JPH0471518B2 - - Google Patents
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- JPH0471518B2 JPH0471518B2 JP61047477A JP4747786A JPH0471518B2 JP H0471518 B2 JPH0471518 B2 JP H0471518B2 JP 61047477 A JP61047477 A JP 61047477A JP 4747786 A JP4747786 A JP 4747786A JP H0471518 B2 JPH0471518 B2 JP H0471518B2
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Microbiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明は黄体形成ホルモンの測定法、測定試
薬、これに好適なモノクロナール抗体及び、その
取得法に関する。 従来の技術 体液、例えば尿、血清及び血漿中の黄体形成ホ
ルモン（LH）の測定は、主として、視床下部、
下垂体及び性腺の内分泌状態を評価するために使
用される。この試験は、特に性腺機能低下、不妊
症等の鑑別診断に役立つ。更に、このLH−測定
は、妊婦の誘導の際の排卵時点の測定のために使
用される。 これらのすべての場合に、血清値は生理学的範
囲内に存在する。更に、血清中のLHの濃度も、
このホルモンの生物学的作用に関する情報を得る
ための目的だけでも測定される。従つて、実質的
に、自然のホルモンの血清濃度の認識は、診断上
重要である。 血清中のヒトLHの生理学的濃度は次の範囲内
にある： 男性 ４〜24mlU／ml 閉経期前の婦人（周期） 10〜20mlU／ml 排卵ピーク時の婦人 80〜100mlU／ml 閉経期後の婦人 80〜150mlU／ml LHの測定のためには、特に抗原としてのこの
ホルモンがこれを認識する抗体１種以上を用いて
測定される免疫学的試験法が好適である。このポ
リペプチドホルモンを用いる抗体取得は、すべて
のポリペプチド−ホルモンは免疫性が悪いので、
困難と結びついている。LHと他の糖蛋白質ホル
モン例えば卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺
激ホルモン（TSH）又はヒト絨毛性ゴナドトロ
ピン（hCG）との間のホルモン学に基づき、これ
らホルモンの１種に対する特異抗体を得ることは
非常に困難である。これら糖蛋白質ホルモンを認
識する抗体は、通例、多かれ少なかれ他の糖蛋白
質−ホルモンとの交叉反応を有する。 クリニカ・ケミカ・アクタ（Clinica Chemica
Acta）133（1983），263〜274頁には、TSH及び
hCGと10％かつFSHと３％交叉反応する、LHに
対するモノクロナール抗体が記載されている。英
国特許（GB−Ａ）第2111201号明細書からは、
同様に、LHに対するモノクロナール抗体が知ら
れている。しかしながら、これは、同様にhCGと
反応する。特異的にLHを認識し、他の糖蛋白質
−ホルモンとの交叉反応をしないモノクロナール
抗体は、従来は知られていない。従つて、現在ま
でのところでは、他の糖蛋白質ホルモンを多かれ
少なかれ共に検出することなしにLHを免疫学的
に測定することは可能ではない。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、それを用いて、他の糖蛋白質
−ホルモン（本明細書中ではFSH，TSH又は
hCGを意味する）の存在でも、LHを特異的に測
定することのできる新規の免疫学的方法及び試薬
を得ることであつた。 問題点を解決するための手段 この課題は、本発明による免疫学的方法及び試
薬で解決される。 従つて、本発明の目的は、特異的にLHを認識
し、他の糖蛋白質ホルモンとは３％より少なく交
叉反応するモノクロナール抗体少なくとも１種を
用いる黄体形成ホルモンの免疫学的測定法並びに
これに好適な試薬である。 免疫学的測定法としては、原則的には、すべて
の慣用のイムノアツセイ例えばラジオイムノアツ
セイ、酵素−イムノアツセイ、螢光−イムノアツ
セイ等が好適である。更に、全体的な変法例えば
競争的イムノアツセイ、サンドイツチ法等も使用
可能である。標識付けのためには、それぞれの測
定法に慣用の手段が好適である。従つて、ラジオ
イムノアツセイの場合には、ラジオアイソトープ
例えば125Jが標識付けのために使用される。酵素
−イムノアツセイのためには、このために通例使
用されるすべての酵素、例えばペルオキシダーゼ
又はβ−ガラクトシダーゼが好適である。螢光−
イムノアツセイのためには、慣用の発光団がマー
カーとして使用可能である。これら種々の試験法
及び変法の詳細は当業者にとつて公知である。
LHの種々の抗原決定因を認識し、そのうちの少
なくとも１種が他の糖蛋白質−ホルモンとは３％
より少なく交叉反応する、少なくとも２種のモノ
クロナール抗体を使用する試験変法が有利であ
る。 LHの測定のためには、測定すべき抗原を担体
結合され、標識付けされた抗体と接触させるサン
ドイツチ法が特に好適であると立証された。この
ような測定法のために、例えば本発明による特異
的なモノクロナール抗体を固定相に結合させるこ
とができる。これを、第１のインキユベーシヨン
工程で、測定すべきLH及び一般に他の糖蛋白質
ホルモンを含有する試料と共にインキユベートす
る。この際、特異的抗体により選択的にLHが結
合される。慣用の洗浄工程の後に、この標識され
た抗体と共にインキユベートする。これは、必ず
しも特異的にLHを認識する必要はなく、他の糖
蛋白質ホルモンと交叉反応してもよい。 この方法は、非特異的に担体結合する抗体を用
いても実施できる。しかしながら、標識された抗
体として、本発明による特異的にLHを認識する
抗体を使用することが必要である。 このサンドイツチ法の変法は、同様に、LHの
測定のために好適である。例えば、差当り、標識
されていない可溶性抗体で、かつ標識された抗体
で、可溶性サンドイツチ−複合体を形成すること
ができる。これを、引続き、標識されていない可
溶性抗体のEcγ−部を認識する担体結合抗体を用
いて不溶性にする。この変法では、少なくとも標
識されていない可溶性抗体が本発明の抗体である
べきである。この際標識された抗体を過剰に使用
するのが有利である。 本発明の重要性は、この免疫学的方法のため
に、特異的にLHを認識し、従つてLHの特異的
測定を可能とするモノクロナール抗体を提供する
