JPH0469996B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0469996B2 JPH0469996B2 JP63170976A JP17097688A JPH0469996B2 JP H0469996 B2 JPH0469996 B2 JP H0469996B2 JP 63170976 A JP63170976 A JP 63170976A JP 17097688 A JP17097688 A JP 17097688A JP H0469996 B2 JPH0469996 B2 JP H0469996B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fructofuranosidase
- chitosan
- immobilized
- porous granular
- acylated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、シヨ糖から転化糖又はフラクトオリ
ゴ糖を製造する際に使用するのに最適な固定化酵
素に関するものである。 〔従来の技術〕 従来よりβ−フラクトフラノシダーゼを用いて
転化糖又はフラクトオリゴ糖を作ることはよく知
られている。β−フラクトフラノシダーゼの固定
化に関するキトサンの利用については、フレーク
状キトサンにグルタルアルデヒドを用いて酵素を
架橋固定化する方法（Chitin in Nature and
Technology、1986 PlenumPress、New York
五版、411頁〜415頁〕、Ｎ−アシルキトサンゲ
ルにグルタルアルデヒドを用いて酵素を架橋する
方法〔SEN−GAKKAISHI（報文）vol.43No.11、
page（82）〜（87）、1987〕又、キトサン硫酸塩
に熱水を加えたキトサン硫酸塩水溶液を冷却し、
ゲル化寸前に酵素を加える方法、キトサン希酸水
溶液に酵素を加え、中性に凝固させる方法や、キ
トサン希酸水溶液に酵素を加え、グルタールアル
デヒドで架橋させ凝集させる方法〔Proceedings
of the First International Conference on
Chitin／Chitosan、364〜369頁（1978）等が発表
されている。 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明は、反応活性が高く、しかもPH及び温度
に対する安定、物理的強度、活性の持続性が高
く、再性も容易で、シヨ糖から転化糖又はフラク
トオリゴ糖を製造するシステムに有効に利用出来
る固定化β−フラクトフラノシダーゼを提供する
ことを目的としている。 従来のβ−フラクトフラノシダーゼをイオン結
合法で固定化したものでは、PH及び温度に対する
安定性に劣り、包括法によるものはゲル化物であ
るため物理的強度が小さい上、酵素がゲル内部に
存在しているために反応効率が低く、物理的吸着
及び共有結合法で得られるものは活性の持続性及
び再生の点で欠点がある。従来のキトサンを用い
た固定化フラクトフラノシダーゼは形状にも問題
があり、システム化が困難である。本発明は、多
孔質粒状キトサンを基材とすることにより、シス
テム化を容易とすると共に物理的強度や活性の発
現率を高くし、再生利用可能として上記問題点の
解決を計つたものである。 〔課題を解決するための手段〕 本発明は、有機ジイソシアネート化合物を反応
させたＮ−アシル化多孔質粒状キトサンに、β−
フラクトフラノシダーゼを固定化したことを特徴
とする固定化β−フラクトフラノシダーゼに係
る。 本発明においては、キトサンを多孔質粒状キト
サンに成型することで利用し易い形状とし、シス
テム化を容易とすると共に、アシル化剤で処理し
てキトサンをＮ−アシル化したものを有機ジイソ
シアネート化合物で処理して、キトサンのアミノ
基を架橋し、β−フラクトフラノシダーゼを固定
化させる部を形成させて、固定化β−フラクトフ
ラノシダーゼとしたものである。本発明において
は、Ｎ−アシル化多孔質粒状キトサンのＮ−アシ
ル化度を適宜調整することにより有機ジイソシア
ネート化合物の導入量が調整でき、その導入量の
差異でβ−フラクトフラノシダーゼの親和性、固
定化量と活性収率の調整を容易に行うことができ
る。 本発明に用いるＮ−アシル化多孔質粒状キトサ
ンを得るために用いられる多孔質粒状キトサン
は、特開昭61−40337号に開示した方法で製造さ
れる。 即ち、平均分子量が10000〜230000である低分
子量キトサンを酢酸、ジクロル酢酸、蟻酸等の単
独又は混合物の水溶液に溶解させて、該溶液を塩
基性溶液より成る凝固浴中に落下せしめて多孔質
粒状キトサンを得る。凝固浴としては、水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭
酸水酸化カリウム、アンモニア、エチレンジアミ
ン等のアルカリ性物質を水又はメタノール、エタ
ノール等の極性を有するアルコール類、又は水と
アルコールとの混合物に加えたものが用いられ
る。得られた多孔質粒状キトサンをＮ−アシル化
多孔質粒状キトサンにするには、多孔質粒状キト
サンを無水酢酸、無水ジクロル酢酸、無水モノク
ロル酢酸、無水プロピオン酸、無水安息香酸、無
水ｎ−カプロン酸、無水ｎ−酪酸等のアシル化剤
を用い、アシル化剤や反応生成物に対して不活性
