JPH0223869A - 固定化β−フラクトフラノシダーゼ - Google Patents
固定化β−フラクトフラノシダーゼInfo
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- JPH0223869A JPH0223869A JP17097688A JP17097688A JPH0223869A JP H0223869 A JPH0223869 A JP H0223869A JP 17097688 A JP17097688 A JP 17097688A JP 17097688 A JP17097688 A JP 17097688A JP H0223869 A JPH0223869 A JP H0223869A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
（産業上の利用分野］
本発明は、ショ糖から転化糖又はフラクトオリゴ糖を製
造する際に使用するのに最適な固定化酵素に関するもの
である。 に従来の技術】 従来よりβ−フラクトフラノシダーゼを用いて転化糖又
はフラクトオリゴ糖を作ることはよく知られている。β
−フラクトフラノシダーゼの固定化に関するキトサンの
利用については、フレーク状キトサンにグルタルアルデ
ヒドを用いて酵素を架橋固定化する方法（Ｃｈｉｔｉｎ
ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、 １９８６ Ｐｌｅｎｕｎ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ五版、４１１頁〜４１５頁］、Ｎ−アシルキト
サンゲルにグルタルアルデヒドを用いて酵素を架橋）る
方法（ＳＥＮ−Ｉ ＧＡＫに＾ｌ５ＨＩＩ報文）ｖｏｌ
、４３ Ｎｏ、１１． ｆ）ａ（ｌｅ（８２）〜（８７
）、 １９８７）又、キトサン硫Ｍ塩に熱水を加えたキ
トサン硫酸塩水溶液を冷却し、グルイヒ寸的にＵ素を加
える方法、キトサン希酸水溶液に酵素を加え、中性に凝
固させる方法や、キトサン希酸水溶液に酵素を加え、ゲ
ルタールアルデヒドで架橋させ凝集させる方法（Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅＦｉｒｓｔ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｎ Ｃ
ｈｉｔｉｎ ／Ｃｈｉｔｏｓａｎ、 ３６４〜３６９
頁（１９７８） ）等が発表されている。 Ｋ発明が解決しようとする課題】 本発明は、反応活性が高く、しかもｐＨ及び温度に対す
る安定性、物理的強度、活性の持続性が高く、再生も容
易で、ショ糖から転化糖又はフラクトオリゴ糖を製造す
るシステムに有効に利用出来る固定化β−フラクトフラ
ノシダーゼを提供することを目的としている。 従来のβ−フラクトフラノシダーゼをイオン結合法で固
定化したものでは、ｐＨ及び温度に対する安定性に劣り
、包括法によるものはゲル化物であるため物理的強度が
小さい上、酵素がゲル内部に存在しているために反応効
率が低く、物理的吸着及び共有結合法で得られるものは
活性の持続性及び再生の点で欠点がある。従来のキトサ
ンを用いた固定化フラクトフラノシダーゼは形状にも問
題があり、システム化が困難である。本発明は、多孔質
粒状キトサンを基材とすることにより、システム化を容
易とすると共に物理的強度や活性の発現率を高くし、再
生利用可能として上記問題点の解決を計ったものである
。 Ｋ課題を解決するための手段】 本発明は、有機ジイソシアネート化合物を反応させたＮ
−アシル化多孔質粒状キトサンに、βフラクトフラノシ
ダーゼを固定化したことを特徴とする固定化β−フラク
トフラノシダーゼに係る。 本発明においては、キトサンを多孔質粒状キトサンに成
型することで利用し易い形状とし、システム化を容易と
すると共に、アシル化剤で処理してキトサンをＮ−アシ
ル化したものを有機ジイソシアネート化合物で処理して
、キトサンのアミノ基を架橋し、β−フラクトフラノシ
ダーゼを固定化させる部位を形成させて、固定化β−フ
ラクトフラノシダーゼとしたものである。本発明におい
ては、Ｎ−アシル化多孔質粒状キトサンのＮ−アシル化
度を適宜調整することにより有機ジイソシアネート化合
物の導入中が調整でき、その導入量の差異でβ−フラク
トフラノシダーゼの親和性。 固定化量と活性収率の調整を容易に行うことができる。 本発明に用いるＮ−アシル化多孔質粒状キトサンを得る
ために用いられる多孔質粒状キトサンは、特開昭６１−
４０３３７号に開示した方法で製造される。 即ち、平均分子量が１０．０００〜２３０．０００であ
る低分子量キトサンを酢酸、ジクロル酢酸、＠酸等の単
独又は混合物の水溶液に溶解させて、該溶液を塩基性溶
液より成る凝固浴中に落下せしめて多孔質粒状キトサン
を得る。凝固浴としては、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、炭酸ナトリウム。 炭酸カリウム、アンモニア、エチレンジアミン等のアル
カリ性物質を水又はメタノール、エタノール等の極性を
有するアルコール類、又は水とアルコールとの混合物に
