JPH01101882A - 動物細胞の培養方法 - Google Patents
動物細胞の培養方法Info
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- JPH01101882A JPH01101882A JP62258252A JP25825287A JPH01101882A JP H01101882 A JPH01101882 A JP H01101882A JP 62258252 A JP62258252 A JP 62258252A JP 25825287 A JP25825287 A JP 25825287A JP H01101882 A JPH01101882 A JP H01101882A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（ａ）産業上の利用分野
本発明は動物細胞の培養方法に関するものである。更に
詳しくは、有用物質を産生ずる動物細胞を、高密度で培
養する方法に関するものである。
詳しくは、有用物質を産生ずる動物細胞を、高密度で培
養する方法に関するものである。
（ｂ）従来技術
大規模による細胞大量培養は、例えばウィルス。
ワクチン、インターフェロンなどの抗ウィルス剤、ある
いはホルモンなどの生物薬品の製造に必須である。殊に
近年特定タンパク質などを標的とするモノクローナル抗
体の生産は、抗体産生細胞とミエローマによるハイプリ
ドーマ大量培養によるものであり、その技術の解決は工
業的に重要なテーマである。
いはホルモンなどの生物薬品の製造に必須である。殊に
近年特定タンパク質などを標的とするモノクローナル抗
体の生産は、抗体産生細胞とミエローマによるハイプリ
ドーマ大量培養によるものであり、その技術の解決は工
業的に重要なテーマである。
（Ｃ）発明の目的
そこで本発明者らは、動物細胞の高密度培養方法におい
て更に効率良く培養を行う方法について鋭意研究を行っ
た結果、本発明に到達した。
て更に効率良く培養を行う方法について鋭意研究を行っ
た結果、本発明に到達した。
（ｄ）発明の構成
すなわち、本発明は動物細胞を生細胞密度３×１０’
ｃｅｌｌｓ ／ ｍ１以上で灌流培養するにあたり、培
養系におけるグルコース濃度を０．０１１１’ＩＯＩ／
Ｆ以上３ｎｎｏｌ／Ｖ以下に維持して培養することを特
徴とする培養方法である。
ｃｅｌｌｓ ／ ｍ１以上で灌流培養するにあたり、培
養系におけるグルコース濃度を０．０１１１’ＩＯＩ／
Ｆ以上３ｎｎｏｌ／Ｖ以下に維持して培養することを特
徴とする培養方法である。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の培養方法において、培養する動物細胞としては
、特に制限はなく、天然の動物細胞のみならず人為的或
いは遺伝子操作により変性された細胞例えばハイブリド
ーマであってもよい。
、特に制限はなく、天然の動物細胞のみならず人為的或
いは遺伝子操作により変性された細胞例えばハイブリド
ーマであってもよい。
また細胞としてＩＬ−２−の如きリンホカインを産生ず
るリンパ球由来の細胞であってもよく、インターフェロ
ン（ＩＦＮ）の如き有用な生理活性物質を産生ずる２倍
体細胞であってもよい、さらに種々のモノクローナル抗
体を産生ずる細胞であってもよく、本発明はかかるモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養に対し
てモノクローナル抗体を高い濃度で得る目的のなめに特
に適している。
るリンパ球由来の細胞であってもよく、インターフェロ
ン（ＩＦＮ）の如き有用な生理活性物質を産生ずる２倍
体細胞であってもよい、さらに種々のモノクローナル抗
体を産生ずる細胞であってもよく、本発明はかかるモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養に対し
てモノクローナル抗体を高い濃度で得る目的のなめに特
に適している。
細胞の形態としては、特に制限はなく、浮部細胞でも培
養細胞でもよいが、本発明方法では浮遊細胞であること
が好ましい。
養細胞でもよいが、本発明方法では浮遊細胞であること
が好ましい。
本発明における細胞培養は浮遊培養でも付着培養でもよ
い。
い。
本発明における細胞培養は灌流培養で行われる。
ここで、灌流培養とは、一般に新しい培養液を培養槽中
へ供給しつつ、生育阻害物質を含んだ古い培養液を培養
槽外へ排出しながら培養を行う培養方式である。
へ供給しつつ、生育阻害物質を含んだ古い培養液を培養
槽外へ排出しながら培養を行う培養方式である。
この方法を用いて培養するに当って重要なことの１つは
、培養液中の生細胞と前記古い培養液とを効率よく分離
し、古い培養液を培養槽外へ取り出し、培養槽内の細胞
の生育環境を最適粂件下に維持することである。
、培養液中の生細胞と前記古い培養液とを効率よく分離
し、古い培養液を培養槽外へ取り出し、培養槽内の細胞
の生育環境を最適粂件下に維持することである。
