JPH0471484A - 低凝集性細胞及びその培養方法 - Google Patents
低凝集性細胞及びその培養方法Info
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- JPH0471484A JPH0471484A JP2181487A JP18148790A JPH0471484A JP H0471484 A JPH0471484 A JP H0471484A JP 2181487 A JP2181487 A JP 2181487A JP 18148790 A JP18148790 A JP 18148790A JP H0471484 A JPH0471484 A JP H0471484A
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- culture
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は低凝集性細胞及びこれを用いた培養方法に関す
るものである。更に詳しくは、サスペンション培養を行
なう際に培養を困難にする大きな凝集塊を形成しない細
胞及びこの細胞を用いてサスペンション培養を行なう方
法に関するものである。さらに該細胞を宿主と覆る遺伝
子導入方法に関する。
るものである。更に詳しくは、サスペンション培養を行
なう際に培養を困難にする大きな凝集塊を形成しない細
胞及びこの細胞を用いてサスペンション培養を行なう方
法に関するものである。さらに該細胞を宿主と覆る遺伝
子導入方法に関する。
従来技術
細胞の培養技術は、例えばウィルス、ワクブン。
モノクロ−サル抗体、インターフエ日ンあるいはホルモ
ンなどの生理活性物質の製造にとって重要である。Ｂ
ＨＫ細胞は従来古くからワクチン製造に用いられ、また
近年では効率の良い遺伝子導入宿主として重要性が高ま
っている。しかしＢＨＫ細胞は接着性細胞であるためマ
イクロキャリ曳７−やローラーボトルなどの何らかの接
着担体に接着させて培養するのが一般的である。このよ
うな担体を用いた培養はコストも高く、スケールアップ
にも適さない。このためＢ ＨＫ細胞のサスペンション
培養の試みもいくつかなされている（Ｒ，Ｃ。
ンなどの生理活性物質の製造にとって重要である。Ｂ
ＨＫ細胞は従来古くからワクチン製造に用いられ、また
近年では効率の良い遺伝子導入宿主として重要性が高ま
っている。しかしＢＨＫ細胞は接着性細胞であるためマ
イクロキャリ曳７−やローラーボトルなどの何らかの接
着担体に接着させて培養するのが一般的である。このよ
うな担体を用いた培養はコストも高く、スケールアップ
にも適さない。このためＢ ＨＫ細胞のサスペンション
培養の試みもいくつかなされている（Ｒ，Ｃ。
Ｔ ｅｌｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ Ｂ １ｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ、Ｂ １ｏｅｎｏ、 ７ 。
ｏｌ、Ｂ １ｏｅｎｏ、 ７ 。
４１７（１９６５） ： Ｒ，Ｃ，Ｔｅ！！ｉｎｇｅｔ
ａＢ １ｏｔｅｃｈｎｏｌ、３１ｏｅｎａ、９．２５
７ （１９６７） ； ｐ 、３ 。
ａＢ １ｏｔｅｃｈｎｏｌ、３１ｏｅｎａ、９．２５
７ （１９６７） ； ｐ 、３ 。
Ｃａｐｓｔｉｃｋ Ｐｒｏｃ、Ｒｏｙ、 Ｓｏｃ、
Ｍｅｄ、 ５６． １０６２（１９６３） ；
Ｐ、 Ｊ、 Ｒａｄｌｅｔｔ ｅｔ ａｔ Ａｐｐ
ｌ。
Ｍｅｄ、 ５６． １０６２（１９６３） ；
Ｐ、 Ｊ、 Ｒａｄｌｅｔｔ ｅｔ ａｔ Ａｐｐ
ｌ。
Ｍ １ｃｒｏｂｉｏｌ、 ２２．５３４ （１９７１）
