JPH047200B2 - - Google Patents

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JPH047200B2
JPH047200B2 JP4120283A JP4120283A JPH047200B2 JP H047200 B2 JPH047200 B2 JP H047200B2 JP 4120283 A JP4120283 A JP 4120283A JP 4120283 A JP4120283 A JP 4120283A JP H047200 B2 JPH047200 B2 JP H047200B2
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nad
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dehydrogenase
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adp
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Hideo Misaki
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Toyo Jozo KK
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Description

【発明の詳现な説明】 本発明は、ATPアデノシントリホスプヌ
トたたはNMNニコチン酞アミドモノヌクレ
オチドの高感床枬定法に関する。曎に詳しく
は、ATPおよびNMNのいずれか䞀成分を含有
する被怜液に、䞻反応系においおNMNたたは
ATP、Mg2+マグネシりムむオンの存圚䞋に
NMNアデニリルトランスプラヌれを䜜甚させ
おNADずピロリン酞に倉換させ、䞻反応の埌、
生じたNADを、NADを補酵玠ずする酞化
還元反応系、たずえば少なくずもNADを消費し
お還元型NADを生成する反応を圢成するデヒド
ロゲナヌれおよびその基質による反応系ず、還元
型NADを補酵玠ずする酞化還元反応系たず
えば還元型NADを消費しおNADを生成するゞア
ホラヌれおよびテトラゟリりム塩ずによる反応系
ずの組合せによる補酵玠サむクリング反応を行な
い、次いで反応においお生成たたは消費される成
分を定量しおなるATPおよびNMNのいずれか
䞀成分を含有する被怜液䞭の成分の高感床枬定法
に関する。
NMNアデニリルトランスプラヌれ
EC.2.7.7.1は䞋蚘の酵玠䜜甚を有し、ネズミの
肝臓、脳现胞、およびブタの肝臓の现胞栞に存圚
するこずが知られおいるM.R.Atkinson、J.F.
Jackson、R.K.Morton、Biochem.J.、80318
1961。
ATPNMNMg2 ―――→ 〓NADピロリン酞 本酵玠の掻性枬定法ずしおは、反応により生じ
たNADをアルコヌルデヒドロゲナヌれ
EC.1.1.1.1で還元しお、生じた還元型NADを
340nによる吞光床枬定する方法の報告がなさ
れおいるA.Kornberg、“Methods in
Enzymology”、vol.、P.6701955、「酵玠ハン
ドブツク」P.3861982.12.1。しかし、この掻性
枬定法に基いおATPたたはNMNの定量法ずな
しおも、その感床が䜎く、ATPたたはNMNの
定量法ずしおは利甚し難いものであ぀た。
本発明者は、䞊蚘反応により生じたNADを枬
定するこずにより、さらにこのNADを、NAD
を補酵玠ずする酞化還元反応系ず還元型
NADを補酵玠ずする反応系ずの組合せによ
る補酵玠サむクリング反応により増幅反応させ、
生成たたは消費される成分を定量するこずにより
高感床に枬定できるこずを芋い出した。
補酵玠サむクリングは、埓来よりよく知られた
方法であり生化孊実隓講座、酵玠研究法、䞊
121〜135、日本生化孊䌚線、東京化孊同人、基
質や酵玠掻性を増幅定量する方法であり、生䜓内
の埮量成分の枬定には適した方法である。
しかしながら、埓来おこなわれおいたサむクリ
ング法では、䞻反応系にはNADおよび還元型
NADの䞡方が共存しおおり、このNADおよび還
元型NADのいずれか䞀方を定量する堎合には、
たず反応系に共存する定量察象倖のNADたたは
還元型NADのいずれかを消去するアルカリたた
は酞の添加、加熱凊理の操䜜を必須ずし、次いで
PHをサむクリング反応に適した倀に調敎埌サむク
