JPH0472508B2 - - Google Patents

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JPH0472508B2
JPH0472508B2 JP58501900A JP50190083A JPH0472508B2 JP H0472508 B2 JPH0472508 B2 JP H0472508B2 JP 58501900 A JP58501900 A JP 58501900A JP 50190083 A JP50190083 A JP 50190083A JP H0472508 B2 JPH0472508 B2 JP H0472508B2
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chymosin
precursor
insoluble
chymosin precursor
methionine
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JP58501900A
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English (en)
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JPS59500996A (ja
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Nooman Henrii Kyarii
Maikeru Terensu Doru
Chimoshii Jon Roi Harisu
Piitaa Ansonii Ro
Jon Supensaa Emutaaga
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Celltech R&D Ltd
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Celltech R&D Ltd
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Publication date
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Publication of JPH0472508B2 publication Critical patent/JPH0472508B2/ja
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents

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Description

請求の範囲 キモシン先駆物質の遺伝情報となる遺伝子を含
むベクターにより形質転換された宿主生物により
不溶性の形態のキモシン先駆物質が生産されるよ
うなキモシンの生産方法において、該不溶性の形
態のキモシン先駆物質が、可溶性の自然の形態の
キモシン先駆物質を切断してキモシンを生産する
前に可溶化して、可溶性の自然の形態のキモシン
先駆物質を生産することを特徴とするキモシンの
生産方法。
２ 特許請求の範囲第１項記載のキモシンの生産
方法において、該可溶化が、該不溶性の形態のキ
モシン先駆物質を可逆的に変性し、次いで該キモ
シン先駆物質を復元せしめ、それにより可溶性の
自然の形態のキモシン先駆物質を生産することを
含むキモシンの生産方法。
３ 特許請求の範囲第２項記載のキモシンの生産
方法において、該不溶性の形態のキモシン先駆物
質が、少なくとも7M濃度の尿素を含む水溶液中
で変性され、次いで該溶液中の尿素の濃度を、該
キモシン先駆物質を実際に変性する濃度まで下げ
ることによつて該キモシン先駆物質が復元され、
よつて可溶性の自然の形態のキモシン先駆物質を
生産することを特徴とするキモシンの生産方法。
４ 特許請求の範囲第２項記載のキモシンの生産
方法において、該不溶性の形態のキモシン先駆物
質が、少なくとも6M濃度のグアニジンハイドロ
クロライドを含む水溶液の中で変性され、次いで
