JPH0472519B2 - - Google Patents
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- JPH0472519B2 JPH0472519B2 JP60055711A JP5571185A JPH0472519B2 JP H0472519 B2 JPH0472519 B2 JP H0472519B2 JP 60055711 A JP60055711 A JP 60055711A JP 5571185 A JP5571185 A JP 5571185A JP H0472519 B2 JPH0472519 B2 JP H0472519B2
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Description
〔発明の背景〕
(1) 発明の分野
本発明は、酸化性物質（オキシダント）特に過
酸化水素との接触によつて光学的信号を生ずる光
学的指示薬化合物に関し、その製造及び使用方法
に関する。特に、本発明は、過酸化水素に対する
蛍光原性指示薬並びに診断用検査法などの、測定
されるべき析分象物に反応して起きる過酸化水素
の生成及び検出に基づく分析方法中におけるその
使用に関する。 (2) 先行技術の説明 多くの分析方法において、最終的検出物質とし
て酸化性物質を測定することが必要とされてい
る。測定される被分析物は、それ自体がそのよう
なオキシダントであるか又は、分析対象物が、測
定可能なオキシダントを生成するかもしくは分壊
する化学的、生化学的、免疫学的あるいは類似の
反応に関与している。これらのオキシダントに
は、過酸化水素、オゾン、過ヨウ素酸塩、過酸及
び超酸化物（Superoxide）がある。 特に、酸化性酵素の活性は、臨床診断方法にお
けるその有用性の故に、分析化学及び生化学にお
いて重要である。より一般に研究されている酸化
性酵素の中に、グルコースオキシダーゼ、キサン
チンオキシダーゼ及びコレステロールオキシダー
ゼ等の、過酸化水素を生ずるオキシダーゼがあ
る。一般に、そのような酵素がそれらの基質に作
用することによつて生じる過酸化水素は、通常、
ペルオキシダーゼの存在下、様々な種類の光学的
指示薬との酸化還元反応によつて測定される。過
酸化水素を測定する為の最も感度の良い手段の一
つは、過酸化水素とのペルオキシダーゼに触媒さ
れた反応により蛍光性を有する生成物を生じる蛍
光原性のペルオキシダーゼ基質の使用によるもの
である。 文献においては、蛍光原性のペルオキシダーゼ
基質の例は比較的少い。文献中に報告されたその
ような指示薬の中にはホモバニリン酸、３−（ｐ
−ヒドロキシフエニル）プロピオン酸、４−アミ
ノ−1H−１，５−ベンゾジアゼピン−３−カル
ボニトリル及びジアセチルジクロロフルオレセイ
ン〔K.財津及びY.大倉よる「Anal.Biochem.」
109：109（1980）、エイチ．コロデイ（H.
Corrodi）及びビー．バイデイニス（B.
Weidinius）による「Acta Chem.Scand」19：
1854（1965）、ワイ．オカモト（Y.Okamoto）等
による「Chem.Pharm.Bull.」28：2325（1980）、
エイ．エス．ケストン（A.S.Keston）及びアー
ル．ブランド（R.Brandt）により「Anal.
Biochem.」11：１（1965）及び米国特許第
4269938号〕がある。過酸化水素の蛍光分析法に
よる測定は、酸化されて非蛍光性生成物になる蛍
光性化合物６−メトキシ−７−ヒドロキシ−１，
２−ベンゾピロンを用いること〔W.A.Andreae，
「Nature」175：859（1955）〕により、そして水素
供与体とＯ−アルキル化−７−ヒドロキシクマリ
ン類との間のカツプリング反応を利用すること
〔欧州特許出願第82101947号〕によつても達成さ
れてきた。 出願者らによつて出願中の米国特許出願第
475200（1983年３月14日出願）は、過酸化水素な
どのオキシダントに反応する光学的指示薬のカル
コゲン（セレン化物又は硫化物）化合物に関して
いる。酸化により、その結果生じる中間体は、同
時に、カルコゲン残基の脱離を起こし、蛍光性な
どの光学的信号を生じる信号化合物を生じる。好
ましい指示薬は、３−カルコゲン−３，４−ジヒ
ドロクマリン類及び３−カルコゲン−３，４−ジ
ヒドロ−２−キノロン類である。 〔発明の概要〕 本発明は、過酸化水素に対して反応する、新規
な一群の蛍光性指示薬化合物及びペルオキシダー
ゼなどの過酸化活性物質を含む試料中の過酸化水
素測定用組成物を提供するもである。 本発明の実質的に非蛍光性の化合物は、過酸化
活性物質の存在下、過酸化水素による酸化によ
り、強い蛍光性を有する反応生成物を生じる。従
つて、本発明は、過酸化水素の検出用、及び対象
となる被分析物の存在による機能として、過酸化
水素が生成もしくは消費される分析法用の高感度
の指示薬を提供する。 本発明に用いられる化合物は、一般式 （式中、Ｚは 式
酸化水素との接触によつて光学的信号を生ずる光
学的指示薬化合物に関し、その製造及び使用方法
に関する。特に、本発明は、過酸化水素に対する
蛍光原性指示薬並びに診断用検査法などの、測定
されるべき析分象物に反応して起きる過酸化水素
の生成及び検出に基づく分析方法中におけるその
使用に関する。 (2) 先行技術の説明 多くの分析方法において、最終的検出物質とし
て酸化性物質を測定することが必要とされてい
る。測定される被分析物は、それ自体がそのよう
なオキシダントであるか又は、分析対象物が、測
定可能なオキシダントを生成するかもしくは分壊
する化学的、生化学的、免疫学的あるいは類似の
反応に関与している。これらのオキシダントに
は、過酸化水素、オゾン、過ヨウ素酸塩、過酸及
び超酸化物（Superoxide）がある。 特に、酸化性酵素の活性は、臨床診断方法にお
けるその有用性の故に、分析化学及び生化学にお
いて重要である。より一般に研究されている酸化
性酵素の中に、グルコースオキシダーゼ、キサン
チンオキシダーゼ及びコレステロールオキシダー
ゼ等の、過酸化水素を生ずるオキシダーゼがあ
る。一般に、そのような酵素がそれらの基質に作
用することによつて生じる過酸化水素は、通常、
ペルオキシダーゼの存在下、様々な種類の光学的
指示薬との酸化還元反応によつて測定される。過
酸化水素を測定する為の最も感度の良い手段の一
つは、過酸化水素とのペルオキシダーゼに触媒さ
れた反応により蛍光性を有する生成物を生じる蛍
光原性のペルオキシダーゼ基質の使用によるもの
である。 文献においては、蛍光原性のペルオキシダーゼ
基質の例は比較的少い。文献中に報告されたその
ような指示薬の中にはホモバニリン酸、３−（ｐ
−ヒドロキシフエニル）プロピオン酸、４−アミ
ノ−1H−１，５−ベンゾジアゼピン−３−カル
ボニトリル及びジアセチルジクロロフルオレセイ
ン〔K.財津及びY.大倉よる「Anal.Biochem.」
109：109（1980）、エイチ．コロデイ（H.
