細胞による組換えヒトＮＴ−４の発現ＣＯ５Ｍ５細胞を 濃度１．．５ＸＩ０５細胞／コウスター（Ｃｏｓｔａｒ）６穴皿のウェル、で１ ０％ＦＢＳ、グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム（ＦＯ３以外の全てはイル ビンサイエンティフィク（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社から）を補 足したＤＭＥＭ培地中で培養を開始した。

翌日、細胞を吸引し１．　ＤＥＡＥ−デキストラン（ファーマシア社）４００　 ｇ／ｍｌ　、クロロキン（シグマ社）４００　Ｍ、グルタミン（イルピン社）　 ４　ｍＭ、　Ｉ　Ｘ　ＩＴＳ（インシュリン、トランスフェリン、セレン、シグ マ社）を含むＲＰＭＩ培地２　ｍｌ／ウェルを再供給した。各ウェルに適切なり ＮＡ　２　ｇを添加し、そして渦巻かせて混合した。３種の別々の構築物を使用 した二Ｘｅｎｏｐｕｓ　ＮＴ−４のプレプロ前駆体を含むｐＣＭＸ−ｘＮＴ４　 ；および２種のヒトＮＴ−４構築物であるｐＣＭＸ−ＨＯ２−２ＭとｐＣＭＸ− ＨＯ２−２Ｑ　、　ＤＮＡを添加後、プレートを３７℃５！％ＣＯ＊　インキュ ベータに３時間１５分戻した。次いで培地／ＤＮＡ混合物を吸引し、そしてＣａ ２４、Ｍｇ２＋除去ＰＢＳ中のｌｏｊｉＤＭｓｏ　２　ｍｌ／ウェルを２分間添 加した。ＤＭＳＯ／ＰＢＳを吸引し、そしてウェルを１０％ＦＢＳ　ＤＭＥＭで １回洗浄し、その後１０ＸＦＢＳ　ＤＭＥＭを再供給した。翌朝、生物検定をす るプレートを合成培地（Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｍｅｄｉａ（ＤＭ））で１回洗浄し、 そしてＤＭ２ｍｌ／ウェルを再供給した。３日間ポストトランスフェクションし 、細胞から上澄みを取り分け、微小遠心分離（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇａ ｔｉｏｎ）で残骸をペレット状にした。上澄みを新しい管に移し生物活性を検定 した。

１１、１．４．濃縮運動ニューロン培養物の調製スプラグ−ドーリラット（Ｉ（ ＳＤまたはジビックミラー（Ｚｉｖｔｃ−ＭｉｌＩｅｒ）からの胚（Ｅ１４）を 全ての実験に使用した。妊娠ラットを二酸化炭素窒息させて殺し、そして胚を迅 速に取り出し、さらに切開するために水冷培地に置いた。を髄を懐胎期間１４日 のラット胚から無菌的に取り出した。を髄は厳密に尾から延髄（第−後板神経節 の位置）とし、感覚神経節と付着髄膜を取り除いた。次いでを髄を分離培養のた めに腹部および中央背面体部に細分割した。腹部を髄組織を小片に細分しＰＢＳ 中の０．１％トリプシン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社）および０．０１％デオキシ リボヌクレアーゼｌ型（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）中で３７℃で２０分インキュ ベートした。その後トリプシン溶液を除去し、４５％イーグルの最小必須培地（ ＭＢＭ）　、４５Ｘハムの栄養混合物Ｆ１２（Ｆ１２）、５％熱不活性化子ウシ 胎児血清（ギブコ社）、５％熱熱不活化化ウマ血清ギブコ社）、グルタミン（２ ｍＭ）　、ペニシリンＧ（０，５Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（０，５ ｇ／ｍｌ）から成る培地で洗浄し再び戻した。次いで組織をパスツールピペット で穏やかに粉砕して機械的に分離し、そして上澄みを集め、ナイロンファイバー にテックス（Ｎｉｔｅｘ）　、テラ：］（Ｔｅｔｋｏ）；４０　ｍ）で濾過した 。濾過した細胞懸濁液に、次いで、シュナール（Ｓｃｈｎａａｒ）とシャツフナ −（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ）により述べられた分画手順（１９８１゜Ｊ、　Ｎｅｕ ｒｏｓｃｉ、Ｉ：２０４−２１７）の修飾を実施した。全ての工程を４℃で実施 した。メトリズアミド（Ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅ）をＦ１２：ＭＥＭ（１：１） 培地に溶解し、そして１８％メトリズアミドクッション（０，５ｍｌ）、１７％ メトリズアミド３ｍｌ　、１２％メトリズアミド３　ｍｌおよび８％メトリズア ミド３ｎ＋１から成る不連続勾配を作成した。上記のようにして得られた濾過腹 部を髄細胞懸濁液（２，５ｍｌ）を段階勾配にかけ、管を振動回転器（Ｓｏｒｖ ａｌｌ　ＨＯ２）を使用して２５００Ｘｇで１５分遠心分離した。遠心分離によ り３層の細胞が得られた：画分１（０−８％界面）画分１１（８−１２％界面） および画分ＩＩＩ（１２−１７％界面）。各界面から細胞を少量（約１　ｍｌ） 取り出し、５０％Ｆ１２および５０％ＭＢＭ　、グルタミン（２ｍＭ）補足、イ ンシュリン（５ｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００ｇ／ｍｌ）、プロゲステ ロン（２０ｎＭ）　、プトレッシン（１００Ｍ）および亜セレン酸ナトリウム（ ３０ｎＭ）から成る無血清合成培地で２回洗浄した（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ　 ａｎｄ　５ａｔｏ、１９７９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　７６：５１４−５１７）。生存細胞計数をトリバンブルーの存在下で血球計 数器で数えた。分画した腹部を髄細胞（運動ニューロンで濃縮されている）を、 次いで、ポリーＬ−オルニチン（シグマ社：１０　ｇ／ｍｌ）およびラミニン（ ギブコ社：１０　ｇ／ｍｌ）で被覆した６　ｍｍウェルに濃度１００゜０００細 胞／ｃ＋＋＋’で塗布した。塗布した日にＮＴ−４を含有するＣＯ８細胞上澄み で処理した。培養物を３７℃で９５％空気７５％ＣＯｔ雰囲気でほぼ１００％の 相対湿度で無血清合成培地に保持した。２日間（４８時間）に、Ｆｏｎｎｕｍ、 １９７５．Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、２４：４０７−４０９に記載されている コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の測定をするために細胞を採取し た。

１１１．５．濃縮ヒト運動ニューロン培養物の調製７−９週齢のヒト胚原材料を ジュネーブ州立病院で吸引堕胎から得た。肝組織を実験に使用する適切な承諾書 を病院の婦人科および産科倫理委員会から得た。胚の年齢は月経歴、足の大きさ く５ｔｒｅｅｔｅｒ、１９２０．　Ｃｏｎｔｒｉ、　Ｅｍｂｒｙｏｌ、　１１． １４３）および外部特徴（Ｍｏｏｒｅ、　１９８２．　ｉｎ　’　Ｔｈｅ　Ｄｅ ｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｌ（ｕｍａｎ’　、に、Ｌ、　Ｍｏｏｒｅ、　ｅｄ、、　ｐ ｐ　７０−９２．　Ｗ、Ｂ、　５ａｕｎｄｅｒｓ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ ）より推測した。原材料を切開するまで２−６時間４℃で保持した。を髄を注意 して単離し、全てのを語根を取り出し、モして髄膜および他の付着組織を廃棄し た。を髄を細分割しＣａ”、Ｍｇ２＋除去食塩水中の０．１２％トリプシンで３ ７℃で１０分インキュベートした。細胞をピペットで繰り返し粉砕して懸濁液と なるよう分散させた。細胞を遠心分離し標準培養培地（ＭＥＭプラス１３％非補 足ヒト血清）に再懸濁した。ベトリ皿に濃度１ｍｇ／ｍｌのポリオルニチン溶液 を３７℃で１時間入れ、プレートに塗布する前にリン酸塩緩衝液生理食塩水（Ｐ ＢＳ）で３回洗浄した。細胞を６および１１ｍｍ組織培養ウェルウェル上れぞれ 濃度４Ｘ１０’および１０−１５　ＸＩＯ″細胞で塗布した。培養物を５％　Ｃ ｏｔ１０ｓ空気中で３７℃で保持した。培地は３日おきに換え、そして培養の最 後の４日間はシトシンアラビノシド（ａｒａ　Ｃ）（ａＦ’　Ｍ）を添加した。

ヒト神経栄養因子ＣＮＴＦ、　ＮＴ−３およびＮＴ−４を培養期間の開始時から 、濃度１０　ｎｇ／ｍｌで添加し、そして培養培地を３日おきに換えた。コリン アセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を”＋１−アセチル補酵素Ａの合成を 測定することにより測定した。ＣｈＡＴ測定は、Ｒａｙｎａｕｄ、　ｅｔａｌ、 、１９８　７．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、１１９：３０５−３１２およびＭａｒｔ ｉｎｏｕ　ｅｔａｌ。

、　１９８９．　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｌ、　９：３６４５−３６５６（１９８９ ）の変法と共にＦｏｎｎｕｍ。

Ｆ、　Ｊ、、　１９７５．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　２４：４０７−４０９の方 法に従って実施した。

１１．２　結果 １１．２．１　生物学的に活性な組換えヒトＮＴ−４の真核発現各ｐＣＭＸ由来 構築物（ｐＣＭＸ−ＨＯ２−２Ｑ、　ｐＣＭＸ−ＨＯ２−２Ｍ　、　ｐＣＭＸ− ｈＮＴ３／ｈＮＴ４および匹ＭＸ−ｘＮＴ４／ｈＮＴ４）からプラスミドＤＮＡ を調製し、別々にＣＯ３細胞にトランスフェクトさせた。各トランスフェクト細 胞系からのＣＯ８上澄みをそれぞれのＮＴ−４の各組換え型の生物学的活性を評 価するために利用した。試験したＣＯ３上澄みの体積は総体積２ｍｌ中の１Ｏ１ ５０および２５０μｍであった。Ｑｌ（ｐＣＭＸ−ＨＯ２−２Ｑ）　、ＮＴ（ｐ ＣＭＸ−ｈＮＴ３／ｈＮＴ４融合）およびＸ　１（ｐＣＭＸ−ｘＮＴ４／ｈＮＴ ４）はＤＲＧ移植片に対して神経突起促進活性を有していた（図２３）。さらに Ｑ（９層ＭＸ−１１０７−２０）およびＭ（ｐＣＭＸ−）ＨＯ７−２Ｍ）（７） 両方をＤＲＧ分離細胞に対する生存促進活性について試験した。試験した体積は 総体積２ｍｌ中の５−２５０μＩであった。分離ＤＲＧニューロンの培養物に添 加した場合は、ｈＮＴ４を含有するＣＯ８上澄みは、模擬トランスフェクトＣＯ ８上澄みでの生存１０％と比較してニューロン生存３０％を促進した（図２４） 。

ｐＣＭＸ−ＨＯ２−２Ｍを用いてトランスフェクトしたＣＯ８細胞の上澄みのヒ ト組換えタンパク質の生物学的作用を、上記の実施例セクションＩ１．１．４． 　に記載したように調製した運動ニューロン濃縮培養物について、そして上記の 実施例セクション１１．１．５．に記載したようにヒトを髄ニューロンについて 試験した。ｌ：５に希釈したヒトＮニー４由来ｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｍを用いて 運動ニューロン濃縮培養物を処理すると、未処理（Ｃ−ＮＴ）および模擬トラン スフェクト（ＭＯＣＣ０３）対照と比較して、４８時間後にコリンアセチルトラ ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性が２．９倍増加した（図２５）。ＣＡＴ活性の増 加は、ｌ：５０希釈を試験した場合は１．７倍に低下したが、これによりこれが 用量依存性反応であることが示唆される（図２５）。

ＣｈＡＴ活性により測定した、ヒトを髄ニューロンに対する神経栄養物質の生物 学的作用は以下のようであった。実験によりＣｈＡＴ値に差異があるので、種々 の実験結果を比較するために対照のウェルの値を１００％に標準化した。２０の 別個の培養物から結果を集め、平均＋／−３，Ｅ、Ｍ、（ｎ＝ウェルの数）とし て表す：条件（ｎ）　ＣｈＡＴ活性Ｘ 対照（７７）　１００ ＮＴ−３（２４）　２３１＋／　−２３ＢＤＮＦ　（１２）　２５２＋／　−２ ７ＮＴ−４（２５）　３１８＋／　−３８１１、３考察 本発明は組換えヒトＮＴ−４を発現するｉｎ　ＶｉｔｒＯ真核発現系の利用を提 供する。本発明はＣＯ８細胞で生物学的に活性な形態の組換えヒトＮＴ−４を発 現するいくつかの戦略を開示する。１つの実施例では、ＮＴ−４プレプロ前駆体 をコードするＤＮＡ配列を２種のＰＣＲ増幅戦略を利用して増幅し、ｐＣＭＸ翻 訳開始部位（ｐＣＭＸ−）ＩＯ２−２Ｍ）またはＫｏｚａｋ　Ｄンセンサス翻訳 部位（ｐＣＭＸ−ＨＯ２−２Ｑ）のいずれがを含むｐｃＭＸ−由来発現プラスミ ドを生成した。別の実施例では、ＸｅｎｏｐｕｓＮＴ−４のプレプロ領域（ｐＣ ＭＸ−ｘＮＴ４／ｈＮＴ４）またはヒトＮＴ−３のプレプロ領域（１）ＣＭＸ− ｈＮＴ３／ｈＮＴ４）（７）　イずれかをＮＴ−４（７）成熟コード領域に融合 させる２種のキメラ神経栄養遺伝子を、ｃｏｓ細胞で発現させるために構築した （　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＮＴ−４を発現するキメラ構築物の使用を考察するため に上記のセクション５を参照されたい）。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ真核発現系での生物学的に活性な形態のヒトＮＴ−４の発現に より、ヒト組換えＮＴ−４、ペプチドまたはその誘導体の生成の規模を、上記に 考察した治療および診断の両方への適用のために拡大することが実質的に容易と なる。本発明の観点から、当業者は、開示した同−ＤＮＡ配列または相同である が異なるＮＴ−４様タンパク質またはその誘導体をコードする類似のＤＮＡ配列 を含むプラスミドを直ちに構築できる。習熟した者は、真核発現系で使用する発 現プラスミドを構築するために、当分野で既知の膨大なりＮＡプラスミドベクタ ーの中から精選することもできる。組換えヒトＮＴ−４は、全プレプロ前駆体と してまたは神経栄養物質−由来キメラ構築物を介して生成されていようとも、Ｄ ＲＧ外植片での神経突起成長に対する組換えＮＴ−４ＣＯ３上澄みの刺激作用並 びにラットおよびヒト培養運動ニューロンに対する生物活性により示されたよう に生物学的に活性であることが示された。