該溶液中のグアニジンハイドロクロライドの濃度
を、該キモシン先駆物質が実際に変性する濃度以
下に下げることによつて該キモシン先駆物質が復
元され、よつて可溶性の自然の形態のキモシン先
駆物質を生産することを特徴とするキモシンの生
産方法。
５ 特許請求の範囲第２項記載のキモシンの生産
方法において、該不溶性の形態のキモシン先駆物
質がPH9とPH11.5の間のアルカリ性水溶液の中
で変性され、次いで該溶液のPHを、該キモシン先
駆物質を実際に変性するPH以下に下げることによ
つて該キモシン先駆物質を変性し、よつて可溶性
の自然の形態のキモシン先駆物質を生産すること
を特徴とするキモシンの生産方法。
６ 特許請求の範囲第５項記載のキモシンの生産
方法において、該不溶性の形態のキモシン先駆物
質が該水溶液の中で不溶性である宿主生物からで
きた断片と共に存在すること及び該変性されたキ
モシン先駆物質の１回以上の抽出が実行されるこ
とを特徴とするキモシンの生産方法。
７ 特許請求の範囲第２項記載のキモシンの生産
方法において、該不溶性の形態のキモシン先駆物
質が水溶液の中で変性され、出来た溶液が10−50
倍量のPH９とPH11.5の間のアルカリ性水溶液で希
釈され、そして該溶液のPHを該キモシン先駆物質
を実際に変性するPH以下に下げることによつて該
キモシン先駆物質を復元し、よつて可溶性の自然
の形態のキモシン先駆物質を生産することを特徴
とするキモシンの生産方法。
８ 特許請求の範囲第７項記載のキモシンの生産
方法において、該不溶性の形態のキモシン先駆物
質が、少なくとも7M濃度の尿素を含む水溶液の
中で変性されることを特徴とするキモシンの生産
方法。
９ 特許請求の範囲第７項記載のキモシンの生産
方法において、該不溶性の形態のキモシン先駆物
質が、少なくとも6M濃度のグアニジンハイドロ
クロライドを含む水溶液中で変性されることを特
徴とするキモシンの生産方法。
１０ 特許請求の範囲第１項乃至第９項のいずれ
か１項記載のキモシンの生産方法において、該キ
モシン先駆物質がメチオニン−プロキモシンであ
ることを特徴とするキモシンの生産方法。
１１ 特許請求の範囲第１項乃至第１０項のいず
れか１項記載のキモシンの生産方法において、該
宿主生物がE.coliであることを特徴とするキモシ
ンの生産方法。
技術分野 本発明は、組換えDNAの生物工学を利用する
蛋白質生産分野に関する。特にキモシン先駆物質
の遺伝情報となる遺伝子を含むベクターにより形
質転換された宿主生物により生産された不溶性の
形態のキモシンの先駆物質からキモシンの生産す
る方法に関する。
背景技術 今日、異種の遺伝物質を発現し得る宿主生物の
培養により大量に生産できる市場価値のある蛋白
質の例は多数ある。宿主生物によつて一旦蛋白質
が生産されたときは、該所定の蛋白質を遊離した
状態で得るためには、その宿主生物を何らかの方
法で処理する必要がある。大腸菌（E.coli）内で
のインターフエロンの生成のごとき場合において
は、溶解又は透過処理のみで充分に満足すべき収
量を得るが、幾つかの蛋白質は宿主生物の内部に
不溶性蛋白質集合体の形で生成され、これは溶解
又は透過処理のみによつては抽出されない。例え
ばE.coliの中で生産されたヒトのインシユリン融
合蛋白質は、不溶性蛋白質集合体を形成すること
が報告されている（D.C.ウイリアムズその他，
Science 215巻，687−689頁参照）。正常な生物学
的活性形態（以下自然の形態という）においては
蛋白質はペプチド結合によりつながれたアミノ酸
の鎖として存在している。この鎖は熱力学的に好
適な三次元構造に折り畳まれ、その構造は、水素
結合、疎水性相互作用及び電荷相互作用のごとき
比較的弱い原子間力により維持されている。該ポ
リペプチド鎖の中では多数のＳ−Ｓ共有結合が分
子間架橋を形成している。ある宿主生物により生
産された不溶性蛋白質は、それらの天然の対応物
の有する機能的活性を発揮しないので一般には経
済的製品として殆んど有用性はない。この機能的
活性の欠除は多くの要因によるが、形質転換され
た宿主生物により生産されるこれらの蛋白質は、
それらの自然の対応物の構造とは異る構造として
形成されているようである。かゝる蛋白質の該変