加えたものが用いられる。得られた多孔質粒状キトサン
をＮ−アシル化多孔質粒状キトサンにするには、多孔質
粒状キトサンを無水酢酸、無水ジクロル酢酸、無水モノ
クロル酢酸、無水プロピオン酸、無水安患舎酸、無水ｎ
−カプロン酸、無水ｎ−酪酸等のアシル化剤を用い、ア
シル化剤や反応生成物に対して不活性で伺ら影響を与え
ない、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルアセトア
ミド、ベンゼン、ジオキサン、メタノール、エタノール
、ｎ−ブタノール等の有機溶媒の単独又は混合液中で反
応させてＮ−アシル化多孔質粒状キトサンとする。 本発明においては、上記のように多孔性粒状キトサンを
まずＮ−アシル化して有機ジイソシアネート化合物を導
入することにより、β−フラクトフラノシダーゼの！！
質への親和性を高め、反応性を増加せしめるものであっ
て、アシル化剤の使用ψを調製することにより、有機ジ
イソシアネート化合物の導入中を調整することができる
。アシル化剤の使用量は、原料である多孔質粒状キトサ
ンの脱アセチル化度によっても異なるが、キトサンのグ
ルコサミン残基１モルに対し、０．０７〜１．４５モル
の割合で使用し、Ｎ−アシル化度が５〜９７％のＮ−ア
シル化多孔質粒状キトサンとした後に、有機ジイソシア
ネートと反応させることが好ましい。 このＮ−アシル化多孔質粒状キトサンを有機ジイソシア
ネート化合物として、例えば、４．４−ジフェニルメタ
ンジイソシアネート、１，４−フにレンジイソシアネー
ト、２，４−トリレンジイソシアネート、ナフタレンジ
イソシアネート、１．４−シクロヘキサンジソイシアネ
ート、４，４−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネー
ト、キシリレンジイソシアネート、４，４°−ジシクロ
ヘキシルメタンジイソシアネート、キシリレンジイソシ
アネート、イソフオロンジイソシアネート、ヘキサメチ
レンジイソシアネート等をメタノール、エタノール、イ
ソプロピルアルコール等のアルコール類。 アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチル
ホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類の極
性溶媒の１種又は２種以上の混合液中で反応させる。そ
して、有機ジイソシアネート化合物の濃度は特に限定さ
れないが、アシル化された後のフリーのアミン基が全て
有機ジイソシアネート化合物と反応されるΦを添加する
ことが好ましい。 かくして有機ジイソシアネート化合物を反応させたＮ−
アシル化多孔質粒状キトサンを得る。この際、水洗処理
がなされるので末端基のイソシアネート基はアミノ基に
なっている。これにβ−フラクトフラノシダーゼをアミ
ノ基を介して固定するが、本発明に用いられるβ−フラ
クトフラノシダーゼは主としてショ糖に作用してフラク
トースとグルコースとのβ−１，２結合を切断する作用
と、生成したフラクトースをショ糖に転移して、ショ糖
にフラクトースが１分子量合したフラクトオリゴ糖を生
成する作用を具備したものが用いられる。 β−フラクトフラノシダーゼを固定化する方法は、β−
フラクトフラシノシダーゼ溶液中に有機ジイソシアネー
ト化合物を反応させたＮ−アシル化多孔質粒状キトサン
を加え、数時間攪拌し、固定化させ、水洗して未固定の
β−フラクトフラノシダーゼを除去して固定化β−フラ
クトフラノシダーゼを得る。 また、本発明においては、β−フラクトフラシノダーゼ
を固定化する際に、有機ジイソアネート化合物を反応さ
せたＮ−アシル化多孔質粒状キトサンをゲルタールアル
デヒド溶液中で処理した後に、β−フラクトフラノシダ
ーゼの固定化を行なってもよい。又、本発明によって得
られた固定化β−フラクトフラノシダーゼを、更にゲル
タールアルデヒド溶液中で数時間処理してもよい。 （実 施 例］ 以下に実施例を挙げて本発明を詳述するが、本発明はこ
れらの範囲に限定されるものではない。 実施例でのβ−７ラクトフラノシダーゼの活性単位の１
０は０．１１Ｍショ糖を含有するｐＨ４，８の０、０１
）４リンＭ緩衝溶液において４０℃で１分間に １μｌ
ｏｌのショ糖を加水分解するものである。 又、活性の測定方法は、ＨＰＬＣ（昭和電工製ＴｏｎＰ
ａｋ Ｋｓ−８０１カラム）で各成分を分離し、高熱度
示差屈折計を用いて定吊し、ショ糖とグルコース、フル
クトース及びフラクトオリゴ糖のピーク相対比より活性
を埠出した。 実施例１ 脱アセチル化度８０％、平均分子量的６０，０００のキ
トサン７０ｇを３．５％酢酸水溶液９３０シに溶解させ
て濃度７％の溶液とした。該溶液を孔径０．２５ｎ／ｉ
φのノズル孔より１０％水酸化ナトリウム水溶液中に落
下させ、粒径１１／ｌφ、比表面積９３．５ｍ／９の多
孔質粒状キトサン８６０ｒｄ （湿状）を得た。 該多孔質粒状キトサン２５０−を充分水洗した後、１文
のエタノールで３回洗浄して溶媒を水からエタノールに
置換し、夫々 １００−づつ分取し、夫々をエタノール
１００威中に加え、アシル化剤として無水酢酸をキトサ
ンのグルコサミン残基１モルに対し夫々０．４５モルと