ことが意想外に達成されたことにある。 従つて、本発明のもう１つの目的は、他の糖蛋
白質ホルモンとの交叉反応性が３％より小さい
LHに対するモノクロナール抗体である。 本発明によるモノクロナール抗体を得るため
に、実験動物例えばマウスをLHで免疫化する。
免疫化のために、この免疫原を例えばアジユバン
スと組合せて常法で付与する。アジユバンスとし
ては、水酸化アルミニウムを百日咳菌（Ｂ−
ordetella pertussis）又はフロインドの（Ｆ−
reundschem）アジユバンスと共に使用するのが
有利である。免疫化は、有利に、数ケ月にわた
り、４〜６週間隔での少なくとも４回の免疫化に
より行なう。（腹膜内注射）。 このように免疫化した動物から、Ｂ−リンパ球
を得、これを永久骨髄腫細胞系と融合させる。こ
の融合は、ケーラー（Ko¨hler）及びミルスタイ
ン（Milstein）の公知方法〔ネイチユア
（Nature）、256，1975，495〜497頁〕で行なう。
この際生じたハイブリツド細胞の一次培養物を常
法で、例えば、市販の細胞ソルター
（Zellsorter）の使用下に、又は限定稀釈により
クローン化する。それぞれ、適当な試験法で例え
ば酵素イムノアツセイ（ELISA−法）で、LHに
対して陽性にかつ他の糖蛋白質ホルモンとは陰性
にもしくは僅かにのみ反応する培養物を更に加工
する。こうして、本発明によるモノクロナール抗
体を産生する多数のハイブリツドーマ細胞系が得
られる。公知方法で、この細胞系を培養し、これ
により産生されたモノクロナール抗体を単離する
ことができる。 この方法で得られる細胞系の例は次のとおりで
ある： クローン369（NCACC84122001）及びクローン
799（NCACC84122005）。これらの細胞系は、そ
れぞれの番号で寄託機関NCACC（National
Collection of Animal Cell Cultures）に寄託さ
れている。 このように得られたモノクロナール抗体は、
LHに対して非常に高い親和性（109〜1011／モ
ルの親和性定数）を有し、他の糖蛋白質ホルモン
とは３％より少なく交叉反応することで優れてい
る。特に有利なモノクロナール抗体は、他の糖蛋
白質ホルモン即ちhCG，FSH及びTSHに対する
１％より少ない、特に有利に0.1％より少ない交
叉反応性を有する。この親和性及び他のホルモン
との交叉反応性の測定のために、当業者に公知の
慣用法が提供される。 本発明によるモノクロナール抗体は、試料例え
ば血清又は血漿中でこのホルモンLHを他の糖蛋
白質ホルモンの存在で特異的に測定するために極
めて好適である。この測定法のために、モノクロ
ナール抗体そのもの又はそれからの相応する免疫
学的特性を有するフラグメント例えばFab−フラ
グメントを使用することができる。従つて、「モ
ノクロナール抗体」の概念で、完全抗体もフラグ
メントも理解される。 実施例 次の実施例につき、本発明を詳説する： 例 １ LHに対するモノクロナール抗体の取得 生後８〜12週のBalb／ｃ−マウスを、水酸化
アルミニウム及び百日咳菌に吸着されたhLH〔イ
ムネツクス社（Firma lmmunex）〕100μｇで腹
膜内で免疫化させる。６週後に４週間間隔で更に
３回免疫化させる。この際、各々、水酸化アルミ
ニウム及び百日咳菌に吸着されたLH50μｇを腹
膜内に施与する。 最後の免疫化の後約４ケ月に融合させる。この
融合の３日及び４日前に、それぞれ１回、
LH100μｇ／PBS（燐酸塩緩衝溶液）により腹膜
内もしくは静脈内で免疫化する。 融合のために、エンツイモロジイ（Enzy−
mology）73（1981）３頁中のガルフレ法
（Galfr′e，Methods）により、免疫化されたマウ
スの脾臓細胞108を骨髄腫（P3×63Ag8−653，
ATCC−CRL8375）２×107と混合し、引続き10
分間遠心分離する（300g，４℃）。細胞をもう一
度BSS（＝平衡塩類溶液：ba−lanced salt
solution）で洗浄し、400ｇで遠心する。上澄み
を除去する。細胞沈殿物に50％PEG−溶液（分
子量4000，Merck）１mlを加える。その後、室
温で、牛胎児血清（FKS）不含のRPMI1640−媒
体（RPMI＝Rosewell Parker Memory
Institute）５mlを、引続きもう１度10％FKS含
有RPMI1640−媒体５mlを徐々に滴加し、媒体で
50mlまで充たし、400ｇで10分間遠心分離する。
沈殿した細胞を10％FKS含有RPMI1640−媒体中
に入れる。脾臓細胞各２×105を24−穴−細胞培
養プレート（ヌンク社：Firma Nunc）上に播種
する。各培養液に、脾臓細胞１×105又は腹膜滲
出液細胞５×104を栄養細胞として添加する。次
の日に、ヒポキサンチン−アザセリン−選択媒体
（ヒポキサンチン100mM、アザセリン1μｇ／ml）
を添加する。 約７〜10日後に、既に多くのクローンが認めら
れる。１次培養液の上澄みを例２に記載の
ELISA法で試験する。抗原特異性抗体を含有す
る１次培養液を螢光活性化細胞ソールターを用い
て96−穴−細胞培養プレート（ヌンク社）上で更
にクローン化する。栄養細胞として、腹膜−滲出
液−細胞１×104又は脾臓細胞２×104を培養液96
−穴−細胞培養プレート当りに使用する。 こうして、双方のハイブリドーマー細胞系クロ
ーン369及びクローン799を単離することができ、
これらは、寄託機関NCACC（National
Collection of Animal Cell Cultures）に次の寄
託番号で寄託されている： NCACC84122001（＝クローン369） NCACC8422005 （＝クローン799）。 腹水を得るために、ハイブリツド細胞５×106
を予めプリスタン（Pristan）0.5mlで１〜２回前
処理されたマウスの腹膜内に注射する。その１〜
３週間後に、このマウスから腹水液を得ることが
できる。これから常法で抗体を単離することがで
きる。このモノクロナール抗体は特異的にLHに
対応していて、他の糖蛋白質−ホルモンとは交叉
反応しないかもしくは僅かに反応するだけであ
る。これらを以後、MAK369（クローン369の）
もしくはMAK799（クローン799の）と称する。 双方のモノクロナール抗体は、サブ群lgG1／
Ｋに属する。これらは次の親和性を有する： MAK 369＝7.9×1010／mol. MAK 799＝9.5×1011／mol. 親和性の測定のために、同族抗原との競争曲線
をスカツチヤード法（Scatchard：Anm.N.Y.