１２、実施例：ｔｒｋＢはニューロトロフィン−４の受容体であＣＯ８細胞上清 液を、３Ｔ３繊維芽細胞を用いた生存アッセイで試験した。このアッセイ系で、 ３Ｔ３繊維芽細胞（これはニューロトロフィン受容体タンパク質を発現しない） は、ｔｒｋＡ。

ｔｒｋＢ、またはｔｒｋＣをコードする哺乳類の発現ベクターでトランスフェク トされる。３Ｔ３繊維芽細胞の生存は、各神経栄養因子の添加とその受容体特異 的結合に依存している。

Ｃ０３−Ｍ５細胞を培養し、実施例セクション１１．１．３に記述するようにｐ ＣＭＸ−ＨＯ２−２Ｑ、ｐＣＭＸ−ＨＯ２−２ＭまたはｐＣＭＸ−ＨＯ２−２Ｑ でトランスフェクトした。

全長ラットｔｒｋＡ　ｃＤＮＡクローンはスタッフォード大学エリツク・シュー タ−博士（叶、Ｅｒ１ｃ　５ｈｏｏｔｅｒ、　５ｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒ ｓｉｔｙ）より入手した。このラットｔｒｋＡ　ｃＤＮＡクローンを、哺乳類の 発現ベクターｐＣＭＸにサブクローン化し、ｐＣＭＸ−ｔｒｋＡを作成した。

全長ラットｔ　ｒｋＢおよびｔｒｋＣｃＤＮＡクローンを、ラムダＺＡＰ２ベク ター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中のラット脳ＣＤＮＡライブラリーをラットｔｒ ｋＢ特異的およびｔｒｋＣ特異的オリゴヌクレオチド（ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ の５′および３′コード領域のほとんとと対応する）を用いてスクリーニングし て得た。ラットｔｒｋＢおよびｔｒｋＣｃＤＮＡをｐＣＭＸにサブクローン化し 、ｐＣＭＸ−ｔｒｋＢおよびｐＣＭＸ−ｔｒｋＣを作成した。

３Ｔ３繊維芽細胞は、ｃＩａｓｓら、１９９１．　Ｃｅ１ｌ　６６：４０５−４ １３が記述するように培養しトランスフェクトした。

この生存アッセイ系では、３Ｔ３繊維芽細胞（これはニューロトロフィン受容体 タンパク質を発現しない）は、ＮＧＦのチロシンキナーゼ受容体をコードするガ ン原遺伝子であるｔｒｋＡＳＢＤＮＦおよびＮＴ−３の機能的結合タンパク質と して働くチロシンキナーゼであるｔ　ｒｋＢ、またはＮＴ−３の機能的結合タン パク質として働くチロシンキナーゼであるｔｒｋＣでトランスフェクトされてい る。これらトランスフェクトされた細胞の生存は、対応するニューロトロフィン の添加に依存しており、したがってニューロトロフィンの生物学的活性のアッセ イに用いることができる。

１２．１．２．ＰＣ１２細胞のトランスフェクション全長ラットｔｒｋＢ　ｃＤ ＮＡクローンを、ｐｃＤＮＡ　１発現ベクター（Ｉｎｖｉ　ｔｒｏｇｅｎ）のＣ ＭＶプロモーターの制御下に置いた。このベクターは、ＬＴＲにプロモートされ るネオレジスタンス遺伝子（ｎｅｏ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅ）をも含 有する。ＰＣ１２細胞（スタッフォード大学エリツク・シュータ−博士からの寄 贈）（１０ｃｍディツシュあたり細胞数１０’個）を２４時間、２５ｍｇのＤＮ Ａおよびｌｏｏｍｇのりポフエクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ。

ＧＩＢＣＯＢＲＬ　）を含有する５ｍｌのＯｐ　ｔ　ｉＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）で培養し、洗浄して新しい培地に置いた。トランスフェクション５日後 に細胞を０．４ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１Ｂ中で選択した。耐性コロニーの、１１００ ｎ／ｍｌ　ＢＤＮＦ存在下での分化を調べ、今後の研究のため１個のクローン（ ＰＣｌ　２／　ｔ　ｒ　ｋＢ）を選択した。

１２．　１．　３．架橋実験 架橋実験を以下のように実施した。要約すると、皮質、海鳥および線条由来の細 胞系および細胞懸濁液をＰＢＳ−グルコース中でｌｎＭのＩｔｓ　ｌ標識ＮＴ− ４と共に、過剰な冷ニューロトロフィンの存在下または不在下で、２時間４℃で インキュベートした。

架橋剤（１２’　Ｉ−ＢＤＮＦおよび１２’　Ｉ−ＮＴ−４には６ｍＭＥＤＡＣ １”’　Ｉ−ＮＧＦには０．２ｍＭ　ＤＳＳ）を添加し、室温で２０分間回転さ せた。この混合物をｔｒｉｓ／ＮａＣ１を含有する溶液で３回洗浄した。細胞ペ レットを完全ＲＩＰＡ溶解緩衝液に再度懸濁した。遠心にかけた後、架橋複合体 を含有する上清液をｔｒｋ−抗体（ＨＯ２２）を用いて免疫沈降させ、電気泳動 にかけた。固定し、乾燥させたゲルをオートラジオグラフィこのバイオアッセイ でＮＴ−４を含有するＣＯ８細胞上清液を添加したところ、４８時間後に３Ｔ３ 　ｔｒｋＢ培養物にのみ生存細胞が残ることが判明した（表２参照：ここには示 していないデータが、ＮＴ−４含有ＣＯＳ細胞上清液は３Ｔ３　ｔｒｋＣ培養物 の生存を支持できないことを示した）。したがって、これらの結果はＮＴ−４タ ンパク質がこの系で生物学的活性を有することを実証し、また、ｔｒｋＡもしく はｔｒｋＣではなくｔｒｋＢがＮＴ−４の機能的結合タンパク質として働くこと を示唆している。

表２ ｔｒｋＡおよびｔｒｋＢを発現する３Ｔ３細胞系に対するＣＯ８上清液のアッセ イ 希釈　モック　ＨＯ２−１（Ｏ７−ｈＮＴ３／２Ｑ　２Ｍ　ｈＮＴ４ １：５０　−　−　−　− ３Ｔ３−ｔｒｋＡ　１：２０　−　−　−　−１：５０　−　−　−　− ３Ｔ３−けｋＢ　１：２０　−　＋　＋　＋１：５０　−　十　＋　＋ １２、　２．　２．　ヒトおよびラットのＮＴ−４はｔｒｋＢを特異的に活性化 する能力においてアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ＮＴ　一種々のｔｒｋ 受容体を活性化する能力について、ヒトおよびラットのＮＴ−４とｘＮＴ−４を 比較するため、我々は初めにこれら３種類のタンパク質をすべてＣＯ８細胞中に 一時的に発現させた。これら３種類のタンパク質すべてがＣＯ８細胞によってほ とんど等しい量で産生されることを実証するため、代謝標識を採用した（データ は示していない）。次に、これら３種類のタンパク質を含有するＣＯ８細胞上清 液を、ＮＴＨ３Ｔ３繊維芽細胞中に発現された３種類の公知ｔｒｋのチロシンリ ン酸化を引き起こす能力について試験した。ヒトおよびラットのＮＴ−４は、ｔ ｒｋＢのチロシンリン酸化を引き起こすことが特異的に可能であるがｔｒｋＢま たはｔｒｋＣのそれはできないという点で、ｘＮＴ−４と同じである（図２６参 照）。さらにヒトＮＴ−４およびｘＮＴ−４は、極めてよく似た用量依存性を示 してｔｒｋＢのチロシンリン酸化を引き起こした（図２７Ａ参照）。ヒトＮＴ− ４およびｘＮＴ−４はまた、ｔｒｋＢ受容体を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖 を引き出す能力においても似かよった用量依存性を示した（図２７Ｂ参照）。さ らに両者は、導入されたｔｒｋＢ受容体を発現するＰＣ１２細胞における軸索の 成長を刺激した；ヒトＮＴ−４もｘＮＴ−４も、これらの細胞のトランスフェク トされていないもの、または他のｔｒｋ受容体を発現する細胞からは、表現型効 果を引き出せなかった（データは示していない）。したがって哺乳類ＮＴ−４お よびｘＮＴ−４は、機能的にｔｒｋＢを活性化するがｔｒｋＡまたはｔｒｋＣは しないという能力において、非常によく似ている。

１２．２．３．ＮＴ−４によるｔ　ｒｋＢのチロシンリン酸化上記のアッセイは 、哺乳類ＮＴ−４１５とｘＮＴ−４がｔｒｋＢの特異的リガンドである点におい てＢＤＮＦと似ているばかりでなく、ｔｒｋＢを活性化する能力においてもＢＤ ＮＦと同じくらい強力でありうると示唆した。すべての公知の哺乳類二二一口ト ロフィンの公知ｔｒｋ受容体のそれぞれに対する特異的活性を直接測定するため 、我々はまず哺乳類ニューロトロフィンのそれぞれについて高度に精製された調 製物を得た。次に、これら精製因子のそれぞれを、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞中に 発現された各ｔｒｋ受容体のチロシンリン酸化を引き起こす能力について試験し た。ＮＧＦは明らかにｔｒｋＡの優先的リガンドで、非常に高濃度のＮＴ−３お よびＮＴ−４によってもｔｒｋＡのチロシンリン酸化誘発はごく少なかった。他 方、ＮＴ−３は明らかにｔｒｋＣの優先的リガンドであり、非常に高濃度のＢＤ ＮＦによってもｔｒｋＣのチロシンリン酸化誘発はごく少なかった（図２８Ａお よび２８Ｃ参照）。ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４はすべてｔｒｋＢのチロ シンリン酸化を引き起こすのに非常に効果的だった。

ただし、ＮＴ−３による誘発は飽和に達するのにより高（Ｘ濃度を必要とするよ うに思われた（図２８Ｂ参照）。

リン酸化を誘発する特異的活性と機能効果のために要求される活性を比較するた めに、次に精製ニューロトロフィンのそれぞれについて、各ｔｒｋ受容体を発現 しているＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を促進する能力を試験した。印象的なことに、 繊維芽細胞における細胞増殖の用量応答は、はぼ正確にリン酸化の用量応答と一 致した（図２８のパネルＡ、ＢおよびＣをり、ＥおよびＦと比較されたい）：こ のアッセイによって、ＢＤＮＦとＮＴ−４ＧｔｔｒｋＢを活性化する能力におい ては本質的に区別不可能であったが、ＮＴ−３は約５０倍弱かった。すべての場 合において、各ｔｒｋ受容体の「優先的」リガンド（すなわちＮＧＦはｔｒｋＡ の、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４はｔｒｋＢの、そしてＮＴ−３はｔｒｋＣのリガン ド）は、ｌ〜ｌ　Ｏｎ　ｇ／ｍ　１の間でその最大活性の５０％（ＥＣ，。−ｓ ）を示した。

１２．２．４．ＮＴ−４によるＰＣＩ２／１ｒｋＢ細胞の活性化３Ｔ３／１ｒｋ Ｂ系に加え、我々はヒトＮＴ−４がＰＣ１２／ｌ　ｒｋＢ細胞中のｔｒｋＢを活 性化する能力を比較した。試験した４種類の二二一口トロフィンのうち、ＰＣ１ ２親細胞はＮＧＦにのみ応答する（図２９参照）。しっかりとｔｒｋＢでトラン スフェクトしたＰＣ１２細胞では、ＮＴ−４が軸索を有するＰｃｔ２／１ｒｋＢ 細胞の生存（図２９Ｂ参照）とパーセンテージ（図２９Ａ参照）を用量依存的に 高めた。これはＢＤＮＦを用いたときに見られたものと同様であった。ＰＣ１２ ／１ｒｋＢ細胞はＮＴ−３に対しては高濃度の時にのみ応答した。ＰＣｌ３また はＰＣＩ２／１ｒｋＢ細胞に対して４種類のニューロトロフィンを用いたチロシ ンリン酸化アッセイの結果は、次のことを示した。すなわち、ＰＣＩ２細胞にお いては、ＮＧＦがｔｒｋＡのリン酸化を引き起こし、また誘発し、ＰＣ１２／１ ｒｋＢ細胞においてはＢＤＮＦ、ＮＴ−４およびＮＴ−３（少し程度は低いカリ がｔｒｋＢのリン酸化を引き起こした（図２９Ｃ参照）。

放射性ヨウ素化ニューロトロフィンを用いて架橋実験を実施した。ヨウ素化ＮＧ Ｆは、ＰＣ１２細胞、線条体ホモジネート（ラット生後７日）（図３０Ａ参照） および３Ｔ３／１ｒｋＡ細胞（データは提示していない）中の、ｔｒｋ抗体と共 に免疫沈降可能なあるタンパク質（ｔ　ｒｋＡと推定される）に架橋することが 分かった。すべての場合、この架橋タンパク質は過剰な冷ＮＧＦによって競合さ れ得たが、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３またはＮＴ−４によってはされなかった。このデ ータは、ＮＴ−４が細胞系中でまたはｉｎ　ｖｉｖｏでｔｒｋＡ受容体と認め得 るほどには相互作用をしなかったことを示す。同様に、ヨウ素化ＢＤＮＦは３Ｔ ３／１ｒｋＢ細胞、ＰＣ１２／１ｒｋＢ細胞（データは提示していない）、およ び皮質（ラット生後７日）中のｔｒｋと免疫沈降可能なあるタンパク質（ｔｒｋ Ｂと推定される）に架橋することができた；この架橋タンパク質はＢＤＮＦおよ びＮＴ−４によって、またより低い程度までであるがＮＴ−３によって競合され 得たが、ＮＧＦによってはされなかった（図３０Ｂ参照）。ヨウ素化ＮＴ−４架 橋実験も同様な結果を示した。すなわち、３Ｔ３／１ｒｋＢ細胞、ＰＣ１２／１ ｒｋＢ細胞（データは提示していない）、皮質および海馬（生後７日）において 、ＮＴ−４架橋タンパク質はＢＤＮＦおよびＮＴ−４によって、またより低い程 度までであるがＮＴ−３によって競合され得たが、ＮＧＦによってはされなかっ た（図３０Ｃ参照）。

培養された一次ニューロンにおけるニューロトロフィン応答を調べた。胎児性Ｅ １４ラット後根伸根神経来の感覚ニューロンの生存は、公知のニューロトロフィ ンのすべてによって、しかし様々な程度まで、支持された。これは、神経節中に おける異なったニューロンサブ集団が異なったニューロトロフィンに応答してい ることを示唆する（図３１参照）。直ちに外植された後板神経節および個々のニ ューロトロフィンの存在下で２４時間維持した後の神経節からＲＮＡを調製した ；この２４時間の処置後、与えられたニューロトロフィンに対して応答する（そ して、それゆえそれに対して適切なｔｒｋ受容体を発現していると推定される） ニューロンのみが生存し、他方応答しないニューロンは死亡する。