更された三次元構造は、不溶性となるのみならず
該蛋白質の生物学的活性を弱めるか又はなくして
しまう。ある宿主生物により発現された蛋白質が
可溶性か不溶性であるかを予言することは不可能
である。
公告された同時係属中の英国特許出願
GB2100737Aの中で、本出願人は蛋白質分解酵素
キモシンの製造方法を記載している。該方法は、
キモシン先駆物質のポリペプチドであるプリプロ
キモシン、メチオニン−プロキモシン又はメチオ
ニン−キモシンのうちの１つを開裂させることに
関する。これらのポリペプチドは、関連する蛋白
質の遺伝情報となる遺伝子を含むベクターにより
形質転換された宿主生物から発現される。適当な
遺伝子を担うベクターで形質転換された宿主生物
の生産方法は、本出願人の英国特許出願
GB2100737Aの明細書の中に詳細に記載され、か
つその教示はこゝで参照により含める。
キモシンの生産方法に関する我々の作業過程に
おいて、種々異なる宿主生物を使用して生産した
キモシン先駆物質の蛋白質はそれらの自然の形態
では生産されないことを発見した。特に、E.coli
により生産したメチオニン−プロキモシンは殆ん
ど完全に不溶性の集合体であり、サツカロミケ
ス・セレヴイシエ（Saccharomyces cerevisiae）
の中に生産したメチオニン−プロキモシンの約75
％は不溶性の形で生産された。
開裂した活性ある自然のキモシンを形成するよ
うな自然の形態のキモシン先駆物質を生産するた
めには、宿主生物により生産された蛋白質は、蛋
白質の精製及び切断に関する標準技術を用いる前
に、溶解し、かつそれらの自然の形態に転換しな
ければならない。
本発明の開示 本発明によれば、キモシンの生産方法が提供さ
れるが、それでは不溶性の形のキモシン先駆物質
がキモシン先駆物質の遺伝情報となる遺伝子を含
むベクターで形質転換された宿主生物により生産
され、不溶性の形態のキモシン先駆物質は溶解さ
れて、キモシンを生産すべき可溶性キモシン先駆
物質の切断に先立つて可溶性の自然の形態のキモ
シン先駆物質が生産される。
好ましくは、該宿主生物により生産された不溶
性の形態のキモシン先駆物質はプレプロキモシ
ン、又はプレプロキモシン、プロキモシン又はキ
モシンのアミノ酸配列を含む融合蛋白質であり、
例えばメチオニン−プロキモシン又はメチオニン
−キモシンである。メチオニン−プロキモシンは
キモシン先駆物質として好適である。該宿主生物
は、ある宿主生物又はキモシン先駆物質の遺伝情
報となる異種の遺伝物質を含むベクターにより形
質転換された（本出願人の公告された英国特許出
願GB2100737Aに記載の技術を使用して）宿主生
物の子孫であつてよい。該宿主生物は酵母、例え
ばサツカロミケス・セレヴイシエ又は細菌、例え
ばE.coli、B.subtilis、B.stearothermophilis、又
はPseudomonasでよい。Sacchacomyces
cerevisiae又はE.coliは好適な宿主生物である。
キモシン先駆物質であるメチオニン−プロキモ
シンの遺伝情報となる遺伝子を含むベクターによ
り形質転換されたE.coliを有する発現システムは
特に好適である。
こゝに使用する用語“不溶性”とは略々中性の
状態において（例えばPH5.5〜8.5の範囲）略々不
溶性であるか又は宿主生物の細胞の溶解に際し生
産された不溶性物質と不溶化して結びついている
状態にあることを意味する。該不溶性生産物は、
該宿主生物の細胞内で不溶性で比較的高い分子量
の集合体の形態で生産されるか又は単に不溶性細
胞膜物質と結びついている。
自然の形態のキモシン先駆物質を生産するため
には、該宿主生物により生産された不溶性生産物
の構造を変えることが必要である。これは該不溶
性蛋白質を変性することによつてできる。変性
は、蛋白質の三次元形状を維持して折れ曲がらな
いようにしている弱い原子間力をなくす効果を有
する。蛋白質内の隣接原子間の共有結合は、蛋白
質の若干の三次元構造を維持するＳ−Ｓ結合を含
めて影響を受けないまゝである。蛋白質の変性さ
れた状態は、稠密さがより少なくかつ一般に触媒
に対して非活性である。しかしながら、変性状態
は、使用された変性溶液中では通常可溶性であ