） 、しかしこれらの培養では細胞の大きな凝集は避
けられず、高密度化や長期培養に不向きであった。特に
無血清培地中では一般に血清培地中より細胞の凝集が大
きくなるためさらに培養が困難であった。
） 、しかしこれらの培養では細胞の大きな凝集は避
けられず、高密度化や長期培養に不向きであった。特に
無血清培地中では一般に血清培地中より細胞の凝集が大
きくなるためさらに培養が困難であった。
また、通常用いられているＢＨＫ細胞は種々の特性を持
つヘテロな細胞群であると考えられる。
つヘテロな細胞群であると考えられる。
よってこれを遺伝子導入の親株として用いると、得られ
るクローンの培養特性は一定でなくサスペンション培養
に有利な低凝集クローンを得ることは極めて困難であっ
た。
るクローンの培養特性は一定でなくサスペンション培養
に有利な低凝集クローンを得ることは極めて困難であっ
た。
発明の目的
そこで本発明者らは、ＢＨＫＩＩ細胞を細胞の凝集を抑
制してサスペンション培養を安定に行なうことを目的と
して研究を進めた。その結果Ｂ ＨＫ細胞をまず無血清
培地に馴化し、次にサスペンション培養に馴化し、さら
にクローニングを行なうことにより意外にももとのＢ
ＨＫ株よりも凝集性の低いクローンが得られることを見
い出した。ここで、サスペンション培養とは水性媒体中
で細胞され自体が浮遊しながら生育されるような培養を
言う。
制してサスペンション培養を安定に行なうことを目的と
して研究を進めた。その結果Ｂ ＨＫ細胞をまず無血清
培地に馴化し、次にサスペンション培養に馴化し、さら
にクローニングを行なうことにより意外にももとのＢ
ＨＫ株よりも凝集性の低いクローンが得られることを見
い出した。ここで、サスペンション培養とは水性媒体中
で細胞され自体が浮遊しながら生育されるような培養を
言う。
また、さらに意外なことにはこの低凝集株を遺伝子導入
宿主として用いると、遺伝子導入効率が大幅に増大覆る
ことを見い出した。よってこの低凝集性株を遺伝子導入
宿主として用いる場合、高い遺伝子導入効率で常に安定
な低凝集性遺伝子導入株を得ることができる。
宿主として用いると、遺伝子導入効率が大幅に増大覆る
ことを見い出した。よってこの低凝集性株を遺伝子導入
宿主として用いる場合、高い遺伝子導入効率で常に安定
な低凝集性遺伝子導入株を得ることができる。
発明の椙成
りなわら本発明は、Ｂ ＨＫ’細胞を無血清培地に馴化
し、さらにサスペンション培養に馴化した細胞であって
、ｅＲＤ Ｆ培地中でのサスペンション培養において細
胞の平均凝集度がＢＨＫ細胞の８０％以下であり、かつ
最大凝集塊の細胞数がＢ ｌ−Ｉ Ｋ細胞の最大凝集塊
の細胞数の１０％以下である低凝集性細胞である。
し、さらにサスペンション培養に馴化した細胞であって
、ｅＲＤ Ｆ培地中でのサスペンション培養において細
胞の平均凝集度がＢＨＫ細胞の８０％以下であり、かつ
最大凝集塊の細胞数がＢ ｌ−Ｉ Ｋ細胞の最大凝集塊
の細胞数の１０％以下である低凝集性細胞である。
また、本発明は上記細胞を用いてサスペンション培養を
行なうことを特徴とする培養方法を包含する。また、本
弁明は上記細胞を宿主として用いることを特徴とする遺
伝子導入方法を包含する。
行なうことを特徴とする培養方法を包含する。また、本
弁明は上記細胞を宿主として用いることを特徴とする遺
伝子導入方法を包含する。
さらに具体的には、本発明はＢＨＫ細胞を無血清培地に
馴化し、さらにサスペンション培養に馴化した細胞であ
って、ｅＲＤ Ｆ培地中に１０６ｃｅｌｌｓ ／〆の密
度で懸濁した細胞懸濁液１０ａｉ！を５０メ三角フラス
コ中で５％ＣＯ２，９５％ａｉｒ雰囲気下１８８；’ｉ
間３７℃、 １３５ｒｐｉで旋回培養した際に、細胞の