Corrodi）及びビー．バイデイニス（B.
Weidinius）による「Acta Chem.Scand」19：
1854（1965）、ワイ．オカモト（Y.Okamoto）等
による「Chem.Pharm.Bull.」28：2325（1980）、
エイ．エス．ケストン（A.S.Keston）及びアー
ル．ブランド（R.Brandt）により「Anal.
Biochem.」11：１（1965）及び米国特許第
4269938号〕がある。過酸化水素の蛍光分析法に
よる測定は、酸化されて非蛍光性生成物になる蛍
光性化合物６−メトキシ−７−ヒドロキシ−１，
２−ベンゾピロンを用いること〔W.A.Andreae，
「Nature」175：859（1955）〕により、そして水素
供与体とＯ−アルキル化−７−ヒドロキシクマリ
ン類との間のカツプリング反応を利用すること
〔欧州特許出願第82101947号〕によつても達成さ
れてきた。 出願者らによつて出願中の米国特許出願第
475200（1983年３月14日出願）は、過酸化水素な
どのオキシダントに反応する光学的指示薬のカル
コゲン（セレン化物又は硫化物）化合物に関して
いる。酸化により、その結果生じる中間体は、同
時に、カルコゲン残基の脱離を起こし、蛍光性な
どの光学的信号を生じる信号化合物を生じる。好
ましい指示薬は、３−カルコゲン−３，４−ジヒ
ドロクマリン類及び３−カルコゲン−３，４−ジ
ヒドロ−２−キノロン類である。 〔発明の概要〕 本発明は、過酸化水素に対して反応する、新規
な一群の蛍光性指示薬化合物及びペルオキシダー
ゼなどの過酸化活性物質を含む試料中の過酸化水
素測定用組成物を提供するもである。 本発明の実質的に非蛍光性の化合物は、過酸化
活性物質の存在下、過酸化水素による酸化によ
り、強い蛍光性を有する反応生成物を生じる。従
つて、本発明は、過酸化水素の検出用、及び対象
となる被分析物の存在による機能として、過酸化
水素が生成もしくは消費される分析法用の高感度
の指示薬を提供する。 本発明に用いられる化合物は、一般式 （式中、Ｚは 式
【式】又は式
本明細書中の使用においては、「アルキル」は、
通常は、「低級アルキル」であつて、例えば、メ
チル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ
−ブチル、イソブチル、第三ブチル、ｎ−ヘキシ
ル等を含む。 一般的に、本発明の蛍光原性指示薬化合物は、
実質的に蛍光性を有しないか又は、過酸化水素に
よる酸化の蛍光性キノリン及びクマリン生成物(B)
とは実質的に異る蛍光性（例えば、励起及び／又
は発スペクトル）を有することを特徴とする。過
酸化的酸化に関係のある特殊な分析法におけるそ
の有用性に関して、式(B)の一般構造を有する蛍光
性キノロン類及びクマリン類を選択し、次に選択
されたキノロンもしくはクマリンを変性せしめ、
又は合成経路を考案して、第１図の３，４−ジヒ
ドロ−誘導(A)を製造することができる。本発明の
ジヒドロ化合物を得るには、主として二つの経路
がある。第１のものは、炭素−炭素の二重結合を
単結合するために発蛍光体(B)の直接的化学変性を
必要とし、第２のものは、非蛍光性化合物からの
ジヒドロ化合物の合成を必要としている。 さて、過酸化水素用の好ましい蛍光原性指示薬
並びにその製造法及び使用法を個別的に叙述する
ことにより本発明を説明する。そのような指示薬
は、式〔Ａ〕の構造を有している。そのとき、Ｙ
が＝０であると、その化合物は、クマリン誘導体
であり、Ｙが＝Ｎ−R5であると、２−キノロン
誘導体である。 特に好ましい指示薬は、式： （式中、R3及びR4は低級アルキルである）に
よつて表わされる７−ジアルキルアミノ−２−キ
ノロン類であり、対応する公知のキノロン類〔西
独国特許公開公報第2363459号（German OLS
2363459）〕を、水素化ホウ素ナトリウムを用いる
などにより還元することにより製造することがで
きる。R5置換基を有する環窒素は、必要に応じ
て、水素化ナトリウム、次にハロゲン化アルキル
によりアルキル化し、還元して、Ｎ−置換ジヒド
ロキノロン類を製造することができる。R5は、
水素原子又は低級アルキル、特にメチルであるこ
とが好ましい。 R1置換基は、適当に出発キノロンを選択する
ことにより、既に記載した原子団の範囲内で広く
変化し得る。 R1が−COOR6，−CONHR6もしくは−CON
（R6）2 （この時、R6は水素原子又はアルキルを表わ
す） であるジヒドロキノロン類は、式： （式中、R7はアルキルであり、好ましくは低
級アルキル（第３図参照）である）によつて表わ
される桂皮酸ジエステル類から製造することがで
きる。 そのような桂皮酸ジエステル類は、４−ジ置換
−アミノ−２−ニトロベンズアルデヒド（西独国
特許第2363458号）と適当なマロン酸ジアルキル
を反応させることにより、製造することができ
る。桂皮酸ジエステル(D)中の２重結合は、水素化
ホウ素ナトリウムを用いる等により、還元し、次
に、触媒的に水素添加して窒素官能価を減じてア
ニリン中間体とし（第３図の化合物(5)参照）、こ
れが環化して３−位に−COOR7置換基（式(C)中
のR1置換基）を有するジヒドロキノロンを生成
する。R1（すなわちCOOR7）置換基は、次に多様
な公知の法により変性せしめ、R1が−COOH，−
CONHR6又は−CON（R6）2であるジヒドロキノ
ロン類(C)を得ることができる。例えば、エステル
(C)（R1＝COOR7）を、けん化し、カルボン酸又
は塩を生ぜしめることができ、これを次に適当な
アミンと縮合せしめて、ジヒドロキノロン類(C)
（R1はCONHR6又はCON（R6）2）を製造すること
ができる。 蛍光原性クマリン指示薬(A)（Ｙは酸素、かつ
R2はヒドロキシル）すなわち、ウンベリフエロ
ン誘導体は、適当な７−ヒドロキシクマリン〔ブ
イ．エス．カマト（V.S.Kamat）等著「Tett.