Acad.Sci.51，1949，660頁参照）で測定し、評価
する。このために必要な測定は例２と同様に実施
する。 例 ２ LHに対する抗体のスクリーニング試験 免疫化されたマウスの血清又はハイブリツド細
胞の培養液上澄み又は腹水中のLHに対する抗体
の存在及び特異性を知るために、試験原理として
ELISA−法を用い、マイクロ滴定プレートに
LH1μｇ／被覆緩衝液ml（0.2M炭酸ナトリウム／
重炭酸ナトリウム、PH9.3〜9.5）を37℃で１夜重
層する。0.9％塩化ナトリウム溶液及び１％アル
ブミン溶液で10分間後処理する。引続き、0.9％
塩化ナトリウム溶液で洗浄する。引続き37℃で１
時間試料100μと共にインキユベートし、改め
て0.9％塩化ナトリウム溶液で洗浄する。更に、
シヤフ（Schaf）−抗−マウス−lgG−ペルオキシ
ダーゼ−コンジユゲート100〜150mU／mlと共に
インキユベートする（37℃，１時間）。0.9％塩化
ナトリウムでの新たな洗浄工程の後に、ペルオキ
シダーゼ活性を常法で測定する（例えばABTS
を用い、室温で30分、405nmでの吸光度差ΔmE
を読む）。 このELISA−試験は次のようにしても実施で
きる： マイクロ滴定プレートにまずシヤフ−抗−マウ
ス−lgGを重層する（20〜30μｇ／被覆緩衝液ml、
37℃で１時間〜１夜）。その後、前記のように更
に処理し、試料溶液を添加し、改めて洗浄する。
引続き、LH−ペルオキシダーゼ−コンジユゲー
ト250mU／mlと共にインキユベートする（１時
間、37℃）。これを改めて洗浄し、ペルオキシダ
ーゼ−活性を例えばABTSにより測定する。 例 ３ 他の糖蛋白質との交叉反応の測定 例２の記載と同様に操作する。差当り、LHの
反応性を測定する。次いで、それぞれのモノクロ
ナール抗体に、それぞれ、交叉反応を試験する抗
原（hCG，TSH，FSH）を上昇性濃度で添加す
る。引続き、この交叉反応を次式で計算する： Ｃ（LH）／Ｃ（交叉反応抗原）×100＝交叉反応率（
％） Ｃ＝最大信号の50％に達するために必要である
抗原の濃度 次に第１表にMAK369及びMAK799に関する
測定値をまとめる。
薬、これに好適なモノクロナール抗体及び、その
取得法に関する。 従来の技術 体液、例えば尿、血清及び血漿中の黄体形成ホ
ルモン（LH）の測定は、主として、視床下部、
下垂体及び性腺の内分泌状態を評価するために使
用される。この試験は、特に性腺機能低下、不妊
症等の鑑別診断に役立つ。更に、このLH−測定
は、妊婦の誘導の際の排卵時点の測定のために使
用される。 これらのすべての場合に、血清値は生理学的範
囲内に存在する。更に、血清中のLHの濃度も、
このホルモンの生物学的作用に関する情報を得る
ための目的だけでも測定される。従つて、実質的
に、自然のホルモンの血清濃度の認識は、診断上
重要である。 血清中のヒトLHの生理学的濃度は次の範囲内
にある： 男性 ４〜24mlU／ml 閉経期前の婦人（周期） 10〜20mlU／ml 排卵ピーク時の婦人 80〜100mlU／ml 閉経期後の婦人 80〜150mlU／ml LHの測定のためには、特に抗原としてのこの
ホルモンがこれを認識する抗体１種以上を用いて
測定される免疫学的試験法が好適である。このポ
リペプチドホルモンを用いる抗体取得は、すべて
のポリペプチド−ホルモンは免疫性が悪いので、
困難と結びついている。LHと他の糖蛋白質ホル
モン例えば卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺
激ホルモン（TSH）又はヒト絨毛性ゴナドトロ
ピン（hCG）との間のホルモン学に基づき、これ
らホルモンの１種に対する特異抗体を得ることは
非常に困難である。これら糖蛋白質ホルモンを認
識する抗体は、通例、多かれ少なかれ他の糖蛋白
質−ホルモンとの交叉反応を有する。 クリニカ・ケミカ・アクタ（Clinica Chemica
Acta）133（1983），263〜274頁には、TSH及び
hCGと10％かつFSHと３％交叉反応する、LHに
対するモノクロナール抗体が記載されている。英
国特許（GB−Ａ）第2111201号明細書からは、
同様に、LHに対するモノクロナール抗体が知ら
れている。しかしながら、これは、同様にhCGと
反応する。特異的にLHを認識し、他の糖蛋白質
−ホルモンとの交叉反応をしないモノクロナール
抗体は、従来は知られていない。従つて、現在ま
でのところでは、他の糖蛋白質ホルモンを多かれ
少なかれ共に検出することなしにLHを免疫学的
に測定することは可能ではない。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、それを用いて、他の糖蛋白質
−ホルモン（本明細書中ではFSH，TSH又は
hCGを意味する）の存在でも、LHを特異的に測
定することのできる新規の免疫学的方法及び試薬
を得ることであつた。 問題点を解決するための手段 この課題は、本発明による免疫学的方法及び試
薬で解決される。 従つて、本発明の目的は、特異的にLHを認識
し、他の糖蛋白質ホルモンとは３％より少なく交
叉反応するモノクロナール抗体少なくとも１種を
用いる黄体形成ホルモンの免疫学的測定法並びに
これに好適な試薬である。 免疫学的測定法としては、原則的には、すべて
の慣用のイムノアツセイ例えばラジオイムノアツ
セイ、酵素−イムノアツセイ、螢光−イムノアツ
セイ等が好適である。更に、全体的な変法例えば
競争的イムノアツセイ、サンドイツチ法等も使用
可能である。標識付けのためには、それぞれの測
定法に慣用の手段が好適である。従つて、ラジオ
イムノアツセイの場合には、ラジオアイソトープ
例えば125Jが標識付けのために使用される。酵素
−イムノアツセイのためには、このために通例使
用されるすべての酵素、例えばペルオキシダーゼ
又はβ−ガラクトシダーゼが好適である。螢光−
イムノアツセイのためには、慣用の発光団がマー
カーとして使用可能である。これら種々の試験法
及び変法の詳細は当業者にとつて公知である。
LHの種々の抗原決定因を認識し、そのうちの少
なくとも１種が他の糖蛋白質−ホルモンとは３％
より少なく交叉反応する、少なくとも２種のモノ
クロナール抗体を使用する試験変法が有利であ
る。 LHの測定のためには、測定すべき抗原を担体
結合され、標識付けされた抗体と接触させるサン
ドイツチ法が特に好適であると立証された。この
ような測定法のために、例えば本発明による特異
的なモノクロナール抗体を固定相に結合させるこ
とができる。これを、第１のインキユベーシヨン
工程で、測定すべきLH及び一般に他の糖蛋白質
ホルモンを含有する試料と共にインキユベートす
る。この際、特異的抗体により選択的にLHが結
合される。慣用の洗浄工程の後に、この標識され
た抗体と共にインキユベートする。これは、必ず
しも特異的にLHを認識する必要はなく、他の糖
蛋白質ホルモンと交叉反応してもよい。 この方法は、非特異的に担体結合する抗体を用
いても実施できる。しかしながら、標識された抗
体として、本発明による特異的にLHを認識する
抗体を使用することが必要である。 このサンドイツチ法の変法は、同様に、LHの