本発明における培養方法としては、タンク培養。
細胞を担体に付着させたものを充填剤として用いる培養
およびフォローファイバー培養等がある。
およびフォローファイバー培養等がある。
ここでタンク培養には、−適法１重力沈降法、遠心沈降
法等があり、それぞれマイクロキャリアーを用いてもよ
い、また、細胞を担体に付着させたものを充填剤として
培養を行う場合、該担体としてはマイクロカプセル、セ
ラミックス担体およびゲル等が用いられる。
法等があり、それぞれマイクロキャリアーを用いてもよ
い、また、細胞を担体に付着させたものを充填剤として
培養を行う場合、該担体としてはマイクロカプセル、セ
ラミックス担体およびゲル等が用いられる。
本発明方法においては、タンク培養による灌流培養が好
ましい。
ましい。
本発明方法の培養に用いられる培養液は実質的に水より
なる水性媒体である。該水性媒体は、動物細胞の培養に
通常使用される各種添加物例えば種々の無機塩、ビタミ
ン類、補酵素、ブドウ糖。
なる水性媒体である。該水性媒体は、動物細胞の培養に
通常使用される各種添加物例えば種々の無機塩、ビタミ
ン類、補酵素、ブドウ糖。
アミノ酸、抗生物質、生長促進因子などを含有している
。一般に培養液中に含まれる糖成分としてはグルコース
が用いられ、該グルコース濃度は２０ｎ＋ｍ＊ｌ／ｆで
ある。しかしながら本発明方法によれば動物細胞を生細
胞密度３ Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ ／ ｍ１以上、好
ましくは５ Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ ／ ｍ１以上で
灌流培養するにあたり培養系におけるグルコース濃度は
０．０１１１１０１／Ｚ以上、３ｎ＋ｇｏｌ／６以下、
好ましくは０．２１１ｏｔ ７１以上、２ｍｍｏｌ／１
以下でよい、グルコースの濃度が３ｎ＋ｌ１ｏｌ／！を
越えると動物細胞が必要以上のグルコースを消費し、ラ
クテートの生産量が増大し、得られる目的物質の精製が
困難となる。
。一般に培養液中に含まれる糖成分としてはグルコース
が用いられ、該グルコース濃度は２０ｎ＋ｍ＊ｌ／ｆで
ある。しかしながら本発明方法によれば動物細胞を生細
胞密度３ Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ ／ ｍ１以上、好
ましくは５ Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ ／ ｍ１以上で
灌流培養するにあたり培養系におけるグルコース濃度は
０．０１１１１０１／Ｚ以上、３ｎ＋ｇｏｌ／６以下、
好ましくは０．２１１ｏｔ ７１以上、２ｍｍｏｌ／１
以下でよい、グルコースの濃度が３ｎ＋ｌ１ｏｌ／！を
越えると動物細胞が必要以上のグルコースを消費し、ラ
クテートの生産量が増大し、得られる目的物質の精製が
困難となる。
またグルコースの濃度が０．Ｏｔｍｎｏｌ／ １より少
ないと動物細胞の増殖がおさえられる。また動物細胞の
生細胞密度が、３ Ｘ １０ＩＩｃｅｌｌｓ ／ ｍｌ
に達しない時点でグルコース濃度を、０．０１ｒＩｒｍ
ｏｌ／ １以上３ｍｍｏｌ／ｌ以下とすると、動物細胞
の増殖はおさえられ、死滅していく。
ないと動物細胞の増殖がおさえられる。また動物細胞の
生細胞密度が、３ Ｘ １０ＩＩｃｅｌｌｓ ／ ｍｌ
に達しない時点でグルコース濃度を、０．０１ｒＩｒｍ
ｏｌ／ １以上３ｍｍｏｌ／ｌ以下とすると、動物細胞
の増殖はおさえられ、死滅していく。
更に、培養液には血清を加えることもできるが、血清を
用いない所謂無血清培地を培養液として使用することも
できる。無血清培地を使用するのが経済的に有利であり
、望ましい。
用いない所謂無血清培地を培養液として使用することも
できる。無血清培地を使用するのが経済的に有利であり
、望ましい。
以下、実施例を掲げて本発明を詳述する。
実施例１
（１） 培養装置
添付図１に示す構造を有する内容積約２００ｍ１゜有効
培養容積＜ｍ胞が存在する部分の容積）１２０ｍｌの重
力沈降型灌流培養槽（特開昭６２−２６５号公報参照）
を用いた。
培養容積＜ｍ胞が存在する部分の容積）１２０ｍｌの重
力沈降型灌流培養槽（特開昭６２−２６５号公報参照）
を用いた。
（２４、Ｓ［ｌＩ胞
マウスミエローマＰ３／ｘ６３−Ａ＋２８−Ｕ１株とヒ
トＢセルを融合して得られたマウス・ヒトハイブリドー
マＣ２３株を用いた。この株は、ヒト型抗サイトメガロ
ウィルスＩｇＧ１産生する。
トＢセルを融合して得られたマウス・ヒトハイブリドー
マＣ２３株を用いた。この株は、ヒト型抗サイトメガロ
ウィルスＩｇＧ１産生する。
（３］ 培地及びグルコース溶液
無血清培地ＩＴＥＳ＋ｅＲＤＦからグルコースを除去し
たものを一過滅菌して用いた。インシュリン、ヒトトラ
ンスフェリン、エタノールアミン、および亜セレン酸ナ
トリウムの添加量はそれぞれ９ｔｓｔｒ／１ 、１０ｒ
ｕ、／！ 、 ０．６２ｎｇ／ｊ。
たものを一過滅菌して用いた。インシュリン、ヒトトラ