で何ら影響を与えない、例えばジメチルホルムア
ミド、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、ジオキ
サン、メタノール、エタノール、ｎ−ブタノール
等の有機溶媒の単独又は混合液中で反応させてＮ
−アシル化多孔質粒状キトサンとする。 本発明においては、上記のように多孔性粒状キ
トサンをまずＮ−アシル化して有機ジイソシアネ
ート化合物を導入することにより、β−フラクト
フラノシダーゼの基質への親和性を高め、反応性
を増加せしめるものであつて、アシル化剤の使用
量を調整することにより、有機ジイソシアネート
化合物の導入量を調整することができる。アシル
化剤の使用量は、原料である多孔質粒状キトサン
の脱アセチル化度によつても異なるが、キトサン
のグルコサミン残基１モルに対し、0.07〜1.45モ
ルの割合で使用し、Ｎ−アシル化度が５〜97％の
Ｎ−アシル化多孔質粒状キトサンとした後に、有
機ジイソシアネートと反応させることが好まし
い。 このＮ−アシル化多孔質粒状キトサンを有機ジ
イソシアネート化合物として、例えば、４，4′−
ジフエニルメタンジイソシアネート、１，４−フ
エニレンジイソシアネート、２，４−トリレンジ
イソシアネート、ナフタレンジイソシアネート、
１，４−シクロヘキサンジイソシアネート、４，
4′−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート、
キシリレンジイソシアネート、イソフオロンジイ
ソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート
等を用いることができるが、ヘキサメチレンジイ
ソシアネートを使用することが好ましい。有機ジ
イソシアネート化合物は、メタノール、エタノー
ル、イソプロピルアルコール等のアルコール類、
アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジ
メチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の
アミド類の極性溶媒の１種又は２種以上の混合液
中で反応させる。そして、有機ジイソシアネート
化合物の濃度は特に限定されないが、アシル化さ
れた後の後で残存しているフリーのアミノ基が全
て有機ジイソシアネート化合物と反応される量を
添加することが好ましい。 かくして有機ジイソシアネート化合物を反応さ
せたＮ−アシル化多孔質粒状キトサンを得る。こ
の際、水洗処理がなされるので末端基のイソシア
ネート基はアミノ基になつている。これにβ−フ
ラクトフラノシダーゼをアミノ基を介して固定す
るが、本発明に用いられるβ−フラクトフラノシ
ダーゼは主としてシヨ糖に作用してフラクトース
とグルコースとのβ−１，２結合を切断する作用
と、生成したフラクトースをシヨ糖に転移して、
シヨ糖にフラクトースが１分子結合したフラクト
オリゴ糖を生成する作用を具備したものが用いら
れる。β−フラクトフラノシダーゼを固定化する
方法は、β−フラクトフラノシシダーゼ溶液中に
有機ジイソシアネート化合物を反応させたＮ−ア
シル化多孔質粒状キトサンを加え、数時間撹拌
し、固定化させ、水洗して未固定のβ−フラクト
フラノシダーゼを除去して固定化β−フラクトフ
ラノシダーゼを得る。 また、本発明においては、β−フラクトフラノ
シダーゼを固定化する際に、有機ジイソシアネー
ト化合物を反応させたＮ−アシル化多孔質粒状キ
トサンをグルタールアルデヒド溶液中で処理した
後に、β−フラクトフラノシダーゼの固定化を行
なつてもよい。又、本発明によつて得られた固定
化β−フラクトフラノシダーゼを、更にグルター
ルアルデヒド溶液中で数時間処理してもよい。 〔実施例〕 以下に実施例を挙げて本発明を詳述するが、本
発明はこれらの範囲に限定されるものではない。 実施例でのβ−フラクトフラノシダーゼの活性
単位の１〓は0.11Mシヨ糖を含有するPH4.8の
0.01Mリン酸緩衝溶液において40℃で１分間に
1μmolのシヨ糖を加水分解するものである。 又、活性の測定方法は、HPLC（昭和電工製Ion
Pak Ks−801カラム）で各成分を分離し、高感
度示差屈折計を用いて定量し、シヨ糖とグルコー
ス、フラクトース及びフラクトオリゴ糖のピーク
相対比より活性を算出した。 実施例 １ 脱アセチル化度80％、平均分子量約60000のキ
トサン70gを3.5％酢酸水溶液930gに溶解させて濃
度７％の溶液とした。該溶液を孔径0.25m／mφ
のノズル孔より10％水酸化ナトリウム水溶液中に
落下させ、粒径1m／mφ、比表面積93.5m2／ｇの
多孔質粒状キトサン860ml（湿状）を得た。 該多孔質粒状キトサン250mlを充分水洗した後、
１のエタノールで、３回洗浄して溶媒を水から
エタノールに置換し、夫々100mlづつ分取し、
夫々をエタノール100ml中に加え、アシル化剤と
して無水酢酸をキトサンのグルコサミン残基１モ
ルに対し夫々0.45モルと0.95モル添加し、室温で
24時間Ｎ−アシル化反応させ、Ｎ−アセチル化度
が夫々50％、80％のＮ−アシル化多孔質粒状キト
サンＡ１，Ｂ１を夫々90ml得た。 これらを夫々湿潤状態で50mlを採取し、充分に
水洗し、250mlのジメチルホルムアミドで４回洗
浄して溶媒を水からジメチルホルムアミドに置換
し、ジメチルホルムアミド50ml中に有機ジイソシ