測定のために好適である。例えば、差当り、標識
されていない可溶性抗体で、かつ標識された抗体
で、可溶性サンドイツチ−複合体を形成すること
ができる。これを、引続き、標識されていない可
溶性抗体のEcγ−部を認識する担体結合抗体を用
いて不溶性にする。この変法では、少なくとも標
識されていない可溶性抗体が本発明の抗体である
べきである。この際標識された抗体を過剰に使用
するのが有利である。 本発明の重要性は、この免疫学的方法のため
に、特異的にLHを認識し、従つてLHの特異的
測定を可能とするモノクロナール抗体を提供する
ことが意想外に達成されたことにある。 従つて、本発明のもう１つの目的は、他の糖蛋
白質ホルモンとの交叉反応性が３％より小さい
LHに対するモノクロナール抗体である。 本発明によるモノクロナール抗体を得るため
に、実験動物例えばマウスをLHで免疫化する。
免疫化のために、この免疫原を例えばアジユバン
スと組合せて常法で付与する。アジユバンスとし
ては、水酸化アルミニウムを百日咳菌（Ｂ−
ordetella pertussis）又はフロインドの（Ｆ−
reundschem）アジユバンスと共に使用するのが
有利である。免疫化は、有利に、数ケ月にわた
り、４〜６週間隔での少なくとも４回の免疫化に
より行なう。（腹膜内注射）。 このように免疫化した動物から、Ｂ−リンパ球
を得、これを永久骨髄腫細胞系と融合させる。こ
の融合は、ケーラー（Ko¨hler）及びミルスタイ
ン（Milstein）の公知方法〔ネイチユア
（Nature）、256，1975，495〜497頁〕で行なう。
この際生じたハイブリツド細胞の一次培養物を常
法で、例えば、市販の細胞ソルター
（Zellsorter）の使用下に、又は限定稀釈により
クローン化する。それぞれ、適当な試験法で例え
ば酵素イムノアツセイ（ELISA−法）で、LHに
対して陽性にかつ他の糖蛋白質ホルモンとは陰性
にもしくは僅かにのみ反応する培養物を更に加工
する。こうして、本発明によるモノクロナール抗
体を産生する多数のハイブリツドーマ細胞系が得
られる。公知方法で、この細胞系を培養し、これ
により産生されたモノクロナール抗体を単離する
ことができる。 この方法で得られる細胞系の例は次のとおりで
ある： クローン369（NCACC84122001）及びクローン
799（NCACC84122005）。これらの細胞系は、そ
れぞれの番号で寄託機関NCACC（National
Collection of Animal Cell Cultures）に寄託さ
れている。 このように得られたモノクロナール抗体は、
LHに対して非常に高い親和性（109〜1011／モ
ルの親和性定数）を有し、他の糖蛋白質ホルモン
とは３％より少なく交叉反応することで優れてい
る。特に有利なモノクロナール抗体は、他の糖蛋
白質ホルモン即ちhCG，FSH及びTSHに対する
１％より少ない、特に有利に0.1％より少ない交
叉反応性を有する。この親和性及び他のホルモン
との交叉反応性の測定のために、当業者に公知の
慣用法が提供される。 本発明によるモノクロナール抗体は、試料例え
ば血清又は血漿中でこのホルモンLHを他の糖蛋
白質ホルモンの存在で特異的に測定するために極
めて好適である。この測定法のために、モノクロ
ナール抗体そのもの又はそれからの相応する免疫
学的特性を有するフラグメント例えばFab−フラ
グメントを使用することができる。従つて、「モ
ノクロナール抗体」の概念で、完全抗体もフラグ
メントも理解される。 実施例 次の実施例につき、本発明を詳説する： 例 １ LHに対するモノクロナール抗体の取得 生後８〜12週のBalb／ｃ−マウスを、水酸化
アルミニウム及び百日咳菌に吸着されたhLH〔イ
ムネツクス社（Firma lmmunex）〕100μｇで腹
膜内で免疫化させる。６週後に４週間間隔で更に
３回免疫化させる。この際、各々、水酸化アルミ
ニウム及び百日咳菌に吸着されたLH50μｇを腹
膜内に施与する。 最後の免疫化の後約４ケ月に融合させる。この
融合の３日及び４日前に、それぞれ１回、
LH100μｇ／PBS（燐酸塩緩衝溶液）により腹膜
内もしくは静脈内で免疫化する。 融合のために、エンツイモロジイ（Enzy−
mology）73（1981）３頁中のガルフレ法
（Galfr′e，Methods）により、免疫化されたマウ
スの脾臓細胞108を骨髄腫（P3×63Ag8−653，
ATCC−CRL8375）２×107と混合し、引続き10
分間遠心分離する（300g，４℃）。細胞をもう一
度BSS（＝平衡塩類溶液：ba−lanced salt
solution）で洗浄し、400ｇで遠心する。上澄み
を除去する。細胞沈殿物に50％PEG−溶液（分
子量4000，Merck）１mlを加える。その後、室
温で、牛胎児血清（FKS）不含のRPMI1640−媒
体（RPMI＝Rosewell Parker Memory
Institute）５mlを、引続きもう１度10％FKS含
有RPMI1640−媒体５mlを徐々に滴加し、媒体で
50mlまで充たし、400ｇで10分間遠心分離する。
沈殿した細胞を10％FKS含有RPMI1640−媒体中
に入れる。脾臓細胞各２×105を24−穴−細胞培
養プレート（ヌンク社：Firma Nunc）上に播種
する。各培養液に、脾臓細胞１×105又は腹膜滲
出液細胞５×104を栄養細胞として添加する。次
の日に、ヒポキサンチン−アザセリン−選択媒体
（ヒポキサンチン100mM、アザセリン1μｇ／ml）
を添加する。 約７〜10日後に、既に多くのクローンが認めら
れる。１次培養液の上澄みを例２に記載の
ELISA法で試験する。抗原特異性抗体を含有す
る１次培養液を螢光活性化細胞ソールターを用い
て96−穴−細胞培養プレート（ヌンク社）上で更
にクローン化する。栄養細胞として、腹膜−滲出
液−細胞１×104又は脾臓細胞２×104を培養液96
−穴−細胞培養プレート当りに使用する。 こうして、双方のハイブリドーマー細胞系クロ
ーン369及びクローン799を単離することができ、
これらは、寄託機関NCACC（National
Collection of Animal Cell Cultures）に次の寄
託番号で寄託されている： NCACC84122001（＝クローン369） NCACC8422005 （＝クローン799）。 腹水を得るために、ハイブリツド細胞５×106
を予めプリスタン（Pristan）0.5mlで１〜２回前
処理されたマウスの腹膜内に注射する。その１〜
３週間後に、このマウスから腹水液を得ることが
できる。これから常法で抗体を単離することがで
きる。このモノクロナール抗体は特異的にLHに
対応していて、他の糖蛋白質−ホルモンとは交叉
反応しないかもしくは僅かに反応するだけであ
る。これらを以後、MAK369（クローン369の）
もしくはMAK799（クローン799の）と称する。 双方のモノクロナール抗体は、サブ群lgG1／
Ｋに属する。これらは次の親和性を有する： MAK 369＝7.9×1010／mol. MAK 799＝9.5×1011／mol. 親和性の測定のために、同族抗原との競争曲線
をスカツチヤード法（Scatchard：Anm.N.Y.