平均凝集度が該ＢＨＫ細胞の８０％以下であり、かつ最
大凝集塊の大きさが１００ｃｅｌｌｓ／塊以下あるいは
該Ｂ ｌ−Ｉ Ｋ細胞の最大凝集塊の１０％以下である
ような低凝集性細胞及びこれを用いてサスペンション培
養を行なうことを特徴とする培養方法である。
馴化し、さらにサスペンション培養に馴化した細胞であ
って、ｅＲＤ Ｆ培地中に１０６ｃｅｌｌｓ ／〆の密
度で懸濁した細胞懸濁液１０ａｉ！を５０メ三角フラス
コ中で５％ＣＯ２，９５％ａｉｒ雰囲気下１８８；’ｉ
間３７℃、 １３５ｒｐｉで旋回培養した際に、細胞の
平均凝集度が該ＢＨＫ細胞の８０％以下であり、かつ最
大凝集塊の大きさが１００ｃｅｌｌｓ／塊以下あるいは
該Ｂ ｌ−Ｉ Ｋ細胞の最大凝集塊の１０％以下である
ような低凝集性細胞及びこれを用いてサスペンション培
養を行なうことを特徴とする培養方法である。
かかる本発明によれば、細胞の凝集を最少限に抑制して
細胞のサスペンション培養を安定に行うことが可能とな
る。
細胞のサスペンション培養を安定に行うことが可能とな
る。
以下本発明について詳細に説明する。
本発明の低凝集性細胞はＢＨＫ５０７株より得られたも
のである。ＢＨＫ５０７株とはＢＨＫ２１株より得られ
た温度感受性株（ｔｓ１３） （Ｔ ａｌａｖｅｒａ
ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｉｃｏ Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、 ９２． ４２５４３６ （１９７７）
）より分離されたチミジンキナーゼ欠損株（Ｗａｅｃｈ
ｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｓｅｒｇａ、 ＰＮＡＳ ７９
゜１１０６−１１１０（１９８２） ）である。この細
胞を無血清サスペンション培養に馴化し、選択した。具
体的な馴化９選択方法は以下に示す通りである。
のである。ＢＨＫ５０７株とはＢＨＫ２１株より得られ
た温度感受性株（ｔｓ１３） （Ｔ ａｌａｖｅｒａ
ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｉｃｏ Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、 ９２． ４２５４３６ （１９７７）
）より分離されたチミジンキナーゼ欠損株（Ｗａｅｃｈ
ｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｓｅｒｇａ、 ＰＮＡＳ ７９
゜１１０６−１１１０（１９８２） ）である。この細
胞を無血清サスペンション培養に馴化し、選択した。具
体的な馴化９選択方法は以下に示す通りである。
まずＢＨＫｉ８胞を自消含有培地から適当な無血清培地
（例えばＩ ＴＥＳ ｅＲＤト： ｅＲＤＦ培地にイ
ンスリン９μｇ／ｌｘｆ！、 トランスフェリン１０８
μｇ／ｄ、エタノールアミン１０μＭ、セレナイト２０
ｎＭを添加したものなどが好ましい）に馴化する。手
順としては１０％血清培地から直接無血清培地に細胞を
移して増殖して来るのを持っても良く、また血清含量を
段階的に減らしていっても良い。
（例えばＩ ＴＥＳ ｅＲＤト： ｅＲＤＦ培地にイ
ンスリン９μｇ／ｌｘｆ！、 トランスフェリン１０８
μｇ／ｄ、エタノールアミン１０μＭ、セレナイト２０
ｎＭを添加したものなどが好ましい）に馴化する。手
順としては１０％血清培地から直接無血清培地に細胞を
移して増殖して来るのを持っても良く、また血清含量を
段階的に減らしていっても良い。
適当な期間（好ましくは１か月収上）培養し、無血清培
地で増殖可能となったＢＨＫ細胞を次に同じ無血清培地