動物から直ちに摘出された未処置の神経節は、すべてのｔｒｋを発現した（図３ ２）。対照的に、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４の存在下で生存する神経節ニューロン は有意なｔｒｋＢメツセージを示したが、検出可能なｔｒｋＣメツセージは何ら 示さなかった（図３２参照）。ＮＴ−３の存在下で生存する神経節ニューロンは ｔｒｋＣを発現したが、ｔ　ｒｋＢは発現しなかった。これらのデータは、ＮＴ −４がｔ　ｒｋＢに作用し、ｔｒｋＣには作用しないことを実証した。ｔｒｋＡ を用いて同様の研究をすることは不可能だった。なぜなら、ｔｒｋＢを発現する ニューロンとｔｒｋＣを発現するそれとの相互に排他的な関係とは対照的に、こ れら両ニューロンの相当数がｔｒｋＡを共発現しているように思われるからであ る（データは提示していない）。

ＮＴ−４をラクトペルオキシダーゼ法の変法によってヨウ素化した。簡単に述べ ると、ｌｍＣ１のＮ　ａ　”’　Ｉ　（ＮＥＮ）を１゜２μｇのラクトペルオキ シダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、８５μＭ　の過酸化水素および１０μｇのＮＴ−４に ｐＨ６，０で１２分間添加した。反応は、０．１Ｍ　ヨウ化ナトリウム、０．１ Ｍリン酸ナトリウム、および１．０Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７，５を加えること によって停止した。反応物は、ＰＢＳ中で２％ウシ血清アルブミン（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）を用いてｌ：１に希釈した。

その溶液を透析し、遊離の（結合していない）　目＝　ｘを除去した。

結合率（５５％）は薄層クロマトグラフィーによって測定した。

比活性（２０４７ｃｐｍ／ｆｍｏｌ）はＮＴ−４の分子量２６゜０００に基づい て計算した。

坐骨神経の研究のため、成体雄スプラーグードーリ−（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗ ｌｅｙ）ラット（Ｚｉｖｉｃ　Ｍｉｌｌｅｒ；　２００〜２２０　ｇ　；　ｎ＝ 　３０）をベンドパルビタール（３５，２ｍｇ／ｋｇ）および抱水クロラール（ １７０ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔し、右坐骨神経を露出サセタ。２　ｕ　Ｉ（ ７）”’　Ｉｍ識ＮＴ　４　（ＰＢＳ＊７’ｌ：ハ５　ｏ倍過剰の無標識二二一 口トロフィンを含有する）を閉鎖筋内側の朧の位置でハミルトン注射器を用いて 神経に注入した。傷口を縫合し、動物を１８時間回復させた。ラットを層殺し、 ＤＲＧを摘出し、４％パラホルムアルデヒドに漬け、ガンマカウンターで１分間 計測した。平均輸送値における差は、差異分析（ＡＮＯＶＡ）により分析した。

交感神経の輸送を研究するため、＋２％　１標識ＮＴ−４を（Ｊ。

ｈｎｓｏｎら、１９７８の）記述にしたがって前眼房に注入した。

１６時間後にＳＣＧを摘出し、ＤＲＧの場合と同様４％パラホルムアルデヒド中 で計測した。

固定したＤＲＧおよびを髄を緩衝化スクロースを用いて平衡させ、メチルブタン 中に凍結し、クリオスラット中で切片を作製しくＤＲＧおよびＳＣＧについては １０μｍ、を髄については２０μｍ）、顕微鏡スライド上にマウントした。潅流 した動物の脳を摘出し、緩衝化スクロース中で平衡させ、２５μｍ凍結切片を前 頭面で切り出し、マウントした。次に、スライドを確立された手順（Ｃｏｗａｎ ら、１９７２）にしたがってエマルジョンオートラジオグラフィー用（Ｋｏｄａ ｋ　ＮＴＢ−２エマルジヨンを使用）に加工した。暴露時間は１〜３週間の範囲 であった；しがし、どの個別領域についても匹敵する暴露時間が使われた。現像 の後、チオニンを用いてエマルジョン（ＮＴＢ−２，Ｋｏｄａｋ）を介して組織 を対抗染色した。

脳内の輸送に関与する研究のため、雄スプラーグードーリーラットを抱水クロラ ール−ベンドパルビタールで麻酔し、定位器具に固定した。少量の１２ｓ　Ｉ標 識栄養因子（０，２〜０．　５μｌ）をホウケイ酸ガラス製マイクロピペットを 用いてゆっくり海馬または新線条体に注入した。他の実験では、より大量（１０ μｌ）の栄養因子を右側脳室に注入した。傷口を閉じ、動物を回復させた。約２ ４時間後に動物を層殺し、その脳を緩衝化パラホルムアルデヒドのトランスカー ディアル（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌ）潅流により固定した。次に、脳を摘出し 、切片を作製し、フィルムおよびエマルジョンオートラジオグラフィー用に加工 した。海馬への注入は、歯状口／ＣＡ４−門領域を中心に行なった。線条体への 注入は、吻側尾状核−被殻を中心に行なった。大脳脳室内（ＩＣＶ）への注入は 、脳室空間に注入されたことが実証された。同様の量の目５■標識ＮＧＦ、ＮＴ −３およびＢＤＮＦが以前の実験でこれらの部位に注入されており、これがＣＮ Ｓ内における分布および逆向き輸送パターンの特異性についての明確な決定を可 能とした。

１４．２．結果 １４、　２．　１．脳内におけるＮＴ−４の輸送フィルムおよびエマルジョンオ ートラジオグラフィー実験（表３参照）は、ＮＧＦ同様、逆向きに輸送されたＮ Ｔ−４と結合した標識は中央隔壁および対角帯の大型細胞ニューロンによく集ま ったことを示した。これらの細胞は海馬にコリン作動性インブ・ソトを提供する ことが知られている。一般的に、ＮＴ−４を注入された動物と比較して、ＮＧＦ を注入された動物ではより多くの大型細胞ニューロンが標識されるように思われ る。

今日までに入手可能だったフィルムおよびエマルジョンオートラジオグラムは、 線条体内または海馬内に注入されたＮＴ−４がＣＮＳの他の細胞グループに輸送 されるという証拠を提供していない。このことは、ＣＮＳ内に広範に輸送される ＢＤＮＦについて得られた結果とは著しく対照的である（表３参照）。

表３．放射性ヨウ素化ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−４の海馬への注入に続く逆 向きニューロン標識脳領域　ＮＧＦ　ＢＤＮＦ　ＮＴ−４ 基底前脳 中央隔壁　＋＋＋＋　＋＋　＋＋ 対角帯（Ｖ）　十＋＋＋　＋＋　＋＋ 対角帯（ｈ）　＋＋　＋　＋ 基底核メイネート （Ｍｅｙｎｅｒｔ）　＋　−− 海馬 門／ＣＡ　４　＋＋＋＋　− 門／ＣＡ４（反対）−＋＋＋　− 歯状口　？？？ 鉤状口　十　− 傍鉤状回　十＋＋− その他 乳腺上積　＋＋　＋＋＋　− ルーニエンス （Ｒｅｕｎ　ｉ　ｅｎｓ）咳　−十　−鼻内皮質　＋十＋− 上記のデータはエマルジョンオートラジオグラフィー実験によって得たものであ る。プラスは与えられた領域内における標識された細胞の相対数を表し、ｒ＋＋ ＋＋Ｊは多数の標識細胞を示し「＋」は少数のそれを示す。マイナスは標識細胞 が全く観察されなかったことを示す。疑問符は、注入部位に近いため評価が困難 な領域を示す。

１４．２．２．ＩＣＶ投与後（７）ＮＴ−４の分布以前の実験で我々は、ＩＣＶ （大脳脳室内）に投与されたＮＧＦは脳実質中に広く拡散し、ＮＧＦ応答性のニ ューロン集団（例：基底前脳のコリン作動性ニューロン）にとって放射性標識リ ガンドが使用可能となり、またそこで濃縮されるほどであることを発見した。Ｎ Ｔ−３、および特にＢＤＮＦの脳物質内への拡散は、ラットではははるかに制限 されており、最大でも脳実質内の２〜３個のニューロンにはっきり識別するのに 十分な量（７）Ｉｌｍ　ＢＤＮＦが集中しているほどである。ＢＤＮＦ　（およ び少し少量のＮＴ−３）のＩＣＶ投与後に、脳室上衣の先端表面の標識をすると 特に顕著である。

［”’　Ｉ］　−ＮＴ−４のＩＣＶ投与後に見られる分布パターンは、他のニュ ーロトロフィンについて上に記述されたものと明確に異なっている。ＮＧＦにつ いては、ＮＴ−４と結合した標識は、特に注入部位の高さでは脳室の境界をなす 編物質まである距離にわたって分散される。そこには同様に大脳外クモ膜下ＣＳ Ｆ空間から神経組織への若干の拡散がある。

”５１−ＮＴ−４はＬ４およびＬ５　ＤＲＧニューロンによって逆向きに輸送さ れた。これは、反対側（注入されていない側）のＬ４またはＬ５　ＤＲＧにはほ とんど蓄積せず、また１６倍過剰のＮＴ−４の共注入によって輸送がブロックさ れたという事実によって評価されるように特異的であった。ＮＴ−４の輸送は、 ニューロトロフィン群のすべてのメンバーによって様々な度合でブロックされた 。ＢＤＮＦとＮＧＦ（５７倍）は輸送をブロックする点でほとんど同等であった 。他方、ＮＴ−３は５７倍過剰で注入されるとＮＴ−４と同じだけ効果的であっ た。ＮＴ−４は前眼房に注入されるとＳＣＧニューロンに輸送された。

ＮＴ−４をラクトペルオキシダーゼ法により比活性２４００〜３５００ｃｐｍ／ ｆｍｏｌ　（１２１１〜１７８９ｃｉ／ｍｍｏｌＮＴ−４）までヨウ素化した。

［”’　Ｉ］　−ＮＴ−４を４℃で保存し、調製後１〜３日以内に使用した。放 射性ヨウ素化ＮＴ−４の生物学的活性をバイオアッセイにより実証した。

雄スブラーグードーリーラット（２００〜２５０　ｇ、　Ｚｉｖｉｃ　Ｍｉｌ　 １ｅｒ）を１２時間＝１２時間の明：暗サイクルで飼育し、水と食料を自由に摂 取させた。各ラットの脳と眼を死後５分以内にインペンタン中で一１５°Ｃで凍 結させた。これら組織の連続した、厚さ１２μｍの切片を、ゼラチンを塗布した スライド上に集め、結合研究に使用した。

成体雄ラットの来状全身切片を１枚の大きい粘着テープの上に置き、次にこれを プラスチックフレームにとり付けた。このプラスチックフレームは、各切片をそ の中で［”’　Ｉ］　−ＮＴ−４とともにインキュベートする窪みを作り出した 。

［”’　Ｉ］　−ＮＴ−４を用いる結合アッセイは以下のように実施した。凍結 を解かした後、隣接する脳および全身切片をリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７，４中 で０．　５時間ブレインキュベートし、その後室温で３時間、大量のグルコース 、１０％熱不活性化ウシつ児血清（６０℃、０．　５時間）、２５ｍＭヘペスＣ ＨｅｐｅＳ）緩衝液、４　μｇ／ｍｌロイペプチン、エタノールに溶解してＯ， １ｍｇ／ｍｇエタノールとした０、５ｍＭ　ＰＭＳＦ　（ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅ ｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、）、０．５ｍＭ塩化マグネシウムおよびｌｎＭ　［”６１ ］−ＮＴ−４を含有し、（合計）ＩμＭの未標識ＮＴ−３またはＮＴ−４を含有 する（非特異的）または含有しないＤＭＥＭ組織培養培地中でインキュベートし た。インキュベーション後、切片をＰＢＳ中で０．５時間洗浄した。眼切片はブ レインキュベートせず、０．　５時間、標識または未標識二二一口トロフィンを 含まない結合緩衝液中で洗浄した。なぜなら、この手る。洗浄後、切片を１０分 間４％パラホルムアルデヒド中に２２℃で固定し、２秒間ｄＨ２Ｏ中で洗浄し、 室温の空気流で乾燥した。標識切片および１２＄　１含有放射能標準品（Ａｍｅ ｒｓｈａｍ、　Ｉｎｃ、）は室温で２〜５日間１２５Ｉ感受性フイルム［ハイパ ーフィルム（）ｌｙｐｅｒ４ｉ１ｍ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ、　Ｉｎｃ、］に暴露 した。次に、スライドを、蒸留水でｌ：１に希釈したコダックＮＴＢ−２フォト グラフィックエマルジョンに浸漬し、１〜２週間後にコダックＤ−１９中で１５ ℃で現像した。

眼切片を含有するスライドは、組織学的検査のためにヘマトキシリン−エオシン で染色した。

１５．２．結果 成体ラットの全身体切片においては、［”’　１１−ＮＴ−４の特異的結合は脳 、を髄および網膜ならびに抜根神経節を含む中枢神経系に限られていた。

脳切片においては、［Ｉ２’　Ｉ］−ＮＴ−４の特異的結合は、皮質、線条体、 海馬、小脳、嗅球、水管周辺灰白質および縫線核を含む脳全体に広く分散してい ることが判明した。

［１２５１］　−ＮＴ−４標識ラット眼切片およびヒト眼切片を乾燥フィルムに 暴露して得られた結果は、網膜における高レベルの置換可能な結合を示した。エ マルジョンレベルで調べると、網膜の内部叢状層および神経節細胞層、およびヒ ト視神経に強力で置換可能な結合が見出された。

（本頁以下余白） １６、実施例：海馬におけるニューロトロフィンの比較効果スブラーグードーリ ーラットのＥ１８ラット胎児から海馬を摘出し、ＦＩＯ培地に集めた。組織を細 かく刻み、ＦＩＯ培地（Ｇｉｂｃｏ　）で２回洗浄し、０．２５％トリプシン（ Ｇｉｂｃｏ　）を用いて２０分間３７℃でトリプシン化した。トリプシンは、１ ０％ウシ胎児血清加ＤＭＥにウシ胎児血清（Ｆｅ２．１０％）、グルタミン（２ ｍＭ）、ペニシリン（２５Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（２５μｇ／ｍ ｌ）を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）からなる血清含有培地の添加により不活 性化された。４時間培養後、培地をＤＭＥに１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、Ｎ２培地補 充物（ＢＯｔｔｅｎｓｔｅｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　５８： ９４−１０９）および１ｍＭピルビン酸塩を加えたものに変え、このときにＮＴ −４を添加した。３〜４日ごとに培地を交換し、この因子を再添加した。