Acad.Sci.51，1949，660頁参照）で測定し、評価
する。このために必要な測定は例２と同様に実施
する。 例 ２ LHに対する抗体のスクリーニング試験 免疫化されたマウスの血清又はハイブリツド細
胞の培養液上澄み又は腹水中のLHに対する抗体
の存在及び特異性を知るために、試験原理として
ELISA−法を用い、マイクロ滴定プレートに
LH1μｇ／被覆緩衝液ml（0.2M炭酸ナトリウム／
重炭酸ナトリウム、PH9.3〜9.5）を37℃で１夜重
層する。0.9％塩化ナトリウム溶液及び１％アル
ブミン溶液で10分間後処理する。引続き、0.9％
塩化ナトリウム溶液で洗浄する。引続き37℃で１
時間試料100μと共にインキユベートし、改め
て0.9％塩化ナトリウム溶液で洗浄する。更に、
シヤフ（Schaf）−抗−マウス−lgG−ペルオキシ
ダーゼ−コンジユゲート100〜150mU／mlと共に
インキユベートする（37℃，１時間）。0.9％塩化
ナトリウムでの新たな洗浄工程の後に、ペルオキ
シダーゼ活性を常法で測定する（例えばABTS
を用い、室温で30分、405nmでの吸光度差ΔmE
を読む）。 このELISA−試験は次のようにしても実施で
きる： マイクロ滴定プレートにまずシヤフ−抗−マウ
ス−lgGを重層する（20〜30μｇ／被覆緩衝液ml、
37℃で１時間〜１夜）。その後、前記のように更
に処理し、試料溶液を添加し、改めて洗浄する。
引続き、LH−ペルオキシダーゼ−コンジユゲー
ト250mU／mlと共にインキユベートする（１時
間、37℃）。これを改めて洗浄し、ペルオキシダ
ーゼ−活性を例えばABTSにより測定する。 例 ３ 他の糖蛋白質との交叉反応の測定 例２の記載と同様に操作する。差当り、LHの
反応性を測定する。次いで、それぞれのモノクロ
ナール抗体に、それぞれ、交叉反応を試験する抗
原（hCG，TSH，FSH）を上昇性濃度で添加す
る。引続き、この交叉反応を次式で計算する： Ｃ（LH）／Ｃ（交叉反応抗原）×100＝交叉反応率（
％） Ｃ＝最大信号の50％に達するために必要である
抗原の濃度 次に第１表にMAK369及びMAK799に関する
測定値をまとめる。
【表】
例 ４
エピトープ特異性（Epitopspezifita¨t）の測定
マイクロ滴定プレートを、0.2M炭酸塩緩衝液
（PH9.6）中のマウス−抗体のFcγ−領域に対する
シヤフ（Schaf）−抗体10μｇ／mlで37℃で２時間
又は４℃で１夜被覆する。その後、PBS／ツイ
ーン（Tween）20（0.1％）（PH7.35）で洗浄する。
引続き、インキユベーシヨン緩衝液（PBS、牛
血清アルブミン（RSA）0.1％、ツイーン20 0.1
％）中のモノクロナール抗体（MAK １、濃度
10μｇ／ml）100μを加え、37℃で２時間インキ
ユベートする。 LH−ペルオキシダーゼ−コンジユゲート
（100mU／ml）を溶液中の第２のモノクロナール
抗体（MAK2）10μｇ／mlと共に４℃で１夜予備
インキユベートする。 MAK1を有するプレートのこのインキユベー
シヨンの後に過剰のMAK1をPBS−ツイーン20
で除去する。このプレートにPBS−RSA中の１
％マウス−正常血清を30分間室温で後重層する。
予備インキユベートされたMAK2／LH−ペルオ
キシダーゼ−複合体100μをプレート上に加え、
37℃で２時間インキユベートする。結合したペル
オキシダーゼ−活性を基質としてのABTSで可
視にする。測定した色強度は、MAK1に結合し
たMAK2／LH−ペルオキシダーゼ−コンジユゲ
ートに正比例する。MAK1としてのMAK799及
びMAK2としてのMAK369に関して、結合活性
は、非競争LH−POD−活性の34％である。 結果は、双方のモノクロナール抗体が抗原LH
の種々のエピトープに対応していることを示して
いる。 例 ５ LHの測定 Ａ 試薬溶液の製造 １ 基質緩衝液： 燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.4） 15mM 塩化ナトリウム 15mM EDTA 5mM 牛血清アルブミン（PH7.4） 0.2％ ｏ−ニトロフエニルガラクトシド 5mM ２ 処方１−溶液 処方１として、本発明によるモノクロナールマ
ウス−抗−hLH−抗体を使用する。この抗体を
含有する腹水液に硫酸アンモニウムを1.8Mまで
加える。沈殿を15mM燐酸ナトリウム（PH7.0）
および50mM塩化ナトリウムの緩衝液中に入れ
る。こうして得た溶液をDEAE−セルロース上か
ら通過させる。 ３ 処方３−溶液 処方３として、同様であるが、処方１とは異な
る抗原決定因を認識する本発明のモノクロナール
マウス−抗−hLH−抗体を使用する。この抗体
を含有する腹水液を２）の記載と同様に精製す
る。完全抗体を公知方法で切断してFab−フラグ
メントを得る。得られたFab−フラグメントとβ
−ガラクトシダーゼとを、R.R.ポルター
（Porter）によるビオケミカル・ジヤーナル
（Biochem.J.）73（1959）119頁の方法で結合させ
る。 ４ 活性化された処方２−溶液 シヤフ−抗−マウス−Ecγ−抗血清に硫酸アン