る。溶解された蛋白質から変性剤を除去すると、
蛋白質は再び折り曲げが生じて熱力学的に好まし
い自然の状態の蛋白質が生産される。この復元に
は生物学的活性の出現を伴う。
本発明の好適な様相によれば、可溶化には不溶
性形態のキモシン先駆物質の可逆的変性を含み、
次いでキモシン先駆物質を復元せしめ、それによ
り可溶性の形態のキモシン先駆物質を生産する。
好ましくは、不溶性の形態のキモシン先駆物質
は少なくとも、7M濃度の尿素を含む水溶液中で
変性し、かつ該キモシン先駆物質は、次いで溶液
中の尿素濃度を該キモシン先駆物質を変性し得る
濃度以下に下げることによりキモシン先駆物質を
復元して、可溶性の自然の形態のキモシン先駆物
質を生産する。
不溶性のキモシン先駆物質を尿素により処理す
るときは、不溶性のキモシン先駆物質は完全に溶
解される。しかし、蛋白質のダイサルフアイド分
子間架橋は保存され、次いで再折り曲げに対する
核として作用する。例えば透析によつて尿素が除
去されるときは、蛋白質は熱力学的に安定な構造
に戻り、キモシン先駆物質の場合にはこの構造は
公告された英国特許出願GB2100737Aに記載され
た方法により活性キモシンに転換され得る構造で
ある。復元された蛋白質は、自然の蛋白質の溶解
特性を有する。
更に好ましい様相においては、不溶性形態のキ
モシン先駆物質は、少なくとも、6M濃度のグア
ニジンハイドロクロライドを含む水溶液の中で変
性し、次いでキモシン先駆物質は、溶液中のグア
ニジンハイドロクロライドの濃度を、キモシン先
駆物質を変性するため有効な濃度以下に下げるこ
とにより復元されて、可溶性の自然の形態のキモ
シン先駆物質を生成する。
グアニジンハイドロクロライドを使用する物理
的効果は尿素に対して上に論じた如くである。
更に好ましい様相においては、不溶性の形態の
キモシン先駆物質は、PH９とPH11.5の間のアルカ
リ性水溶液の中で変性し、キモシン先駆物質は次
いで溶液のPHをキモシン先駆物質を変性するため
に有効なPH以下に下げることにより、復元され
て、可溶性の自然の形態のキモシン先駆物質を生
産する。好ましくは、アルカリ性水溶液はPH10と
PH11の間のPHである。最も好ましいのは、PHが
10.5から10.9，好ましくは約10.7のPHを有するア
ルカリ性水溶液である。
不溶性キモシン先駆物質抽出物を上記アルカリ
性溶液で処理しても、キモシン先駆物質は完全に
は溶解されない。細胞の断片のごとき不溶性物質
は常に存在するので、多数の集合体が移転する影
響は重要である。アルカリによる多数回の抽出の
方が、抽出量が大量のときであつても、１回の抽
出よりもより効率のよいことが判つた。これはま
た可溶化されたキモシン先駆物質がアルカリと接
触している時間を最小とする利点を有する。これ
は重要である。何故ならば、プロキモシンはアル
カリ性溶液中で徐々に活性を失うという証拠があ
るからである。それ故に、好ましくは本発明はこ
の様相において、不溶性の形態のキモシン先駆物
質は、水溶液に不溶性の宿主生物からできた断片
と共に存在しているため、変性されたキモシン先
駆物質について１回以上の抽出を実施する。使用
する物質が比較的低価格であるために、このアル
カリ可溶化技術は商業的利用の見地から魅力的で
ある。
グアニジンヒドロクロライド又は尿素の如き強
い変性剤中の可溶化及びアルカリを使用する可溶
化の方法は、それぞれ宿主生物からの抽出物中に
ある不溶性キモシン先駆物質のかなりの割合を可
溶化する。しかしながら、その何れも自然のキモ
シン先駆物質の回収については定量的ではない。
その理由は、明瞭には判つて居らず、おそらくこ
れら２種の可溶化に対して異ると考えられる。グ
アニジンヒドロクロライドは存在するすべての物
質を可溶化するが、一部分のみがキモシンへの活
性化をなし得る蛋白質へ転換されるようである。
アルカリ処理は、完全な復元をもたらして自然の
形態のキモシン先駆物質を形成させることができ
ず、加えて不溶性の形態のキモシン先駆物質の全
ては可溶化しない。本発明者達は、該２つの方法
を組合せることにより、自然の状態のキモシン先
駆物質の回収を大幅に増大させることができるこ
とを見出した。