でサスペンションＷ１８！培養する。潅流培養は新しい
培養液を培養槽中へ供給しつつ、古い培養液を培養槽外
へ排出しながら培養する方式である。培養装置はサスペ
ンション潅流培養に適したものならば何でも良い。培養
初期には細胞は大きな凝集塊を形成し、培養槽底部に沈
降してしまう。
地で増殖可能となったＢＨＫ細胞を次に同じ無血清培地
でサスペンションＷ１８！培養する。潅流培養は新しい
培養液を培養槽中へ供給しつつ、古い培養液を培養槽外
へ排出しながら培養する方式である。培養装置はサスペ
ンション潅流培養に適したものならば何でも良い。培養
初期には細胞は大きな凝集塊を形成し、培養槽底部に沈
降してしまう。
しかし培養を適当な期間継続していると（１０日以上）
培養初期の凝集塊の数分の１以下の大きさの塊が出現し
てくる。これを無菌的に取り出し、適当なりローユング
法でクローニングする。得られたクローンの凝集性を比
較すると種々の異なるものが存在する。凝集性の測定法
としては適当容量（約５０〜１００ａｊ ’）の三角フ
ラスコ中に適当密度の細胞懸濁液（１０６ｃｅｌｌｓ
／Ｉｄ！程度）を適当量（１０〜２０−）入れ、一定時
間（１８〜２４時間）振盪培養し、一定量の培地中の凝
集塊数を計数して平均凝集度を算出する（細胞懸濁液中
の全細胞数／凝集塊数）という方法が簡便かつ適切であ
るが、他の方法によっても良い。本発明で用いた条件は
以下に示す通りである。
培養初期の凝集塊の数分の１以下の大きさの塊が出現し
てくる。これを無菌的に取り出し、適当なりローユング
法でクローニングする。得られたクローンの凝集性を比
較すると種々の異なるものが存在する。凝集性の測定法
としては適当容量（約５０〜１００ａｊ ’）の三角フ
ラスコ中に適当密度の細胞懸濁液（１０６ｃｅｌｌｓ
／Ｉｄ！程度）を適当量（１０〜２０−）入れ、一定時
間（１８〜２４時間）振盪培養し、一定量の培地中の凝
集塊数を計数して平均凝集度を算出する（細胞懸濁液中
の全細胞数／凝集塊数）という方法が簡便かつ適切であ
るが、他の方法によっても良い。本発明で用いた条件は
以下に示す通りである。
■ 三角フラスコ容量 ５０Ｉｄ
■ 細胞密度 １０６ｃｅｌｌｓ ／ｄ■ 培
地 ＩＴＥＳｅＲＤＦ■ 細胞懸濁液容量
１０ａｔｅ ■ 振盪機 大洋ロータリーシェーカー Ｒ−１■ 振
盪速度 １３５ｒｐｍ ■ 温度 ３７℃ ■ 培養時間 １８時間 ■ 雰囲気 ５％ＣＯ２，９５％ａｉｒ本条
件で各クローンの平均凝集度及び最大凝集塊の凝集度を
測定すると、例えば−例として以下のような値を示す。
地 ＩＴＥＳｅＲＤＦ■ 細胞懸濁液容量
１０ａｔｅ ■ 振盪機 大洋ロータリーシェーカー Ｒ−１■ 振
盪速度 １３５ｒｐｍ ■ 温度 ３７℃ ■ 培養時間 １８時間 ■ 雰囲気 ５％ＣＯ２，９５％ａｉｒ本条
件で各クローンの平均凝集度及び最大凝集塊の凝集度を
測定すると、例えば−例として以下のような値を示す。
（最大凝東度／馴化前のＢｌ−ＩＫ細胞の最大凝集度）
×１■無血清、サスペンション培養に馴化前のＢＨＫ細
胞の同条件での平均凝集度は２．５、最大凝集度は５０
６個／凝集塊）である。これより平均凝集度の小さいク
ローン、例えば上記■のようなりローンが本発明の対象
である。■あるいは■のような凝集度の高いクローンも
クローニングによって得られるが、これらはサスペンシ
ョン培養には適さない。
×１■無血清、サスペンション培養に馴化前のＢＨＫ細
胞の同条件での平均凝集度は２．５、最大凝集度は５０
６個／凝集塊）である。これより平均凝集度の小さいク
ローン、例えば上記■のようなりローンが本発明の対象
である。■あるいは■のような凝集度の高いクローンも
クローニングによって得られるが、これらはサスペンシ
ョン培養には適さない。