Lett.」23：154（1982）〕の３，４−二重結合を還
元することにより製造することができ、式： で示される指示薬化合物を得ることができる。こ
の化合物は、過酸化水素による酸化によつて、既
に記載したように、３，４二重結合の再導入によ
り式： の蛍光性クマリン類を生じる。 R1置換基は、既に記載した原子団の範囲内で、
広く変化し得る。多様な３−置換クマリン類「式
(F)中、R1はCN，COOC2H5，COCH3，C6H5，
CONH2等〕が公知であり、〔W.R.シヤーマン及
びイー．ロビンズ（E.Robins）著「Anal.
Chem.」40：803（1968）〕又は天然に植物中に存
在する〔アール．シー．エルダーフイールド
（R.C.Elder−field）編集「ヘテロサイクリツク
コンパウンズ（Heterocyclic Compounds）」第
２巻、214−216頁、シヨンウイリーアンドサンズ
社（John Wiley＆Sons）（ニユーヨーク1951）〕。
多くのそのような天然に存在するクマリン類は、
ベンゼン環に置換基を有し、他のものは、合成に
よつて作られている〔ジエイ．アイ．デグロー
（J.I.DeGrow）等著「J.Mmd.Chem.」11：375
（1968）；ジエイ．バネルジ（J.Banerji）等「J.
Chem.Soc.」C3：3992（1971）；及びエム．バンド
パドキアイ（M.Bndo pad kyay）等著「Indian
J.Chem」12：295（1974）〕。 Ｙが酸素であり、R2が−NR3R4であるものに
ついては、蛍光原性指示薬(A)は、適当な７−アミ
ノクマリンの還元により製造して、式： の７−アミノ−３，４−ジヒドロクマリン類を製
造することができる（R3及びR4が水素である指
示薬は、７−アミノ又は、７−ニトロクマリン類
の接触水素添加により得ることができる）。７−
アルキルアミノ又はジアルキルアミノ−３，４−
ジヒドロクマリン類が必要とされている場合、そ
れらは７−アミノジヒドロクマリンのＮ−アルキ
ル化又は７−アミノジヒドロクマリンのシツフ塩
基の接触水素添加により製造することができる。
あるいはまた、Ｎ−アルキルアミノクマリンは適
当な３−アルキルアミノフエノール又は３−ジア
ルキルアミノフエノールを出発物質として用い、
下記の方法により製造することができる。過酸化
水素による酸化によつて作られる蛍光性のある物
質は式： を有する。 ３−置換−７−アミノクマリン類は、４−アミ
ノ−２−ヒドロキシ又は２−Ｏ−保護ベンズアル
デヒド類〔ダブリユー．イー．ソロダール（W.
E.Solodar）等著「J.Org.Chem.」23：103
（1958）；イー．ブロフト（E.Profft）等著
「Arch.Pharm.」300：１（1967）；又はシツフ塩基
〔エイ．エイ．ゴールドベルグ（A.A.Goldberg）
等著「J.Chem.Soc.」2641（1954）；エイチ．イチ
バガセ（H.IChibagase）「J.Pharm.Soc.Jap」
75：1477（1955）；西独国特許第1293160号（1964
年）、C.W.シエルハンマー（C.W.Shell−
hammer）、K.W.ミユーラー（K.W.Mueller）、
R.レイン（R.Rane）〕をアシル酢酸エステル類又
はマロン酸エステル類を用いてクネーフエナーゲ
ル縮合することにより得ることができる。Ｏ−保
護の場合、環化が起きるには脱保護化が必要であ
る。 Ｙが＝NR8，R2がヒドロキシルである蛍光原
性指示薬(A)、即ち、２−キノロン誘導体は、上記
のようにキノロン類又は桂皮酸エステル類によ
り、又は式： によつて表わされる適当な７−ヒドロキシル−
３，４−ジヒドロ−２−キノロン類〔エヌ．シゲ
マツ（N.Shigematsu）、「Chem.Pharm.Bull.」
９：970（1961）〕から製造することができる。上
記ヒドロキシル基は、その２−テトラヒドロピラ
ニルエーテル〔第５図の化合物(13)参照〕に転換す
るなどの適当な方法で保護される。次に保護され
たキノロンは、必要に応じて、適当な置換又は非
置換ハロゲン化アルキル並びに水酸化ナトリウム
などの塩基を用いて処理するなどにより、Ｎ−ア
ルキル化することができる〔上記、エヌ．シゲマ
ツ（N.Shigematsu）〕。過酸化水素による酸化に
よつて作られる蛍光性を有する物質は、式 によつて表わされる。R1置換基は、既に記載さ
れた原子団の範囲内で広く変化させることができ
る。上記ラクタムを強い塩基を用いて、次に炭酸
ジエチルなどのアシル化剤を用いて反応させるこ
とにより、３−エトキシカルボニル置換基を導入
し、それをさらに、上記の様々な３−置換ジヒド
ロキノロン類に合成することができる。また、７
−ヒドロキシル基は、７−（低級アルキル）アミ
ノ置換基より置換することができ、様々な誘導体
が知られている〔上記エヌ．シゲマツ（N.
Shigemasu）；エイチ．ベーダ（H.Veda）及び
ゼツド．エイチ．ヤン（Z.H.Yan）著、「J.