０．９５モル添加し、室温で２４時間Ｎ−アシル化反応
させ、Ｎ−アセチル化度が夫々５０％、８０％のＮ−ア
シル化多孔質粒状キトサンＡＩ、Ｂ１を夫々９０ｄ得た
。 これらを夫々湿潤状態で５０ｒｄを採取し、充分に水洗
し、２５０−のジメチルホルムアミドで４回洗浄して溶
媒を水からジメチルホルムアミドに置換し、ジメチルホ
ルムアミド５０ｄ中に有機ジイソシアネート化合物とし
てヘキサメチレンジイソシアネートをキトサンのグルコ
サミン残基１モルに対して１．５モル添加し、室温で１
時間反応させた。 反応後、ジメチルホルムアミド２５０ｄで４回洗浄し、
更に水洗、ｉｉ！洗をしてジメチルホルムアミドを完全
に除去して有機ジイソシアネート化合物を反応させたＮ
−アシル多孔質粒状キトサンＡ２゜Ｂ２を夫々４０−（
湿状）得た。 次いで、Ａ２．Ｂ２夫々２０ｇを採取し、１２９Ｕ／１
１９のパン酵母由来のβ−フラクトフラノシダーゼ（和
光Ｉ！ｉＩ！薬株式会社製、インベルターゼ） ２７．
６Ｎ９を含むｐＨ４，８の０．０１Ｎリン酸緩Ｆｊ溶液
ｆ３０ｍ！に添加し、４℃で１２Ｍ間攪拌後、ｐＨ４，
８の０．０１Ｎリン酸緩Ｗｉｊ溶液２１で洗浄して固定
化β−フラクトフラノシダーゼ（試料１．２＞夫々２０
ｇを得た。 比較例 実施例１と同様にして得たＮ−アセチル化度が夫々５０
％、８０％のＮ−アシル化多孔質粒状キトサンについて
有機ジイソシアネート化合物で処理せずに、単に実施例
１と同様の操作でβ−フラクトフラノシダーゼを固定化
した固定化β−フラクトフラノシダーゼ（試料３．４）
を夫々２０９得た。 実施例１で得た試料１，２及び試料３．４を夫々湿潤状
態で１ｇ採取し、０．５５ｎ ｌｏｌのショ糖を含有す
るＩ）Ｈ４，８の０．０１Ｎリン酸！ｌ衝溶液（シヨ糖
濃度０．１１Ｍ） ５−に添加し、４０℃で２０分間
加水分解反応をさせて、固定化β−フラクトフラノシダ
ーゼの活性を測定した。その結果を表１に示した。 表 表１において、理論値とは固定化されたβ−フラクトフ
ラノシダーゼが全て活性化に寄与したと推定した理論的
な数値を示しく単位はｗｅｔ−ｒｅｓｉｎによるｕｎｉ
ｔｓ／ｇ） 、活性収率は３！論値（ａ）と実測値（ｂ
）との割合（ｂ／ａ ｘ １００）を示す。この結果
より、ヘキサメチレンジイソシアネートで処理した本光
明の固定化β−フラクトフラノシダーゼ〈試＊４１．２
）は、比較例によって得られたヘキサメチレンジイソシ
アネートでＬＨ！しないもの（試料３．４）よりも活性
並びに活性収率において顕著に優れていることが明らか
である。 応用例１ 実施例１．比較例で得た試料１，２．３．４並びに実施
例１と同様にして得た脱アセチル化度８０％の多孔質粒
状キトサンをＮ−アシル化処理せずに、有機ジイソシア
ネート化合物であるヘキサメチレンジイソシアネート処
理し、β−フラクトフラノシダーゼを固定化した固定化
β−フラクトフラノシダーゼ（試料５）を夫々湿潤状態
で１ｇを夫々５本分取し、ショ糖濃度が０．２５ｎ ｌ
１ｏｌ、 ０．５ｖａ ｎｏｔ、 １．Ｏｍ ｌ′Ｉ
ｏｌ、 ２．０ＩＩｎｏｆ、 ３．５ｎ＋ ｎｏｌ夫々
含有するｐＨ４，８の０．０ＩＭリンＨ緩ｉｆｉ溶液５
−に添加し、４０℃で３０分間加水分解反応をさせて、
ＨＰＬＣのピーク相対比よりショ糖の加水分解反応速度
を測定した結果を表２に示した。シ：１ｍ！添加最をＳ
２反反応度を■とし、１／Ｓと１／Ｖの関係を表２より
求め、ラインウーバーパーク・プ０７ト（Ｌ＋ｎｅｗｅ
ａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ Ｐｌｏｔ）として第１図に示し、
そして第１図より固定化β−フラクトフラノシダーゼの
基質に対する親和性を表わすミバエリス定数（Ｋｌｌ値
）と最大反応速度（■１ｌａＸ）を算出するため、夫々
の直線で１／Ｓ−０の時の（１／Ｖ）即ち（１／Ｖｌｌ
ａｘ ）と傾き（Ｋｍ ／ＶｒＭａｘ ）からＫｌｌと
ｙ ｍａｘを求め、表３に示した。 尚、Ｋ１１ｉａが小さい程親和性が高いことを示すもの
である。 以 下 余 白 表 表 この結果より、本発明の試料１であるＮ−アシル化後へ
キサメチレンジイソシアネート処理された固定化β−７
ラクトフラノシダーゼは、試料３のへキサメチレンジイ
ソシアネートで処理しなかったものよりもＫｌｌ値が低
く、基質との親和性が増すと同時に、反応速度も上昇し
ていることが明らかである。同様に試料２が試料４より
優れていることが明らかである。又、試料１．２のアシ
ル化剤で処理されたものは、試料５のアシル化剤で処理
しなかったものよりも、基質との親和性１反応性が増加
した固定化β−フラクトフラノシダーゼが得られた。 実施例２ 脱アセチル化度９８％、平均分子量的４７，０００のキ
トサン６０９を３％酢酸水溶液９４０ｇに溶解させて、
濃度６％の溶液とした。該溶液を孔径０．２５ｉ／ｎφ
のノズル孔より１０％苛性ソーダ、 ３０％エタノール
と６０％の水から成る塩基性溶液中に落下させて粒径１
１／ｌφ、比表面積９７．７ｒｌｔ／９の多孔質粒状キ
トサン７７９ｒｄ＜湿状）を得た。 該多孔質粒状キトサン２００−を充分水洗した後、１文
のエタノールで３回洗浄して溶媒を水からエタノールに