このようにして得られた無血清かスペンジジン培養馴化
細胞は有用物質の遺伝子導入の宿主細胞として、あるい
はワクヂン生産のためのウィルス産生宿主として有利に
用いることができるが、細胞の用途はこれらに限定され
るものではない。
細胞は有用物質の遺伝子導入の宿主細胞として、あるい
はワクヂン生産のためのウィルス産生宿主として有利に
用いることができるが、細胞の用途はこれらに限定され
るものではない。
リスペンション培養に用いる培養槽は細胞それ自体が液
体培地中に浮遊し撹拌されるものならばどのようなもの
でも良い。
体培地中に浮遊し撹拌されるものならばどのようなもの
でも良い。
サスペンション培養に用いられる培養液は実質的に水よ
りなる水性媒体である。該水性媒体は動物Ｉ胞の培養に
通常使用される各種添加物例えば種々の無機塩、ビタミ
ン類、補酵素、ブドウ糖。
りなる水性媒体である。該水性媒体は動物Ｉ胞の培養に
通常使用される各種添加物例えば種々の無機塩、ビタミ
ン類、補酵素、ブドウ糖。
アミノ酸、抗生物質、増殖因子などを含有している。
また培養液には血清を加えることもできるが、血清を用
いないいわゆる無血清培地を用いることもできる。本発
明は殊に無血清培地に有利に適用される。
いないいわゆる無血清培地を用いることもできる。本発
明は殊に無血清培地に有利に適用される。
かくして、本発明によれば細胞の凝集を最小限に抑えた
ＢＨＫ細胞の安定した無血清サスペンション培養が可能
となる。また、潅流培養にも適している。
ＢＨＫ細胞の安定した無血清サスペンション培養が可能
となる。また、潅流培養にも適している。
発明の効果
本発明によれば、凝集度の小さい状態でサスペンション
培養を安定に行うことが可能となり有用物質の安定生産
が可能となった。さらに無血清培地で培養を行うことが
でき、潅流培養を行うことも可能となった。
培養を安定に行うことが可能となり有用物質の安定生産
が可能となった。さらに無血清培地で培養を行うことが
でき、潅流培養を行うことも可能となった。
また、本発明の細胞によれば遺伝子導入の効率がＢＨＫ
Ｉ細胞にくらべ５〜４０侶向上する。
Ｉ細胞にくらべ５〜４０侶向上する。
実施例
以下に実施例を挙げ本発明を詳述する。
実施例１ 低凝集ＢＨＫ株の取得
（方法）
細！１１：前述のＢ ＨＫ ５０７ｔｋ−株を用いた。
培養ｔＩ：
基礎培地として、ＲＰＭ Ｉ １６４０培地、ハムーＦ
１２培地及びダルベツコ変法イーグル培地を２：１：１
で混合したものにアミノ酸、グルコース等をさらに増強
したもの（以下、ｅ −ＲＤＦと称する）を用い、増殖
因子としてインスリン、トランスフェリン、エタノール
アミン、亜セレンＭ（ＩＴＥＳ）を加えた。インスリン
の添加小は９μｑ／ｌｄ。
１２培地及びダルベツコ変法イーグル培地を２：１：１
で混合したものにアミノ酸、グルコース等をさらに増強
したもの（以下、ｅ −ＲＤＦと称する）を用い、増殖
因子としてインスリン、トランスフェリン、エタノール
アミン、亜セレンＭ（ＩＴＥＳ）を加えた。インスリン
の添加小は９μｑ／ｌｄ。
トランスフェニリンは１０μｇ／ｒｄ、エタノールアミ
ンは１０μＭ、亜セレン酸は２０ ｎＭであった。
ンは１０μＭ、亜セレン酸は２０ ｎＭであった。
まず、ＢＨＫ ５０７ｔｋ−株を血清培地から上記無血
清培地ＩＴＥＳ−ｅＲＤＦに移し、１か月間馴化した。
清培地ＩＴＥＳ−ｅＲＤＦに移し、１か月間馴化した。
次にこの無血清培地馴化ＢＨＫ ５０７ｔｋ−株をサス
ペンション培養槽で潅流培養した。
ペンション培養槽で潅流培養した。
培養には添付第１図に示す培養システムを使用した。培
養槽は図のような外壁の内側に隔壁によって仕切られた
セトリングゾーンがもうけられ、その上部には培養液の