１６．２．結果 精製組換え体ヒトＮＴ−４はこれらの細胞中で、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３を用い た際に見られたのと同様な、ｆｏｓ　ｍＲＮＡの増加をもたらした（図３３Ａ参 照）。この増加についで、処理２時間後に調べた際にｆｏｓタンパク質の増加が 見られた。３種類のニューロトロフィン（ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４） は、全ｔｒｋ特異的抗体によって免疫沈降可能なタンパク質類のチロシンリン酸 化を引き起こすことが判明した（図３３Ｂ参照）。

ＢＤＮＦに応答することが示された２つの細胞集団はＮＴ−４にも応答した。つ まり、ＮＴ−４で処理した海馬培養物において、アセチルコリンエステラーゼ− 陽性細胞およびカルビンジン（Ｃａ１ｂｉｎｄｉｎ）−免疫陽性細胞の数が増加 した（図３４参照）。

妊娠１７日のラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）の中隔領域を周辺組織か ら切り離した。組織断片をプールし、ハム（Ｈａｍ）　Ｆ　−１０培地で３回洗 浄し、次に３５ｍｍ組織培養ディツシュに移して細かく刻んだ。０．２５％トリ プシンで組織を２０分間３７℃でインキュベートすることにより、単一細胞懸濁 液を調製した。室温で１００μｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼ　タイプｌ　 （Ｓｉｇｍａ）を含有する増殖培地（後述）中で５分間インキュベートしてトリ プシンを不活性化した後、組織断片を繰り返しパスツールピペットの締めた先端 を通すことによって細胞を分離した。次に、分離した細胞を５００ｘｇで４５秒 間遠心にかけた。上清液を除去して再度遠心にかけた。

ゆるい細胞ペレットを再度懸濁し、普通の増殖培地［５％（Ｖ／ｖ）ウマ血清（ Ｇｉｂｃｏ）、１％　Ｎ３添加物（ｖ　／　ｖ　）（Ｒｏｍｉｊｎら、１９８２ ．　Ｄｅｖ、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、２：５８３−５８９）、０．５％（Ｖ／ｖ） グルタミン（２００ｍＭ、　Ｇｉｂｃｏ）および０．２５％（ｖ／Ｖ）ペニシリ ン−ストレプトマイシン（それぞれ１０，０００単位／ｍ　１．　１０．　ＯＯ Ｏｍｃ　ｇ／ｍ　１．　Ｇｉｂｃｏ）を含有するダルベツコ変法イーグル培地（ ＤＭＥＭ）］に混ぜた。ブレーティングの３〜４時間後に、滅菌カバースリップ を各ウェルに載せ、細胞を覆った。ブレーティングの２４および７２時間後に、 増殖培地の２／３をＮ３／ＤＭＥＭ　（１％Ｎ３添加物、０．　５％グルタミン 、および０．２５％のペニシリンとストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）に 置き変えることにより、ニューロン富化培養物を調製した。これ以後のすべての 培地交換（１日おきに実施された）は、培地の１／２容量を除去し、同量の新鮮 なＮ３／ＤＭＥＭを加えることにより行なった。アストログリアの増殖を制限す るため、培養１週間後に培養物を２４時間、濃度２μＭのシトシンアラビノシド で処理した。

培養物から増殖培地を除去し、１２５μｌの溶解緩衝液［２００ｍＭ　ＮａＣ１ および２５％（ｖ／ｖ））リドンＸ−１００を含有する５０ｍＭ　ＫＨｔ　Ｐｏ ｔ　、１）Ｈ６，７］を添加した。組織培養プレートを氷上に置き、細胞をプレ ートからかき取り、新たに１２５μｌの溶解緩衝液を使ってウェルを洗浄した。

２アリコートづつエッペンドルフチューブに入れ、ドライアイスメタノールスラ リー中で急速に凍結した。

１７．２．結果 この研究に採用した培養条件はアストログリアの増殖を制限し、基底前脳ニュー ロンのｉｎ　ｖｉｔｒｏでの長期維持を可能としている。

Ｅ、ｃｏｌｉ産生ＮＴ−４をブレーティングの２４時間後に培養物に添加し、培 地交換のたびに補充した。２週間の処理期間の終りに細胞を集めた。図３５は、 ＮＴ−４のＣｈＡＴ活性に対する用量相関的効果を示している。２５　ｎ　ｇ／ ｍ　１の飽和濃度で、ＮＴ−４はＣｈＡＴ活性に約２倍の増大をもたらした。こ の酵素誘導レベルは、試験したＮＴ−４の最高濃度（１００ｎｇ／ｍｌ）まで維 持された。ＮＴ−４を用いた際に観察されるＣｈＡＴ誘導レベルは、ＢＤＮＦを 用いた時のそれとほぼ等しい。よって、これらのデータは、基底前脳コリン作動 性ニューロンがＮＴ−４の標的であることを実証している。

受胎１３〜１５日まで異なる日齢のラット胎児の脳より腹側中脳を摘出した。典 型的には、各実験に２腹の胎児を使用した。摘出溶液は以下の組成を有した：Ｎ ａＣ１１３６，８ｍＭ、ＫＣｌ　２．７ｍＭ、Ｎａｔ　ＨＰＯ４・７Ｈｔ　Ｏ８ ，ＯｍＭ、ＫＨ２ＰＯｔ　１．　５ｍＭ、グルコース６　ｍ　ｇ　／　ｍ　１　 、およびＢＳＡＯ，１ｍｇ／ｍ１．Ｉ）Ｈ７，４゜この溶液を調製し、次に０゜ ２μＭボアフィルターを通してフィルター滅菌した。摘出は非無菌条件下で行な った。すべての脳から上記の組織を摘出すると、残りの手順は無菌条件下で実施 した。組織断片を３５ｍｍ培養ディツシュに入れ、精巧な鋏で刻んだ。次に、０ ．１２５％のトリプシンを含有するＦ−１２栄養培地２ｍｌを組織に添加し、３ ７℃でインキュベートした。このインキュベーション期間の終わりに、最終濃度 が８０ｎｇ／ｍｌとなるようにＤＮＡ５ｅｌをスラリーに加えた。もう１つのイ ンキュベーションを同じ〈実施し、こちらの組織スラリーには８．０ｍｌの増殖 培地を加えた。この増殖培地は、最小必須培地（Ｍ　Ｅ　Ｍ）に２ｍＭグルタミ ン、６ｍｇ／ｍｌグルコース、５単位／ｍｌペニシリン、５ｍｇ／ｍ１ストレプ トマイシン、および７．５％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を補充してなるものであっ た。試料を卓上遠心器に入れ室温で５０゜ｒｐｍで５分間遠心した。培地を吸引 し、２ｍｌの増殖培地を細胞ベレットに加えた。１ｍｍの開口部をもつ火仕上げ ピペットを使用して細胞を８回つき砕いた。残りの組織断片を重力で沈降させ、 少量の上清液を取って血球計数器により細胞数を調べた。細胞密度を測定した後 、組織培養プレートに５０．０００／ｃｍ’の密度で細胞をプレートした。

培養プレートは摘出の前日に調製した。組織プレート（２４ウエル、２ｃｍ”／ ウェル）を０．５ｍｇ／ｍｌのポリオルニチン（分子量３０，０００〜７０，０ ００　ｇ／ｍｏｌ）を用いて室温で３時間プレコートした。プレートを水で徹底 的に洗浄し、次に５μｇ／ｍｌのマウスラミニンで室温で３時間処理した。プレ ートを上記のように水で洗浄し、３７℃で、５％ＣＯＩ、９５％空気からなる湿 雰囲気中で増殖培地の存在下で１晩インキユベートした。翌日プレートから培地 を除去し、新鮮な増殖培地と入れ替えた。

培養プレートに細胞をプレートした後、３７℃および５％ＣＯ２／９５％空気に 設定したインキュベーターで２４時間インキュベートした。培養培地を以下の組 成を有する無血清培地（ＳＦＭ）に変えた：イーグルの基本培地（ＢＥＭ）と栄 養混合物Ｆ−１２［グルコース（３３ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）　、ＮａＨ ＣＯ３（１５ｍＭ）＜ＨＥＰＥＳ　（１０ｍＭ）含有］の１：１（ｖ／ｖ）混合 物に、インスリン（２５ｕ　ｇ／ｍ　１）　、プトレシン（６０μＭ）、プロゲ ステロン（２０ｎＭ）、亜セレン酸ナトリウム（３０ｎＭ）、ペニシリン（５Ｕ ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５ｍｇ／ｍｌ）、およびＴ、（３０ｎＭ）を補 充しである。いくつかの実験では、培養２日目に培地をＳＦＭに変えた後、精製 ＢＤＮＦを培養物に加えた。

ドーパミン作動性ニューロンを培養するのに使用する溶液は、帽１１ｉ−Ｑ試薬 水システムによって得た水を使って調製した。組織培養培地組成物は、ウシ胎児 血清（ロットＮｏ、　４３Ｎ１０８６）およびマウスラミニンと共にＧｉｂｃｏ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｓａｎｔａ　Ｃ１ａｒａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎ ｉａ　）より入手した。他の培地成分はすべてＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 （Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）より購入し、それらは細胞培養試験済みグレードであった 。ポリオルニチンおよびＤＮＡ５ｅｌもＳｉｇｍａより入手した。

トリプシンはＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　（Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、　ＮＪ）より入手 し、ｏ−７トＮｏ。

３６６７であった。市販薬品は分析グレードのもので、Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、　ＮＪ）より購入した。

１８、　１．　２．腹側中脳培養物の免疫細胞化学的染色方法固定液は各実験ご とに新しく調製した。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の染色には、固定液は ソレンソン（Ｓｏｒｅｎｓｏｎ）リン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドで あった。５ｏｒｅｎｓｏｎ４１衝液は、ＫＨ２ＰＯ，（７）０．２Ｍ溶液を０． ２Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯｔのストックにｐＨが７．３になるまで添加して調製した。

次にパラホルムアルデヒドをこの溶液に加え、少し加熱して溶解し、使用前に室 温まで冷却した。

実験に取り掛かる前に、穏やかな吸引によって培地を培養ディツシュから除去し 、適当な固定液をそっとディツシュに加えた。

２０分の室温インキュベーションを実施した。ついで、５ｏｒｅｎｓｏｎリン酸 緩衝液で各５分間穏やかに回転させながら３回洗浄した。

次に、細胞を消光溶液中で３０分間室温で穏やかに回転させながらインキュベー トした。ＴＨ染色を行なう培養物のための消光溶液は、２％標準的ウマ血清を含 有する５ｏｒｅｎｓｏｎリン酸緩衝液からなった。次に培養物を透過性化緩衝液 中で室温で３０分穏やかに回転させながらインキュベートした。この溶液は、０ ．２％サポニン、およびＴＨ染色を行なう培養物に対し１．　５％の標準的ウマ 血清を含有する５ｏｒｅｎｓｏｎ緩衝液からなった。透過性化段階に続いて、培 養物を１次抗体の存在下で１晩４℃でインキュベートした。ラットＴＨに対する 抗体は、イソタイプＩｇＧ２ａというマウスモノクローナル抗体であった。この 抗体は、２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、５０ｍＭ　ＮａＣ１および０．２％サポ ニンを含有するｐＨ７，５の溶液中で４０μｇ／ｍｌで使用した。１次抗体イン キュベーションの後、培養物は適切な透過性化緩衝液で１回につき１５分間、５ 回洗浄した。次に、培養物をビオチンと結合した２次抗体（ビオチニル化ウマ抗 マウスＩｇＧ）とともにインキュベートした。このインキュベーションは、室温 で２時間積やかに回転させながら行なった。上記と同じ洗浄を実施し、次に培養 物を製造者のプロトコールにしたがってあらかじめ調製したアビジン−ビオチニ ル化西洋ワサビベルオシダーゼ複合体（ＡＢＣ試薬、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）の存在下でインキュベート した。室温で穏やかに回転させながら３０分インキュベーションした後、培養物 を上記のように洗浄した。次に、培養物を０．．５ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジ ンおよび０．０２％過酸化水素を含有する５５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＬ　ｐＨ７’ 、３でインキュベートした。反応生成物の発生を２〜５分間許し、その後溶液を 除去して培養物を数回水冷ＰＢＳで洗浄した。次に、１ｃｍ２あたりの陽性細胞 数を確認した。

パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドは、Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌより入手した。標準的血清（ブロッキング剤として使用した）、ビオチニル 化アフィニティ精製抗イムノグロブリン、アビジンＤＨ１およびビオチニル化Ｈ ＲＰ−Ｈを含有するベクタスティンキット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ｋｉｔ）は 、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入した。ジアミノベンジジン はＢ　ＲＢ　Ｄ　Ｎ　Ｆ　Ｌ　（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ。

ＭＤ）より入手した。

した実験からの２組のデータが図３６Ａおよび３６Ｂに示されている。培養物は さきに記述したように調製し、ＮＴ−４の濃度を上げながらこれで処理した。図 ３６Ａに示される実験では、ＮＴ−４による培養物の処理は、ただ１回だけの添 加としてブレーティングの日に行なった。図３６Ｂに示される実験では、ＮＴ− ４による処理は、何回も添加するものとしてブレーティングの日（培養第１日） 、その後培養第４日および７日（ＣＤ４．ＣＤ７）に行なった。培養第８日に、 ドーパミン作動性マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼを免疫細胞化学的に 染色するため培養物を加工した。次に、各ディツシュに存在するドーパミン作動 性ニューロンの数を測定した。各処理グループは５回の反復培養物からなる。

両方の実験から得られた結果は、ＮＴ−４による処理が、ＴＨ免疫細胞化学的染 色によって検出されるドーパミン作動性ニューロンの数を増加させることを示し ている。この増加は図３６Ｂに示されるように用量依存性であり、また飽和可能 である。

線条体ニューロン培養物は、Ｅ１７ラツト脳より以下のように調製した。すなわ ち、カルシウムとマグネシウムを含まないハンクスの平衡化塩類溶液中で線条体 組織を細かく刻み、０．２５％トリプシンおよびＤＮＡアーゼ（ＤＮＡａ　ｓ　 ｅ、０．２ｍｇ／ｍｌ）を用いた酵素処理により分離した。次に、ダルベツコ変 法イーグル培地および１０％ウシ胎児血清よりなる培地（ＤＭＥ−Ｆｅ２）中で 、機械によりすりつぶした。分離した細胞を１０’個／ウェルの密度で、前もっ てポリリシンとメロシンを塗布しておいた９６ウ工ル組織培養プレートの無血清 Ｎ２培地にシードした。