アネート化合物としてヘキサメチレンジイソシア
ネートをキトサンのグルコサミン残基１モルに対
して1.5モル添加し、室温で１時間反応させた。 反応後、ジメチルホルムアミド250mlで４回洗
浄し、更に水洗、湯洗をしてジメチルホルムアミ
ドを完全に除去して有機ジイソシアネート化合物
を反応させたＮ−アシル化多孔質粒状キトサンＡ
２，Ｂ２を夫々40ml（湿状）得た。 次いで、Ａ２，Ｂ２夫々20gを採取し、129
〓／mgのパン酵母由来のβ−フラクトフラノシダ
ーゼ（和光純薬工業株式会社製、インベルター
ゼ）27.6mgを含むPH4.8の0.01Mリン酸緩衝溶液60
mlに添加し、４℃で12時間撹拌後、PH4.8の
0.01Mリン酸緩衝溶液２で洗浄して固定化β−
フラクトフラノシダーゼ（試料１，２）夫々20g
を得た。 比較例 実施例１と同様にして得たＮ−アセチル化度が
夫々50％、80％のＮ−アシル化多孔質粒状キトサ
ンについて有機ジイソシアネート化合物で処理せ
ずに、単に実施例１と同様の操作でβ−フラクト
フラノシダーゼを固定化した固定化β−フラクト
フラノシダーゼ（試料３，４）を夫々20g得た。
実施例１で得た試料１，２及び試料３，４を夫々
湿潤状態で1g採取し、0.55m molのシヨ糖を含有
するPH4.8の0.01Mリン酸緩衝溶液（シヨ糖濃度
0.11M）５mlに添加し、40℃で20分間加水分解反
応をさせて、固定化β−フラクトフラノシダーゼ
の活性を測定した。その結果を表１に示した。
ゴ糖を製造する際に使用するのに最適な固定化酵
素に関するものである。 〔従来の技術〕 従来よりβ−フラクトフラノシダーゼを用いて
転化糖又はフラクトオリゴ糖を作ることはよく知
られている。β−フラクトフラノシダーゼの固定
化に関するキトサンの利用については、フレーク
状キトサンにグルタルアルデヒドを用いて酵素を
架橋固定化する方法（Chitin in Nature and
Technology、1986 PlenumPress、New York
五版、411頁〜415頁〕、Ｎ−アシルキトサンゲ
ルにグルタルアルデヒドを用いて酵素を架橋する
方法〔SEN−GAKKAISHI（報文）vol.43No.11、
page（82）〜（87）、1987〕又、キトサン硫酸塩
に熱水を加えたキトサン硫酸塩水溶液を冷却し、
ゲル化寸前に酵素を加える方法、キトサン希酸水
溶液に酵素を加え、中性に凝固させる方法や、キ
トサン希酸水溶液に酵素を加え、グルタールアル
デヒドで架橋させ凝集させる方法〔Proceedings
of the First International Conference on
Chitin／Chitosan、364〜369頁（1978）等が発表
されている。 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明は、反応活性が高く、しかもPH及び温度
に対する安定、物理的強度、活性の持続性が高
く、再性も容易で、シヨ糖から転化糖又はフラク
トオリゴ糖を製造するシステムに有効に利用出来
る固定化β−フラクトフラノシダーゼを提供する
ことを目的としている。 従来のβ−フラクトフラノシダーゼをイオン結
合法で固定化したものでは、PH及び温度に対する
安定性に劣り、包括法によるものはゲル化物であ
るため物理的強度が小さい上、酵素がゲル内部に
存在しているために反応効率が低く、物理的吸着
及び共有結合法で得られるものは活性の持続性及
び再生の点で欠点がある。従来のキトサンを用い
た固定化フラクトフラノシダーゼは形状にも問題
があり、システム化が困難である。本発明は、多
孔質粒状キトサンを基材とすることにより、シス
テム化を容易とすると共に物理的強度や活性の発
現率を高くし、再生利用可能として上記問題点の
解決を計つたものである。 〔課題を解決するための手段〕 本発明は、有機ジイソシアネート化合物を反応
させたＮ−アシル化多孔質粒状キトサンに、β−
フラクトフラノシダーゼを固定化したことを特徴
とする固定化β−フラクトフラノシダーゼに係
る。 本発明においては、キトサンを多孔質粒状キト
サンに成型することで利用し易い形状とし、シス
テム化を容易とすると共に、アシル化剤で処理し
てキトサンをＮ−アシル化したものを有機ジイソ
シアネート化合物で処理して、キトサンのアミノ
基を架橋し、β−フラクトフラノシダーゼを固定
化させる部を形成させて、固定化β−フラクトフ
ラノシダーゼとしたものである。本発明において
は、Ｎ−アシル化多孔質粒状キトサンのＮ−アシ
ル化度を適宜調整することにより有機ジイソシア
ネート化合物の導入量が調整でき、その導入量の
差異でβ−フラクトフラノシダーゼの親和性、固
定化量と活性収率の調整を容易に行うことができ
る。 本発明に用いるＮ−アシル化多孔質粒状キトサ
ンを得るために用いられる多孔質粒状キトサン
は、特開昭61−40337号に開示した方法で製造さ
れる。 即ち、平均分子量が10000〜230000である低分
子量キトサンを酢酸、ジクロル酢酸、蟻酸等の単
独又は混合物の水溶液に溶解させて、該溶液を塩
基性溶液より成る凝固浴中に落下せしめて多孔質
粒状キトサンを得る。凝固浴としては、水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭
酸水酸化カリウム、アンモニア、エチレンジアミ
ン等のアルカリ性物質を水又はメタノール、エタ
ノール等の極性を有するアルコール類、又は水と