排出口を有しており、正味培養容積は約１５０ａｆ！で
あった。酸素は外径４ＩＩＩ＃Ｉφの多孔性テフロンチ
ューブによって供給した。
養槽は図のような外壁の内側に隔壁によって仕切られた
セトリングゾーンがもうけられ、その上部には培養液の
排出口を有しており、正味培養容積は約１５０ａｆ！で
あった。酸素は外径４ＩＩＩ＃Ｉφの多孔性テフロンチ
ューブによって供給した。
あらかじめオートクレーブ滅菌した前記培養槽に正味培
養容積が約１５０ａｉ！ １．：なるように培養液を送
入し、これに無血清馴化Ｂ ＨＫ ５０７ｔｋ−株を１
、ＯＸ １０６個／ｄとなるように播種した。培養槽に
は酸素ガスが（溶存酸素が３ ｐｐｍとなるように）吹
込みノズルを通して自動的にコントロールされた送入さ
れた。培養槽中の培養液は３７℃に保持された。培養槽
中にはマリン型面１￥買が取付けられており、撹拌速度
は４０ｒｐｍ ”Ｃあった。
養容積が約１５０ａｉ！ １．：なるように培養液を送
入し、これに無血清馴化Ｂ ＨＫ ５０７ｔｋ−株を１
、ＯＸ １０６個／ｄとなるように播種した。培養槽に
は酸素ガスが（溶存酸素が３ ｐｐｍとなるように）吹
込みノズルを通して自動的にコントロールされた送入さ
れた。培養槽中の培養液は３７℃に保持された。培養槽
中にはマリン型面１￥買が取付けられており、撹拌速度
は４０ｒｐｍ ”Ｃあった。
播種後１日間は回分培養を行ない、この後パーヒコージ
〕ンを開始した。
〕ンを開始した。
培養１日目から細胞は大きな凝集塊を形成し、培養槽底
部に数個の塊として沈降した。このまま還流培養を続け
たところ、培養２週間前後から小さな細胞塊が多数出現
し、サスペンション状態で増殖してきた。これを培養１
９９日目無菌的に培養槽より取り出し、クローニングを
行なった。クロニングは以下の手順により行なった。
部に数個の塊として沈降した。このまま還流培養を続け
たところ、培養２週間前後から小さな細胞塊が多数出現
し、サスペンション状態で増殖してきた。これを培養１
９９日目無菌的に培養槽より取り出し、クローニングを
行なった。クロニングは以下の手順により行なった。
■ 細胞塊をトリプシン処理により個々の細胞に分離し
、ｅＲＤ Ｆ中に１ｘ１０３ｃｅｌｌｓ ／ｄＯ）ｍ度
で懸濁した。
、ｅＲＤ Ｆ中に１ｘ１０３ｃｅｌｌｓ ／ｄＯ）ｍ度
で懸濁した。
■ ９６ｗｅｌｌプレート１ｗｅｌｌ当り１μ塁ずつ細
胞懸濁液を分注した。
胞懸濁液を分注した。
■ 顕微鏡により１ｗｅ＋＋に１個の細胞が存在するｗ
ｅｌｌを選び、４０％ＦＣ８ｅＲＤＦ培地を１ｗｅ当り
１００μ塁添加した。
ｅｌｌを選び、４０％ＦＣ８ｅＲＤＦ培地を１ｗｅ当り
１００μ塁添加した。
■ 約２週間後、増殖してきた細胞をデイツシユに移し
、十分な細胞数が得られたところで凝集度を測定した。
、十分な細胞数が得られたところで凝集度を測定した。
凝集度は本文記載の方法により測定した。
（結果）
得られた４クローンのＢＨＫ株の平均凝集度及び最大凝
集度を第１表に示す。
集度を第１表に示す。
第１表（実施例１実験結果）
未馴化Ｂ ＨＫ ５０７ｔｋ−株の平均凝集度、最大凝
集度はそれぞれ２．５． ５０６個／凝集塊であった。
集度はそれぞれ２．５． ５０６個／凝集塊であった。
最も凝集度の低かった１２Ｄ株を以下の実施例に用い
Ｉこ 。
Ｉこ 。
実施例１記載株サスペンション培養
（方法）
細胞に実施例１記載の低凝集株１２Ｄ株を用いた以外は
実施例１のサスペンション培養と同様に行なった。培養
は１２日間継続した。結果を第２表に示す。
実施例１のサスペンション培養と同様に行なった。培養
は１２日間継続した。結果を第２表に示す。
第２表 実施例２実験結果
細胞 １２［）株
培地
ＩＴＥＳｅＲ［）Ｆ
比較例１