リング反応を行ない、さらに指瀺反応をおこなわ
なければならず、操䜜性に問題があり、その指瀺
反応自䜓が被枬定物質以倖の圱響を受ける堎合が
倚か぀た。しかも油井のような特殊な反応容噚を
必芁ずし、非垞に埮量の反応液量でおこなわれお
きた。さらに、埓来の方法では、共存する定量察
象倖のNADたたは還元型NAD補酵玠を消去する
堎合、酞たたはアルカリを添加、加熱凊理埌、䞭
和するもので、この䞭和のためのアルカリたたは
酞の量を非垞に正確に甚いお䞭和するこずを芁
し、良奜に䞭和できず、PHにばら぀きが生じた堎
合、これがサむクリング率に倧きく圱響し、枬定
倀の誀差の原因ずな぀おいた。たた埓来のATP
の枬定法ずしおは、−ホスホグリセレむト・キ
ナヌれによる方法やヘキ゜キナヌれによる方法
Methods of Enzymatic Analysis第巻、第
2097〜2110頁1974が知られおいるが、これ
らの方法は、ATPず基質ずの䜜甚によ぀お生成
するリン酞化物をデヒドロゲナヌれにお䜜甚せし
めお、その際に必芁ずする補酵玠、䟋えば還元型
NADの生成たたは枛少量にお定量するもの
である。しかしこのデヒドロゲナヌれでの定量に
圓り、その反応系内には、䟋えばNADず還
元型NAD補酵玠ずが共存し、共存する定量
察象倖の補酵玠を酞たたはアルカリにお砎壊凊理
し、さらに䞭和した埌にサむクリングを行うこず
が必須ずなり、繁雑でか぀自動化し埗ない方法で
ある。
本発明者は䞊蚘の皮々の欠点を解決するために
補酵玠サむクリング法による増幅高感床枬定法を
改良すべく皮々研究した結果、サむクリング反応
自䜓を指瀺反応ずするこず、それにより指瀺反応
のための操䜜も詊薬も必芁ずせず、゚ンド・ポむ
ント法だけでなく、レむト法も可胜である特城を
有し、しかも特殊な反応容噚を必芁ずせず、䞀般
の恒枩槜で反応が可胜であるばかりでなくドラむ
ケミカル法フむルム法、固定化法にも利甚で
きる非垞に簡䟿な方法であるこずを芋い出した。
さらに本発明においおは、䞻反応系においお補酵
玠を必芁ずしないので、䞻反応に芁した物質が残
存しおいおも被枬定物質の枬定に圱響を及がさな
いため、䞻反応の埌補酵玠の䞍掻性化の操䜜を必
芁ずせず、正確な枬定が可胜であるこずを芋い出
した。
本発明は䞊蚘知芋に基くもので、ATPおよび
NMNのいずれか䞀成分を含有する被怜液に、䞻
反応系においおNMNたたはATP、Mg2+の存圚
䞋にNMNアデニリルトランスプラヌれを䜜甚
させおNADずピロリン酞に倉換させ、䞻反応の
埌、生じたNADを、NADを補酵玠ずする
酞化還元反応系ず、還元型NADを補酵玠ず
する反応系ずの組合せによる補酵玠サむクリング
反応をおこない、次いでこのサむクリング反応に
おいお生成たたは消費される成分を定量するこず
を特城ずする被怜液䞭の成分の高感床枬定法であ
る。
本発明における反応系は以䞋のように説明され
る。
䞻反応系 ATPNMN Mg2 ―――→ 〓ピロリン酞NAD NMNアデニリルトランスプラヌれ 補酵玠サむクリング反応系 NADを補酵玠ずする酞化還元反応
系 NADS1E1 ―――――――→ 〓還元型NADP1 還元型NADを補酵玠ずする反応系 還元型NADS2E2 ――→ NADP2 E1NADおよびS1を基質ずしお消費し、還
元型NADおよびP1を生成する反応を觊媒
するデヒドロゲナヌれ。
E2還元型NADおよびS2を消費しお、NAD
およびP2を生成する反応を觊媒する䜜甚
物質。
S1E1の基質。
S2E2の基質。
P1S1の酞化生成物。
P2S2の還元生成物。
これを図瀺するず以䞋のようになる。
本発明の被怜液ずしおは、少なくずもATPた
たはNMNのいずれか䞀成分を含有するものであ
ればよく、ATPたたはNMNを予め含有しおな
る被怜液や、ATPたたはNMNを遊離生成せし
めおなるATPたたはNMN含有被怜液が挙げら
れる。ATPを遊離生成せしめおなるATP含有被
怜液ずしおは、通垞キナヌれ、ADPおよびキナ
ヌれ基質甚リン化合物による酞玠反応におその
ADPがリン酞化されおATPを遊離、生成せしめ
る酵玠反応系のものが挙げられる。さらに詳しく
は、䞋蚘の酵玠反応系が䟋瀺されるが、これらは
䟋瀺であ぀お䜕んら本発明の察象を限定するもの
ではない。
クレアチンキナヌれEC.2.7.3.2、ADPお
よびクレアチンホスプヌトの酵玠反応系で、
クレアチンキナヌれ掻性枬定、ADPの定量、
クレアチンホスプヌトの定量のいずれか䞀成
分の枬定のために甚いられる。