ンスフェリン、エタノールアミン、および亜セレン酸ナ
トリウムの添加量はそれぞれ９ｔｓｔｒ／１ 、１０ｒ
ｕ、／！ 、 ０．６２ｎｇ／ｊ。
０．４３Ｘ１０°’ｒｗ／ｌである。培地には５ｎ＋Ｍ
ＨＥＰＥ３．１ｇ／ｆ水酸化ナトリウム、 １０８１Ｕ
／ｌペニシリン０．１ｚ／ｌストレプトマイシンを添加
した。
ＨＥＰＥ３．１ｇ／ｆ水酸化ナトリウム、 １０８１Ｕ
／ｌペニシリン０．１ｚ／ｌストレプトマイシンを添加
した。
グルコース溶液としては、ｅＲＤＦ培地に１０％のグル
コースを溶解したものを濾過滅菌して用いた。
コースを溶解したものを濾過滅菌して用いた。
（４） 培養方法及び結果
３７℃の恒温水槽中に設置された培養槽に濾過滅菌した
培地１５０ｍ１およびグルコース溶液５ｍｌを入れ０２
３株を５Ｘ１０５個播種した。培養槽においては、炭酸
ガス５％含有空気が空間部に、純酸素ガスが培養液中に
送入しうるようになっており、溶存酸素量が３〜４１）
０１の範囲で一定になるように制御された。撹拌速度は
２０ｒ、＋１．１゜であった。
培地１５０ｍ１およびグルコース溶液５ｍｌを入れ０２
３株を５Ｘ１０５個播種した。培養槽においては、炭酸
ガス５％含有空気が空間部に、純酸素ガスが培養液中に
送入しうるようになっており、溶存酸素量が３〜４１）
０１の範囲で一定になるように制御された。撹拌速度は
２０ｒ、＋１．１゜であった。
培養開始２日目よりノズル３から培地を２４０ｍ１／ｄ
ａｙで送入し潅流を開始した。グルコース溶液は２日目
から４日目まではノズｌし４から８．６ｍｌ／ｄａｙ送
入し、５８目以降は８時間に１回 図１のノズル１０よ
りサンプリングを行ってグルコースの濃度を測定しその
濃度が２〜３１ＷＩｗｏｌ／ｌとなるようにポンプの流
量を調節して培養を継続した。かくして１８日間培養を
行った結果は表１の通りであった。
ａｙで送入し潅流を開始した。グルコース溶液は２日目
から４日目まではノズｌし４から８．６ｍｌ／ｄａｙ送
入し、５８目以降は８時間に１回 図１のノズル１０よ
りサンプリングを行ってグルコースの濃度を測定しその
濃度が２〜３１ＷＩｗｏｌ／ｌとなるようにポンプの流
量を調節して培養を継続した。かくして１８日間培養を
行った結果は表１の通りであった。
実施例２
（１）培養装置
添付図２に示す培養システムを用いた。培養槽（ＡＰ−
１）は実施例１に同じである０図２のＡＰ−２はプレー
トアンドフレーム型限外濾過装置である。限外−過膜は
シリボア社製ベリコンラボカセット用限外濾過膜を使用
しな、膜の分画分子量は１０，０００である。
１）は実施例１に同じである０図２のＡＰ−２はプレー
トアンドフレーム型限外濾過装置である。限外−過膜は
シリボア社製ベリコンラボカセット用限外濾過膜を使用
しな、膜の分画分子量は１０，０００である。
（２細胞：実施例１と同じものを用いた。
（３） 培地及びグルコース溶液
培地はインシュリン、トランスフェリンの添加量はそれ
ぞれ１．８ｒａｔ／ ｌ 、 ２ ｗ／ ｌとしそれ以
外の組成は実施例１に同じものを用いた。グルコース溶
液は実施例１に同じものを用いた。
ぞれ１．８ｒａｔ／ ｌ 、 ２ ｗ／ ｌとしそれ以
外の組成は実施例１に同じものを用いた。グルコース溶
液は実施例１に同じものを用いた。
（４１培養方法および結果
おらかしめオートクレーブ滅菌した前記培養槽に正味培
養容積が約２００ｍ１になるように培養液を送入して、
グルコース溶液６．７０１１ををさらに追加して細胞を
播種した。培養槽の温度、溶存酸素コントロール、撹拌
速度は実施例１に同じである。
養容積が約２００ｍ１になるように培養液を送入して、
グルコース溶液６．７０１１ををさらに追加して細胞を
播種した。培養槽の温度、溶存酸素コントロール、撹拌
速度は実施例１に同じである。
播種ｆ＆ ２日間は回分培養を行った。３日目から潅流
を開始し表２に示すように培養開始後４日目に細胞密度
は１．１ ｘ１０１ｉ個／ ｍｌに達し、培地とグルコ
ース溶液の送入比は２４：１とした。
を開始し表２に示すように培養開始後４日目に細胞密度
は１．１ ｘ１０１ｉ個／ ｍｌに達し、培地とグルコ
ース溶液の送入比は２４：１とした。
潅流の尺度として正味培養容積の１日当り置換率として
表わし実験結果を併記する。すなわちポンプＰ−Ｉ、Ｐ
−Ｉ１．Ｐ−ＩＩＩを駆動しバルブＸを開、バルブＹを
閉として、培養槽内で細胞と分離された培養液をライン
Ｄから抜きとり、その量と同じ量の新培地をラインＡか
ら連続的に送入した。＠外−過装置ＡＰ−２には分子量
分画１０，０００の限外−過膜がセットされており、ラ
インＦからは膜を通過した液を、またラインＥからは膜
を通過しなかった液を系外に取出した０時間の経過とと
もに細胞密度が上昇し、７日には２．９ ｘｌＯ１個／
ｍｌに達した。この時点で図２においてバルブＸを閉じ
バルブＹを開き限外−過膜を通過しなかった液はライン
Ｇを通して培養槽に循環した。またこの時点から８時間
に１回培養槽からサンプリングを行ってグルコース濃度
を測定し、その濃度が１．５ｉＩＩｏｌ／！以下になる