アルコールとの混合物に加えたものが用いられ
る。得られた多孔質粒状キトサンをＮ−アシル化
多孔質粒状キトサンにするには、多孔質粒状キト
サンを無水酢酸、無水ジクロル酢酸、無水モノク
ロル酢酸、無水プロピオン酸、無水安息香酸、無
水ｎ−カプロン酸、無水ｎ−酪酸等のアシル化剤
を用い、アシル化剤や反応生成物に対して不活性
で何ら影響を与えない、例えばジメチルホルムア
ミド、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、ジオキ
サン、メタノール、エタノール、ｎ−ブタノール
等の有機溶媒の単独又は混合液中で反応させてＮ
−アシル化多孔質粒状キトサンとする。 本発明においては、上記のように多孔性粒状キ
トサンをまずＮ−アシル化して有機ジイソシアネ
ート化合物を導入することにより、β−フラクト
フラノシダーゼの基質への親和性を高め、反応性
を増加せしめるものであつて、アシル化剤の使用
量を調整することにより、有機ジイソシアネート
化合物の導入量を調整することができる。アシル
化剤の使用量は、原料である多孔質粒状キトサン
の脱アセチル化度によつても異なるが、キトサン
のグルコサミン残基１モルに対し、0.07〜1.45モ
ルの割合で使用し、Ｎ−アシル化度が５〜97％の
Ｎ−アシル化多孔質粒状キトサンとした後に、有
機ジイソシアネートと反応させることが好まし
い。 このＮ−アシル化多孔質粒状キトサンを有機ジ
イソシアネート化合物として、例えば、４，4′−
ジフエニルメタンジイソシアネート、１，４−フ
エニレンジイソシアネート、２，４−トリレンジ
イソシアネート、ナフタレンジイソシアネート、
１，４−シクロヘキサンジイソシアネート、４，
4′−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート、
キシリレンジイソシアネート、イソフオロンジイ
ソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート
等を用いることができるが、ヘキサメチレンジイ
ソシアネートを使用することが好ましい。有機ジ
イソシアネート化合物は、メタノール、エタノー
ル、イソプロピルアルコール等のアルコール類、
アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジ
メチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の
アミド類の極性溶媒の１種又は２種以上の混合液
中で反応させる。そして、有機ジイソシアネート
化合物の濃度は特に限定されないが、アシル化さ
れた後の後で残存しているフリーのアミノ基が全
て有機ジイソシアネート化合物と反応される量を
添加することが好ましい。 かくして有機ジイソシアネート化合物を反応さ
せたＮ−アシル化多孔質粒状キトサンを得る。こ
の際、水洗処理がなされるので末端基のイソシア
ネート基はアミノ基になつている。これにβ−フ
ラクトフラノシダーゼをアミノ基を介して固定す
るが、本発明に用いられるβ−フラクトフラノシ
ダーゼは主としてシヨ糖に作用してフラクトース
とグルコースとのβ−１，２結合を切断する作用
と、生成したフラクトースをシヨ糖に転移して、
シヨ糖にフラクトースが１分子結合したフラクト
オリゴ糖を生成する作用を具備したものが用いら
れる。β−フラクトフラノシダーゼを固定化する
方法は、β−フラクトフラノシシダーゼ溶液中に
有機ジイソシアネート化合物を反応させたＮ−ア
シル化多孔質粒状キトサンを加え、数時間撹拌
し、固定化させ、水洗して未固定のβ−フラクト
フラノシダーゼを除去して固定化β−フラクトフ
ラノシダーゼを得る。 また、本発明においては、β−フラクトフラノ
シダーゼを固定化する際に、有機ジイソシアネー
ト化合物を反応させたＮ−アシル化多孔質粒状キ
トサンをグルタールアルデヒド溶液中で処理した
後に、β−フラクトフラノシダーゼの固定化を行
なつてもよい。又、本発明によつて得られた固定
化β−フラクトフラノシダーゼを、更にグルター
ルアルデヒド溶液中で数時間処理してもよい。 〔実施例〕 以下に実施例を挙げて本発明を詳述するが、本
発明はこれらの範囲に限定されるものではない。 実施例でのβ−フラクトフラノシダーゼの活性
単位の１〓は0.11Mシヨ糖を含有するPH4.8の
0.01Mリン酸緩衝溶液において40℃で１分間に
1μmolのシヨ糖を加水分解するものである。 又、活性の測定方法は、HPLC（昭和電工製Ion
Pak Ks−801カラム）で各成分を分離し、高感
度示差屈折計を用いて定量し、シヨ糖とグルコー
ス、フラクトース及びフラクトオリゴ糖のピーク
相対比より活性を算出した。 実施例 １ 脱アセチル化度80％、平均分子量約60000のキ
トサン70gを3.5％酢酸水溶液930gに溶解させて濃
度７％の溶液とした。該溶液を孔径0.25m／mφ
のノズル孔より10％水酸化ナトリウム水溶液中に
落下させ、粒径1m／mφ、比表面積93.5m2／ｇの
多孔質粒状キトサン860ml（湿状）を得た。 該多孔質粒状キトサン250mlを充分水洗した後、
１のエタノールで、３回洗浄して溶媒を水から
エタノールに置換し、夫々100mlづつ分取し、
夫々をエタノール100ml中に加え、アシル化剤と
して無水酢酸をキトサンのグルコサミン残基１モ
ルに対し夫々0.45モルと0.95モル添加し、室温で
24時間Ｎ−アシル化反応させ、Ｎ−アセチル化度