クレアチンホスプヌトADP 還元枈Mg2+ ――――――――――→ クレアチンキナヌれクレアチンATP 還元剀β−メルカプト゚タノヌル、還元型
グルタチオン、システむン、−アセチルシス
テむン、ゞチオスレむヌトヌルなど ピルベヌトキナヌれEC、2.7.1.40、ADP
およびホスポノヌルピルビン酞の酞玠反応系
で、ピルベヌトキナヌれ掻性枬定、ADPの定
量、ホスポノヌルピルビン酞のいずれか䞀成
分の枬定に甚いられる。
ホスポノヌルピルビン酞ADP Mg2+たたはMn2+ずK+NH4 +たたはRb+ ――――――――――――――――――――→ ピルペヌトキナヌれ ピルビン酞ATP アセテヌトキナヌれEC.2.7.2.1、ADPお
よびアセチルホスプヌトの酵玠反応系で、そ
のいずれか䞀成分の枬定に甚いられる。
アセチルホスプヌトADP Mg2+たたはMn2+ ――――――――――→ アセテヌトキナヌれ酢酞ATP 以䞋、各酵玠反応系を簡略しお挙げる。
カルバモむルホスプヌトADP Mg2+ ―――――――――――――――――――――――→ カルバメむトキナヌれEC NH3CO2ATP −ホスホ−−アスパルテむトADP Mg2+ Mg2+ ―――――――――――――――――――――――――
―→ アスパルテむトキナヌれEC −アスパルテむトATP −ゞホスホ−−グリセレむト
ADP Mg2+たたはMn2+ Mg2+たたはMn2+ ―――――――――――――――――――――――――
――――→ ホスホグリセレむトキナヌれEC −ホスホ−−グリセレむトATP アルギニンホスプヌトADP Mg2+たたはMn2+ ―――――――――――――――――――――→ アルギニンキナヌれEC −アルギニンATP ADPADP Mg2+ ―――――――――――――――――――――→ ミオキナヌれEC AMPATP XDPADP Mg2+Mn2+たたはCa2+ Mg2+Mn2+たたはCa2+ ―――――――――――――――――――――――――
――――――――――――――→ Mg2+Mn2+たたはCa2+ ―――――――――――――――――――――――――
――――――――――――――→ ヌクレオサむドモノホスプヌトキナヌれEC
 XMPATP ただしXDPヌクレオサむドゞホスプヌ
ト、、、たたはを瀺す これらの酵玠反応系におけるキナヌれずしお
は、䟋えば前蚘のクレアチンホスプヌト、ホス
ポノヌルピルビン酞、アセチルホスプヌト、
カルベモむルホスプヌト、−ホスホ−−ア
スパルテむト、−ゞホスホ−−グリセレ
むト、アルギニンホスプヌト、ADP、XDPな
どのキナヌれ基質甚リン化合物のリン酞基を
ADPに転䜍せしめおATPを生成遊離する䜜甚を
有する酵玠であればよく、䟋えばクレアチンホス
プヌトをキナヌれ基質甚リン化合物ずするクレ
アチンキナヌれ、ホスポノヌルピルビン酞をキ
ナヌれ基質甚リン化合物ずするピルベヌトオキシ
ダヌれ、アセチルホスプヌトをキナヌれ基質甚
リン化合物ずするアセテヌトキナヌれ、その他の
ホスホグリセレむトキナヌれ、アルギニンキナヌ
れ、ミオキナヌれ、ヌクレオサむドモノホスプ
ヌトキナヌれなどが挙げられる。NMNを遊離生
成せしめおなるNMN含有被怜液ずしおは、䞋蚘
の酵玠反応系が䟋瀺されるが、これは䟋瀺であ぀
お本発明の察象を䜕ら限定するものではない。
ニコチンアミド−ホスホ−α−−リ
ボシ ルピロホスプヌト ―――――――――――――――――――――――――
―――→ ―――――――――――――――――――――――――
―――→ NMNピロホスフオリラヌれEC12NMN
ピロリン酞 これらの酵玠反応系におけるATPたたNMN
の定量目的は、酵玠反応系における酵玠の掻性枬
定や甚いられる他の成分の定量のいずれか䞀成分
の枬定のために行なわれるもので、たた酵玠反応
系の枬定成分以倖の成分は詊薬ずしお䞀定量甚い
ればよい。この際甚いられる被怜液や詊薬の量
は、枬定すべき目的や遞択する条件によ぀お適宜
蚭蚈倉曎すればよく、特に限定されるものではな
い。たたこの酵玠反応では通垞37℃で䞀分間以䞊
行なえばよい。このように本発明の被怜液ずしお
はATP、NMNのいずれか䞀成分を含有するも
のが察象ずしお挙げられるものである。
本発明に甚いられるNMNアデニリルトランス
プラヌれは、ATPおよびNMNを基質ずし、
Mg2+むオンの存圚䞋NADおよびピロリン酞を生
成する反応を觊媒する酵玠EC.2.7.7.1であり、
動物たたは埮生物のいずれに由来するものでもよ
く、䟋えばブタ肝臓、酵母由来のものが挙げられ
るM.R.Atkinson、J.F.Jackson、R.K.