置換し、エタノール２０〇−中にアシル化剤として無水
酢酸をキトサンのグルコサミン残基１モルに対して０．
１８モルを添加し、室温で２４時間Ｎ−アシル化反応さ
せ、Ｎ−アセチル化度が２０％のＮ−アシル化多孔質粒
状キトサン１９０ｉ（湿状）を得た。 これを湿潤状態で１００−採取し、充分に水洗し、５０
０威のジメチルホルムアミドで４回洗浄して溶媒を水か
らジメチルホルムアミドに置換し、ジメチルホルムアミ
ド１００ｄ中に有機ジイソシアネート化合物としてヘキ
サメチレンジイソシアネートをキトサンのグルコサミン
残基１モルに対して２モル添ｈ口し、室温で１時間反応
させた。 反応後、ジメチルホルムアミド５００ｄで４回洗浄し、
更に水洗、湯洗をして、ジメチルホルムアミドを完全に
除去して有機ジイソシアネート化合物を反応させたＮ−
アシル多孔質粒状キトサンタ０ＲＩ！（湿状）を得た。 次いでアスペルギルス・オリゼ（＾ｓｐｅｒｇ ｉ ｌ
１ｕｓｏｒｙｚａｅ ）の米ＩＩ（伊勢惣製、商品名
二部こうじ）１ｇをｐＨ７，８の０．０ＩＭリン酸緩衝
溶液３０ｄで懸濁後、吸引濾過、遠心分離（３５００ｒ
ｐＩＦ） ｕて得た相β−７ラクトフラノシダーゼ溶液
３−に、湿潤状態の有機ジイソシアネート化合物を反応
させたＮ−アシル多孔質粒状キトサン１ｇを添加し、４
℃で１２時間攪拌後、ｐＨ７，８の０．０１Ｍリン酸緩
ＩＩ溶液１００Ｍ！で洗浄して固定化β−フラクトフラ
ノシダーぜ１ｇ（試料６）を得た。 応用例２ 実施例２で得た試料６並びに、実施例２と同様の操作で
得たＮ−アセチル化度２０％のＮ−アシル化多孔質粒状
キトサンを、有機ジイソシアネート化合物としてヘキサ
メチレンジイソシアネートで処理せずに、単に実施例２
と同様にβ−フラクトフラノシダーゼを固定化した固定
化β−フラクトフラノシダーゼ（試料７）を夫々湿潤状
態で１ｇ採取し、１．５１１信ＯＩシ］糖を含有するｐ
Ｈ７，８の０．０１ＨＩＪン酸！ｌ！ｉ？ＩＦ１３ｍ！
ニ１７］ＯＬ、、４０℃テ２３時間違反応させ、経時的
にショ糖の消費量と、グルコース、フルクトース、フラ
クトオリゴ糖の生成量をＨＰＬＣにより測定した。その
結果を表３・表４に、フラクトオリゴ糖生成量の経時変
化を第２図に示した・この結果から本発明品のＮ−アシ
ル化し、その債、有機ジインシアネート化合物で反応さ
せた固定化β−フラクトフラノシダーゼ（試料６）は、
フラクトオリゴ糖の生成速度が早く、最大生成量に達す
る時間が試料７より約２時間短縮されたことが明らかで
、効率のよいフラクトオリゴ糖の生産が応用が計られる
。 表 以 下 余 白 表
造する際に使用するのに最適な固定化酵素に関するもの
である。 に従来の技術】 従来よりβ−フラクトフラノシダーゼを用いて転化糖又
はフラクトオリゴ糖を作ることはよく知られている。β
−フラクトフラノシダーゼの固定化に関するキトサンの
利用については、フレーク状キトサンにグルタルアルデ
ヒドを用いて酵素を架橋固定化する方法（Ｃｈｉｔｉｎ
ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、 １９８６ Ｐｌｅｎｕｎ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ五版、４１１頁〜４１５頁］、Ｎ−アシルキト
サンゲルにグルタルアルデヒドを用いて酵素を架橋）る
方法（ＳＥＮ−Ｉ ＧＡＫに＾ｌ５ＨＩＩ報文）ｖｏｌ
、４３ Ｎｏ、１１． ｆ）ａ（ｌｅ（８２）〜（８７
）、 １９８７）又、キトサン硫Ｍ塩に熱水を加えたキ
トサン硫酸塩水溶液を冷却し、グルイヒ寸的にＵ素を加
える方法、キトサン希酸水溶液に酵素を加え、中性に凝
固させる方法や、キトサン希酸水溶液に酵素を加え、ゲ
ルタールアルデヒドで架橋させ凝集させる方法（Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅＦｉｒｓｔ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｎ Ｃ
ｈｉｔｉｎ ／Ｃｈｉｔｏｓａｎ、 ３６４〜３６９
頁（１９７８） ）等が発表されている。 Ｋ発明が解決しようとする課題】 本発明は、反応活性が高く、しかもｐＨ及び温度に対す
る安定性、物理的強度、活性の持続性が高く、再生も容
易で、ショ糖から転化糖又はフラクトオリゴ糖を製造す
るシステムに有効に利用出来る固定化β−フラクトフラ
ノシダーゼを提供することを目的としている。 従来のβ−フラクトフラノシダーゼをイオン結合法で固
定化したものでは、ｐＨ及び温度に対する安定性に劣り
、包括法によるものはゲル化物であるため物理的強度が
小さい上、酵素がゲル内部に存在しているために反応効
率が低く、物理的吸着及び共有結合法で得られるものは
活性の持続性及び再生の点で欠点がある。従来のキトサ
ンを用いた固定化フラクトフラノシダーゼは形状にも問
題があり、システム化が困難である。本発明は、多孔質
粒状キトサンを基材とすることにより、システム化を容
易とすると共に物理的強度や活性の発現率を高くし、再
生利用可能として上記問題点の解決を計ったものである
。 Ｋ課題を解決するための手段】 本発明は、有機ジイソシアネート化合物を反応させたＮ