本発明の更に好適な様相によれば、不溶性の形
態のキモシン先駆物質は、水溶液中で変性され、
その結果できた溶液はPH９とPH11.5の間の10から
50倍の容積のアルカリ性水溶液に稀釈し、キモシ
ン先駆物質は、この溶液のPHを、該キモシン先駆
物質を変性し得るPH以下に下げることにより復元
され、可溶性の自然の形態のキモシン先駆物質が
生成する。
該変性されたキモシン先駆物質を含む溶液は、
好ましくは、PH10とPH11の間の、より好ましくは
PH10.5からPH10.9の、更に好ましくは約PH10.7の
アルカリ性水溶液で稀釈する。
該稀釈は、例えば該アルカリ性変性溶液の中和
によつて復元が生じる前に、変性された分子間を
物理的に分離させるという要素をもたらしてい
る。該稀釈及びその結果生じた変性された分子の
物理的分離は、復元を助けるようである。直ぐ上
に記載した可溶化法は、メチオニン−プロキモシ
ンの場合、例えば同じく上に記載した多数回アル
カリ抽出の10から20％と比較して、30％以上の回
収結果となる。
好ましくは、上に記載した組合せ可溶化法にお
いては、不溶性の形態のキモシン先駆物質は、少
なくとも7M濃度の尿素を含む水溶液中か又は少
なくとも6M濃度のグアニジンヒドロクロライド
を含む溶液中で変性される。
本発明は、好ましくは、メチオニン−プロキモ
シンの遺伝情報となる遺伝子を含むベクターによ
り形質転換された宿主生物により生産された不溶
性メチオニン−プロキモシンの可溶化に応用され
る。好ましくは、宿主生物はE.coliとする。
メチオニン−プロキモシンを含む多数のキモシ
ン先駆物質の遺伝情報となる宿主生物の生産方法
は、本出願人による公告された英国特許出願
GB2100737Aに詳細に記載されている。加えてこ
の出願中には、本発明に係る可溶化法により、そ
の自然の形態で生産されたキモシン先駆物質から
活性キモシンを生産する詳細な記載を含んでい
る。
本発明を実施するための最良の形態 本発明を以下実施例について詳細に説明する。
実施例 １ ベクターpCT70により形質転換したE.coli細胞
により生産された不溶性メチオニン−プロキモシ
ンの可溶化が、変性剤として尿素又はグアニジン
ハイドロクロライドを使用して達成された。形質
転換されたE.coli細胞系の生産については、公告
された英国特許出願GB2100737Aに詳細に記載さ
れている。
誘導条件の下で成長した凍結E.colipCT70細胞
を、130μg／mlのリソチームを含む、３倍量の
0.05M tris−HCl ph8，1mMEDTA，0.233M
NaCl，10％グリセリン（ｖ／ｖ）の中に懸濁さ
せ、この懸濁液を４℃で20分間培養した。ナトリ
ウムデオキシコレートを最終濃度が0.05％になる
まで加え、次に10μgの（牛のすい臓からの）
DNAアーゼ１を出発材料のE.coli1gについて加
えた。該溶液を15℃で30分間培養したが、その時
までに溶液の粘度は著しく減少した。等量の
0.01M tris PH８，0.1mM EDTA，５％グリセ
リンを含む溶液を加え、該抽出物を４℃、
10000xgで45分間遠心分離した。この段階ですべ
てのメチオニン−プロキモシン生成物は、多分集
合化又は細胞の断片への結合の結果、実際にペレ
ツト部分中に存在していた。該ペレツトは、50倍
容量の0.01M tris HCl，PH８，0.1M NaCl，
1mM EDTAの中で４℃で洗滌した。更に上述の
如く遠心分離を行つた後、上澄液を棄て、そして
該ペレツトを室温で、8Mの尿素又は6Mのグアニ
ジンハイドロクロライド，0.05M tris.HCl PH
８，1mM EDTA及び0.1M、NaClを含む緩衝液
中で急速に溶解した。次に、それを終夜４℃で
200倍容量の0.01M tris.HClPH８，1mM EDTA，
0.1M NaCl及び10％グリセリンを使用して透析
した。重い沈澱が形成され（不溶性のE.coli蛋白
質）、これを遠心分離によつて除去すると、自然
のメチオニン−プロキモシン蛋白質の溶液が残つ
た。この可溶性メチオニン−プロキモシンは触媒
を用いて酸性化／中性化により活性化キモシンに
転換することができた。これは本質的に英国特許
出願GB2100737Aに記載したところである。