Jaiwan Pharmaceat.Assoc」１：88（1949）；ワ
イ．タムラ（Y.Tamura）等著、「Chem.Ind.」
（ロンドン）1975，922；そして、ジー．エス．シ
ドヒユー（G.S.Sidhu）等著「アナレン
（Annalen）627：224（1959）参照〕。 第１図の式(A)に関しては、本発明の蛍光原性指
示薬の一般構造を示しながら、R1置換基は本発
明の独創的特徴を離れることなく、広く変化する
ことができる。R1置換基は、一般に、水素原子
又は電子吸引基である。電子吸引基は、非置換の
場合に関して、誘起又は共鳴効果（ジエイ．マー
チ（J.March）著「アドバーンスト オーガニツ
ク ケミストリー：リアクシヨンズ、メカニズム
アンドストラクチヤー（Advanced Organic
Chemistry：Reactions，mechanisms，and
Structure）228頁 マグローヒル社（ニユーヨー
ク））により、Ｃ−３陽子の酸性度を増加する基
であるものとし、シアノ、カルボキシル、カルボ
アルコキシ、カルボキサミド、によつて代表され
る。カルボキシルエステル類は、主として、カル
ボメトキシ、エトキシカルボニル等などのアルキ
ルエステル類であり、カルボキサミドは、Ｎ−ア
ルキルカルボキサミド類（例えば、Ｎ−エチルカ
ルボキサミド、Ｎ−ブチルカルボキサミド）など
の置換基アミド類を含む。R1は、式−COOR6、−
CONHR6又は−CON（R6）2（このとき、R6は水素
原子、又はアルキルである）で表わされるものが
好ましい。３−置換キノロン類及びクマリン類に
関し、上に挙げられた幾つかの引例と、オランダ
国特許出願第6603985号及び6604766号並びに西独
国特許公開公報第2502588号も参照されたい。 本発明は、診断の分野の分析方法において使用
する為の特に優れた過酸化水素反応性を有する指
示薬を提供するものである。最終的に過酸化水素
の測定に基く診断上の検査方法が数多く知られて
いる。例えば、特異的オキシダーゼ（例えば、グ
ルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダー
ゼ、コレステローオキシダーゼ、ウリカーゼ）の
作用に基いた、グルコース、ガラクトース、コレ
ステロール及び尿酸などの様々の分析対象物の測
定法がある。同様に分析対象物が酵素的にもしく
は非酵素的に反応して、生成物を生じ、その生成
物が、次に、１以上の酵素的なあるいは非酵素的
な段階において反応して最終的に過酸化水素を生
成する酵素学的検査方法がある。 さらに、本発明の指示薬は、過酸化水素の発生
によつて検知可能となる標識化物質が用いられ
る、免疫検定法などの特殊な結合分析法にも用い
ることができる。そのような結合分析法には、標
識が、オキシダーゼ酵素であるか又はある物質を
生成し、その物質が次に酵素と関係してもしくは
関係せず反応して過酸化水素を生成する酵素であ
るような結合分析法が含まれる。そのような方法
の例としては、米国特許第3654090号及び第
3817837号などの文献に記載されている不均質及
び均質酵素標識免疫検定法がある。あるいはま
た、標識は基質、抑制因子、補酵素、又、そのよ
うな酵素に対する補欠分子族であつてもよく、そ
れは、米国特許第4279992号、第4238565号、第
4134792号及び第4273866号並びに英国特許明細書
第1552607号に記載されている。 本発明の指示薬化合物を用いて測定される過酸
化水素を含している検査試料又は反応混合物は当
該分野で公知の過酸化活性物質にも接触させるこ
とが好ましい。ワサビダイコンペルオキシダー
ゼ、もしくはジヤガイモペルオキシダーゼなどの
植物性ペルオキシダーゼを用いることができる。
ペルオキシダーゼ活性を有する無機化合物には、
ヨウ化ナトリウム及びヨウ化アンモニウムなどの
ヨウ化物並びにモリブデン酸塩がある。さらに、
ウロヘミン並びに他の幾つかのペルオキシダーゼ
活性を有するポルフイリン物質も用いることがで
きる。 本発明を、以下の実施例により説明するが、本
発明は、これのみに限定されるものではない。 参考例 蛍光原性キノロン及びクマリン指示薬化合物の
製造 （ ）の中の斜字体の数字は、第３〜６図中の
図で示した構造式をさし、実施例の末尾の表中に
使用されている。 エチル−α−エトキシカルボニル−４−ジメチ
ルアミノ−２−ニトロ桂皮酸塩(1) トルエン400ミリリツトル中の４−ジメチルア
ミノ−２−ニトロベンズアルデヒド〔エイチ．バ
ウマン（H.Bawnann）等、西独国特許第
2363458号〕8.9g（50ミリモル）マロン酸ジメチル
23.7g（148ミリモル）、ピペリジン3.44g（40.4ミリ
モル）及び酢酸2.43g（40.4ミリモル）の混合物
を、付属のデイーンスタークトラツプ（Dean
Stark trap）を用いて、アルゴン下で16時間還
流した。溶液は、室温まで冷却し、水酸化カリウ
ム（KOH）５％水溶液200ミリリツトルを用いて
洗浄した。有機相を分離し、硫酸ナトリウム
（Na2SO4）上で乾燥し、過し、溶媒を蒸発さ
せた。暗赤色の固体残留物を、塩化メチレン
（CH2Cl2）40ミリリツトル中に溶解し、ヘキサン
100ミリリツトルを加えた。１時間放置した後、
溶液を過してオレンジ色の結晶10.4gを得た。
CH2Cl2−ヘキサンからの再結晶化により、分析
用試料（融点：101〜102℃）を生成した。 分析：計算値：C16H20N2O6：Ｃ，57，14；Ｈ，
5.99；Ｎ，8.33 実測値：Ｃ，57.65；Ｈ，6.12；Ｎ，8.34 1H NMR（CDCl3）δ：8.08（ｓ，1H）；7.3−
7.5（m.2H）； 6.84（dd，Ｊ＝３，８Hz，1H）； 4.34（ｑ，Ｊ＝８，2H）；4.23 （ｑ，Ｊ＝８，2H）；3.10（ｓ，
6H）； 1.27（ｑ，Ｊ＝８，6H）． エチル−α−エトキシカルボニル−４−メチ
ルアミノ−２−ニトロ桂皮酸塩(2) 桂皮酸エステル(1)（5.0g，14.8ミリモル）を酢
酸100ミリリツトル中に溶解し、四酢酸鉛7.6g
（17.2ミリモル）を加えた。混合物を室温で１時
間撹拌した後に、溶媒を除去した。トルエン
（100ミリリツトル）を加えてスラリーを濃縮し、
次にクロロホルム（CHCl3）100ミリリツトルを
加え、固形物を完全に粉砕し、溶液をデカント
（傾しや）した。クロロホルム（100ミリリツト
ル）を固形物に加え、混合物を簡単に還流し、
過し、液を前記のCHCl3溶液と混合した。その
有機溶液を濃縮した後、残留物にシリカゲル
350g上でクロマトグラフイを行いアセトンと
CHCl3（容積比：１：19）を用いて溶出した。第
83〜第140分画（15ミリリツトル／分画）を混合
し、濃縮し、これをCH2Cl2（3.45g72％）により
結晶化して生成物（融点：113〜114℃）を得た。 分析：計算値：C15H18N2O6：Ｃ，55，90；Ｈ，
5.63；Ｎ，8.69 実測値：Ｃ，55.57；Ｈ，5.78；Ｎ，
8.59. 1H NMR（CDCl3）δ：8.00（ｓ，1H）；7.33（d.