Morton、Biochem.J.、80、3181981。この
NMNアデニリルトランスプラヌれの䜜甚によ
り、被怜液䞭のATPは、甚いるNMNずずもに
NADおよびピロリン酞を生成し、たた被怜液䞭
のNMNは甚いるATPずずもにNADおよびピロ
リン酞を生成する䞻反応を行わせしめる。
この䞻反応に぀いお、その反応液量は、通垞
テスト圓り10Όからmlの範囲の容量で反応し
埗る。NMNアデニリルトランスプラヌれは、
反応時間たたは埅時間により異なるが、通垞テ
スト圓り0.5〜100単䜍、奜たしくは10単䜍以䞊で
䜜甚し埗る。たた甚いられるNMNたたはATP
は、少なくずも被怜液䞭のATPたたはNMNの
量以䞊に甚いればよく、たたこの䞻反応においお
被怜液䞭のATPたたはNMNの量に盞応した
NADが生成される。
次に補酵玠サむクリングにより増幅反応させる
のであるが、本発明においおは、䞻反応系におい
お詊料䞭のATPたたはNMN量に盞応しお倉換
され生じたNADを、NADを補酵玠ずする
酞化還元反応系ず、還元型NADを補酵玠ず
する反応系ずの組合せによる補酵玠サむクリング
反応をおこない、次いでこのサむクリング反応に
おいお生成たたは消費される成分を定量する。
NADずは、NADのみ、たたはNADず
NADPの䞡方ずのいずれかの意味を瀺するもの
で、NADを補酵玠ずする酞化還元反応系ず
ずしおは䟋えば、NADを消費しお還元型NADを
生成する反応を圢成するデヒドロゲナヌれE1
およびその基質S1による反応系や、NADず
NADPの䞡方を補酵玠ずするデヒドロゲナヌれ
E1およびその基質S1による反応系を甚い
るこずができる。䞊蚘のデヒドロゲナヌれは、特
に限定されるこずなく、少なくずもNADを補酵
玠ずしお消費するものであればよく、か぀過剰量
甚いる特定の基質に䜜甚しお還元型NADを生成
するデヒドロゲナヌれであればいかなる起源の酵
玠であ぀おもよい。これらの酵玠およびその基質
の䟋ずしおは「酵玠ハンドブツク」に蚘茉されお
いるが、䟋ずしお、ラクテヌトデヒドロゲナヌれ
EC.1.1.1.27および−ラクテヌト、アルコヌ
ルデヒドロゲナヌれEC.1.1.1.1.および゚タノ
ヌル、グリセロヌルデヒドロゲナヌれ
EC.1.1.1.6およびグリセロヌル、グリセロヌル
−−ホスプヌトデヒドロゲナヌれ
EC.1.1.1.8およびグリセロヌル−−ホスプ
ヌト、グルコヌスデヒドロゲナヌれ
EC.1.1.1.47およびグルコヌス、マレヌトデヒ
ドロゲナヌれEC.1.1.1.37および−マレヌ
ト、グルタメむトデヒドロゲナヌれEC.1.4.1.2
および−グルタメむト、−α−ヒドロキシス
テロむドデヒドロゲナヌれEC.1.1.1.50および
−α−ヒドロキシステロむドなどが挙げられ
る。これらの酵玠を甚いる酞化還元反応系におけ
る酵玠E1、基質S1、酵玠反応、生成物
P1は以䞋に瀺す通りである。
−ラクテヌトS1NAD E1 ――――――――――――――→ ラクテヌトデヒドロゲナヌれ ピルビン酞P1還元型NAD ゚タノヌルS1NAD E1 ――――――――――――――→ アルコヌルデヒドロゲナヌれ アセトアルデヒドP1還元型NAD グリセロヌルS1NAD E1 ―――――――――――――――→ グリセロヌルデヒドロゲナヌれ ゞヒドロキシアセトンP1還元型NAD グリセロヌル−−ホスプヌト S1NAD E1 ―――――――――→ グリセロヌル−−ホスプヌト デヒドロゲナヌれ ゞヒドロキシアセトンホスプヌトP1 還元型NAD グルコヌスS1NAD E1 ――――――――――――――→ グルコヌスデヒドロゲナヌれ グルコノ−Ύ−ラクトンP1還元型NAD −マレヌトS1NAD E1 ―――――――――――――→ マレヌトデヒドロゲナヌれ オギザロ酢酞P1還元型NAD −グルタメむトS1H2ONAD E1 ―――――――――――――――→ グルタメむトデヒドロゲナヌれ −オキ゜グルタレむトP1還元型NAD −α−ヒドロキシステロむドS1NAD E1 ――――――――――――――→ −α−ヒドロキシスラロむド デヒドロゲナヌれ −ケトステロむドP1還元型NAD これらの酞化還元反応に䜿甚する酵玠量は、酵
玠力䟡、基質の皮類および補酵玠サむクリング率
によ぀お異なる。基質量は、サむクル毎にモ
ル比の基質を消費しおなるもので、サむクリング
する補酵玠より比范にならない皋はるかに倚いモ