−アシル化多孔質粒状キトサンに、βフラクトフラノシ
ダーゼを固定化したことを特徴とする固定化β−フラク
トフラノシダーゼに係る。 本発明においては、キトサンを多孔質粒状キトサンに成
型することで利用し易い形状とし、システム化を容易と
すると共に、アシル化剤で処理してキトサンをＮ−アシ
ル化したものを有機ジイソシアネート化合物で処理して
、キトサンのアミノ基を架橋し、β−フラクトフラノシ
ダーゼを固定化させる部位を形成させて、固定化β−フ
ラクトフラノシダーゼとしたものである。本発明におい
ては、Ｎ−アシル化多孔質粒状キトサンのＮ−アシル化
度を適宜調整することにより有機ジイソシアネート化合
物の導入中が調整でき、その導入量の差異でβ−フラク
トフラノシダーゼの親和性。 固定化量と活性収率の調整を容易に行うことができる。 本発明に用いるＮ−アシル化多孔質粒状キトサンを得る
ために用いられる多孔質粒状キトサンは、特開昭６１−
４０３３７号に開示した方法で製造される。 即ち、平均分子量が１０．０００〜２３０．０００であ
る低分子量キトサンを酢酸、ジクロル酢酸、＠酸等の単
独又は混合物の水溶液に溶解させて、該溶液を塩基性溶
液より成る凝固浴中に落下せしめて多孔質粒状キトサン
を得る。凝固浴としては、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、炭酸ナトリウム。 炭酸カリウム、アンモニア、エチレンジアミン等のアル
カリ性物質を水又はメタノール、エタノール等の極性を
有するアルコール類、又は水とアルコールとの混合物に
加えたものが用いられる。得られた多孔質粒状キトサン
をＮ−アシル化多孔質粒状キトサンにするには、多孔質
粒状キトサンを無水酢酸、無水ジクロル酢酸、無水モノ
クロル酢酸、無水プロピオン酸、無水安患舎酸、無水ｎ
−カプロン酸、無水ｎ−酪酸等のアシル化剤を用い、ア
シル化剤や反応生成物に対して不活性で伺ら影響を与え
ない、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルアセトア
ミド、ベンゼン、ジオキサン、メタノール、エタノール
、ｎ−ブタノール等の有機溶媒の単独又は混合液中で反
応させてＮ−アシル化多孔質粒状キトサンとする。 本発明においては、上記のように多孔性粒状キトサンを
まずＮ−アシル化して有機ジイソシアネート化合物を導
入することにより、β−フラクトフラノシダーゼの！！
質への親和性を高め、反応性を増加せしめるものであっ
て、アシル化剤の使用ψを調製することにより、有機ジ
イソシアネート化合物の導入中を調整することができる
。アシル化剤の使用量は、原料である多孔質粒状キトサ
ンの脱アセチル化度によっても異なるが、キトサンのグ
ルコサミン残基１モルに対し、０．０７〜１．４５モル
の割合で使用し、Ｎ−アシル化度が５〜９７％のＮ−ア
シル化多孔質粒状キトサンとした後に、有機ジイソシア
ネートと反応させることが好ましい。 このＮ−アシル化多孔質粒状キトサンを有機ジイソシア
ネート化合物として、例えば、４．４−ジフェニルメタ
ンジイソシアネート、１，４−フにレンジイソシアネー
ト、２，４−トリレンジイソシアネート、ナフタレンジ
イソシアネート、１．４−シクロヘキサンジソイシアネ
ート、４，４−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネー
ト、キシリレンジイソシアネート、４，４°−ジシクロ
ヘキシルメタンジイソシアネート、キシリレンジイソシ
アネート、イソフオロンジイソシアネート、ヘキサメチ
レンジイソシアネート等をメタノール、エタノール、イ
ソプロピルアルコール等のアルコール類。 アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチル
ホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類の極
性溶媒の１種又は２種以上の混合液中で反応させる。そ
して、有機ジイソシアネート化合物の濃度は特に限定さ
れないが、アシル化された後のフリーのアミン基が全て
有機ジイソシアネート化合物と反応されるΦを添加する
ことが好ましい。 かくして有機ジイソシアネート化合物を反応させたＮ−
アシル化多孔質粒状キトサンを得る。この際、水洗処理
がなされるので末端基のイソシアネート基はアミノ基に
なっている。これにβ−フラクトフラノシダーゼをアミ
ノ基を介して固定するが、本発明に用いられるβ−フラ
クトフラノシダーゼは主としてショ糖に作用してフラク
トースとグルコースとのβ−１，２結合を切断する作用
と、生成したフラクトースをショ糖に転移して、ショ糖
にフラクトースが１分子量合したフラクトオリゴ糖を生
成する作用を具備したものが用いられる。 β−フラクトフラノシダーゼを固定化する方法は、β−
フラクトフラシノシダーゼ溶液中に有機ジイソシアネー
ト化合物を反応させたＮ−アシル化多孔質粒状キトサン
を加え、数時間攪拌し、固定化させ、水洗して未固定の
β−フラクトフラノシダーゼを除去して固定化β−フラ
クトフラノシダーゼを得る。 また、本発明においては、β−フラクトフラシノダーゼ
を固定化する際に、有機ジイソアネート化合物を反応さ