細胞にサスペンション培養馴化１遺択を行なっていない
無血清馴化Ｂ ＨＫ ５０７ｔｋ−株を用いた以外は実
施例２と同様に行なった。培養は５日間継続した。結果
を第３表に示す。
無血清馴化Ｂ ＨＫ ５０７ｔｋ−株を用いた以外は実
施例２と同様に行なった。培養は５日間継続した。結果
を第３表に示す。
第３表 比較例実験結果
細胞 無血清馴化８ＨＫ ５０７ｔｋ−株培地
ＩＴＥＳ ｃＲＤＦ
※ 細胞の凝集が大きいため培養途中の４ノンブリング
が不可能であった。
が不可能であった。
実施例３１２Ｄ株への遺伝子導入
（方法）
細胞：１２Ｄ株
導入遺伝子：ヒトプロティンＣＣ−ＤＮＡ及びジヒドロ
葉酸還元酵素（ｄＭｒ）遺伝子を持つプラスミド 遺伝子導入方法二通常のカルシウム−リン酸法によった
。
葉酸還元酵素（ｄＭｒ）遺伝子を持つプラスミド 遺伝子導入方法二通常のカルシウム−リン酸法によった
。
１０αφのプラスチックデイツシュ上で増殖するＢ ）
−Ｉ Ｋ １２Ｄ株約５ ｘ １０６ｃｅｌｌｓ ニリ
ン酸カルシウムに共沈させた上記遺伝子１０μ９を加え
、６時間静置の後１０％ＦＣ８ｅＲＤＦに培地を交換し
、２日問培養した。２日後メソトレキセート（（＋）Ａ
ＭＥＴＨＯＰＴＥＲＩＮ、Ｓ＋ｕａ）１μＭを含む５％
透析ＦＣ８ＯＭＥ培地に移し、安定形質転換株（ｓｔａ
ｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｌａｎｔ ）を選択した。
−Ｉ Ｋ １２Ｄ株約５ ｘ １０６ｃｅｌｌｓ ニリ
ン酸カルシウムに共沈させた上記遺伝子１０μ９を加え
、６時間静置の後１０％ＦＣ８ｅＲＤＦに培地を交換し
、２日問培養した。２日後メソトレキセート（（＋）Ａ
ＭＥＴＨＯＰＴＥＲＩＮ、Ｓ＋ｕａ）１μＭを含む５％
透析ＦＣ８ＯＭＥ培地に移し、安定形質転換株（ｓｔａ
ｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｌａｎｔ ）を選択した。
この際の培養にはｉｓｃ、φプラスチックデイツシュを
用い、培地間は３０〆／デイツシユとした。
用い、培地間は３０〆／デイツシユとした。
約２週間後生育してきたコロニー数を計数し、遺伝子導
入効率を求めた。
入効率を求めた。
（結果）
遺伝子導入効率を第４表に示す。
第４表 １２［）株への遺伝子導入効率本カウント不能
（コロニー数多数のため）得られたコロニーはほぼすべ
てＰＣ産生細胞であった。最大ＰＣ産生クローンのＰＣ
産生濃度は２．４μ９／ｒｄであった。
（コロニー数多数のため）得られたコロニーはほぼすべ
てＰＣ産生細胞であった。最大ＰＣ産生クローンのＰＣ
産生濃度は２．４μ９／ｒｄであった。
比較例２ Ｂｌ−（Ｋ ５０７ｔｋ−株への遺伝子導
入（方法） 細胞に無血清、サスペンション未馴化ＢＨＫ５０７ｔｋ
−を用いた以外は実施例３と同様に行なった。
入（方法） 細胞に無血清、サスペンション未馴化ＢＨＫ５０７ｔｋ
−を用いた以外は実施例３と同様に行なった。
（結果）
遺伝子導入効率を第５表に示す。
第１図
第５表 ［３ｌ−ＩＫ ５０７ｔｋ−株への遺伝子導入
効率得られたコロニーはほぼすべてＰＣ産生細胞であっ
た。最大ＰＣ産生クローンのＰＣ産生濃度は２．４μ９
／ｌｄであった。
効率得られたコロニーはほぼすべてＰＣ産生細胞であっ
た。最大ＰＣ産生クローンのＰＣ産生濃度は２．４μ９
／ｌｄであった。
第１図は実施例において使用した培養システムの概略図
を示す。 使用済培地
を示す。 使用済培地
Claims (3)
- （１）ＢＨＫ細胞を無血清培地に馴化し、さらにサスペ
ンション培養に馴化した細胞であって、ｅＲＤＦ培地中
でのサスペンション培養において細胞の平均凝集度がＢ
ＨＫ細胞の８０％以下であり、かつ最大凝集塊の細胞数