が夫々50％、80％のＮ−アシル化多孔質粒状キト
サンＡ１，Ｂ１を夫々90ml得た。 これらを夫々湿潤状態で50mlを採取し、充分に
水洗し、250mlのジメチルホルムアミドで４回洗
浄して溶媒を水からジメチルホルムアミドに置換
し、ジメチルホルムアミド50ml中に有機ジイソシ
アネート化合物としてヘキサメチレンジイソシア
ネートをキトサンのグルコサミン残基１モルに対
して1.5モル添加し、室温で１時間反応させた。 反応後、ジメチルホルムアミド250mlで４回洗
浄し、更に水洗、湯洗をしてジメチルホルムアミ
ドを完全に除去して有機ジイソシアネート化合物
を反応させたＮ−アシル化多孔質粒状キトサンＡ
２，Ｂ２を夫々40ml（湿状）得た。 次いで、Ａ２，Ｂ２夫々20gを採取し、129
〓／mgのパン酵母由来のβ−フラクトフラノシダ
ーゼ（和光純薬工業株式会社製、インベルター
ゼ）27.6mgを含むPH4.8の0.01Mリン酸緩衝溶液60
mlに添加し、４℃で12時間撹拌後、PH4.8の
0.01Mリン酸緩衝溶液２で洗浄して固定化β−
フラクトフラノシダーゼ（試料１，２）夫々20g
を得た。 比較例 実施例１と同様にして得たＮ−アセチル化度が
夫々50％、80％のＮ−アシル化多孔質粒状キトサ
ンについて有機ジイソシアネート化合物で処理せ
ずに、単に実施例１と同様の操作でβ−フラクト
フラノシダーゼを固定化した固定化β−フラクト
フラノシダーゼ（試料３，４）を夫々20g得た。
実施例１で得た試料１，２及び試料３，４を夫々
湿潤状態で1g採取し、0.55m molのシヨ糖を含有
するPH4.8の0.01Mリン酸緩衝溶液（シヨ糖濃度
0.11M）５mlに添加し、40℃で20分間加水分解反
応をさせて、固定化β−フラクトフラノシダーゼ
の活性を測定した。その結果を表１に示した。
【表】
表１において、理論値とは固定化されたβ−フ
ラクトフラノシダーゼが全て活性化に寄与したと
推定した理論的な数値を示し（単位はwet−resin
によるunits／ｇ）、活性収率は理論値(a)と実測値
(b)との割合（ｂ／ａ×100）を示す。この結果よ
り、ヘキサメチレンジイソシアネートで処理した
本発明の固定化β−フラクトフラノシダーゼ（試
料１，２）は、比較例によつて得られたヘキサメ
チレンジイソシアネートで処理しないもの（試料
３，４）よりも活性並びに活性収率において顕著
に優れていることが明らかである。 応用例 １ 実施例１、比較例で得た試料１，２，３，４並
びに実施例１と同様にして得た脱アセチル化度80
％の多孔質粒状キトサンをＮ−アシル化処理せず
に、有機ジイソシアネート化合物であるヘキサメ
チレンジイソシアネート処理し、β−フラクトフ
ラノシダーゼを固定化した固定化β−フラクトフ
ラノシダーゼ（試料５）を夫々湿潤状態で1gを
夫々５本分取し、シヨ糖濃度が0.25m mol、
0.5m mol、1.0m mol、2.0m mol、3.5m mol
夫々含有するPH4.8の0.01Mリン酸緩衝溶液５ml
に添加し、40℃で30分間加水分解反応をさせて、
HPLCのピーク相対比よりシヨ糖の加水分解反応
速度を測定した結果を表２に示した。シヨ糖添加
量をＳ、反応速度をＶとし、１／Ｓと１／Ｖの関
係を表２より求め、ラインウーバー・バーク・プ
ロツト（Lineweaver−Burk Plot）として第１
図に示し、そして第１図より固定化β−フラクト
フラノシダーゼの基質に対する親和性を表わすミ
ハエリス定数（Km値）と最大反応速度
（Vmax）を算出するため、夫々の直線で１／Ｓ
＝０の時の（１／Ｖ）即ち（１／Vmax）と傾き
（Km／Vmax）からKmとVmaxを求め、表３に
示した。 尚、Km値が小さい程親和性が高いことを示す
ものである。
ラクトフラノシダーゼが全て活性化に寄与したと
推定した理論的な数値を示し（単位はwet−resin
によるunits／ｇ）、活性収率は理論値(a)と実測値
(b)との割合（ｂ／ａ×100）を示す。この結果よ
り、ヘキサメチレンジイソシアネートで処理した
本発明の固定化β−フラクトフラノシダーゼ（試
料１，２）は、比較例によつて得られたヘキサメ
チレンジイソシアネートで処理しないもの（試料
３，４）よりも活性並びに活性収率において顕著
に優れていることが明らかである。 応用例 １ 実施例１、比較例で得た試料１，２，３，４並
びに実施例１と同様にして得た脱アセチル化度80
％の多孔質粒状キトサンをＮ−アシル化処理せず
に、有機ジイソシアネート化合物であるヘキサメ
チレンジイソシアネート処理し、β−フラクトフ
ラノシダーゼを固定化した固定化β−フラクトフ
ラノシダーゼ（試料５）を夫々湿潤状態で1gを
夫々５本分取し、シヨ糖濃度が0.25m mol、
0.5m mol、1.0m mol、2.0m mol、3.5m mol
夫々含有するPH4.8の0.01Mリン酸緩衝溶液５ml
に添加し、40℃で30分間加水分解反応をさせて、
HPLCのピーク相対比よりシヨ糖の加水分解反応
速度を測定した結果を表２に示した。シヨ糖添加
量をＳ、反応速度をＶとし、１／Ｓと１／Ｖの関
係を表２より求め、ラインウーバー・バーク・プ
ロツト（Lineweaver−Burk Plot）として第１
図に示し、そして第１図より固定化β−フラクト
フラノシダーゼの基質に対する親和性を表わすミ
ハエリス定数（Km値）と最大反応速度
（Vmax）を算出するため、夫々の直線で１／Ｓ