ヒトＮＴ−４（０，１〜５０ｎｇ／ｍｌ）をブレーティング時に添加し、１日お きに補充した。

１９、　１．　２．カルビンジンの免疫組織化学的染色培養第８日のｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ線条体培養物（８ＤＩＶ）を４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し 、ＰＢＳで洗浄し、０．　１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００／Ｐ　Ｂ　 Ｓ中で１５分間透過性化し、１０％ウマ血清／１％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ で９０分間室温でブロックした。次に、培養物を１次抗体（マウス抗カルビンジ ン、Ｓｉｇｍａ、　ｌ　：　５０００希釈物）および５％標準的ウマ血清と共に ４℃で１晩インキユベートした。これは、２次抗体（ビオチニル化ウマ抗マウス ）　（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ、、ｌ　：　４００希釈物）との室温での９０分 間のインキュベーションに先立って行なった。

カルビンジン免疫反応性を、ベクタスタチン（Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ）ＡＢＣ キット（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ、）を用いて視覚化した。合計ニューロン数、 およびカルビンジンに対して免疫反応性のニューロン数を、４個Ｘ２組の培養ウ ェルのそれぞれの総面積の約５〜１０％について計測した。

１９．１．３．高アフィニティー〇ＡＢＡ取込みの測定高アフィニティーＧＡＢ Ａ取込みを、ＴｏｍｏｚａｗａおよびＡｐｐｅｌ、　１９８６、　Ｂｒａｉｎ　 Ｒｅｓ、　３９９：１１１−１２４の方法の変法によって測定した。

細胞を、１４０ｍＭ　ＮａＣ１，２，６ｍＭ　ＫＣＩ、０．７５ｍＭ　ＭｇＣｌ ２．０．７５ｍＭ　ＣａＣ１ｚ、１ｍＭ　ＫＨｚＰＯ＋　、１ｍＭ　Ｎａ２ＨＰ Ｏｔ　、６ｍｇ／ｍ　１グルコース、２ｍＭ　β−アラニン、および１ｍｇ／ｍ ｌ　ＢＳＡを含有する緩衝液で１回洗浄した。１回洗浄後、細胞を取込み緩衝液 中で５分間３７℃でインキュベートした。次に、　３Ｈ−Ｇ　Ａ　Ｂ　Ａ　（Ｎ ＥＮ、ＮＥＴ−１９１Ｘ、　１００ｃｉ／ｍｍｏｌ）を最終濃度１７ｎＭで添加 し、細胞を１５分間３７℃でインキュベートした。両方のインキュベーションに おいて、ニューロン特異的取込みが、１ｍＭニペコチン酸をいくつかのウェルに 添加することによって立証された。第２のインキュベーションの後、細胞を取込 み緩衝液を用いて４℃で４回洗浄し、次に０．５ｍＭ　ＮａＯＨを用いて２時間 室温でインキュベートした。細胞抽出物を回収し、抽出物中の’Ｈ−ＧＡＢＡを 数えた。

１９．２．結果 ８日間ＮＴ−４で処理した線条体培養物においては、カルビンジン免疫反応性の 全ニューロンの百分率が、処理していない対照の培養物と比較して約３〜４倍に 増加した（図３７参照）。

ＮＴ−４による処理は、ＧＡＢＡの高アフィニティー取込みのレベルを、処理し ていない対照と比較して約３〜４倍に増大させた（図３８参照）。

受胎後１４日（Ｅ１４）のラットの腹側中脳より、先に記述したように培養物を 調製した（　Ｈｙｍａｎら、１９９１．Ｎａｔｕｒｅ、　３５０：２３０−２３ ２；　５ｐｉｎａら、　１９９２．　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、、　５９：９９ −１０６）。脳組織のトリプシン化および機械的分離によって得た単一細胞懸濁 液を、５Ｘ１０′個／ｃｍ”の密度で、あらかじめポリーＬ−リシンおよびメロ シン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）でプレコートしておい た３５ｍｍディツシュにシードした。グルタミン（２ｍＭ）、グルコース（６ｍ ｇ／ｍｌ）、ペニシリンＧ　（０，５Ｕ／ｍ　１）　、ストレプトマイシン（５ μｇ／ｍｌ）、および牛胎児血清（Ｆ　ＣＳ。

７．５％）を補充したＭＥＭで細胞を４時間インキュベーションして細胞の培地 への付着を可能とした後、栄養因子の存在下または不在下で細胞を定められた培 地［ＢｏＬｔｅｎｓｔｅｉｎおよび５ａｔｏ、　１９７９、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、６４ニア８７−７９４の記述するように、Ｆ １２およびイーグル基本培地（１：　１．　ｖ／ｖ）にＮ２補充物を加えてなる 培地、だたしインスリン濃度は２０ｎｇ／ｍｌに下げ、またグルタチオンを２． ５μｇ／ｍｌ含有させた］で培養した。

２０．１．２．３Ｈ−ＧＡＢＡ取込みの測定高アフィニティー〇ＡＢＡ取込み活 性の測定を、実施例１９に記載の方法にしたがって実施した。

ＣＡＤの染色を行なうべき培養物を４％パラホルムアルデヒドとＦ　１２／ＢＭ Ｅ　（１：　１．ｖ／ｖ）のｌ：１混合物中で１０分間プレフィックスし、その 後４％バラホルムアルデヒド中で３０分間インキュベートした。次に、培養物を ４％ヒツジ血清および０．０２％サポニンを含有するリン酸緩衝液の存在下でイ ンキュベートし、その後、培養物を１晩４℃で、ヒツジ抗ネコＧＡＤｓ７抗血清 （叶、Ａ、Ｔａｂｉｎ、　ＵＣＬＡ、　ＣＡより置火に提供された）ｌ／７５０ ０希釈物と共にインキュベートした。培養物を洗浄し、濃度１゜５μｇ／ｍｌの ヒツジ抗ラビットＩｇＧと共にインキュベートし、特異的に結合した抗体をアビ ジン−ＨＲＰ結合の後、Ｎ　ｉ　Ｓ　Ｏ＋を強化したＤＡＢを用いた現像によっ て検出した（Ｈａｎｃｏｃｋら、１９８２、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｌｅｔｔ、 、３１：２４７−２５２）。

２０．１．４．ＧＡＢＡ含量の測定 培養物を調製し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで様々な時間にわたって栄養因子の存在下ま たは不在下で維持した。培養期間の終わりに、細胞を集め、直ちにＯ，１ｍＭア スコルビン酸塩および２．５μｇ／ｍｌジヒドロキンベンジルアミン（Ｄ　ＨＢ 　Ａ、内部標準品）を含有する０、４Ｎ過塩素酸塩で酸化した。これをホモジナ イズし、遠心にかけて沈降したタンパク質を除いてから、抽出物中のカテコール アミンをアルミナ（ＩＣＮ）に吸収させた。次に試料を徹底的に洗浄し、カテコ ールアミンを０．０５％二亜硫酸ナトリウムおよび０．０２５％ＥＤＴＡを含有 する１７４ｎＭ酢酸を用いてアルミナから抽出して回収した。ペレット化した沈 殿物をＰＢＳに再度懸濁してから、Ｓｍｉ　ｔｈら、　１９８５．　Ａｎａｌ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７６−８５の方法により試料のタンパク質含量を測定した 。ＧＡＢＡの測定は、０−フタルアルデヒドを用いたデリバタイゼーション（ｄ ｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）の後に、逆層Ｃ１１カラムを２５％メタノール、 ３．　１％アセトニトリル、Ｏ，ＬＭ　Ｎａｇ　Ｐｏｔ　、ｐＨ８，８からなる 移動層を使用するＨＰＬＣ分離によって実施した。種々のアミノ酸の定量化は、 ＨＰＬＣによる溶出ピークの電気化学的検出（ＢＳＡ　５５００　Ｃｏｕｌｏｃ ｈｅｍ電極配列システム検出器）の後で行ない、そのデータは試料のタンパク質 含量に対し標準化した。

点質ＧＡＢＡ作動性ニューロンに対するニューロトロフィンの考え得る効果を検 討するため、高アフィニティーＧＡＢＡ取込み、ＧＡＢＡ含量、およびＣＡＤ活 性を対照および処理された培養物について測定した。培養物におけるＧＡＢＡ作 動性ニューロンの存在を、まずＣＡＤの６７ｋＤ形（これは末端過程および神経 細胞の周核体に見出だされる）に特異的に向けられている抗体を用いた免疫細胞 化学的染色によって検出した（Ｇｏｎｚａｌｅｓら、１９９１．　Ｊ。

Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ、、２０：９５３−９６１；　Ｋａｕｆｍａｎら、　１９ ９１．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　５６：７２０−７２３）。図４は神経栄 養因子の全くの不在下で４．７または１１日間維持された培養物（それぞれ図４ １Ａ−Ｃ参照）によって得られた、代表的なＣＡＤ染色パターンを示す。１吹拭 体の不在下ではいかなる染色も観察されなかった（図４１Ｄ参照）。細胞数の計 測は、二二一口トロフィンの不在下でＩｎ　ｖｉｔｒｏで１週間維持された培養 物において、ＣＡＤ陽性ニューロンの数がその時点での全細胞数の３．３±０． ７％に相当することを示した。ＮＴ−３のみが７日後ｉｎ　ＶｉｔｒＯでＧＡＤ 陽性ニューロン数の有意な増加（６３％）をもたらした。

ＢＤＮＦはＣＡＤ陽性ニューロン数を増加させなかったが、ＮＴ−３はもちろん ＢＤＮＦも７日間維持された培養物においてＧＡＤ酵素活性の用量依存性増大を 引き起こした。それぞれ図４２Ａおよび４２Ｂに示す通りである。ＮＴ−３は、 ＢＤＮＦに比べより大きい増大をもたらした（３倍対１．８倍）。他方、ＮＴ− ４７５は試験したどの濃度でも効果がなかった（図４２Ｃ参照；２００ｎｇ／ｍ ｌまではデータは示していない）。

ＧＡＢＡ作動性ニューロンのもう１つのマーカーとして、我々は７日間培養され た細胞の高アフィニティー〇ＡＢＡ取込み能力に対する各ニューロトロフィンの 効果を調べた。図４３Ａに示されるように、試験した３種類のニューロトロフィ ン（ＢＤＮＦ。

ＮＴ−３およびＮＴ−４１５）はすべてＧＡＢＡ取込みの２〜３倍の増加を引き 出した。ＢＤＮＦとＮＴ−３の用量応答は類似しており、約２０ｎｇ／ｍｌで最 大に達した。ＮＴ−４１５はＢＤＮＦまたはＮＴ−３よりも低い濃度で効果を示 し、１０ｎｇ／ｍｌで飽和し、これ以上の濃度では効果が減少した。我々が可能 な添加物またはＧＡＢＡ取込みに対する相乗効果を査定したところ、いかなるニ ューロトロフィンの組み合わせ効果も観察されなかった（図４３Ｂ参照）　、　 ＮＧＦ　（５０ｎ　ｇ／ｍ　１）はＧＡＢＡ取込み活性にいかなる効果も持たな かった。

ＧＡＢＡ作動性表現型のさらなるマーカーとして、我々は各ニューロトロフィン で処理した培養物中のＧＡＢＡ含量を測定した（図４４参照）。ＢＤＮＦ、ＮＴ −３およびＮＴ−４１５はすべて、これらの因子を加えて７日間増殖させた培養 物のＧＡＢＡ含量において中程度の、しかし有意な増加をもたらした。ここでも ＮＧＦによる処理は効果がなかった。これらのデータは、高アフィニティーＧＡ ＢＡ取込み活性測定において観察された増加と首尾一貫している。

２０、　２．　２黒質におけるｔｒｋ受容体分布の分析培養された点質ニューロ ンに対して上記の効果を成就する際のニューロトロフィンの活動部位の疑問を解 くために、胎児培養物および成体ラット脳点質の両方における高アフィニティー ＢＤＮＦおよびＮＴ−３受容体（それぞれＴｒｋＢおよびＴｒｋＣ）の発現パタ ーンを突き止めることは興味深かった。図４５に示すように、ｉｎ　５ｉｔｕハ イブリダイゼーシヨンは、腹側被蓋領域（ＶＴＡ）および成体ラット脳点質の両 方におけるＴｒｋＢ　（図４５Ｂ。

４５Ｃ参照）およびＴｒｋＣ（図４５Ｄ−Ｆ参照）ｍＲＮＡの高いレベルを明確 に示した。ＴｒｋＣの分布はＴｒｋＢのそれよりも広範囲に広がっている。より 高い倍率でのＴｒｋＣの局在パターン（図４５Ｅ、４５Ｆ参照）の検討は、Ｔｒ ｋＣがニューロンのしるしである大きな周核体で発現されていることを実証する 。

ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣがラット胎児腹側中脳組織で発現されているかどうかを 突き止めるため、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３の存在下または不在下で様々な期間増 殖させたＥ１４中脳培養物より調製したＲＮＡを、ノーサンプロット法により精 査した。図４６Ａに示すように、ＴｒｋＢのキナーゼドメインの検査は、すべて の条件下で９ｋｂ転写物の存在を示した。培養物をＢＤＮＦまたはＮＴ−３に最 大２９時間まで暴露することは、ＴｒｋＢ　ｍＲＮＡの発現レベルを実質的に変 化させなかった。検出された９ｋｂ転写物は、Ｋｌｅｉｎら、１９９１．Ｃｅ１ ｌ　６５：１８９−１９７によって記述された２つの脇侍異的転写物の１つで、 ＴｒｋＢチロシンキナーゼ細胞表面受容体の全長に対応することが示された。Ｔ ｒｋＣについて精査したプロット（図４６Ｃ参照）では、成体脳およびＥ１４Ｖ Ｍ培養物のＲＮＡの両方に１４ｋｂ転写物が検出された。これは、全長ＴｒｋＣ をコードする主要転写物であると同定されている（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、１ ９９３．印刷中）。この転写物の発現レベルは、ＮＴ−３で処理した培養物にお いて、著しい変化を示さなかった。

もう１つ５ｋｂ　ＴｒｋＣ転写物が検出された。これは２８ＳリポソームＲＮＡ バンドのすぐ上まで移動するもので、不完全な形のＴｒｋＣをコードする２つの 公知転写物の１つである（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、１９９３．印刷中）。

２０．２．３考察 上記のデータは、ニューロトロフィンは点質でＧＡＢＡ作動性ニューロンを支持 しなからある役割を与えている可能性があるという証拠を提供している。一般的 に、ＧＡＢＡ作動性神経伝達が変化すると全身性発作を伴なう。特に全身性発作 は点質内でＧＡＢＡ作動性神経伝達を増加させることによって防止できる。Ｇａ １ｅ。