J＝10，1H）；
7.25（ｄ，Ｊ＝
４，1H）； 6.73（dd，Ｊ＝４，10，1H）； 480（broad ｑ，1H）；4.30 （ｍ，4H）；2.90（ｄ，Ｊ＝５，
3H）； 1.30（ｑ，Ｊ＝８，6H）． エチル−α−エトキシカルボニル−４−メチル
アミノ−２−ニトロジヒドロ桂皮酸塩(4) 水素化ホウ素ナトリウム（NaBH4）（0.2g，
5.8ミリモル）を無水エタノール100ミリリツトル
中の桂皮酸エステル(2)（3.4g，10.5ミリモル）の
スラリーに加え、反応混合物を室温で1.5時間撹
拌した。酢酸（0.5ミリリツトル）を加え、混合
物を濃縮した。残留物を、CHCl3250ミリリツト
ル中で溶解し、重炭酸ナトリウム（NaHCO3）
の飽和溶液100ミリリツトル、そしてH2O（100ミ
リリツトル）を用いて洗浄した。有機相を分離
し、乾燥し（Na2SO4）濃縮してオレンジ色の固
形物3.1gを生成した。分析用試料をメタノール
（MeOH）−水からの結晶化によつて得た。融点
75〜77℃。 分析：計算値：C15H20N2O6：Ｃ，55，55；Ｈ，
6.21；Ｈ，8.64 実測値：Ｃ，55.34；Ｈ，6.08；Ｈ，
8.45. 1H NMR（CDCl3）δ：7.2（ｍ，2H）；6.70（dd.
J＝４，９，
1H）；4.13（ｑ，
Ｊ＝７，4H）；
3.95−3.20（ｍ，
3H）；2.86（ｄ，
Ｊ＝５，3H）；
1.20（ｔ，Ｊ＝
7.6H）． ７−ジメチルアミノ−３−エトキシカルボニル
−３，４−ジヒドロ−２−キノロン(5) 無水エタノール（EtOH）100ミリリツトル中
の桂皮酸エステル(1)5.0g（14.8ミリモル）のスラ
リーに、NaBH4の0.34g（9.2ミリモル）を加え
た。混合物を室温で2.5時間撹拌し、次に、氷酢
酸（AcOH）１ミリリツトルを加え、溶媒を減圧
下で除去した。残留物をCHCl3250ミリリツトル
中に溶解し、飽和NaHCO3溶液100ミリリツトル
を用いて洗浄した。H2O100ミリリツトルを用い
て洗浄後、有機相を乾燥（Na2SO4）し、過
し、溶媒を減圧下で蒸発させて、粗製ジヒドロ桂
皮酸塩(3)4.86gを暗赤色の油状物質として生成し
た。ジオキサン（50ミリリツトル）を加え、溶液
を濃縮した。油状の残留物をジオキサン50ミリリ
ツトル中に溶解し、10％パラジウム−炭素0.5gを
加えた。混合物を水素ガス（H2）の50psi圧力
下、50℃で6.5時間振とうした。反応混合物が室
温まで冷却した後で、触媒をケイソウ土（セライ
ト；；米国、コロライド州デンバーのシヨンズ−
マンビル（Johns−Manville）社製）により過
することによつて除去し、溶媒を容積25ミリリツ
トルまで濃縮した。ジエチルエーテル（５ミリリ
ツトル）を加え、溶液を一晩放置した。過によ
り生成物2.3gを白色の固形物として生成した。融
点：181〜182℃。 分析：計算値：C14H18N2O3：Ｃ，64.10；Ｈ，
6.91；Ｎ，10.68 実測値：Ｃ，64.45；Ｈ，6.87；Ｎ，
11.11. ７−メチルアミノ−３−エトキシカルボニル−
３，４−ジヒドロ−２−キノロン(6) ジエステル(4)2.6g、木炭上の10％Pd及びジオ
キサン75ミリリツトルを水素の50psi圧力下、50
℃、17時間振とうした。触媒をセライトで過す
ることにより除去し、溶媒を除去した。残留物に
シリカゲル200g上でクロマトグラフイを行い、
アセトンとCH2Cl2（容積比：３：17）を用いて溶
出した。第75〜第120分画（17ミリリツトル／分
画）を混合し、濃縮して白色の粉末0.5gを得た。
MeOH−H2Oからの再結晶化により、分析用試
料（融点、171〜172℃）を製造した。 分析：計算値：C13H16N2O3：Ｃ，62，89；Ｈ，
6.50；Ｎ，11.28. 実測値：Ｃ，63.03；Ｈ，6.62；Ｎ，
11.54. 1H NMR（D6DMSO）δ：10.10（ｓ，1H）；
6.86（d.J＝８，
1H）；６，86
（ｄ，Ｊ＝８，
1H）；6.10（ｍ，
2H）；5.57
（broad ｑ，
1H）；4.07（ｑ，
Ｊ＝７，2H）；
3.49（ｔ，Ｊ＝
８，1H）；2.95
（ｄ，Ｊ＝８，
2H）；2.60（ｄ，
Ｊ＝５，3H）；
1.15（ｔ，Ｊ＝
７，3H）． ７−ジメチルアミノ−３−カルボキシ−３，４
−ジヒドロ−２−キノロンカリウム塩(7) 無水エタノール55ミリリツトル中のエチルエス
テル1.43g（5.45ミリモル）のスラリーに、水を溶
かしたKOH16ミリリツトル（8.3ミリモル）を加
えた。混合物をアルゴン下室温で、24時間撹拌し
た。反応物を過し、カリウム塩(7)（融点：193
〜195℃）1.3g（84％）を得た。 分析：計算値：C12H13N2O3K・３／4H2O：
Ｃ，50.44；Ｈ，5.11；Ｎ，
9.80. 実測値：Ｃ，50.54；Ｈ，5.46；Ｈ，
9.82. ７−ジメチルアミノ−３−（Ｎ−エチルカルボ
キサミド）−３，４−ジヒドロ−２−キノロン
(8) 乾燥ジメチルホルムアミド（DMF）45ミリリ
ツトル中の前段階のカルボキシレート塩(7)1.3g
（4.8ミリモル）のスラリーを、氷浴中で５℃に冷