モニウムを1.8Mまで加える。沈殿を15mM硫酸
ナトリウム（PH7.0）及び5mM塩化ナトリウムか
らの緩衝液中に入れる。こうして得た溶液を
DEAE−セルロース上に通過させる。 Ｂ 試薬担持材の製造 １ 試薬担持材 １ １ml当り 燐酸ナトリウム（PH7.3，37℃） 100μモル 塩化マグネシウム 2μモル 塩化ナトリウム 0.9％ 牛血清アルブミン 0.5％ マウスからの抗−hLH−モノクロナール抗
体（処方１−溶液） 5μｇ／ml 抗−hLH−抗体−（マウス）−Fab−フラグメ
ント−β−ガラクトシダーゼコンジユゲート
（処方３−溶液） 100mU を含有する溶液40μを市販のポリエステル紙よ
りなるフリース上に滴加する。引続き、室温で乾
燥させる。このフリースをその使用まで４℃及び
相対湿度20％に保持する。 ２ 試薬担持材 ２ セルロースフリース上に公知のブロムシアン活
性化法（西ドイツ特許出願公開第1768512号明細
書）で、マウス−抗体のEcγ−部に対するシヤフ
−抗体（活性化された処方２−溶液）を固定さ
せ、この際、繊維材料１ｇ当り抗体10μｇを固定
のために提供する。洗浄により、結合しなかつた
抗体を除き、フリースを室温で温和に乾燥させ
る。こうして得たフリースの貯蔵は試薬担持材１
と同様に行なう。 この双方の試薬担持材１及び２を用いる測定
は、西ドイツ特許出願第3425008・５号明細書に
記載の分析測定実施用装置を用いて行なう。これ
は、それぞれ特定の１試薬で含浸された吸収性担
持物質を有する多数の試薬領域と連結していて、
挿入素子をローター上に固定する際に、一緒にな
つて内部半径から外部半径方向に通じる試料液体
搬送路を形成する少なくとも１個の混合弁室と混
合室を有する試料装入室及び更に少なくとももう
１つの液体収容室及びこの室から測定室に通じ、
試料液体搬送路と少なくとも部分的に同じ搬送路
を有する成形体よりなる自動遠心分離分析装置用
ローター挿入素子を明らかにしている。ここで、
試料液体搬送路は、試料装入室（Ｐ）から吸着性
材料の充填された緩衝液含有室(a)、室(c)及び室(a)
と(c)の間に配置された第１弁室（VK1）を経て、
第２弁室（VK2）に至り、かつここから室(d)及
び収集室（AK）を経て測定室（Ｋ）に至る。も
う１つの液体を収容するために、ポンプ室として
構成された基質室（PK）を備えており、これは、
配量室（DK）及び毛細管（Kap）よりなる配量
装置及び溢流室（u¨K）を経て第２弁室と連結し
ている。第１図はこの使用ローター挿入素子を図
示している。ここで、試薬担持材１をこの使い捨
て部品の区分ｃに配置し、試薬担持材２を区分ｄ
に配置する。この際、試薬40μを、上縁の開口
部から直接、区分ａにピペツト装入する。この試
料は稀釈されていない。基質溶液270μを室pK
中にピペツト装入する。高回転数が静止状態と交
換する適当なプログラムにより、試料及び基質溶
液は分離マトリツクス及びキユベツトの方向に送
られる。 この際、プログラムの経過で処方１及び３は試
料液により区分ｃから溶離され、引続き均質混合
物が反応される。生じた複合体が区分ｄで処方２
と結合される。区分ｃからｄへの試料の移動は非
常に短時間内に行なわれる。 基質溶液は、配量室DKを通つて少部分に分け
られ、その最初のものは、過剰の非複合コンジユ
ゲートの洗浄のために使用される。 複合体形成を介してｄで結合したβ−ガラクト
シダーゼ活性は、試料中に含有されるhLH量に
比例する。この活性は、基質が５分間の反応で着
色生成物に変換されるのに充分な更なる基質量で
測定される。生じる色はキユベツト中、410nmで
測定される。 既知LH−含量を有する検量血清で、第２図の
検量曲線が得られ、これは、hLH0〜25mU／ml
の範囲（hLH68／40に関する第1IRP−規準で標
準化）を把握し、血清又は血漿中の充分に敏感な
hLH測定を可能にする。この検量曲線を用いて、
体液例えば血清又は血漿中の未知hLH含量を測
定することができる。hCG100IU／ml（1.IRP＝
WHOの1.国際関連製剤）を有して貯蔵された標
準の再現率は96〜104％である。 例 ６ サンドイツチ−原理によるLHの測定 被覆緩衝液（0.2M炭酸ナトリウム／重炭酸ナ
トリウムPH9.4）中に本発明によるLHに対するモ
ノクロナール抗体を50μｇ／mlの濃度で含有する
溶液100μをマイクロ滴定プレートの各々の凹
所に入れ、室温で１時間インキユベートする。引
続き、インキユベーシヨン緩衝液（牛血清アルブ
ミン１％，Nac0.9％）を後重層し、室温で30
分間インキユベートする。洗浄緩衝液（Nac
0.9％、ツイーン20 0.1％）で洗浄後に、各凹所
に測定すべきLHを含有する試料100μを入れ、
室温で30分間インキユベートする。洗浄緩衝液で
の再度洗浄の後に、ペルオキシダーゼ（活性
100mU／ml）とLHとは異なるエピトープに対応
する本発明によるもう１つのモノクロナール抗体
とからのコンジユゲート100μを重層し、室温
で１時間インキユベートする。 このコンジユゲートの製造のために、西洋ワサ
ビ（Meerrettich）ペルオキシダーゼ（E.