Ｋ、、１９８５．Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　４４：２４ １４−２４２４；　０１ｓｅｎ、　Ｒ１゜ら、１９８６．Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓ ｍｉｔｔｅｒｓ、５ｅｉｚｕｒｅｓ　ａｎｄ　Ｅｐｉｌｅｐｓｙ　ＩＩＩ；　Ｎ １５ｔｉｃｏら、（編）　、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｏ　 Ｌ／たがってここに提供するデータは、ニューロトロフィンが発作関連障害の治 療に潜在的効用を有する可能性があることを示唆している。

運動ニューロンに対するＮＴ−４の効果を、前述のようにｃｈＡＴ活性をモニタ ーすることにより測定した。ＮＴ−４は運動ニューロン富化培養物中でＣｈＡＴ 活性を用量依存的に刺激した（図３９参照）。ＮＴ−４とＣＮＴＦを組み合わせ て、またＮＴ−４とＮＴ−３を組み合わせて、同時に運動ニューロン富化培養物 を処理すると、ＣｈＡＴ活性に対して相加効果よりも大きな効果をもたらした。

ＮＴ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）単独ではＣｈＡＴ活性を３．８倍に増大させ、ま たＣＮＴＦ　（５０ｎ　ｇ／ｍ　ｌ）単独ではＣｈＡＴ活性を４．５倍に増大さ せた。しかしこれらを同時に添加すると、ＣｈＡＴ活性は１３．４倍に上昇し、 ２つの因子の相乗作用を示唆した（図４０参照）。

２１、微生物の寄託 ニューロトロフィン−４に関わるヒトゲノム配列を含有する下記の組換え体バク テリオファージは、１９９１年８月２２日（ＨＯ２−２およびＨＯ２−２）およ び１９９１年９月１１日（ＨＯ２−１）に１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ ｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に所在するア メリカンタイプカルチャーコレクションに寄託し、下記の受託番号を与えられた 。さらに、キメラ遺伝子構築体ｐｃＭＸ−ｈＮＴ３／ｈＮＴ４は１９９１年１０ 月３０日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託し、下記の受託番号 を与えられた。繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）に関わるヒトゲノム配列を含有す る組換え体バクテリオファージ（ｈＣＮＴＦ−Ｇｌ）は１９８９年９月１２日に アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託し、受託番号ＡＴＣＣ４０６５ ７を与えられた。二二一口トロフィン−３（ＮＴ−３）に関わるヒトゲノム配列 を含有する組換え体バクテリオファージ［ｐｈｌ　ｈＮ３（Ｇｌ）］は１１９９ ０２２月２８にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託し、受託番号Ａ ＴＣＣ４０７６３を与えられた。

バクテリオファージ　ＡＴＣＣ受託番号ＨＧ４−２　７５０６９ ＨＧ７−２　７５０７０ ＨＧ２−１　７５０９８ 本発明は、寄託された微生物またはここに記述した特定の態様によって範囲を制 限されるべきではない。実際、ここに記載するもののほかに、本発明の種々の変 法がこれまでの記載および添付の図から当業者には明らかになるであろう。その ような変法は、本発明の特許請求の範囲内に入るものとする。

ここに種々の刊行物を挙げ、それらは参照としてそっくり組み込んだ。

国際出願番号：ＰＣＴ／ 国際出願番号：ＰＣＴ／ 配列表 鎖の数　二本鎖 トポロジー・不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＧＧＣＴＧＣＣ１２フ 配列番号、４ 配列の長さ・１２７ 配列の型　核酸 鎖の数・二本鎖 トポコノ−。不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号　５ 配列の長さ、１２７ 配列の型　核酸 鎖の数　二本鎖 トポロジー　不明 配列の種類＋　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＡＧＣＡＧＣＣ１２フ 配列番号・６ 配列の長さ・１２７ 配列の型　核酸 鎖の数・二本鎖 トポロジー−不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号・７ 配列の長さ　１２７ 配列の型　核酸 鎖の数・二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号＝８ 配列の長さ　１２７ 配列の型　核酸 鎖の数、二本鎖 トポロジー　不明 配列の種類　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 （ＪＩＣＣ１２） 配列番号　９ 配列の長さ：　１３０ 配列の型　核酸 鎖の数　二本鎖 トポロジ−不明 配列の種類　ＤＮＡ　（ｇｃｎｏｍｉｃ）配列 配列番号、ｌＯ 配列の長さ　１３０ 配列の型　核酸 鎖の数　二本鎖 トポロジー　不明 配列の種類　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＧＡＧ入Ａｒｃｌコ０ 配列番号、１１ 配列の長さ°１３０ 配列の型・核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー・不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号、１２ 配列の長さ、１３０ 配列の型　核酸 鎖の数・二本鎖 トポロジー　不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＧＡＧＩＩ；ＡＴＴＧＧＡＬコ０ 配列番号・１３ 配列の長さ　１３０ 配列の型　核酸 鎖の数・二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号・１４ 配列の長さ：１３０ 配列の型、核酸 鎖の数　二本鎖 トポロジー　不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号：１５ 配列の長さ・１３０ 配列の型　核酸 鎖の数・二本鎖 トポロジー　不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 Ｃ入＾＾丁Ｃ？ＡＡｅ　ＣＣ（ＪＡＧＧＧＴ’ｒ　丁ｃＡｃｃＡＡｃＧＡ　ｅ（ ＪＧＡ　！Ａ丁＾ＧｋＣｋ　ｋＤｋｋｋｔＪτ’ｌ’Ｇ　６O 配列番号・１６ 配列の長さ・１３０ 配列の型、核酸 鎖の数°二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号　１７ 配列の長さ・１３０ 配列の型、核酸 鎖の数・二本鎖 トポロジー・不明 配列の種類　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号　１８ 配列の長さ・１３０ 配列の型：核酸 鎖の数、二本鎖 トポロジー二不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 Ａｅ！？Ｃ′ＴＡＧＧＣ１３０ 配列番号、１９ 配列の長さ・６６ 配列の型　核酸 鎖の数　二本鎖 トポロジー　不明 配列の種類　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号　２０ 配列の長さ　＋２８ 配列の型　核酸 鎖の数　不明 トポロジー　直鎖状 配列の種類　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 二Ｔ素Ｃ１２１１ 配列番号：２１ 配列の長さ：１３０ 配列の型：核酸 鎖の数、二本鎖 トポロジー二不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列　− 配列番号：２２ 配列の長さ・４３ 配列の型二アミノ酸 鎖の数・−水路 トポロジー、不明 配列の種類　ペプチド 配列 ＬＹ＠　ＣＹ＠　ｘｓｎ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　ＧＬｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｅ　Ｖａｌ　 ＧＬｙ　Ｇｌｙ　Ｃ７ｎ　Ａｒｇ　ＧＬｙ　Ｖａｌ　Ａｓｐｌ　１０　１５ Ａｒ９　ＡＪ”９　１４Ｌ＠　Ｔｒｐ　ＸＬｍ　ｓａｒ　ＧＬｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙ ｇ　Ａｌａ　ＬＹ＠　Ｇｉｎ　Ｓ＠ｒ　τｙｅ　Ｖａｌ　＾P°ｑ ２０２５コ０ ＡＬａ　Ｌａｕ　Ｔｈｅ　Ｍ＠ｔ　＾−ｐ　５＠ｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ＸＬｍ　 ＶａＬ　Ｃ１ｙコ５　４０ 配列番号　２３ 配列の長さ　４３ 配列の型　アミノ酸 トポロジー・不明 配列の種類、ペプチド 配列 Ｌｙｅ　ＣＹａ　Ｐ、ｓｆＩ　ｐｒｏ　Ｓｅｆ　ＧＬｙ　Ｓｅｔ　Ｔｈｘ　Ｔｈ ｅ　入ｒｇ　ＧＬｙ　Ｃｙ−人ｒｇ　ＧＬｙ　ＶａＬ　Ｍｐｌ　Ｓ　ｌｏ　１ｓ Ｌｙｓ　ＬＹｌ　ｅｌｎ　テｒｐ　１１ｍ　Ｓｅｔ　ＧＬｕ　ＣＹａ　Ｌｙ−＾ ｉｌｌ　ＬＹｌ　ＧＬｎ　Ｓａｔ　Ｔｙｒ　ｖａｔ　ｙｑ２０２％ユ０ ＡＬａ　Ｌａｕ　Ｔｈｅ　！ｌ−＾−ｐ　ＡＬａ　Ｍｎ　Ｌｙｅ　＋＋＠ｕ　Ｖ ａＬ　Ｃ１ｙコ５　４０ 配列番号　２４ 配列の長さ　４２ 配列の型・アミノ酸 鎖の数；−末鎖 トポロジー　不明 配列の種類　ペプチド 配列 ＬＹｌ　ｃｙａ　Ａｔ９＾−ｐ　Ｐｒｏ　Ｍｎ　ｉ’ｒｏ　ＶａＬ　Ａｓｐ　Ｓ ｇａｒ　Ｏｌｙ　ｅｙｅ＾ｔｑ　ＧＬｙ　ＩＬ−＾−ｐＬ　Ｓ　１０　１％ 配列番号・２５ 配列の長さ　４２ 配列の型、アミノ酸 鎖の数・−末鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列 ＬＹＩＩＣＹ−＾ｚ９＾１ａＰｒｏ＾−ｎＰ＋″ｏＶａＬＯＬｕ！５ｒＯ１ｙＣ Ｙ＠ＭＩＧＬｙ！Ｌ・＾−ｐＬ　Ｓ　１０　１！ Ｓｉｒ　Ｌ、ｙｓ　Ｈ１ｓτｒｐ　ｋｅｎ　Ｓａｔτｙｒ　ａｙｓ　？ｈｒτｈ ｒτｈｒ　ＨＬｓ　Ｔｈｒ　ＰＭ　ＶａＬＬｙ１ＡＬａ　Ｌａｙ　Ｔｈｅ　Ｔｈ ｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　ＬＹｌ　Ｇｉｎ　ＡＬａ　Ａｌａ３％　４０ 配列番号：２６ 配列の長さ；４２ 配列の型・アミノ酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：不明 配列の種類、ペプチド 配列 Ｌｙｓ　ＣＹａ　Ａｔ９　Ａｍｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　ＶａＬ　Ｍａｒ　 ５＠ｒ　ＧＬＹ　ＣＹａ　λｅｑ　ＧＬｙ　ＩＬｓ　ｋｍ９１　Ｓ　１０　ｉｓ ＾１１１ＬＹ自ＨＬｍ丁ｒｐＭｎ３＠ｒテｙｒｅｙｅＴｈｅτｈ【τｈｒＨ１ｓ ？ｈｒＩ’ｈｓＶｉＬＬｙｅ２０２％３０ ＡＬａ　Ｌａｕ　Ｔｈｅ　Ｍａｔ　ＣＬｕ　（Ｌｙ　Ｌｙｅ　ＧＬｎ　ＡＬａ　 ＾１１１ｉ４０ 配列番号：２７ 配列の長さ：４２ 配列の型二アミノ酸 鎖の数−一本鎖 トポロン−９不明 配列の種類・ペプチド 配列 Ｌｙｓ　ＣＹＩＩ　ＬＹｌ入−ｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｔ　Ｐｒｔｓ　ＶａＬ　Ｓ・ｔ 　ＧＬｙ　ＧＬｙ　ｌ：ｙｓ　Ｍ９１ＬＹ　Ｘｉｓ　ｊｖ９Ｌ　Ｓ　１０　１％ 配列番号：２８ 配列の長さ・４２ 配列の型・アミノ酸 鎖の数８−一本 トポロジー二不明 配列の種類、ペプチド 配列 Ｌｙｅ　Ｃｙ畷　ｋｔＱ　Ａｍｐ　ＰＴＯｔ、Ｙ＠　ｐｒａ　ｖａλ　Ｓｅｔ　 Ｍａｒ　（ｌｌｙ　Ｃｙ−人ｒｇ　ＧＬｙ　！Ｌ−＾−ｐｌ　Ｓ　ＸＯＬ！ ＾Ｌｍ　Ｌｙｓ　ＨＬｍ　Ｐｒｏ　＾−ｎ　Ｓａｔ　Ｔｙｒ　Ｃｙ−τｈ【　丁 ｈｒ　Ｔｈｅ　Ｈｌｓ　Ｔｈｅ　ｔｈｅ　ＶａＬ　ＬｙｓＡＬａ　Ｌａｕ　Ｔｈ ｅ　Ｍ・ｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙ−Ｇｉｎ　＾１蟲　＾Ｌａ配列番号　２９ 配列の長さ　４２ 配列の型　アミノ酸 鎖の数、−末鎖 トポロジー　不明 配列の種類　ペプチド 配列 配列番号：３０ 配列の長さ：４３ 配列の型、アミノ酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー二不明 配列のＮ類；ペプチド 配列 Ｌｌｌ１　ＣＹｍ　＆ｊｆｌ　ｐｔｏ　Ｈａζ　Ｇｌｙ　ｆｙｔ　Ｔｈｅ　Ｌｙ ｅ　（ＳＬ％ｌ　（ＬＹ　Ｃｙ−Ｍｑ　ＧＬｙ　ＺＬ−＾・X １　１　１０　Ａｓ ＬＹｇ　Ａｒｑ　ＩＩＬ＠　Ｐｒｏ　ｈａｔｓ　！ｏｒ　（：Ｌｌｌ　ＣＹａ　 Ｍ９　？ｈｒτｈｒ　ＧＬＩＩ　ｓｉｒ　’ｔｙｔ　ｖａλ香Aｇ ２０　２％　３０ ＡＬａＬＪｕＴｈｅＭｅｔ＾叩１＠ｒＬｙｓＬｙ−＾ｒｑＫＬ＠ＧＬｙコＳ４０ 配列番号、３１ 配列の長さ：４３ 配列の型二アミノ酸 鎖の数、−末鎖 トポロジー二不明 配列の種類・ペプチド 配列 ＬｙｓＣｙ−＾−ｎｐｒｏＩｌｌ・ｔＧｌｙ丁ｙ【τｈｒＬｙｅＧＬｕＧＬｙＣ Ｙ＠入ｒｇＧＬｙ１１−＾−ｐＬ　Ｓ　ＬＯＬＳ Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ＭＬ−τり＾−ｎ　５ｅａｔ　ＱＬｎ　Ｃｙ−Ａｒｇ　Ｔｈｅ 　Ｔｈｅ　ＧＬｎ　Ｓｇａｒ　Ｔｙｒ　ＶＩＩＬ　Ｍｅ２Ｏ２５３０ 人Ｌａ　Ｌａｕ　Ｔｈｅ　Ｍｅｔ　Ａｍｐ　９ｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　入ｒｇ　Ｉ ｎ　ＣＬｙコｓ　４０ 配列番号：３２ 配列の長さ　４３ 鎖の数ニー末鎖 トポロジー　不明 配列の種類；ペプチド 配列番号：３３ 配列の長さ、４３ 鎖の数、−末鎖 配列の長さ＝４３ 配列の型　アミノ酸 鎖の数ニー末鎖 トボロノー、不明 配列番号、３５ 配列の型；アミノ酸 鎖の数　−末鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｍ＠ｔ　ｅｌｙ　？ｙｒτｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇ Ｌｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｍ　ｋｅｇ　（ｆｌｙ　Ｘ工・＾−Ｐ１　％　１０　１ｓ Ｌｙｓ＾ｒｇＦｌｉｓ？ｙｒ＾ａｎ！＠ｒ（＋１ｎｅｙｅ入ｒｇＴｈｅＴｈｅＧ ｉｎＳ・ｒＴｙｒＶａλ＾ｒｑ＾１ａｌＪＩＩτｈｔｋｔ入ｍｐＳｓｒＬｙｓＬ ｙｓＬｙｓｔＬｓＧＬｙコＳ４０ 配列の型　アミノ酸 鎖の数　−末鎖 配列の種類、ペプチド ＬＹ＠ＣＹ−＾ａｎＰｒａＬｙｓＧＬｙＰｈ・τｈｒＡｓｎＧＬｕＱＬｙｅｙ＠ ＾ｔｑＧＬｙＸｉ−ＡｓｐＩ　Ｓ　１０　１５ ＬＹ＠　ＬＹ＠　ＨＬｍ　？ｒｐ　Ａａｎ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　ｅｙｅ　Ａｒｇ　 Ｔｈｒ　Ｓａｒ　ＧＬｎ　Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｉ　Ａｒｇ２０　２５　コ０ ＾１ａ　ＬＩＩＩＪ　Ｔｈｅ　Ｍａｔ　＾―ｐ　ｊａｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ＬＹ ＠　Ｌｌａ　ＯＬｙコ５　４０ 配！ｊ１１番号、３７ 配列の型二アミノ酸 鎖の数・−末鎖 配列の種類　ペプチド Ａｒｇ　Ｃｙａ　Ｌｙｅ　ＧＬｕ　入Ｌ＆　Ａｒｇ　ｐｒｏ　ｖａｔ　ＬＹＩＩ 　Ａｓｎ　ＧＬｙ　ＣＹ藝　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ＸＬ＊　Ａｓ■ Ｉ　Ｓ　１０　１ｓ ＾５ｐＬｙ＠ＭＬ−τｒｐ＾ａｎ９ｒＧｉｎＣｙｍＬＹ＠丁ｈｒＳａｙ：Ｇｉｎ Ｔｈｒ：ＴｙｔＶａλ入ｚ９２０　：ｌＳ　３０ ＾１ａＬ＠ｕＴｈｅＳａｔＧｌｕＡｇｎＪｖｓｎＬｙｓＬＩＩｕＶａｌＧＬｙコ ５　４０ 配列の長さ　４３ 配列の型　アミノ酸 鎖の数　−末鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 入Ｍ　ｅＦ＠　ＬＹ＠　ＧＬｕ　＾１蟲　Ａｒｇ　ｐｒｏ　ＶａＬ　Ｌｙｅ　Ａ ａｎ　ｃｌｙ　ｃｙ−Ａｒｇ　（Ｓｌｙ　！Ｌ−＾１ｐｌ　Ｓ　Ｌ（Ｉ　ＬＳ 入ｓｐ　ＬＹ＠　Ｈｌｓ　τｒｐ　Ｍｎ　Ｓａｒ　Ｇｌｎ　Ｃｙａ　Ｌｙｅ　Ｔ ｈｅ　Ｓｉｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｅ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ　ＪＬｒｇ＾Ｌｌｌ　Ｌａｕ　 Ｔｈｅ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　ＬＹ＠　Ｌａｕ　ＶａＬ　０１１３ ％　４０ 配列番号：３９ 鎖の数ニー末鎖 トポロン−。不明 配列の種類：ペプチド λ１ｍＬ＊ｕτｈｒｍ＠ｒＧｌｕＡ＊ｎＡｍｎＬｙｓＬａｕＶａｌｄａｙＳ４０ 配列番号　４０ 配列の型　アミノ酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド Ｍｅ　ｃｙｍ　Ｌｙｅ　ＧＬｕ　ＡＬａ　ｍｇ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓ ｎ　ｃｌｙ　Ｃｙｇ　ｋｘｑ　ＧＬｙ　ＧＬｕ　ＭＰＳ ＬＦｍｅｙ−為４丁’ｈｒｌｕａＬＹ＠Ｐｒｏｐｈ＠ＬＹ＠ｍａｒＧＬｙＣａｍ Ａｘｑｄｌｙ！ｌ＠＾１ｐＩ　Ｓ　ｉｏ　１％ ＾−ｐＬｙ＠ＫＬａτｒｐ＾ｓｎ３＊ｒＧｉｎｌ：Ｙ＠Ｌｙ−τｈｒＳ＠ｙＧｉ ｎτｈｒ？ｙｒＶａｉｊＬｒｇス０２５３０ ＾ＬａＴａｕＴｈｅＧＬｎ入１ｐ入ｘ９丁ｈｚＳ＠ｔＶａｔＣＬｙコＳ　４０ トポロジー：不明 配列 ｋｒｑ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　ｍｇｓｔ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ＯＬｙ　Ｌｙ− ＾−ｎ　ａｉｙ　Ｃｙｍ　Ａｒｇ　Ｏｌｙ　ＧＬｕ　ｋｓｇｌ　％　１０　１％ ＾−ｐ　Ｌｙｓ　ＭＬ−τ１＾ａｎ　ｍａｒ　ＧＬｎ　Ｃ２Ｓ　ＬＹ−Ｔｈｅ　 Ｓａｒ　Ｇｉｎτｈｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ　ｋｇ２０　２Ｍ　３Ｇ ＾１ａＴＡｕＳａｒＬＹ＠ＧＬｕ＾５ｎＡｓｎＬＹ＠？ｙｒＶａｌＧＬｙコ５　 ４０ ａｃｃｘｔｃτＧＣｅＣ’ｒＧＣＣｅｃｅ？１ｒｅＣＡＧＡ（：（：ｅｅ４＾Ｃ 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６５　７０　７５　ｇ。