却し、イソブチルクロロホルム塩0.72g（0.68ミリ
リツトル、5.2ミリモル）を３分間かけて一滴ず
つ加えた。反応混合物を放置して室温にもどし15
分間撹拌した。次に、DMF15ミリリツトル中の、
前もつて蒸留し、水酸化ナトリウム（NaOH）
上に保存したエチルアミン６ミリリツトルを急速
に加えた。２時間攪拌した後、溶液を濃縮し、残
留物にシリカゲル150g上でクロマトグラフイを
行い、CH3OHとCH2Cl2（容積比：１：19）を用
いて溶出した。第45〜第75分画（12ミリリツト
ル／分画）は、アミド(8)を含有しており、このア
ミドをジエチルエーテル−ヘキサンから結晶化
し、白色の固形物0.2g（融点：216−28℃）を得
た。 分析：計算値：C14H19O2N3：Ｃ，64.35；Ｈ，
7.33；Ｎ，16.08. 実測値：Ｃ，64.97；Ｈ，7.78；Ｎ，
16.24. 1HMR1δ：8.10（broad ｓ，1H）；7.60（broad，
1H）；7.05（ｄ，Ｊ＝９，1H）；7.05
（ｄ，Ｊ＝９，1H）；6.33（dd，Ｊ＝
４，９，1H）；6.07（ｄ，Ｊ＝４，
1H）；3.60−3.20（ｍ，5H）；2.90（ｓ，
6H）；1.13（ｔ，Ｊ＝７，3H）． ７−ジメチルアミノ−３−（Ｎ−エチルカルボ
キサミド）−２−キノロン(9) 桂皮酸エステル(1)1.0g（3.0ミリモル）、無水
EtOH40ミリリツトル、H2O1ミリリツトル、濃
塩酸（HCl）0.4ミリリツトル及び鉄屑
（ironFilings）1.5g（26.9mg−atom）の混合物を
激しく撹拌しながらアルゴン下、2.5時間還流し
た。さらに鉄屑1.7g（30.4mg−atom）を加え、３
時間加熱を続けた。混合物を熱過し、液を蒸
発させた。残留物を2.55Mメタノール性HCl50ミ
リリツトル中に溶解し、室温で20分間放置した。
次に、溶媒を蒸発させ、残留物をCHCl3150ミリ
リツトル及び飽和NaHCO3溶液50ミリリツトル
に分配した。有機相を噴離し、水性相をCHCl375
ミリリツトルを用いて洗浄した。有機相を混合
し、乾燥し（NaSO4）過し、濃縮して、暗褐
色の固形物0.49gを得た。水性相をイソブタノー
ル120ミリリツトルを用いて抽出し、それを乾燥
し（Na2SO4）、過し、留去して、さらに0.08g
を製造した。２つの残留物を混合し、MeOH30
ミリリツトル中でスラリー化し、エチルアミン
（EtNH2）70％−水（H2O）30％の10ミリリツト
ルを加えた。混合物を室温で３目間撹拌し、次
に、ステンレススチール製のボンベ中に置き、
100℃で６時間加熱した。溶媒を蒸発させてから、
残留物にシリカゲル75g上でクロマトグラフイを
行いCH2Cl2とMeOH（容積比：19：１）を用いて
溶出した。 第25〜第34分画（ミリリツトル／分画）を混合
し、濃縮して体積７ミリリツトルとした。過に
より、黄色の針状結晶0.19g（融点：299〜300℃）
を得た。 分析：計算値：C14H17N3O2：Ｃ，74.85；Ｈ，
6.61；Ｎ，16.20. 実測値：Ｃ，74，84；Ｈ，6.74；Ｎ，
16.19. 1NMR（CDCl3）δ：7.53（ｄ，Ｊ＝９，1H）；
6.60（dd，Ｊ＝４，９，
1H）；6.40（broad ｍ，
1H）′；3.53（ｍ，
2H）；3.10（ｓ，6H）；
1.25（ｔ，Ｊ＝７，3H）． ７−ジメチルアミノ−３−（Ｎ−エチルカルボ
キサミド）−１−メチル−２−キノロン(10) 水素化ナトリウム（10mg、0.2ミリモル）の50
％油分散液をヘキサンを用いて２回洗浄し、ジオ
キサン１ミリリツトルを加えた。スラリーに、ジ
オキサン／DMF（１：１）の混合物２ミリリツト
ル中のキノロン(9)50mg（0.2ミリモル）を加えた。
混合物を室温で30分間撹拌し、次に、ヨードメタ
ン0.56g（４ミリモル）を急速に加えた。溶液を30
分間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、残留物を
CHCl350ミリリツトル中に溶解した。溶液を
H2O30ミリリツトルを用いて、洗浄し、有機相
を乾相し（Na2SO4）、過し、留去した。生成
物の沈殿が生じ、残留物をCHCl3の５ミリリツト
ル中に溶解し、ジエチルエーテル20ミリリツトル
を用いて、すりつぶした。過により、黄色の固
形物（融点：248−250℃）32mgを製造した。エタ
ノールからの再結晶化により、黄色の針状結晶
（融点：252−253℃）を得た。 分析：計算値：C154H21N3O2：Ｃ，75.09；Ｈ，
7.00；Ｎ，15.37. 実測値：Ｃ，75，08；Ｈ，6.93；Ｎ，
15.31. 1NMR（CDCl3）δ：8.40（ｓ，1H）；7.58（ｄ，
Ｊ＝９，1H）；6.68（dd，
Ｊ＝４，９，1H）；6.23
（ｓ，3H）；３，２−3.7
（ｍ，2H）；3.13（ｓ，
6H）；1.26（ｔ，Ｊ＝８，
3H）． ７−ジメチルアミノ−３−（Ｎ−エチルカル
ボキサミド）−３，４−ジヒドロ−１−メチル
−２−キノロン(11) 前段階の２−キノロン(10)0.3g（1.15ミリモル）
及び無水EtOH25ミリリツトル中のNaBH40.1g