C.1.11.1.7）を使用する。このコンジユゲートは
過沃素酸塩での酸化及び引続く水素化ホウ素を用
いる還元により、P.K.ナカネ（Nakane）による
処方〔M.B.ウイルソン（Wilson）及びP.K.ナカ
ネのW.クナツプ（Knapp）発行、イムノフルオ
レツセンス・アンド・リレイテツド・ステイニン
グ・テクニクス（Immunofluorescense and
Related Staining Technics）、1978、エルスヴ
イア／ノース・ホーランド・ビオメデイカル・プ
レス（Elsevier／North Holland，Biochemical
Press）215〜224頁〕に応じて製造する。 洗浄緩衝液を用いる洗浄の後に、ABTS−標
準溶液100μを重層し、１時間の呈色反応後に、
405nmでの吸光度をELISA−リーダー（ダイナ
テツク：Dynatec）で測定する。 検量曲線を得るために、前記の方法で、試料の
代りに、LHを種々の限定された濃度で含有する
溶液を用いる。
（PH9.6）中のマウス−抗体のFcγ−領域に対する
シヤフ（Schaf）−抗体10μｇ／mlで37℃で２時間
又は４℃で１夜被覆する。その後、PBS／ツイ
ーン（Tween）20（0.1％）（PH7.35）で洗浄する。
引続き、インキユベーシヨン緩衝液（PBS、牛
血清アルブミン（RSA）0.1％、ツイーン20 0.1
％）中のモノクロナール抗体（MAK １、濃度
10μｇ／ml）100μを加え、37℃で２時間インキ
ユベートする。 LH−ペルオキシダーゼ−コンジユゲート
（100mU／ml）を溶液中の第２のモノクロナール
抗体（MAK2）10μｇ／mlと共に４℃で１夜予備
インキユベートする。 MAK1を有するプレートのこのインキユベー
シヨンの後に過剰のMAK1をPBS−ツイーン20
で除去する。このプレートにPBS−RSA中の１
％マウス−正常血清を30分間室温で後重層する。
予備インキユベートされたMAK2／LH−ペルオ
キシダーゼ−複合体100μをプレート上に加え、
37℃で２時間インキユベートする。結合したペル
オキシダーゼ−活性を基質としてのABTSで可
視にする。測定した色強度は、MAK1に結合し
たMAK2／LH−ペルオキシダーゼ−コンジユゲ
ートに正比例する。MAK1としてのMAK799及
びMAK2としてのMAK369に関して、結合活性
は、非競争LH−POD−活性の34％である。 結果は、双方のモノクロナール抗体が抗原LH
の種々のエピトープに対応していることを示して
いる。 例 ５ LHの測定 Ａ 試薬溶液の製造 １ 基質緩衝液： 燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.4） 15mM 塩化ナトリウム 15mM EDTA 5mM 牛血清アルブミン（PH7.4） 0.2％ ｏ−ニトロフエニルガラクトシド 5mM ２ 処方１−溶液 処方１として、本発明によるモノクロナールマ
ウス−抗−hLH−抗体を使用する。この抗体を
含有する腹水液に硫酸アンモニウムを1.8Mまで
加える。沈殿を15mM燐酸ナトリウム（PH7.0）
および50mM塩化ナトリウムの緩衝液中に入れ
る。こうして得た溶液をDEAE−セルロース上か
ら通過させる。 ３ 処方３−溶液 処方３として、同様であるが、処方１とは異な
る抗原決定因を認識する本発明のモノクロナール
マウス−抗−hLH−抗体を使用する。この抗体
を含有する腹水液を２）の記載と同様に精製す
る。完全抗体を公知方法で切断してFab−フラグ
メントを得る。得られたFab−フラグメントとβ
−ガラクトシダーゼとを、R.R.ポルター
（Porter）によるビオケミカル・ジヤーナル
（Biochem.J.）73（1959）119頁の方法で結合させ
る。 ４ 活性化された処方２−溶液 シヤフ−抗−マウス−Ecγ−抗血清に硫酸アン
モニウムを1.8Mまで加える。沈殿を15mM硫酸
ナトリウム（PH7.0）及び5mM塩化ナトリウムか
らの緩衝液中に入れる。こうして得た溶液を
DEAE−セルロース上に通過させる。 Ｂ 試薬担持材の製造 １ 試薬担持材 １ １ml当り 燐酸ナトリウム（PH7.3，37℃） 100μモル 塩化マグネシウム 2μモル 塩化ナトリウム 0.9％ 牛血清アルブミン 0.5％ マウスからの抗−hLH−モノクロナール抗
体（処方１−溶液） 5μｇ／ml 抗−hLH−抗体−（マウス）−Fab−フラグメ
ント−β−ガラクトシダーゼコンジユゲート
（処方３−溶液） 100mU を含有する溶液40μを市販のポリエステル紙よ
りなるフリース上に滴加する。引続き、室温で乾
燥させる。このフリースをその使用まで４℃及び
相対湿度20％に保持する。 ２ 試薬担持材 ２ セルロースフリース上に公知のブロムシアン活
性化法（西ドイツ特許出願公開第1768512号明細
書）で、マウス−抗体のEcγ−部に対するシヤフ
−抗体（活性化された処方２−溶液）を固定さ
せ、この際、繊維材料１ｇ当り抗体10μｇを固定
のために提供する。洗浄により、結合しなかつた
抗体を除き、フリースを室温で温和に乾燥させ
る。こうして得たフリースの貯蔵は試薬担持材１
と同様に行なう。 この双方の試薬担持材１及び２を用いる測定
は、西ドイツ特許出願第3425008・５号明細書に
記載の分析測定実施用装置を用いて行なう。これ
は、それぞれ特定の１試薬で含浸された吸収性担
持物質を有する多数の試薬領域と連結していて、
挿入素子をローター上に固定する際に、一緒にな
つて内部半径から外部半径方向に通じる試料液体
搬送路を形成する少なくとも１個の混合弁室と混
合室を有する試料装入室及び更に少なくとももう
１つの液体収容室及びこの室から測定室に通じ、
試料液体搬送路と少なくとも部分的に同じ搬送路
を有する成形体よりなる自動遠心分離分析装置用
ローター挿入素子を明らかにしている。ここで、
試料液体搬送路は、試料装入室（Ｐ）から吸着性
材料の充填された緩衝液含有室(a)、室(c)及び室(a)
と(c)の間に配置された第１弁室（VK1）を経て、
第２弁室（VK2）に至り、かつここから室(d)及
び収集室（AK）を経て測定室（Ｋ）に至る。も
う１つの液体を収容するために、ポンプ室として
構成された基質室（PK）を備えており、これは、
配量室（DK）及び毛細管（Kap）よりなる配量
装置及び溢流室（u¨K）を経て第２弁室と連結し
ている。第１図はこの使用ローター挿入素子を図
示している。ここで、試薬担持材１をこの使い捨
て部品の区分ｃに配置し、試薬担持材２を区分ｄ
に配置する。この際、試薬40μを、上縁の開口
部から直接、区分ａにピペツト装入する。この試
料は稀釈されていない。基質溶液270μを室pK
中にピペツト装入する。高回転数が静止状態と交
換する適当なプログラムにより、試料及び基質溶
液は分離マトリツクス及びキユベツトの方向に送
られる。 この際、プログラムの経過で処方１及び３は試
料液により区分ｃから溶離され、引続き均質混合
物が反応される。生じた複合体が区分ｄで処方２
と結合される。区分ｃからｄへの試料の移動は非