＝０の時の（１／Ｖ）即ち（１／Vmax）と傾き
（Km／Vmax）からKmとVmaxを求め、表３に
示した。 尚、Km値が小さい程親和性が高いことを示す
ものである。
【表】
【表】
この結果より、本発明の試料１であるＮ−アシ
ル化後ヘキサメチレンジイソシアネート処理され
た固定化β−フラクトフラノシダーゼは、試料３
のヘキサメチレンジイソシアネートで処理しなか
つたものよりもKm値が低く、基質との親和性が
増すと同時に、反応速度も上昇していることが明
らかである。同様に試料２が試料４より優れてい
ることが明らかである。又、試料１，２のアシル
化剤で処理されたものは、試料５のアシル化剤で
処理しなかつたものよりも、基質との親和性、反
応性が増加した固定化β−フラクトフラノシダー
ゼが得られた。 実施例 ２ 脱アセチル化度98％、平均分子量約47000のキ
トサン60gを３％酢酸水溶液940gに溶解させて、
濃度６％の溶液とした。該溶液を孔径0.25m／
mφのノズル孔より10％苛性ソーダ、30％エタノ
ールと60％の水から成る塩基性溶液中に落下させ
て粒径1m／mφ、比表面積97.7m2／ｇの多孔質粒
状キトサン779ml（湿状）を得た。 該多孔質粒状キトサン200mlを充分水洗した後、
１のエタノールで３回洗浄して溶媒を水からエ
タノールに置換し、エタノール200ml中にアシル
化剤として無水酢酸をキトサンのグルコサミン残
基１モルに対して0.18モルを添加し、室温で24時
間Ｎ−アシル化反応させ、Ｎ−アセチル化度が20
％のＮ−アシル化多孔質粒状キトサン190ml（湿
状）を得た。 これを湿潤状態で、100ml採取し、充分に水洗
し、500mlのジメチルホルムアミドで４回洗浄し
て溶媒を水からジメチルホルムアミドに置換し、
ジメチルホルムアミド100ml中に有機ジイソシア
ネート化合物としてヘキサメチレンジイソシアネ
ートをキトサンのグルコサミン残基１モルに対し
て２モル添加し、室温で１時間反応させた。 反応後、ジメチルホルムアミド500mlで４回洗
浄し、更に水洗、湯洗をして、ジメチルホルムア
ミドを完全に除去して有機ジイソシアネート化合
物を反応させたＮ−アシル化多孔質粒状キトサン
90ml（湿状）を得た。 次いでアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus
oryzae）の米麹（伊勢惣製、商品名：都こうじ）
1gをPH7.8の0.01Mリン酸緩衝溶液30mlで懸濁後、
吸引濾過、遠心分離（3500rpm）して得た粗β−
フラクトフラノシダーゼ溶液３mlに、湿潤状態の
有機ジイソシアネート化合物を反応させたＮ−ア
シル化多孔質粒状キトサン1gを添加し、４℃で
12時間撹拌後、PH7.8の0.01Mリン酸緩衝溶液100
mlで洗浄して固定化β−フラクトフラノシダーゼ
1g（試料６）を得た。 応用例 ２ 実施例２で得た試料６並びに、実施例２と同様
の操作で得たＮ−アセチル化度20％のＮ−アシル
化多孔質粒状キトサンを、有機ジイソシアネート
化合物としてヘキサメチレンジイソシアネートで
処理せずに、単に実施例２と同様にβ−フラクト
フラノシダーゼを固定化した固定化β−フラクト
フラノシダーゼ（試料７）を夫々湿潤状態で1g
採取し、1.5m molシヨ糖を含有するPH7.8の
0.01Mリン酸緩衝溶液３mlに添加し、40℃で23時
間迄反応させ、経時的にシヨ糖の消費量と、グル
コース、フラクトース、フラクトオリゴ糖の生成
量をHPLCより測定した。その結果を表３、表４
に、フラクトオリゴ糖生成量の経時変化を第２図
に示した。この結果から本発明品のＮ−アシル化
し、その後、有機ジイソシアネート化合物で反応
させた固定化β−フラクトフラノシダーゼ（試料
６）は、フラクトオリゴ糖の生成速度が早く、最
大生成量に達する時間が試料７より約２時間短縮
されたことが明らかで、効率のよいフラクトオリ
ゴ糖の生産への応用が計られる。
ル化後ヘキサメチレンジイソシアネート処理され
た固定化β−フラクトフラノシダーゼは、試料３
のヘキサメチレンジイソシアネートで処理しなか
つたものよりもKm値が低く、基質との親和性が
増すと同時に、反応速度も上昇していることが明
らかである。同様に試料２が試料４より優れてい
ることが明らかである。又、試料１，２のアシル
化剤で処理されたものは、試料５のアシル化剤で
処理しなかつたものよりも、基質との親和性、反
応性が増加した固定化β−フラクトフラノシダー
ゼが得られた。 実施例 ２ 脱アセチル化度98％、平均分子量約47000のキ
トサン60gを３％酢酸水溶液940gに溶解させて、
濃度６％の溶液とした。該溶液を孔径0.25m／
mφのノズル孔より10％苛性ソーダ、30％エタノ
ールと60％の水から成る塩基性溶液中に落下させ
て粒径1m／mφ、比表面積97.7m2／ｇの多孔質粒
状キトサン779ml（湿状）を得た。 該多孔質粒状キトサン200mlを充分水洗した後、
１のエタノールで３回洗浄して溶媒を水からエ
タノールに置換し、エタノール200ml中にアシル
化剤として無水酢酸をキトサンのグルコサミン残
基１モルに対して0.18モルを添加し、室温で24時
間Ｎ−アシル化反応させ、Ｎ−アセチル化度が20
％のＮ−アシル化多孔質粒状キトサン190ml（湿
状）を得た。 これを湿潤状態で、100ml採取し、充分に水洗
し、500mlのジメチルホルムアミドで４回洗浄し
て溶媒を水からジメチルホルムアミドに置換し、