ことを目標に送入量を調節して培養を継続した。
表わし実験結果を併記する。すなわちポンプＰ−Ｉ、Ｐ
−Ｉ１．Ｐ−ＩＩＩを駆動しバルブＸを開、バルブＹを
閉として、培養槽内で細胞と分離された培養液をライン
Ｄから抜きとり、その量と同じ量の新培地をラインＡか
ら連続的に送入した。＠外−過装置ＡＰ−２には分子量
分画１０，０００の限外−過膜がセットされており、ラ
インＦからは膜を通過した液を、またラインＥからは膜
を通過しなかった液を系外に取出した０時間の経過とと
もに細胞密度が上昇し、７日には２．９ ｘｌＯ１個／
ｍｌに達した。この時点で図２においてバルブＸを閉じ
バルブＹを開き限外−過膜を通過しなかった液はライン
Ｇを通して培養槽に循環した。またこの時点から８時間
に１回培養槽からサンプリングを行ってグルコース濃度
を測定し、その濃度が１．５ｉＩＩｏｌ／！以下になる
ことを目標に送入量を調節して培養を継続した。
かくして４０日間培養を行った結果は表２の通りであっ
た。
た。
比較例１
培養開始５日目以降の培養系中グルコース濃度が１０〜
１５Ｉｌｎｏｌ／ｆとなるようにする以外は実施例１と
同様にして培養を行った結果を表３に示、す。
１５Ｉｌｎｏｌ／ｆとなるようにする以外は実施例１と
同様にして培養を行った結果を表３に示、す。
比較例２
播種した細胞数をＩ×１０−個とし培養開始時より培養
系中グルコース濃度を１〜３ ｆｆｍｏｌ／ １とし、
培養開始直後から培地送入遠度２４０ｍ１ ／ ｄａｙ
で潅流する以外は、実施例１と同様にして培養した結果
を表４に示す。
系中グルコース濃度を１〜３ ｆｆｍｏｌ／ １とし、
培養開始直後から培地送入遠度２４０ｍ１ ／ ｄａｙ
で潅流する以外は、実施例１と同様にして培養した結果
を表４に示す。
表４
（ｅ）発明の効果
従って、本発明方法によれば動物細胞の高密度培養方法
において培地コストの低減が可能となり、得られた目的
物質の分離、精製が行いやすくなり、より効率的に培養
を行うことが可能となる。
において培地コストの低減が可能となり、得られた目的
物質の分離、精製が行いやすくなり、より効率的に培養
を行うことが可能となる。
図１および図２はそれぞれ本発明の培養方法を超施する
工程の該略図を示したものである。
工程の該略図を示したものである。
Claims (1)
- 動物細胞を生細胞密度３×１０＾６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以
上で灌流培養するにあたり、培養系におけるグルコース
濃度を０．０１ｍｍｏｌ／ｌ以上３ｍｍｏｌ／ｌ以下に
維持して培養することを特徴とする培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62258252A JPH066054B2 (ja) | 1987-10-15 | 1987-10-15 | 動物細胞の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62258252A JPH066054B2 (ja) | 1987-10-15 | 1987-10-15 | 動物細胞の培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01101882A true JPH01101882A (ja) | 1989-04-19 |
| JPH066054B2 JPH066054B2 (ja) | 1994-01-26 |
Family
ID=17317644
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62258252A Expired - Fee Related JPH066054B2 (ja) | 1987-10-15 | 1987-10-15 | 動物細胞の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH066054B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5856179A (en) * | 1994-03-10 | 1999-01-05 | Genentech, Inc. | Polypeptide production in animal cell culture |
| DE10255508A1 (de) * | 2002-11-27 | 2004-06-17 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Kultivierung von Zellen zur Produktion von Substanzen |
| EP1609853A1 (en) | 1995-06-06 | 2005-12-28 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Process for controlling sialylation of proteins produced by mammalian cell culture |