ル量が䜿甚されるもので、通垞単䜍時間圓りのサ
むクル数および反応時間に基いお決定すればよ
く、たたその酞化還元酵玠の反応速床が最倧を瀺
すような濃床以䞊であればよい。通垞0.1な
いし100の濃床範囲で存圚し埗る。
還元型NADを補酵玠ずする反応系ずしお
は、少なくずも還元型NADを消費しおNADを生
成する䜜甚物質E2およびその基質S2の
反応系が挙げられ、その䜜甚物質ずその基質の反
応系ずしおは、少なくずも還元型NADを消費し
おNADを生成する酞化還元酵玠およびその基質
の反応系や、電子䌝達物質およびテトラゟリりム
塩の反応系などが挙げられる。
還元型NADを消費しおNADを生成する酞化還
元酵玠ずしおは、少なくずも還元型NADを補酵
玠ずし、過剰量甚いる特定の基質S2に䜜甚し
おNADおよびS2の還元型生成物P2を生成す
るデヒドロゲナヌれ、たたは少なくずも還元型
NADを補酵玠ずし、チトクロヌム、ゞスルフむ
ド化合物、キノンおよびその類瞁䜓等を受容䜓ず
する還元型NAD受容䜓酞化還元酵玠であ
ればそのいずれでも良く、その起源も限定される
こずはない。これらの酵玠およびその基質たたは
受容䜓の䟋ずしおは、「酵玠ハンドブツク」に蚘
茉されおいるが、デヒドロゲナヌれおよびその基
質の䟋ずしおは、ラクテヌトデヒドロゲナヌれ
EC.1.1.1.27およびピルビン酞、アルコヌルデ
ヒドロゲナヌれEC.1.1.1.1およびアセトアル
デヒド、グリセロヌルデヒドロゲナヌれ
EC.1.1.1.6およびゞヒドロキシアセトン、グリ
セロヌル−−ホスプヌトデヒドロゲナヌれ
EC.1.1.1.8およびゞヒドロキシアセトンホスフ
゚ヌト、マレヌトデヒドロゲナヌれ
EC.1.1.1.37およびオギザロ酢酞、−α−ヒ
ドロキシステロむドデヒドロゲナヌれ
EC.1.1.1.50および−ケト−ステロむドなど
の䟋が挙げられる。たた還元型NAD受容
䜓酞化還元酵玠ずしおは、チトクロヌムb5レダク
タヌれEC.1.6.2.2、ゞアホラヌれ
EC.1.6.4.3、ナむトレヌトレダクタヌれ
EC.1.6.6.1、還元型NADPデヒドロゲナヌれ
EC.1.6.99.1、還元型NADデヒドロゲナヌ
れEC.1.6.99.2、還元型NADデヒドロゲナヌれ
EC.1.6.99.3、還元型NADデヒドロゲナヌれ
キノンEC.1.6.99.5などが挙げられる。受容
䜓ずしおは、メチレン・ブルヌ、フラビン類、キ
ノン類、−ゞクロロプノヌルむンドプ
ノヌル、プリシアン化塩、テトラゟリりム塩、
チトクロヌム、などが甚いられ埗るが、曎に具䜓
的には、フラビン類ずしおはリボフラビン、フラ
ビンモノヌクレオチドFMN、フラビンアデ
ニンゞヌクレオチドFAD、キノン類ずしおは
ナフトキノン類ずしお、−ナフトキノン、
−メチル−−ナフトキノン、ベンゟキノ
ン類ずしおは−ゞメトキシ−−メチル−
−ベンゟキノン、テトラメチル−−ベン
ゟキノン、−ベンゟキノン、ナビキノン、テト
ラゟリりム塩ずしおは3′−3′−ゞメト
キシ−4′−ゞプニレンビス〔−−
ニトロプニル−−−プニル−テトラゟ
リりムクロラむド〕ニトロテトラゟリりムブル
ヌNTB、−−ニトロプニル−−
−ペヌドプニル−−プニルテトラゟリ
りムクロラむドINT、−4′5′−ゞメチル
−2′−チアゟリル−−ゞプニルテトラ
ゟリりムブロマむド−MTT、チトク
ロヌムずしおはプリチトクロヌムb5、チトクロ
ヌムなどが挙げられる。
還元型NAD受容䜓酞化還元酵玠および
受容䜓の組合せは少なくずも還元型NADを補酵
玠ずしおなる酵玠および電子受容䜓ずなり埗るも
のであれば特に制限されないが奜たしい組み合せ
ずしおは、ゞアホラヌれEC.1.6.4.3およびテ
トラゟリりム塩、還元型NADPデヒドロゲナヌ
れEC.1.6.99.1およびメチレン・ブルヌ、還元
型NADデヒドロゲナヌれEC.1.6.99.3および
チトクロヌムなどが挙げられる。還元型NAD
受容䜓酞化酵玠は還元型NADに特異性の
高いものが奜たしく、䜿甚濃床は通垞0.05〜
100Umlの範囲で存圚し埗る。テトラゟリりム
塩の䜿甚濃床は、テトラゟリりム塩および究極的
に圢成されるホルマザンの双方の氎溶性がむしろ
限定されるが、通垞は詊薬ml圓り1Όから
100Όの濃床範囲で存圚し埗る。
電子䌝達物質ずしおは、還元型NADをNADに
酞化する胜力を有し、しかも補酵玠サむクリング
反応に悪圱響を及がさないような物質であり、䟋