ジメチルホルムアミド100ml中に有機ジイソシア
ネート化合物としてヘキサメチレンジイソシアネ
ートをキトサンのグルコサミン残基１モルに対し
て２モル添加し、室温で１時間反応させた。 反応後、ジメチルホルムアミド500mlで４回洗
浄し、更に水洗、湯洗をして、ジメチルホルムア
ミドを完全に除去して有機ジイソシアネート化合
物を反応させたＮ−アシル化多孔質粒状キトサン
90ml（湿状）を得た。 次いでアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus
oryzae）の米麹（伊勢惣製、商品名：都こうじ）
1gをPH7.8の0.01Mリン酸緩衝溶液30mlで懸濁後、
吸引濾過、遠心分離（3500rpm）して得た粗β−
フラクトフラノシダーゼ溶液３mlに、湿潤状態の
有機ジイソシアネート化合物を反応させたＮ−ア
シル化多孔質粒状キトサン1gを添加し、４℃で
12時間撹拌後、PH7.8の0.01Mリン酸緩衝溶液100
mlで洗浄して固定化β−フラクトフラノシダーゼ
1g（試料６）を得た。 応用例 ２ 実施例２で得た試料６並びに、実施例２と同様
の操作で得たＮ−アセチル化度20％のＮ−アシル
化多孔質粒状キトサンを、有機ジイソシアネート
化合物としてヘキサメチレンジイソシアネートで
処理せずに、単に実施例２と同様にβ−フラクト
フラノシダーゼを固定化した固定化β−フラクト
フラノシダーゼ（試料７）を夫々湿潤状態で1g
採取し、1.5m molシヨ糖を含有するPH7.8の
0.01Mリン酸緩衝溶液３mlに添加し、40℃で23時
間迄反応させ、経時的にシヨ糖の消費量と、グル
コース、フラクトース、フラクトオリゴ糖の生成
量をHPLCより測定した。その結果を表３、表４
に、フラクトオリゴ糖生成量の経時変化を第２図
に示した。この結果から本発明品のＮ−アシル化
し、その後、有機ジイソシアネート化合物で反応
させた固定化β−フラクトフラノシダーゼ（試料
６）は、フラクトオリゴ糖の生成速度が早く、最
大生成量に達する時間が試料７より約２時間短縮
されたことが明らかで、効率のよいフラクトオリ
ゴ糖の生産への応用が計られる。
【表】
本発明による固定化β−フラクトフラノシダー
ゼは、キトサンを部分的アシル化後有機ジイソシ
アネート化合物で処理してβ−フラクトフラノシ
ダーゼを固定化する部位を形成後β−フラクトフ
ラノシダーゼを固定化するものであり、このよう
にすることによつて実施例及び比較例、応用例に
記載のようにβ−フラクトフラノシダーゼの反応
活性を高め、シヨ糖からグルコース、フラクトー
ス、フラクトオリゴ糖を短時間で効率よく得るこ
とができる。 また、本発明においては、機械的強度の高い多
孔質粒状キトサンを用いているので、固定化β−
フラクトフラノシダーゼを用いたシヨ糖転化方法
のシステム化が容易であり、再生利用も可能であ
る。
ゼは、キトサンを部分的アシル化後有機ジイソシ
アネート化合物で処理してβ−フラクトフラノシ
ダーゼを固定化する部位を形成後β−フラクトフ
ラノシダーゼを固定化するものであり、このよう
にすることによつて実施例及び比較例、応用例に
記載のようにβ−フラクトフラノシダーゼの反応
活性を高め、シヨ糖からグルコース、フラクトー
ス、フラクトオリゴ糖を短時間で効率よく得るこ
とができる。 また、本発明においては、機械的強度の高い多
孔質粒状キトサンを用いているので、固定化β−
フラクトフラノシダーゼを用いたシヨ糖転化方法
のシステム化が容易であり、再生利用も可能であ
る。
第１図は、実施例１及び比較例で得られた固定
化β−フラクトフラノシダーゼのラインウエーバ
ーバーク・プロツトを示すグラフであり、第２図
は、実施例２及び応用例２で得られた固定化β−
フラクトフラノシダーゼを用いた際のフラクトオ
リゴ糖の生成量の経時変化を示すグラフである。
化β−フラクトフラノシダーゼのラインウエーバ
ーバーク・プロツトを示すグラフであり、第２図
は、実施例２及び応用例２で得られた固定化β−
フラクトフラノシダーゼを用いた際のフラクトオ
リゴ糖の生成量の経時変化を示すグラフである。
Claims (1)
- １ ヘキサメチレンジイソシアネートを反応させ
たＮ−アシル化多孔質粒状キトサンに、β−フラ
クトフラノシダーゼを固定化したことを特徴とす
る固定化β−フラクトフラノシダーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17097688A JPH0223869A (ja) | 1988-07-11 | 1988-07-11 | 固定化β−フラクトフラノシダーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17097688A JPH0223869A (ja) | 1988-07-11 | 1988-07-11 | 固定化β−フラクトフラノシダーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0223869A JPH0223869A (ja) | 1990-01-26 |
| JPH0469996B2 true JPH0469996B2 (ja) | 1992-11-09 |
Family
ID=15914840