せたＮ−アシル化多孔質粒状キトサンをゲルタールアル
デヒド溶液中で処理した後に、β−フラクトフラノシダ
ーゼの固定化を行なってもよい。又、本発明によって得
られた固定化β−フラクトフラノシダーゼを、更にゲル
タールアルデヒド溶液中で数時間処理してもよい。 （実 施 例］ 以下に実施例を挙げて本発明を詳述するが、本発明はこ
れらの範囲に限定されるものではない。 実施例でのβ−７ラクトフラノシダーゼの活性単位の１
０は０．１１Ｍショ糖を含有するｐＨ４，８の０、０１
）４リンＭ緩衝溶液において４０℃で１分間に １μｌ
ｏｌのショ糖を加水分解するものである。 又、活性の測定方法は、ＨＰＬＣ（昭和電工製ＴｏｎＰ
ａｋ Ｋｓ−８０１カラム）で各成分を分離し、高熱度
示差屈折計を用いて定吊し、ショ糖とグルコース、フル
クトース及びフラクトオリゴ糖のピーク相対比より活性
を埠出した。 実施例１ 脱アセチル化度８０％、平均分子量的６０，０００のキ
トサン７０ｇを３．５％酢酸水溶液９３０シに溶解させ
て濃度７％の溶液とした。該溶液を孔径０．２５ｎ／ｉ
φのノズル孔より１０％水酸化ナトリウム水溶液中に落
下させ、粒径１１／ｌφ、比表面積９３．５ｍ／９の多
孔質粒状キトサン８６０ｒｄ （湿状）を得た。 該多孔質粒状キトサン２５０−を充分水洗した後、１文
のエタノールで３回洗浄して溶媒を水からエタノールに
置換し、夫々 １００−づつ分取し、夫々をエタノール
１００威中に加え、アシル化剤として無水酢酸をキトサ
ンのグルコサミン残基１モルに対し夫々０．４５モルと
０．９５モル添加し、室温で２４時間Ｎ−アシル化反応
させ、Ｎ−アセチル化度が夫々５０％、８０％のＮ−ア
シル化多孔質粒状キトサンＡＩ、Ｂ１を夫々９０ｄ得た
。 これらを夫々湿潤状態で５０ｒｄを採取し、充分に水洗
し、２５０−のジメチルホルムアミドで４回洗浄して溶
媒を水からジメチルホルムアミドに置換し、ジメチルホ
ルムアミド５０ｄ中に有機ジイソシアネート化合物とし
てヘキサメチレンジイソシアネートをキトサンのグルコ
サミン残基１モルに対して１．５モル添加し、室温で１
時間反応させた。 反応後、ジメチルホルムアミド２５０ｄで４回洗浄し、
更に水洗、ｉｉ！洗をしてジメチルホルムアミドを完全
に除去して有機ジイソシアネート化合物を反応させたＮ
−アシル多孔質粒状キトサンＡ２゜Ｂ２を夫々４０−（
湿状）得た。 次いで、Ａ２．Ｂ２夫々２０ｇを採取し、１２９Ｕ／１
１９のパン酵母由来のβ−フラクトフラノシダーゼ（和
光Ｉ！ｉＩ！薬株式会社製、インベルターゼ） ２７．
６Ｎ９を含むｐＨ４，８の０．０１Ｎリン酸緩Ｆｊ溶液
ｆ３０ｍ！に添加し、４℃で１２Ｍ間攪拌後、ｐＨ４，
８の０．０１Ｎリン酸緩Ｗｉｊ溶液２１で洗浄して固定
化β−フラクトフラノシダーゼ（試料１．２＞夫々２０
ｇを得た。 比較例 実施例１と同様にして得たＮ−アセチル化度が夫々５０
％、８０％のＮ−アシル化多孔質粒状キトサンについて
有機ジイソシアネート化合物で処理せずに、単に実施例
１と同様の操作でβ−フラクトフラノシダーゼを固定化
した固定化β−フラクトフラノシダーゼ（試料３．４）
を夫々２０９得た。 実施例１で得た試料１，２及び試料３．４を夫々湿潤状
態で１ｇ採取し、０．５５ｎ ｌｏｌのショ糖を含有す
るＩ）Ｈ４，８の０．０１Ｎリン酸！ｌ衝溶液（シヨ糖
濃度０．１１Ｍ） ５−に添加し、４０℃で２０分間
加水分解反応をさせて、固定化β−フラクトフラノシダ
ーゼの活性を測定した。その結果を表１に示した。 表 表１において、理論値とは固定化されたβ−フラクトフ
ラノシダーゼが全て活性化に寄与したと推定した理論的
な数値を示しく単位はｗｅｔ−ｒｅｓｉｎによるｕｎｉ
ｔｓ／ｇ） 、活性収率は３！論値（ａ）と実測値（ｂ
）との割合（ｂ／ａ ｘ １００）を示す。この結果
より、ヘキサメチレンジイソシアネートで処理した本光
明の固定化β−フラクトフラノシダーゼ〈試＊４１．２
）は、比較例によって得られたヘキサメチレンジイソシ
アネートでＬＨ！しないもの（試料３．４）よりも活性
並びに活性収率において顕著に優れていることが明らか
である。 応用例１ 実施例１．比較例で得た試料１，２．３．４並びに実施
例１と同様にして得た脱アセチル化度８０％の多孔質粒
状キトサンをＮ−アシル化処理せずに、有機ジイソシア
ネート化合物であるヘキサメチレンジイソシアネート処
理し、β−フラクトフラノシダーゼを固定化した固定化
β−フラクトフラノシダーゼ（試料５）を夫々湿潤状態
で１ｇを夫々５本分取し、ショ糖濃度が０．２５ｎ ｌ
１ｏｌ、 ０．５ｖａ ｎｏｔ、 １．Ｏｍ ｌ′Ｉ
ｏｌ、 ２．０ＩＩｎｏｆ、 ３．５ｎ＋ ｎｏｌ夫々
含有するｐＨ４，８の０．０ＩＭリンＨ緩ｉｆｉ溶液５
−に添加し、４０℃で３０分間加水分解反応をさせて、
ＨＰＬＣのピーク相対比よりショ糖の加水分解反応速度
を測定した結果を表２に示した。シ：１ｍ！添加最をＳ
２反反応度を■とし、１／Ｓと１／Ｖの関係を表２より
求め、ラインウーバーパーク・プ０７ト（Ｌ＋ｎｅｗｅ
ａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ Ｐｌｏｔ）として第１図に示し、