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１６ｓ１フＯＬフ５ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｍ＠ｒτｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｃｙ−Ａｒｇ　ＧＬ ｙ　Ｖａλ＾−ｐ　ＬＹ＠　ＬＹ＠　ａＬｎτ１ＬｍＯ１０１９０ ！１ｓＳｅｅＧｌｕＣｙｓＬｙｓ＾ＬａＬＹ＃Ｇ１ｎ５＠ｒ？ｙｒＶａＬｋｒｑ ＾ＬａＬａｕＴｈｅ！Ｌｍ１９％　２００　２０５ ＾ｓｐ　ＡＬａ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌ、ａｕ　ＶａＬ　ＧＬｙ　Ｔｒｐ　入ｒ９ 　Ｔｒｐ　Ｉｌ＠　入ｒｇ　！Ｌｅ　＾ａｐ　Ｐｈｅ　入Ｌ■ ２１０　２１％　２２０ 配列の型、アミノ酸 鎖の数−一本鎖 配列の種類・ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｂａｓｅ存在位置　９ 他の情報・／標識−Ｎ ／注＝“Ｎ＝Ｉ” 配列 ＧｋＹＴＣＹｔｒＨＧ　ＣＹ’１ＴＲＣＡ　ｌフ配列番号　５７ 配列の長さ　１７ 配列の型、核酸 鎖の数・一本鎖 トポロジー　不明 配列の種類　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列の特徴 特徴を表す記号：　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｂａｓｅ存在位置・９ 他の情報・／標識＝Ｎ ／注＝“Ｎ＝　１” 配列 ｅＴＹｍ’ｆｆＴＮＧ　ｌ：’ｒＴＴ’ＲｃＡ　１７配列番号：５８ 配列の長さ　１７ 配列の型　核酸 鎖の数　一本鎖 トポロジー　不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列の特徴 特徴を表す記号：　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｂａｓｅ存在位置・６ 池の情報：／標識＝Ｎ ／注＝“Ｎ＝Ｉ” 配列の特徴 特徴を表す記号：　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｂａｓｅ存在位置、９ 池の情報、／標識＝Ｎ ／注＝“Ｎ＝Ｉｎ 配列の特徴 特徴を表す記号＋　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｂａｓｅ存在位置：１２ 他の情報、／標識＝Ｎ ／注＝“Ｎ＝ＩＮ 配列 ＧＴ’ＲτｅＮＡＴＮｃ　ｕＡ？ｌ：ｅＡ　１７配列番号・５９ 配列の長さ、１７ 配列の型、核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー・不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴ　Ｍ、ｋｋＴＴＣｌフ配列番号・６０ 配列の長さ、１７ 配列の型、核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー　不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 Ｇ＾ＣＴＣＣｋＧＴＣ：　ＧｋＣＪｋＴ３　１フ配列番号：６１ 配列の長さ　＋２６ 配列の型５核酸 鎖の数、二本鎖 トポロジー　不明 配列ノ種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列の特徴 特徴を表す記号　ＣＤＳ 存在位置　１．．１２６ 配列 ス０２５３０ 配列番号、６２ 配列の長さ　４２ 配列の型；アミノ酸 トボロノー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ｇｉｎ　Ｔｙｔ　Ｐｍ　Ｔｙｅ　Ｃ１ｕ　Ｔｈｅ　＾ｘｑ　ＣＹＩＩ　Ｌｙ−Ａ Ｌａ　Ｇｌｕ　ｍａｔ　＾工ａ　ＧＬｙ　Ｇｌｕ　。ＩＹｌＳ　１０　１ｓ ａｌｙ　Ｐｒｅ　Ｏｌｙ　ＶａＬ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＧＬｙ　ｃＹ−Ａ ｒｇ　Ｑｌｙ　ＶａλＡｌｊｐ　Ａｒｇ　ＡｒＱ　Ｆｌ五−２０２ｓコ〇 〒ｒｐ　Ｌ＠ｕ　Ｓ＠ｔ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　ＬＹ＠　Ａ１１ｌ　Ｌｙｓ　Ｏ１＋ ′Ｉｍ＠ｔコＳ　４０ 配列番号、６３ 配列の長さ：１２６ 配列の型・核酸 鎖の数、二本鎖 トポロジー・不明 配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列の特徴 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置・１．．１２６ 配列 配列番号・６４ 配列の長さ・４２ 配列の型二アミノ酸 トポロジー・直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 ＧＬｎ　ｔｙｒ　Ｐｈ・Ｔｙｔ　Ｃ１ｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｑ　（：Ｙ＠　Ｌｙ−＾ １息　＾虐９　Ａａｎ　ｋＬ亀　ＱＬｕ　ＱＬｕ　ＱＬｙｌ　Ｓ　１０　１５ ＧＬｙ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　（Ｌｙ　ＧＡＹ　Ｃ７６入 ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｖａｉ　＾ｓｐ　入【ｑ　入ｒｑ　１ｌＬａ２０２＄３０ Ｔｒｐ　Ｖａｌ　＄＠ｒ　ＯＬｕ　Ｃｙ＠　Ｌｙ−ＡＬａ　ＬＹ＠　Ｇｉｎ　ｍ ＠ｔコＳ４Ｇ 配列番号：６５ 配列の長さ、３５ 配列の型、アミノ酸 鎖の数、−重鎖 トポロジー　不明 配列の種類　ペプチド 配列 配列番号・６６ 配列の長さ＝３５ 配列の型二アミノ酸 鎖の数　−重鎖 トポロジー二不明 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：６７ 配列の長さ・３５ 配列の型二アミノ酸 鎖の数　−重鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列 ａＬｎ　Ｔｙｒ　ｐＨ＠　Ｔｙｒ　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　ＬＹ＠　Ｃｙａ　Ａｇｎ　 Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｃ１ｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈｅ　ＬＹ＃　ＧｌｕＩ　Ｓ　１０　１ｓ ＧＬＹ　ｅｙ−Ａｒｇ　ＧＬｙ　！Ｌ−＾−ｐ　ＬＹ＠　ｋｒｑ　ＨＬｍτｒｐ 　Ａａｎ　Ｓｓｒ　ＯＬｎ　Ｃ７６Ａｒｇτｈｅ２ｏ　２５　コ。

Ｔｈｅ　（ｉｎ　ｊａｒ コ５ 配列番号二６８ 配列の長さ＝３５ 配列の型二アミノ酸 鎖の数；−重鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列　ｄｉｎ　Ｔｙｒ　ＰＴＩ＠　Ｔｙｒ　ＧｌｕＩｈｒ　Ａｒ９　Ｃｙｓ　Ｌ Ｙ＠　ｅｍｕ　ＡＬａ＾ｒｇ　Ｐｒｏ　ＶＩＩＬ　ＬＩＴ＠@Ａａｎ Ｉ　Ｓ　Ｌｏ　１％ ＧＬｙｅｙｅ＾ｒｇ（ＬｙＩＬ＊＾ｍｐＡｓｐＬｙ＠ＨＬ＠τｒｐＡｓｎＳａｔ ＧＬｎＣｙｍＬｙｍＴｈｒ配列番号：６９ 配列の長さ：１９２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロン−・不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列の特徴 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置・１．．１９２ 配列 配列番号ニア０ 配列の長さ二６４ 配列の型　アミノ酸 トポロジー　直鎖状 配列の種類　タンパク質 配列 丁ｒｐ　ＶａＬ　ｍ＠ｒ　Ｃ１Ｌｕ　Ｃｙａ　Ｌｙｅ　ＡＬａ　Ｌｙｓ　ＧＬｎ 　Ｓｓｒ　Ｔｙｒ　ｖａλ　Ａｒｇ　ＡＬａ　Ｌａｕ　Ｔｈ■ コＳ　４０　４１ ＾工蟲　＾＠Ｐ　ｋＬａ　（）Ｌｎ　ＧＬｙ　Ａｒｑ　ＶａＬ　ＧＬｙ　Ｔｒｐ 　八ｒ９　テｒｐ　Ｋ１１ｌ　入ｒｇ　ＸＬａ　ＭＰ　Ｔｈ■ Ｓｏ　５５　６０ 配列番号ニア１ 配列の長さ：３５ 配列の型、核酸 鎖の数：二本鎖 トポロン−不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列の特徴 特徴を表す記号・ＣＤＳ 存在位置　１８．　、３５ 配列 配列番号ニア２ 配列の長さ　６ 配列の型二アミノ酸 トポロジー　直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 ＧＬｕ　Ｔｈｅ　ｋｒｑ　Ｃｙｓ　Ｌｙ−＾Ｌａｓ 配列番号　７３ 配列の長さ　３５ 配列の型・核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー・不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｃｎｏｍｉｃ）配列の特徴 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置：　１８．．３５ 配列 配列番号、７４ 配列の長さ・６ 配列の型　アミノ酸 トポロジー、１１鎖状 配列の種類、タンパク質 配列番号　７５ 配列の長さ：　＋４０４ 配列の型　核酸 鎖の数　二本鎖 トポロジー；不明 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列の特徴 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置・４６０．　、１１０４ 配列 ａＣｔ　で’ｒｒｃテＧ　ｃ（（ｅｅＴ　ａｘＧ　〕ＣＣＣ＾ＣＣ〒〒　ＣＴＣ 丁Ｃｃ　ＣＣＣＣＧ＾　Ｃτ＾　ＧτＣＣτａ　５ｚａＰｒｏ　Ｐｈ＠　Ｌａｕ 　ＡＬａ　Ｐｒｏ　ａＬｕ　Ｔｒｐ　＾−ｐ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｓａｔ　Ｐｒ口 　入ｒｑ　ＶａＬ　ＶａＬ　Ｌａｕ４０　４５　Ｓ。