（2.6ミリモル）の混合物を24時間撹拌した。さら
にNaBH40.1gを加え、反応混合物を室温で一晩
撹拌した。再び、NaBH40.1gを加え、反応混合
物を70℃で24時間加熱した。次に、NaBH40.3g
を加え、24時間加熱を続けた。溶媒を蒸発させ、
残留物にシリカゲル100g上でクロマトグラフイ
を行い、MeOHとCH2Cl2（容積比：2.5％）を用
いて溶出した。第55〜第85分画（12ミリリツト
ル／分画）を混合し、濃縮して、淡い黄色の固形
物（融点：105−107℃）でシヒドロキノロン
0.14gを得た。 分析： 1NMR（CDCl3）δ7.10（ｄ，Ｊ＝８，
1H）；6.33（ｓ，1H）；3.40（ｓ，3H）；3.24
（ｍ，5H）；２，97（ｓ，6H）；1.18（ｔ，
Ｊ＝８，3H）． ７−ヒドロキシ−３−エトキシカルボニル−
３，４−ジヒドロ−１−メチル−２−キノロン
(16) 乾燥ジオキサン８ミリリツトル中の７−ヒドロ
キシ−３，４−ジヒドロ−２−キノロン(12)（エ
ヌ．シゲマツ（N.Shigematsu）．「Chem.Pharm.
Ball」９：970（1961年）〕のスラリーに、ジヒド
ロピラン８ミリリツトル及びｐ−トルエンスルホ
ン酸５mgを加えた。反応混合物を不活性ガス雰囲
気下、90分間撹拌し、次にH2O150ミリリツトル
を用いて希釈した。エーテルの50ミリリツトル分
量の３分量を用いて、それを抽出し、抽出物を混
合して無水炭酸カリウム（K2CO3）上で乾燥し
た。過及び蒸発により、油状粉質2gを得、ヘ
キサンを用いてすりつぶし、結晶化した。それを
乾燥し、２−テトラヒドロピラニルエーテル(13)
（融点：129〜131℃）の白色の結晶1.18g（78％）
を得た。 トルエン50ミリリツトル及びH2O1ミリリツト
ル中のNaOH1gの溶液４ミリリツトルの混合物
中の(13)の2.47g（10ミリモル）及びベンジルトリエ
チルアンモニウムクロリド228mgのスラリーを不
活性雰囲気下、室温で撹拌した。ヨウ化メチル
（1.26ミリリツトル ミリモル）を加え、反応混
合物を急速に47℃（油浴）で20時間撹拌した。次
に、CHCl3の250ミリリツトル分量を用いて希釈
した。CHCl3抽出物をトルエン相と混合し、乾燥
し、留去した。油状残留物をヘキサンから結晶化
し、白色の固形物（融点：53−55℃）として(14)を
2.56g（93％）得た。 乾燥テトラヒドロフラン（THF）２ミリリツ
トル中の新しく蒸留したイソプロピルシクロヘキ
シルアミン0.315ミリリツトルの溶液を25ミリリ
ツトルフラスコ中に入れた。同様のアミン0.315
ミリリツトルを５ミリリツトルフラスコ中の
THF1.5ミリリツトルに溶解することにより、第
二の溶液を製造した。両方の溶液を、不活性雰囲
気下撹拌しながら−78℃まで冷却し、ｎ−ブチル
リチウムの1.6Mヘキサン溶液の1.2ミリリツトル
を1.5分に亘り注入器から１滴ずつ反応させ、リ
チウムイソプロピルシクロヘキシルアミドを生成
した。第一の溶液には、THFの１ミリリツトル
中の(14)500mgを６分間に亘り、一滴ずつ加えた。
反応混合物は、−78℃で５分間に亘り撹拌し、次
にTHF0.5ミリリツトル中の炭酸ジエチル0.12ミ
リリツトルの溶液を、注入器により10分間に亘り
一滴ずつ加えた。さらに３分間経過の後、リチウ
ムイソプロピルシクロヘキシルアミドの第二の溶
液を加え、次に炭酸ジエチルをさらに0.12ミリリ
ツトル加えた。−78℃で20分間経過の後に、反応
混合物を室温まで加熱し、10分間撹拌し、次に
H2O2ミリリツトル中の酢酸0.2ミリリツトルを用
いて中和した。反応混合物をH2O100ミリリツト
ルとエーテル35ミリリツトルに分配した。エーテ
ル相を分離し、乾燥し、過し、留去し、そして
残留物を高真空下で乾燥し、黄色の油状物質を得
た。それにシリカゲル60g上で、クロマトグラフ
イを行い、CH2Cl2とEtOH（容積比29：１）を用
いて溶出し、９ミリリツトル分画を集めた。第29
〜第51分画を混合し、留去し、透明な淡黄色油状
物質でエステル(15)の548mg（収率86％）を得た。 AcOHとH2O（容積比：３：１）中のテトラヒ
ドロピラニルエーテル(15)の溶液を室温で17時間撹
拌した。混合物を濃縮し、トルエン10ミリリツト
ルを加え、次に留去して、白色の固形物（融点：
121〜123℃）を得た。 分析：計算値：C13H15NO3：Ｃ，62.64；Ｈ，
6.07；Ｎ，5.62. 実測値：Ｃ，62，98；Ｈ，6.25；Ｎ，
5.27. 1NMR（CDCl3）δ：7.45（droad，1H）；7.05
（ｄ，Ｊ＝８，1H）；
6.67（ｓ，1H）；6.57
（dd，Ｊ＝２，８，
1H）；4.20（ｔ，Ｊ＝７，
2H）；3.40（ｓ，3H）；
3.8−3.0（ｍ，3H）；1.20
（ｑ，Ｊ＝７，3H）． 〔２，３，６，７，９，10〕−ヘクサヒドロ−
10−エトキシカルボニル−11−オキソ−1H，
5H，11H−〔１〕ベンゾピラン〔６，７，８−
ij〕キノリジン(17) クマリン314（イースマンオーガニツクケミカル
ズ社（Eastman Organic Chemicals）製、