そして第１図より固定化β−フラクトフラノシダーゼの
基質に対する親和性を表わすミバエリス定数（Ｋｌｌ値
）と最大反応速度（■１ｌａＸ）を算出するため、夫々
の直線で１／Ｓ−０の時の（１／Ｖ）即ち（１／Ｖｌｌ
ａｘ ）と傾き（Ｋｍ ／ＶｒＭａｘ ）からＫｌｌと
ｙ ｍａｘを求め、表３に示した。 尚、Ｋ１１ｉａが小さい程親和性が高いことを示すもの
である。 以 下 余 白 表 表 この結果より、本発明の試料１であるＮ−アシル化後へ
キサメチレンジイソシアネート処理された固定化β−７
ラクトフラノシダーゼは、試料３のへキサメチレンジイ
ソシアネートで処理しなかったものよりもＫｌｌ値が低
く、基質との親和性が増すと同時に、反応速度も上昇し
ていることが明らかである。同様に試料２が試料４より
優れていることが明らかである。又、試料１．２のアシ
ル化剤で処理されたものは、試料５のアシル化剤で処理
しなかったものよりも、基質との親和性１反応性が増加
した固定化β−フラクトフラノシダーゼが得られた。 実施例２ 脱アセチル化度９８％、平均分子量的４７，０００のキ
トサン６０９を３％酢酸水溶液９４０ｇに溶解させて、
濃度６％の溶液とした。該溶液を孔径０．２５ｉ／ｎφ
のノズル孔より１０％苛性ソーダ、 ３０％エタノール
と６０％の水から成る塩基性溶液中に落下させて粒径１
１／ｌφ、比表面積９７．７ｒｌｔ／９の多孔質粒状キ
トサン７７９ｒｄ＜湿状）を得た。 該多孔質粒状キトサン２００−を充分水洗した後、１文
のエタノールで３回洗浄して溶媒を水からエタノールに
置換し、エタノール２０〇−中にアシル化剤として無水
酢酸をキトサンのグルコサミン残基１モルに対して０．
１８モルを添加し、室温で２４時間Ｎ−アシル化反応さ
せ、Ｎ−アセチル化度が２０％のＮ−アシル化多孔質粒
状キトサン１９０ｉ（湿状）を得た。 これを湿潤状態で１００−採取し、充分に水洗し、５０
０威のジメチルホルムアミドで４回洗浄して溶媒を水か
らジメチルホルムアミドに置換し、ジメチルホルムアミ
ド１００ｄ中に有機ジイソシアネート化合物としてヘキ
サメチレンジイソシアネートをキトサンのグルコサミン
残基１モルに対して２モル添ｈ口し、室温で１時間反応
させた。 反応後、ジメチルホルムアミド５００ｄで４回洗浄し、
更に水洗、湯洗をして、ジメチルホルムアミドを完全に
除去して有機ジイソシアネート化合物を反応させたＮ−
アシル多孔質粒状キトサンタ０ＲＩ！（湿状）を得た。 次いでアスペルギルス・オリゼ（＾ｓｐｅｒｇ ｉ ｌ
１ｕｓｏｒｙｚａｅ ）の米ＩＩ（伊勢惣製、商品名
二部こうじ）１ｇをｐＨ７，８の０．０ＩＭリン酸緩衝
溶液３０ｄで懸濁後、吸引濾過、遠心分離（３５００ｒ
ｐＩＦ） ｕて得た相β−７ラクトフラノシダーゼ溶液
３−に、湿潤状態の有機ジイソシアネート化合物を反応
させたＮ−アシル多孔質粒状キトサン１ｇを添加し、４
℃で１２時間攪拌後、ｐＨ７，８の０．０１Ｍリン酸緩
ＩＩ溶液１００Ｍ！で洗浄して固定化β−フラクトフラ
ノシダーぜ１ｇ（試料６）を得た。 応用例２ 実施例２で得た試料６並びに、実施例２と同様の操作で
得たＮ−アセチル化度２０％のＮ−アシル化多孔質粒状
キトサンを、有機ジイソシアネート化合物としてヘキサ
メチレンジイソシアネートで処理せずに、単に実施例２
と同様にβ−フラクトフラノシダーゼを固定化した固定
化β−フラクトフラノシダーゼ（試料７）を夫々湿潤状
態で１ｇ採取し、１．５１１信ＯＩシ］糖を含有するｐ
Ｈ７，８の０．０１ＨＩＪン酸！ｌ！ｉ？ＩＦ１３ｍ！
ニ１７］ＯＬ、、４０℃テ２３時間違反応させ、経時的
にショ糖の消費量と、グルコース、フルクトース、フラ
クトオリゴ糖の生成量をＨＰＬＣにより測定した。その
結果を表３・表４に、フラクトオリゴ糖生成量の経時変
化を第２図に示した・この結果から本発明品のＮ−アシ
ル化し、その債、有機ジインシアネート化合物で反応さ
せた固定化β−フラクトフラノシダーゼ（試料６）は、
フラクトオリゴ糖の生成速度が早く、最大生成量に達す
る時間が試料７より約２時間短縮されたことが明らかで
、効率のよいフラクトオリゴ糖の生産が応用が計られる
。 表 以 下 余 白 表
本発明による固定化β−フラクトフラノシダーゼは、キ
トサンを部分的アシル生後有機ジイソシアネート化合物
で処理してβ−フラクトフラノシダーゼを固定化する部
位を形成後β−フラクトフラノシダーゼを固定化するも
のであり、このようにすることによって実施例及び比較
例、応用例に記載のようにβ−７ラクトフラノシダーゼ
の反応活性を高め、ショ糖からグルコース、フルクトー
ス、フランオリゴ糖を短時間で効率よく得ることができ
る。 また、本発明においては、機械的強度の高い多孔質粒状
キトサンを用いているので、固定化βフラクトフラノシ
ダーゼを用いたショ糖転化方法のシステム化が容易であ
り、再生利用も可能である。
トサンを部分的アシル生後有機ジイソシアネート化合物
で処理してβ−フラクトフラノシダーゼを固定化する部
位を形成後β−フラクトフラノシダーゼを固定化するも
のであり、このようにすることによって実施例及び比較
例、応用例に記載のようにβ−７ラクトフラノシダーゼ
の反応活性を高め、ショ糖からグルコース、フルクトー
ス、フランオリゴ糖を短時間で効率よく得ることができ