実施例 ２ ベクターpCT70により形質転換したE.coli細胞
により生産された不溶性メチオニン−プロキモシ
ンの可溶化が、、アルカリ性変性を使用して達成
された。形質転換されたE.coli細胞系の生産は公
告された英国特許出願GB2100737Aに詳細に記載
されている。
誘導条件のもとで成長した凍結E.coli／pCT70
細胞を23μg／mlのPMSF及び130μg／mlのリソチ
ームを含む、３倍重量の0.05Mtris−HCl PH８，
1mM EDTA，0.1M NaClの溶液中に懸濁中に
懸濁させ、この懸濁液を４℃で20分間培養した。
ナトリウムデオキシコレートを最終濃度が0.5％
になるまで加え、次に10μgの（牛のすい臓から
の）DNAアーゼ１を出発材料のE.coli1gついて
加えた。該溶液を15℃で30分間培養したが、その
時までに溶液の粘度は著しく減少した。上記の如
くして得た抽出物を４℃，10000xgで45分間遠心
分離した。この段階で、すべてのメチオニン−プ
ロキモシン生成物は、多分集合化又は細胞の断片
との結合の結果、不溶の形態でペレツト部分中に
存在していた。該ペレツトは、３倍量の0.01M
tris−HClPH８，0.1M NaCl，1mM EDTAの溶
液中で４℃で洗滌した。更に上述の如く遠心分離
を行つた後、上澄液を棄て、そして該ペレツトを
３倍量のアルカリ性抽出緩衝液：
0.05MK2HPO4，1mM EDTA，0.1M NaCl，PH
10.7の中で再度懸濁させ、該懸濁液を水酸化ナト
リウムによりPH10.7に調整した。該懸濁液を少な
くとも１時間（16時間まで）４℃で放置し、上澄
液のPHは濃縮HClを添加することにより8.0に調
整し、上述の如く遠心分離した。該ペレツト中に
最初存在したメチオニン−プロキモシンの実質的
な割合をあらわすメチオニン−プロキモシンは、
可溶の形態で上澄液の中に存在することが発見さ
れ、これは触媒を用いた酸性化／中性化の活性化
処理により、活性化キモシンに転換することがで
きた。この処理方法は、公告された英国特許出願
GB2100737Aに詳細に記載されている。
更に述べると、第１回のアルカリ性抽出の後に
残つた断片の再抽出により等量のプロキモシンが
離れる。アルカリ性抽出は、各抽出で略々等しい
数のプロキモシンを遊離させながら４〜５回繰り
返し行つてもよい。
実施例 ３ ベクターpCT70により形質転換したE.coli細胞
により生産されたメチオニン−プロキモシンの可
溶化は、グアニジンハイドロクロライドによる変
性を行い、次いでこれをアルカリ性溶液中で稀釈
することにより達成された。この形質転換された
細胞系の生産は、公告された英国特許出願
GB2100737Aに詳細に記載されている。
不溶性メチオニン−プロキモシンを含むE.
colipCT70細胞断片は、上の実施例１において記
載した如く調製、洗滌し、そして次の操作を室温
で行つた。該細胞断片は、３−５培量の最終濃度
が6M グアニジン HCl／0.05M tris PH８，
1mM EDTA，0.1m NaClの緩衝液中で溶解し、
30分から２時間放置した。この混合物は、グアニ
ジンHClを含まない10−50倍量のPH10.7の上記緩
衝液中で稀釈した。稀釈は、撹拌されている稀釈
液中へ10−30分間にわたつて該サンプルを徐々に
添加することにより行つた。この稀釈された混合
物は、1M NaOHの添加によりPH10.7に再び調整
し、10分から２時間放置した。次に、このPHを
1N HClの添加により８に調整し、そしてこの混
合物を、沈澱した蛋白質を除去するため、上述の
如く遠心分離する前に、更に30分間放置した。か
くして、調製された上澄液は、可溶性メチオニン
−プロキモシンを含んで居り、これは酸性化及び
中性化により触媒に活性なキモシンに転換するこ
とができ、公告された英国特許出願GB2100737A
に記載の如く精製した。非常によく似た実施例に
おいては、8Mの尿素緩衝液を上述の6Mのグアニ
ジンHCl緩衝液の代りに使用した。結果は上に記
載した如くであつた。
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