| JP2016187360A (ja) * | 2010-10-05 | 2016-11-04 | ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー | タンパク質を生産するための方法 |
| US10168326B2 (en) | 2013-07-04 | 2019-01-01 | F. Hoffmann-La Roche Inc. | Interference-suppressed immunoassay to detect anti-drug antibodies in serum samples |
| JP2021048776A (ja) * | 2019-09-20 | 2021-04-01 | 株式会社日立製作所 | 培養方法および培養装置 |
| US11021728B2 (en) | 2009-10-26 | 2021-06-01 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the production of a glycosylated immunoglobulin |
-
1987
- 1987-10-15 JP JP62258252A patent/JPH066054B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6180401B1 (en) | 1994-03-10 | 2001-01-30 | Genentech, Inc. | Polypeptide production in animal cell culture |
| US5856179A (en) * | 1994-03-10 | 1999-01-05 | Genentech, Inc. | Polypeptide production in animal cell culture |
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| US11021728B2 (en) | 2009-10-26 | 2021-06-01 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the production of a glycosylated immunoglobulin |
| US11377678B2 (en) | 2009-10-26 | 2022-07-05 | Hoffman-La Roche Inc. | Method for the production of a glycosylated immunoglobulin |
| US11136610B2 (en) | 2009-10-26 | 2021-10-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the production of a glycosylated immunoglobulin |
| US10138290B2 (en) | 2010-10-05 | 2018-11-27 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Process for protein production |
| JP2016187360A (ja) * | 2010-10-05 | 2016-11-04 | ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー | タンパク質を生産するための方法 |
| US10761091B2 (en) | 2013-07-04 | 2020-09-01 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Interference-suppressed immunoassay to detect anti-drug antibodies in serum samples |
| US10168326B2 (en) | 2013-07-04 | 2019-01-01 | F. Hoffmann-La Roche Inc. | Interference-suppressed immunoassay to detect anti-drug antibodies in serum samples |
| JP2021048776A (ja) * | 2019-09-20 | 2021-04-01 | 株式会社日立製作所 | 培養方法および培養装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH066054B2 (ja) | 1994-01-26 |
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