る。 また、本発明においては、機械的強度の高い多孔質粒状
キトサンを用いているので、固定化βフラクトフラノシ
ダーゼを用いたショ糖転化方法のシステム化が容易であ
り、再生利用も可能である。
第１図は、実施例１及び比較例で得られた固定化β−フ
ラクトフラノシダーゼのラインウーバーパーク・プロッ
トを示すグラフであり、第２図は、実施例２及び応用例
２で得られた固定化β−７ラクトフラノシダーゼを用い
た際のフラクトオリゴ糖の生成♀の経時変化を示すグラ
フである。
ラクトフラノシダーゼのラインウーバーパーク・プロッ
トを示すグラフであり、第２図は、実施例２及び応用例
２で得られた固定化β−７ラクトフラノシダーゼを用い
た際のフラクトオリゴ糖の生成♀の経時変化を示すグラ
フである。
Claims (1)
- １、有機ジイソシアネート化合物を反応させたＮ−アシ
ル化多孔質粒状キトサンに、β−フラクトフラノシダー
ゼを固定化したことを特徴とする固定化β−フラクトフ
ラノシダーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17097688A JPH0223869A (ja) | 1988-07-11 | 1988-07-11 | 固定化β−フラクトフラノシダーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17097688A JPH0223869A (ja) | 1988-07-11 | 1988-07-11 | 固定化β−フラクトフラノシダーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0223869A true JPH0223869A (ja) | 1990-01-26 |
| JPH0469996B2 JPH0469996B2 (ja) | 1992-11-09 |
Family
ID=15914840
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17097688A Granted JPH0223869A (ja) | 1988-07-11 | 1988-07-11 | 固定化β−フラクトフラノシダーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0223869A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0654686A (ja) * | 1992-08-05 | 1994-03-01 | Fuji Spinning Co Ltd | 微生物固定化用担体の製造法 |
| JPH0654687A (ja) * | 1992-08-05 | 1994-03-01 | Fuji Spinning Co Ltd | 微生物固定化用担体の製造方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59213390A (ja) * | 1983-05-19 | 1984-12-03 | Asahi Denka Kogyo Kk | 固定化酵素及びその製造方法 |
| JPS6176504A (ja) * | 1984-09-21 | 1986-04-19 | Fuji Boseki Kk | 粒状多孔質キトサンの製造法 |
| JPS62158484A (ja) * | 1986-01-06 | 1987-07-14 | Showa Denko Kk | 固定化酵素の製造法 |
-
1988
- 1988-07-11 JP JP17097688A patent/JPH0223869A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59213390A (ja) * | 1983-05-19 | 1984-12-03 | Asahi Denka Kogyo Kk | 固定化酵素及びその製造方法 |
| JPS6176504A (ja) * | 1984-09-21 | 1986-04-19 | Fuji Boseki Kk | 粒状多孔質キトサンの製造法 |
| JPS62158484A (ja) * | 1986-01-06 | 1987-07-14 | Showa Denko Kk | 固定化酵素の製造法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0654686A (ja) * | 1992-08-05 | 1994-03-01 | Fuji Spinning Co Ltd | 微生物固定化用担体の製造法 |
| JPH0654687A (ja) * | 1992-08-05 | 1994-03-01 | Fuji Spinning Co Ltd | 微生物固定化用担体の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0469996B2 (ja) | 1992-11-09 |
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