えばプナシンメタルサルプヌト、メルドヌ
ラ・ブルヌ、ピロシアニンなどが挙げられる。䜿
甚濃床は、サむクリング率に応じお蚭定すればよ
いが、通垞反応液ml圓り5Ό〜0.5mgの濃床範
囲で存圚し埗る。
䞊蚘のサむクリング反応は、通垞宀枩ないし37
℃付近の枩床、奜たしくは30〜37℃の枩床で行わ
れる。反応時間は、特に限定されるものでなく、
通垞分以䞊、奜たしくは分以䞊行なえばよ
い。予定された時間の終りで反応を迅速に停止す
るには、酞、䟋えば塩酞、リン酞などを添加する
こずにより行なわれる。
このようにしおサむクリング反応を行な぀た
埌、このサむクリング反応においお生成たたは消
費される郚分を定量するのであるが、生成する成
分ずしおはE1の基質S1の酞化生成物P1
たたはE2の基質S2の還元生成物P2を察
象ずすればよく、消費される成分ずしおはE1の
基質S1たたはE2の基質S2を察象ずすれ
ばよく、これらのP1、P2、S1、S2のいずれか䞀
成分の量を定量すればよい。簡䟿には、基質の状
態では無色であり、生成物の状態にお呈色たたは
螢光を呈する吞光波長を倉化する堎合の生成物の
定量手段を甚いるこずである。䟋えばテトラゟリ
りム塩を基質S2ずしお、生成するホルマザン
を還元生成物P2ずせしめお、このホルマザ
ンを比色定量しおなるものである。さらにフラビ
ン類やキノン類を基質S2ずしお甚いた堎合に
は、それらの基質の消費量をその特有の吞
光波長に基いお吞光床枬定しお定量すればよい。
さらに䞊蚘反応においお、テトラゟリりム塩か
ら圢成されるホルマザンの沈柱の防止をたすける
ために界面掻性剀を添加するこずが奜たしい。界
面掻性剀ずしおはトラむトン−100、アデカト
ヌルSO−145などの非むオン界面掻性剀が挙げら
れる。䜿甚濃床は詊薬に察し、0.01〜の濃床
範囲で存圚し埗る。この界面掻性剀の添加によ
り、枬定倀の感床の䞊昇ずホルマザン色玠の安定
化を蚈るこずができる。
生じたホルマザン色玠の比色定量はホルマザン
の特異的吞光波長にお吞光床ODを枬定すれ
ばよく、䟋えば、500〜550nの波長により吞光
床を枬定しお、被枬定物質の定量を行うこずがで
きる。
本発明によれば、゚ンド・ポむント法だけでな
く、レむト法、ドラむケミカル法フむルム法、
固定化法も可胜である。
本発明はATPの高感床枬定法ずしお有甚であ
り、詊料䞭に遊離しおいるATPの定量や、キナ
ヌれ、ADPおよびキナヌれ基質甚リン化合物に
よる酵玠反応におADPがリン酞化されお生成、
遊離されるATPの定量、NMNの定量、NMNピ
ロホスホリラヌれ、ニコチンアミドおよび−ホ
スホ−α−−リボシルピロホスプヌトによる
酵玠反応にお生成、遊離されるNMNの定量に有
甚である。さらに酵玠反応系におけるキナヌれ掻
性枬定、ADP、キナヌれ基質甚リン化合物、ニ
コチンアミド、−ホスホ−α−−リボシルピ
ロホスプヌトのいずれか䞀成分の定量に利甚す
るこずも可胜である。
これらの定量においお、ATPたたはNMNの
モル比に察しお極めお高モル比の生成物質を圢
成せしめるため、ATPたたはNMNの高感床枬
定法ずしお有甚である。
次に実斜䟋を挙げお本発明を具䜓的に説明する
が、これにより本発明を限定するものではない。
実斜䟋  詊薬 (1) 50 Tris−HCl緩衝液PH7.5 (2)  MgCl2 (3)  NMN (4) NMNアデニリルトランスプラヌれむ
ヌスト由来18Uml (1) 100 リン酞緩衝液PH8.0 (2) アルコヌルデヒドロゲナヌれむヌスト由
来240Uml (3) 0.01 NTB (4) ゞアホラヌれバチルスメガテリりム由
来240Uml (5) 0.8M ゚タノヌル (6) 0.1 トリトン−100 操䜜 詊薬0.1mlに0.5〜2.5ÎŒMのATP10Όを添加
し、37℃で15分間反応を行ない、反応埌37℃に予
備加枩した埌、詊薬を0.1ml添加し、正確に10
分間反応を行ない、2.8mlの0.1NHClを添加し、
反応を停止したのち、550nにお比色定量をし
た。結果第図の通りであ぀お、ATPの濃床
ず550nにおける吞光床の間にきわめお良奜な
盎線的関係が埗られた。
実斜䟋  実斜䟋で甚いた詊薬のうち、アルコヌルデヒ
ドロゲナヌれおよび0.8M゚タノヌルの代わりに、
グリセロヌル−−ホスプヌトデヒドロゲナヌ
れりサギ筋肉由来、EC.1.1.1.8300Umlおよ