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17097688A Granted JPH0223869A (ja) | 1988-07-11 | 1988-07-11 | 固定化β−フラクトフラノシダーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0223869A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2613154B2 (ja) * | 1992-08-05 | 1997-05-21 | 富士紡績株式会社 | 微生物固定化用担体の製造法 |
| JP2613153B2 (ja) * | 1992-08-05 | 1997-05-21 | 富士紡績株式会社 | 微生物固定化用担体の製造方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59213390A (ja) * | 1983-05-19 | 1984-12-03 | Asahi Denka Kogyo Kk | 固定化酵素及びその製造方法 |
| JPS6176504A (ja) * | 1984-09-21 | 1986-04-19 | Fuji Boseki Kk | 粒状多孔質キトサンの製造法 |
| JPH0616706B2 (ja) * | 1986-01-06 | 1994-03-09 | 昭和電工株式会社 | 固定化酵素の製造法 |
-
1988
- 1988-07-11 JP JP17097688A patent/JPH0223869A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0223869A (ja) | 1990-01-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS5840474B2 (ja) | 酵素反応により有機物質を少くとも１種類の他の有機物質に変換する酵素利用法 | |
| JPS638121B2 (ja) | ||
| HU179727B (en) | Process for producing water-insoluble enzyme composition | |
| CN1407103A (zh) | 一种珠状壳聚糖载体的制备及其用于酶固定化的方法 | |
| CA1179283A (en) | SUCROSE MUTASE, IMMOBILISED SUCROSE MUTASE AND THE USE OF THIS IMMOBILISED SUCROSE MUTASE FOR THE PREPARATION OF ISOMALTULOSE (6-0-.alpha.-D- GLUCOPYRANOSIDO-D-FRUCTOSE) | |
| FR2542010A1 (fr) | Procede pour immobiliser l'enzyme cyclodextrineglycosyl-transferase | |
| JPH0223869A (ja) | 固定化β−フラクトフラノシダーゼ | |
| JPH0455609B2 (ja) | ||
| Chakrabarti et al. | Co-immobilization of amyloglucosidase and pullulanase for enhanced starch hydrolysis | |
| CN101260396A (zh) | 以丝瓜络为载体的固定化脂肪酶及其制备方法 | |
| US7482019B2 (en) | Methods of producing modified microcrystalline chitosan and uses therefor | |
| US4202939A (en) | Glucoamylase immobilized on cationic colloidal silica | |
| CN117247930A (zh) | 利用壳聚糖磁性材料对肝素酶ii的固定化方法 | |
| CN112708616B (zh) | 一种固定化多酶体系生产塔格糖的方法 | |
| JPS5838152B2 (ja) | 水に不溶性酵素錯体 | |
| JP3025947B2 (ja) | 乾燥固定化リパーゼ担体の製造方法 | |
| JP2824902B2 (ja) | 酵素固定化用担体の製造方法 | |
| CN111607631B (zh) | 一种(s)-邻氯苯甘氨酸甲酯酶法合成方法 | |
| Kusaoke et al. | UTILIZATION OF PARTIALLY N-AND O-ACYLATED; CHITOSAN GELS AS SUPPORTS FOR THE IMMOBILIZATION OF INVERTASE | |
| KR0130938B1 (ko) | 고농도 갈락토올리고당의 제조방법 | |
| CN110723910B (zh) | 一种控制细胞黏附和脱离的细胞培养材料及制备方法 | |
| JPS6167489A (ja) | 枯草菌の固定化細胞、固定化方法及び７‐β‐アシルアミドセフアロスポラン酸からの３‐アセトキシ基の脱離に対する生成物の使用 | |
| JP2510109B2 (ja) | 酵素固定用繊維状担体の製法 | |
| JPH0361422B2 (ja) | ||
| JPS60160885A (ja) | 固定化した微生物、植物細胞および／または酵素 |