常に短時間内に行なわれる。 基質溶液は、配量室DKを通つて少部分に分け
られ、その最初のものは、過剰の非複合コンジユ
ゲートの洗浄のために使用される。 複合体形成を介してｄで結合したβ−ガラクト
シダーゼ活性は、試料中に含有されるhLH量に
比例する。この活性は、基質が５分間の反応で着
色生成物に変換されるのに充分な更なる基質量で
測定される。生じる色はキユベツト中、410nmで
測定される。 既知LH−含量を有する検量血清で、第２図の
検量曲線が得られ、これは、hLH0〜25mU／ml
の範囲（hLH68／40に関する第1IRP−規準で標
準化）を把握し、血清又は血漿中の充分に敏感な
hLH測定を可能にする。この検量曲線を用いて、
体液例えば血清又は血漿中の未知hLH含量を測
定することができる。hCG100IU／ml（1.IRP＝
WHOの1.国際関連製剤）を有して貯蔵された標
準の再現率は96〜104％である。 例 ６ サンドイツチ−原理によるLHの測定 被覆緩衝液（0.2M炭酸ナトリウム／重炭酸ナ
トリウムPH9.4）中に本発明によるLHに対するモ
ノクロナール抗体を50μｇ／mlの濃度で含有する
溶液100μをマイクロ滴定プレートの各々の凹
所に入れ、室温で１時間インキユベートする。引
続き、インキユベーシヨン緩衝液（牛血清アルブ
ミン１％，Nac0.9％）を後重層し、室温で30
分間インキユベートする。洗浄緩衝液（Nac
0.9％、ツイーン20 0.1％）で洗浄後に、各凹所
に測定すべきLHを含有する試料100μを入れ、
室温で30分間インキユベートする。洗浄緩衝液で
の再度洗浄の後に、ペルオキシダーゼ（活性
100mU／ml）とLHとは異なるエピトープに対応
する本発明によるもう１つのモノクロナール抗体
とからのコンジユゲート100μを重層し、室温
で１時間インキユベートする。 このコンジユゲートの製造のために、西洋ワサ
ビ（Meerrettich）ペルオキシダーゼ（E.
C.1.11.1.7）を使用する。このコンジユゲートは
過沃素酸塩での酸化及び引続く水素化ホウ素を用
いる還元により、P.K.ナカネ（Nakane）による
処方〔M.B.ウイルソン（Wilson）及びP.K.ナカ
ネのW.クナツプ（Knapp）発行、イムノフルオ
レツセンス・アンド・リレイテツド・ステイニン
グ・テクニクス（Immunofluorescense and
Related Staining Technics）、1978、エルスヴ
イア／ノース・ホーランド・ビオメデイカル・プ
レス（Elsevier／North Holland，Biochemical
Press）215〜224頁〕に応じて製造する。 洗浄緩衝液を用いる洗浄の後に、ABTS−標
準溶液100μを重層し、１時間の呈色反応後に、
405nmでの吸光度をELISA−リーダー（ダイナ
テツク：Dynatec）で測定する。 検量曲線を得るために、前記の方法で、試料の
代りに、LHを種々の限定された濃度で含有する
溶液を用いる。
第１図は本発明の方法を実施する自動遠心分離
分析装置用ローター挿入素子の略示図であり、第
２図は既知LH−含分の血清の検量曲線である。
分析装置用ローター挿入素子の略示図であり、第
２図は既知LH−含分の血清の検量曲線である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 黄体形成ホルモン（LH）を測定するため
に、LHを認識し、卵胞刺激ホルモン（FSH）、
甲状腺刺激ホルモン（TSH）又はヒト絨毛性ゴ
ナドトロピン（hCG）とは３％より少なく交叉反
応するモノクロナール抗体少なくとも１種を使用
することを特徴とする、黄体形成ホルモンの免疫
学的測定法。 ２ LHを認識し、FSH，TSH又はhCGとは１
％より少なく交叉反応するモノクロナール抗体少
なくとも１種を使用する、特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ３ そのうちの少なくとも１種はFSH，TSH又
はhCGとは３％より少なく交叉反応するLHを認
識するモノクロナール抗体少なくとも２種を使用
する、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方
法。 ４ LHを認識し、FSH，TSH又はhCGとは３
％より少なく交叉反応するモノクロナール抗体少
なくとも１種を含有することを特徴とする、黄体
形成ホルモン測定用試薬。 ５ LHを認識し、FSH，TSH又はhCGとは１
％より少なく交叉反応するモノクロナール抗体少
なくとも１種を含有する、特許請求の範囲第４項
記載の試薬。 ６ そのうちの少なくとも１種がFSH，TSH又
はhCG3％とより少なく交叉反応する、少なくと
も２種のLHを認識するモノクロナール抗体を含
有する、特許請求の範囲第４項又は第５項記載の
試薬。 ７ FSH，TSH又はhCGと３％より少なく交叉
反応することを特徴とする、黄体形成ホルモンを
認識するモノクロナール抗体。 ８ FSH，TSH又はhCGと１％より少なく交叉
反応する、特許請求の範囲第７項記載のモノクロ
ナール抗体。 ９ FSH，TSH又はhCGと３％より少なく交叉
反応する、黄体形成ホルモンを認識するモノクロ
ナール抗体を取得するため、マウスをLHで免疫
化させ、この免疫化された動物の脾臓からＢ−リ
ンパ球を得、これを骨髄腫細胞と融合させ、生じ
たハイブリドーマ細胞をクローン化し、特異的に
LHを認識する抗体を産生するクローンを選択
し、これにより形成された抗体を取得することを
特徴とするモノクロナール抗体の取得法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853507848 DE3507848A1 (de) | 1985-03-06 | 1985-03-06 | Verfahren und reagenz zur bestimmung des luteinisierenden hormons sowie hierzu geeignete monoklonale antikoerper |
| DE3507848.0 | 1985-03-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61218599A JPS61218599A (ja) | 1986-09-29 |
| JPH0471518B2 true JPH0471518B2 (ja) | 1992-11-13 |
Family
ID=6264312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61047477A Granted JPS61218599A (ja) | 1985-03-06 | 1986-03-06 | 黄体形成ホルモンの測定法、測定試薬、これに好適なモノクロナール抗体及びその取得法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
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