がＢＨＫ細胞の最大凝集塊の細胞数の１０％以下である
低凝集性細胞。 - （２）請求項１記載の細胞を用いてサスペンション培養
を行なうことを特徴とする培養方法。 - （３）請求項１記載の細胞を宿主として用いることを特
徴とする遺伝子導入方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2181487A JPH0471484A (ja) | 1990-07-11 | 1990-07-11 | 低凝集性細胞及びその培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2181487A JPH0471484A (ja) | 1990-07-11 | 1990-07-11 | 低凝集性細胞及びその培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0471484A true JPH0471484A (ja) | 1992-03-06 |
Family
ID=16101622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2181487A Pending JPH0471484A (ja) | 1990-07-11 | 1990-07-11 | 低凝集性細胞及びその培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0471484A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5535901A (en) * | 1993-05-17 | 1996-07-16 | Yoshino Kogyosho Co., Ltd. | Synthetic resin bottle with handle and its production method |
| JP2009502167A (ja) * | 2005-07-25 | 2009-01-29 | イムノメディクス， インコーポレイテッド | 細胞の培養寿命の延長および培養細胞からのタンパク質収量を増加させるための改良された方法および組成物 |
| JP2012254084A (ja) * | 2004-07-23 | 2012-12-27 | Immunomedics Inc | 細胞培養物の寿命および由来するタンパク質の収率を増加させるための方法および組成物 |
-
1990
- 1990-07-11 JP JP2181487A patent/JPH0471484A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5535901A (en) * | 1993-05-17 | 1996-07-16 | Yoshino Kogyosho Co., Ltd. | Synthetic resin bottle with handle and its production method |
| JP2012254084A (ja) * | 2004-07-23 | 2012-12-27 | Immunomedics Inc | 細胞培養物の寿命および由来するタンパク質の収率を増加させるための方法および組成物 |
| JP2009502167A (ja) * | 2005-07-25 | 2009-01-29 | イムノメディクス， インコーポレイテッド | 細胞の培養寿命の延長および培養細胞からのタンパク質収量を増加させるための改良された方法および組成物 |
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