丁ＣＴ　ＡＧＣ（ＡＴ　ＧＣＣＣｃＴ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　Ｃｅ（：　ＣＣＴ　Ｃ ↑ａＣテＣ丁τＣＣテａ　ｅｒａ　ｃ＾α　ＣＣＴ　６６６１＠ｒ　ｋｘｑ　Ｃ １ｙ　ＡＬａ　Ｉｒｏ　ＡＬａ　ＩＪｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　ＬＩＩＬＩ 　Ｐｈｓ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　ＧＬｕ　入Pａ ５％　６０　Ｎ ＣＧＣｋＧＴ　ＣＣＣ：　ＣＴＣｌ：Ｇｃ　ＣＡＧ　〒λｃ　’ｒｙｅ　’ｍ　 ａ入＾ＡＣＣＣＯＣ丁ＧＣ＾＾ＧＣＣτ　ＨＡ〒　９０６ＧＬｙＳｅｒＰｒｏＬ ａｕｋｔｑＧｉｎＴｙｒＰＩＴ＠Ｐｈ＊ＯＬｕテｈｒ＾ｒｇＣｙ−ＬＩＴ＠ＡＬ ＩＩ＾−９１３５１４０１４％ 配列番号　７６ 配列の長さ：２１５ 配列の型　アミノ酸 トポロジー、直鎖状 配列の種類　タンパク質 Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｐｈ＠　Ｌａｕ　Ｌ＠％ｌ　Ｐｒｏ　Ｓａｔ　Ｖａｌ 　Ｐｒｏ　ＺＬ＊　ＧＬｕ　ｊａｒ　ＧＬｎ　Ｐｒｏ　ＰｒB ２０２ｓコ０ Ｐｒｏ　Ｓａｔ　Ｔｈｒ　Ｌ＃ｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｈ＠　Ｌａｕ　Ａｌａ　 Ｐｒｏ　ＯＬｕ　丁【ｐ　＾−ｐ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　！ｏｒコＳ　４Ｑ　４％ Ｐｒｏ　Ａｒｑ　ＶａＬ　νｍｌ　Ｌｍｕ　５＊ｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　 Ｐｒｏ　Ａｌａ　ＧＬｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｓｕ　ＬａｕＳｏ　５５　６０ Ｐｈ＠　Ｌｓｕ　Ｌａｕ　ＧＬｕ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　＾１蟲　Ｐｈ・　入１ｑ　 Ｃ１ｕ　ｓ＠ｒ　Ａｌａ　ａｌｙ　Ａｉｍ　ｐｅａ　＾ｌａ６％　７０　７５　 Ｓ。

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ＦＩＧ、　ｌ０Ａ ＦＩＧ、　１１ 卵母細胞　即 ＦＩＧ、　１２ ＦＩＧ、　１９２ ＦＪＧ、１９３ ＦＩＧ、　２０ ＡＣＣＴＧＡ　ＣＧＡ　ＣＡＣＣＴＧ　ＭＣＣＣＡ　ＣＡＣＧＡＧ　ＣＴＣＣＡ Ｇ　ＣＴＣＷ　Ｔ　Ａ　Ｖ　Ｄ　Ｌ　Ｇ　Ｖ　Ｌ　Ｅ　Ｖ　Ｅ＞ＦＩＧ、　２０ （ＣＯＮＴ、） ＦＩＧ、　２２ ＦＩＧ、　２Ｂ ＦＩＧ、　２４Ａ ＦＩＧ、　２４８ ＦＩＧ、　２５ ＣＯ８上清の希釈度 ＦＩＧ、２７Ｂ ３Ｔ３／ｌｒｋ　Ｃ Ｏ，０１，１１１０１００１００Ｏ ＧＦ ８ＯＮＦ　ＩＩ Ｔ−４ １度　（ｎｇ／ｍ１ｌ Ｆ　ＩＧ、　２９Ａｔ ａｙｔ　（ｎｇ／ｍ１） Ｆ　Ｉ　Ｇ、　２９Ａ２ １度　（ｎｇ／ｍ１） ＦＩＧ、２９Ｂ１ １度　（ｎｇ／ｍ１） Ｆ　ＩＧ、　２９Ｂ２ ＰＣｌ３　ＰＣＩ２／１ｒｋＢ ＦＩＧ、２９Ｃ ＊ （ｔ ＦＩＧ、　３１ Ｊｅｌ＆　＠　１．ｋＣ−一 転 ２８Ｓ−− ＦＩＧ、３２ ＦＩＧ、３３Ａ ２０〇− ＦＩＧ、　３３Ｂ 対照　ＮＴ４ ＦＩＧ、　３４Ａ 対照　ＢＤＮＦ　５０ｎｑ／ｍｌ　ＮＴ−４５０ｎｇ／ｍ１ＦＩＧ、　３４Ｂ （’ｌ／τ◇／晶−／八ｄ（１） へ蜜−）−４丁Ｌ　Ｙ：／：　ｌ−４４（−ｊｌ−＋　Ｌ　＜　ｒ＋　ＣＦＩＧ 、３６Ａ ＮＴ−４（ｎｇ／ｍ１ｌ ＦＩＧ、３６Ｂ ＮＴ−４（ｎｇ／ｍ１） ＦＩＧ、３７ ＮＴ−４（ｎｇ／ｍ１） ＦＩＧ、３８ ？＋、、−６＋ ＦＩＧ、　４１Ｂ ＦＩＧ、４１Ｄ ニューロトロフィン濃度　（ｒ＋ｑ／ｍ１）ＦｔＧ、４３Ａ ＦＩＧ、４３Ｂ ＦＩＧ、４４ ＦＩＧ、　４５Ａ ＦＩＧ、４５Ｂ Ｆ　ＩＧ、　４５Ｃ ＦＩＧ、４５Ｄ Ｆ　ＩＧ、　４５Ｆ ＣＧＣＧＢＢＢＢＴＢ −一一一一一一一− ＦＩＧ、４６Ａ ＴＢＣＮＣＮＣＮ ＦＩＧ、　４６Ｄ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８／２２　 ＡＡＢ ／／　Ｃ０７Ｋ　１４／４８　８３１８−４ＨＣ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８ ２−４８（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） ９４５５−４Ｃ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、ＳＥ ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ 、　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＢＹ、ＣＡ。

ＣＺ、ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＮＺ、 ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、　ＵＡ、　ＵＳ （７２）発明者　アルタ−、チャールズ　エイ。

アメリカ合衆国　１０５３６　ニューヨーク州力トナー、リリー　ポンド　シー ２３１番地 ＦＩ Ａ６１Ｋ　３７／２４　ＡＡＢ ３７１０２　ＡＡｈｉ （７２）発明者　デイステファノ、ピーターアメリカ合衆国　１０５１２　ニュ ーヨーク州カーメル、リッジ　ロード　８番地 （７２）発明者　ヴエンティミグリア、ロザンアメリカ合衆国　１０５４９　ニ ューヨーク州マウント　キスコ、レイクサイド　ロード　６７７番 地７２）発明者　ウィーガンド、スタンレーアメリカ合衆国　１０５６２　ニュ ーヨーク州オシニング、オーバートン　ロード２１番地 （７２）発明者　ウォング、ヴイヴイアンアメリカ合衆国　１０５８３　ニュー ヨーク州スカースデイル、フォート　ヒル　ロード　４２３番地 （７２）発明者　ヤンコパウロス、ジョージ　ディー。

アメリカ合衆国　１０５１０　ニューヨーク州ブライアークリフ　メイナー、ス リーピー　ホロー　ロード　４２８番地

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．運動ニューロンの生存、成長および／または分化を支持することがｉｎｖｉ ｔｒｏ培養系で実証された、有効量のＮＴ−４タンパク質を、ＮＴ−４関連運動 ニューロン障害の患者に投与することからなる、上記障害の治療方法。
2. ２．ＮＴ−４タンパク質がＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５０７０を指定され たバクテリオファージＨＧ７−２中に含まれるＮＴ−４関連ＤＮＡ配列を含む組 換え核酸分子によりコードされる、請求項１に記載の方法。
3. ３．ＮＴ−４タンパク質がＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５０７０を指定され たバクテリオファージＨＧ７−２中に含まれる対応ＤＮＡ配列に少なくとも約７ ０％相同である組換え核酸分子によりコードされる、請求項１に記載の方法。
4. ４．運動ニューロンの生存、成長および／または分化を支持することがｉｎｖｉ ｔｒｏ培養系で実証された、有効量の第二の神経栄養因子を、前記のＮＴ−４タ ンパク質とともに投与することからなる、請求項１に記載の方法。
5. ５．第二の神経栄養因子が毛様体神経栄養因子、ニューロトロフィン−３または 神経成長因子である、請求項４に記載の方法。
6. ６．ドーパミン作動性ニューロンの生存、成長および／または分化を促進するこ とがｉｎｖｉｔｒｏ培養系で実証された、有効濃度のＮＴ−４タンパク質に該ニ ューロンをさらすことからなる、ドーパミン作動性ニューロンの生存、成長およ び／または分化を促進する方法。
7. ７．ドーパミン作動性ニューロンの生存、成長および／または分化を促進するこ とがｉｎｖｉｔｒｏ培養系で実証された、有効量のＮＴ−４タンパク質を、ドー パミン作動性ニューロン疾患または障害の患者に投与することからなる、上記疾 患または障害の治療方法。
8. ８．前記の疾患または障害がパーキンソン病である、請求項７に記載の方法。
9. ９．コリン作動性ニューロンの生存、成長および／または分化を促進することが ｉｎｖｉｔｒｏ培養系で実証された、有効濃度のＮＴ−４タンパク質に該ニュー ロンをさらすことからなる、コリン作動性ニューロンの生存、成長および／また は分化を促進する方法。
10. １０．コリン作動性ニューロンの生存、成長および／または分化を促進すること がｉｎｖｉｔｒｏ培養系で実証された、有効量のＮＴ−４タンパク質を、コリン 作動性ニューロン疾患または障害の患者に投与することからなる、上記疾患また は障害の治療方法。
11. １１．コリン作動性ニューロンが基底前脳のコリン作動性ニューロンである、請 求項１０に記載の方法。
12. １２．コリン作動性ニューロンが中隔のコリン作動性ニューロンである、請求項 １０に記載の方法。
13. １３．前記の疾患または障害がアルツハイマー病である、請求項１０に記載の方 法。
14. １４．後根神経節または他の感覚ニューロンの生存、成長および／または分化を 促進することがｉｎｖｉｔｒｏ培養系で実証された、有効量のＮＴ−４関連タン パク質を、末梢神経障害の患者に投与することからなる、上記障害の治療方法。
15. １５．前記の末梢神経障害が急性ニューラプラキシー、神経断裂症、軸索断裂症 、糖尿病性神経障害、筋萎縮性側索硬化症および圧迫である、請求項１４に記載 の方法。
16. １６．海馬の細胞の生存、成長および／または分化を促進することがｉｎｖｉｔ ｒｏ培養系で実証された、有効量のＮＴ−４関連タンパク質を、海馬細胞が関与 する疾患または障害をもつ患者に投与することからなる、上記疾患または障害の 治療方法。
17. １７．前記の疾患または障害が虚血、低酸素、低血糖または卒中に関係がある、 請求項１６に記載の方法。
18. １８．線条体の細胞の生存、成長および／または分化を促進することがｉｎｖｉ ｔｒｏ培養系で実証された、有効量のＮＴ−４関連タンパク質を、線条体細胞が 関与する疾患または障害をもつ患者に投与することからなる、上記疾患または障 害の治療方法。
19. １９．前記の疾患または障害がハンテントン舞踏病、線条体黒質変性、脳性小児 麻痺、卒中、虚血、低酸素症または低血糖症である、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．検出可能に標識されたＮＴ−４を末梢神経に注入し、そして標識ＮＴ−４ が逆行輸送されるか否かを判定することからなり、その際、逆行輸送されないこ とがＮＴ−４に対する応答性の欠如と正の相関関係にあり、末梢神経系の障害が ＮＴ−４に関連することを示すものである、ＮＴ−４関連末梢神経系障害の診断 方法。
21. ２１．前記の疾患または障害が急性ニューラプラキシー、神経断裂症、軸索断裂 症、糖尿病性神経障害、筋萎縮性側索硬化症、および圧迫よりなる群から選ばれ る、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．検出可能に標識されたＮＴ−４を中枢神経に注入し、そして標識ＮＴ−４ が逆行輸送されるか否かを判定することからなり、その際、逆行輸送されないこ とがＮＴ−４に対する応答性の欠如と正の相関関係にあり、中枢神経系の障害が ＮＴ−４に関連することを示すものである、ＮＴ−４関連中枢神経系障害の診断 方法。
23. ２３．前記の疾患または障害が腫瘍、膿瘍、外傷、アルツハイマー病、およびパ ーキンソン病よりなる群から選ばれる、請求項２２に記載の方法。
24. ２４．有効量のＮＴ−４関連タンパク質を、網膜の疾患または障害をもつ患者に 投与することからなる、上記疾患または障害の治療方法。
25. ２５．前記の疾患または障害が網膜剥離、加齢によるまたは他の黄斑障害、光網 膜症、手術により引き起こされた網膜症、未熟児網膜症、ウイルス網膜症、ブド ウ膜炎、静脈または動脈閉塞もしくは他の血管障害による虚血性網膜症、眼の外 傷または穿通性障害による網膜症、末梢硝子体網膜症、または遺伝的網膜変性で ある、請求項２４に記載の方法。
26. ２６．前記の疾患または障害が視神経と関係がある、請求項２４に記載の方法。
27. ２７．前記の疾患または障害が網膜神経節細胞の変性と関係がある、請求項２４ に記載の方法。
28. ２８．有効量のＮＴ−４を、発作を起こした患者に投与することからなる、発作 の治療方法。