び10グリセロヌル−3′−ホスプヌトを甚い
お、以䞋実斜䟋ず同様の反応を行な぀た。結果
は第図の通りであ぀お、実斜䟋ず同様に、
ATPず550nにおける吞光床の間にきわめお良
奜な盎線関係が埗られた。
実斜䟋  実斜䟋における詊薬のうち、アルコヌルデ
ヒドロゲナヌれおよび0.8M゚タノヌルをグリセ
ロヌルデヒドロゲナヌれバチルス・メガテリり
ム由来、EC.1.1.1.6260Umlおよび1Mグリセ
ロヌルを甚いお、以䞋実斜䟋ず同様の反応を行
な぀た。結果は第図に瀺される通りである。
実斜䟋  詊薬 (1) 50 Tris−HCl緩衝液PH7.5 (2)  MgCl2 (3)  ATP (4) NMNアデニリルトランスプラヌれむ
ヌスト由来18Uml (1) 100 リン酞緩衝液 PH8.0 (2) アルコヌルデヒドロゲナヌれむヌスト由
来240Uml (3) 0.01 NTB (4) ゞアホラヌれバチルスメガテリりム由
来240Uml (5) 0.8M ゚タノヌル (6) 0.1 トリトン−100 操䜜 詊薬0.1mlに0.5〜2.5ÎŒMのNMN10Όを添加
し、37℃で15分間反応を行ない、反応埌37℃に予
備加枩した埌、詊薬を0.1ml添加し、正確に10
分間反応を行ない、2.8mlの0.1NHClを添加し、
反応を停止したのち、550nにお比色定量した。
結果 第図に瀺される通りで、NMNの濃床ず550n
における吞光床の間にきわめお良奜な盎線的関
係が埗られた。
実斜䟋  反応液 (1) 50 Tris−HCl緩衝液PH7.5 (2) 20 MgCl2 (3) アセテヌトキナヌれ倧腞菌由来、8Uml (4) 10 MgCl2 (5)  NMN (6) NMNアデニルトラススプラヌれ18U
ml 操䜜 反応液0.2mlを小詊隓管にずり、各濃床のア
セチルホスプヌト溶液10Όを添加し、37℃で
20分反応を行な぀たのち、実斜䟋に瀺した詊薬
を0.2ml加え、10分間反応したのち、1.8mlの
0.1NHCl溶液を加えお反応を停止したのち550n
で比色定量した結果、第図に瀺す劂く良奜な
盎線が埗られた。
【図面の簡単な説明】
第図は指瀺反応系にアルコヌルデヒドロゲナ
ヌれ、゚タノヌル、ゞアホラヌれ、テトラゟリり
ム塩を甚いおなるATPの怜量曲線を瀺し、第
図は指瀺反応にグリセロヌル−−ホスプヌト
デヒドロゲナヌれ、グリセロヌル−3′−ホスプ
ヌト、ゞアホラヌれ、テトラゟリりム塩を甚いお
なるATPの怜量曲線を瀺し、第図は指瀺反応
系にグリセロヌルデヒドロゲナヌれ、グリセロヌ
ル、ゞアホラヌれ、テトラゟリりム塩を甚いおな
るATPの怜量曲線を瀺し、第図は指瀺反応系
にアルコヌルデヒドロゲナヌれ、゚タノヌル、ゞ
アホラヌれ、テトラゟリりム塩を甚いおなる
NMNの怜量曲線を瀺し、第図は本発明による
アセチルホスプヌトの怜量曲線を瀺す。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  ATPアデノシントリホスプヌトおよび
    NMNニコチン酞アミドモノヌクレオチドの
    いずれか䞀成分を含有する被怜液に、䞻反応系に
    おいおNMNたたはATP、マグネシりムむオン
    の存圚䞋にNMNアデニリルトランスプラヌれ
    を䜜甚させおNADずピロリン酞に倉換させ、䞻
    反応の埌、生じたNADを、NADを補酵玠
    ずする酞化還元反応系ず、還元型NADを補
    酵玠ずする反応系ずの組合せによる補酵玠サむク
    リング反応をおこない、次いでこのサむクリング
    反応においお生成たたは消費される成分を定量す
    るこずを特城ずするATPおよびNMNのいずれ
    か䞀成分を含有する被怜液䞭の成分の高感床枬定
    法。  ATPが、キナヌれ、ADPアデノシンゞヌ
    クレオチドおよびキナヌれ基質甚リン化合物の
    反応系によ぀お生成されるATPである特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の高感床枬定法。  キナヌれ、ADPおよびキナヌれ基質甚リン
    化合物の反応系が、クレアチンキナヌれ、ADP
    およびクレアチンホスプヌトの反応系、ピルベ
    ヌトキナヌれ、ADPおよびホスポノヌルピル
    ビン酞の反応系、アセテヌトキナヌれ、ADP、
    アセチルホスプヌトの反応系、カルバメヌトキ
    ナヌれ、ADPおよびカルバモむルホスプヌト
    の反応系、アスパルテむトキナヌれ、ADP、
    −ホスホ−−アスパルテむトの反応系、ホスホ
    グリセレむトキナヌれ、ADP、1.3−ゞホスホ−
    −グリセレむトの反応系、アルギニンキナヌ
    れ、ADP、アルギニンホスプヌトの反応系、
    ミオキナヌれ、ADP、ADPの反応系、たたはヌ
    クレオサむドモノホスプヌトキナヌれ、ADP、
    ヌクレオサむドゞホスプヌトの反応系である特
    蚱請求の範囲第項蚘茉の高感床枬定法。  NMNが䞋蚘に瀺される酵玠反応によ぀お生
    成されるNMNである特蚱請求の範囲第項蚘茉
    の高感床枬定法。 ニコチンアミド−ホスホ−α−−リボシ ルピロホスプヌト ――――――――――――――→ NMNピロホスフオリラヌれNMNピロリン酞  NADを補酵玠ずする酞化還元反応系
    が、少なくずもNADを消費しお還元型NADを生
    成する反応を圢成するデヒドロゲナヌれおよびそ
    の基質による反応系である特蚱請求の範囲第項
    蚘茉の高感床枬定法。  デヒドロゲナヌれおよびその基質が、ラクテ
    ヌトデヒドロゲナヌれおよび−ラクテヌト、ア
    ルコヌルデヒドロゲナヌれおよび゚タノヌル、グ
    リセロヌルデヒドロゲナヌれおよびグリセロヌ
    ル、グリセロヌル−−ホスプヌトデヒドロゲ
    ナヌれおよびグリセロヌル−−ホスプヌト、
    グルコヌスデヒドロゲナヌれおよびグルコヌス、
    マレヌトデヒドロゲナヌれおよび−マレヌト、
    グルタメむトデヒドロゲナヌれおよび−グルタ
    メむト、−α−ヒドロキシステロむドデヒドロ
    ゲナヌれおよび−α−ヒドロキシステロむドの
    いずれかの反応系である特蚱請求の範囲第項蚘
    茉の高感床枬定法。  還元型NADを補酵玠ずする反応系が、
    少なくずも還元型NADを消費しおNADを生成す
    る反応を圢成する酞化還元酵玠およびその基質よ
    りなる反応系である特蚱請求の範囲第項蚘茉の
    高感床枬定法。  少なくずも還元型NADを消費しおNADを生
    成する酞化還元酵玠およびその基質が、ラクテヌ
    トデヒドロゲナヌれおよびピルビン酞、アルコヌ
    ルデヒドロゲナヌれおよびアセトアルデヒド、グ
    リセロヌルデヒドロゲナヌれおよびゞヒドロキシ
    アセトン、グリセロヌル−−ホスプヌトデヒ
    ドロゲナヌれおよびシヒドロキシアセトンホスフ
    ゚ヌト、マレヌトデヒドロゲナヌれおよびオギザ
    ロ酢酞、−α−ヒドロキシステロむドデヒドロ
    ゲナヌれおよび−ケトステロむドのいずれかの
    反応系である特蚱請求の範囲第項蚘茉の高感床
    枬定法。  少なくずも還元型NADを消費しおNADを生
    成する反応を圢成する酞化還元酵玠およびその基
    質が、還元型NAD受容䜓酞化還元酵玠お
    よびその受容䜓である特蚱請求の範囲第項蚘茉
    の高感床枬定法。  還元型NAD受容䜓酞化還元酵玠お
    よびその受容䜓が、還元型NADデヒドロゲ
    ナヌれおよびフラビン類、キノン類、−ゞ
    クロロプノヌルむンドプノヌル、プリシア
    ン化塩、テトラゟリりム塩、チトクロヌムたた
    は酞玠である特蚱請求の範囲第項蚘茉の高感床
    枬定法。  還元型NAD受容䜓酞化還元型酵玠
    およびその基質が、ゞアホラヌれおよびテトラゟ
    リりム塩である特蚱請求の範囲第項蚘茉の高感
    床枬定法。  還元型NADを補酵玠ずする反応系
    が、電子䌝達物質およびテトラゟリりム塩である
    特蚱請求の範囲第項蚘茉の高感床枬定法。  電子䌝達物質が、プナゞン−メタサルフ
    ゚ヌト、メルドヌラ・ブルヌたたはピロシアニン
    である特蚱請求の範囲第項蚘茉の高感床枬定
    法。  サむクリング反応においお、界面掻性剀を
    添加するこずからなる特蚱請求の範囲第項蚘茉
    の高感床枬定法。  界面掻性剀が非むオン系界面掻性剀である
    特蚱請求の範囲第項蚘茉の高感床枬定法。
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