0.1g）、10％Pd／C0.05g及び酢酸25ミリリツトル
の混合物を水素50psi圧力及び温度50℃下に置き、
24時間振とうした。触媒をセライトにより過す
ることにより除去し、溶液を濃縮した。褐色の残
留物にシリカゲル40g上でクロマトグラフイを行
い、アセトンとメチレンクロリド（容積比：１：
19）を用いて溶出した。第３〜第17分画（15ミリ
リツトル／分画）を混合し、真空下で濃縮した。
生成物をメチレンクロリド−ヘキサンから結晶化
し、白色の針状物質（融点141−143℃）0.03gを
得た。 分析：計算値：C18H21O4N：Ｃ，68.61；Ｈ，
6.71；Ｎ，4.44. 実測値：Ｃ，68.25；Ｈ，6.96；Ｎ，
4.49. 第６図に示した一般式の化合物は、R1が水素
原子、シアノ又は−COOR6，−CONHR6もしく
は、−CON（R6）2（このとき、R6は水素原子、アル
キルである）であり、かつＹがＯ又はＮ−R5（こ
のときR5は水素又は低級アルキルである）であ
るものに関して、適当な出発クマリン又は２−キ
ノロンを選択することにより製造することができ
る。 ７−ジメチルアミノ−３，４−ジヒドロ−２−
キノロン MeOH40ミリリツトル中の７−ジメチルアミ
ノ−２−キノロン〔エイ．ライス（A.Rice）
「Ann.Chim.」48：958−996（1958年）〕1.0g（5.7ミ
リモル）の溶液に、マグネシウム1.3g（5.7ミリモ
ル）を加えた。反応混合物を、蒸気浴で、ゆるや
かに温め、次に、室温で２時間撹拌した。次に酢
酸（８ミリリツトル）を加え、溶液を過した。
液を濃縮し残留物にシリカゲル220g上でクロ
マトグラフイを行い、CH2Cl2とMeOH（容積比：
97.5：2.5）を用いて溶出した。第50〜第60分画
（12ミリリツトル／分画）を混合し、濃縮して、
白色の固形物（融点：154〜156℃）のジヒドロキ
ノロン0.14gを得た。 分析： 1HNMR（CDCl3）δ：7.00（ｄ，Ｊ＝
８，1H）；6.40（dd，Ｊ＝2.8，1H；6.13
（ｄ，Ｊ＝２，1H）；2.93（ｓ，6H）；2.73
（ｍ，4H）． 実施例 過酸化水素の検出 下記の表に列挙したジヒドロキノロン類及びジ
ヒドロクマリン類の燐酸ナトリウム緩衝液
（1.0μM.PH7.0又は7.5）を、適当な化合物のエタ
ノール又はDMF−エタノール溶液の緩衝液を用
いて、次々に希釈することにより製造した。溶液
を37℃浴中で温め、次に、１mg／ミリリツトルの
ワサビダイコンペルオキシダーゼ酵素の40マイク
ロリツトルを１度に加えた。キユベツト中の内容
物を混合し、蛍光性を少くとも50秒間（水晶セル
及びその内容物は37℃に一定に保つた）監視し
た。次に、冷水中に希釈し８時間より短い時間０
℃に保存した過酸化水素の１定量を、ジヒドロキ
ノロン対ペルオキシダーゼの所望の比に適した分
量加えた。次に蛍性を600秒間に亘り監視した。
化合物(5)，(6)，(7)，(11)，(16)及び(17)に蛍光性の
値
は、研究の対象物と同様の蛍光出力を達成するの
に必要となるであろう蛍光性の基準となる７−ヒ
ドロキシ−３−（Ｎ−エチルカルボキサミド）ク
マリン（米国特許第4273715号）の濃度（nM）
の単位で報告した。化合物(8)は、光子／秒で報告
されている。全てのスリツト幅は、２ナノメータ
ー（nm）に設定した。 蛍光性は、SLM8000分光蛍光計（米国、イリ
ノイ州、ウルバナのSLMインスツルメンツ社
SLMInstruments，Inc.）製）にかけ、水晶セル
中で測定した。スペクトルを処理する為にヒユー
レツト−パツカード（Hewlett−Packard
8915A）8915Aコンピユーターを使用した。 結果を表１に示し、本発明の化合物が過酸化水
素の存在に対して有用な蛍光反応を示すことを実
証する。 上記の本発明の他の変種や変型を、本発明の精
神及び範囲を離れることなく、数多く製造できる
ことは明らかである。
通常は、「低級アルキル」であつて、例えば、メ
チル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ
−ブチル、イソブチル、第三ブチル、ｎ−ヘキシ
ル等を含む。 一般的に、本発明の蛍光原性指示薬化合物は、
実質的に蛍光性を有しないか又は、過酸化水素に
よる酸化の蛍光性キノリン及びクマリン生成物(B)
とは実質的に異る蛍光性（例えば、励起及び／又
は発スペクトル）を有することを特徴とする。過
酸化的酸化に関係のある特殊な分析法におけるそ
の有用性に関して、式(B)の一般構造を有する蛍光
性キノロン類及びクマリン類を選択し、次に選択
されたキノロンもしくはクマリンを変性せしめ、
又は合成経路を考案して、第１図の３，４−ジヒ
ドロ−誘導(A)を製造することができる。本発明の
ジヒドロ化合物を得るには、主として二つの経路
がある。第１のものは、炭素−炭素の二重結合を
単結合するために発蛍光体(B)の直接的化学変性を
必要とし、第２のものは、非蛍光性化合物からの
ジヒドロ化合物の合成を必要としている。 さて、過酸化水素用の好ましい蛍光原性指示薬
並びにその製造法及び使用法を個別的に叙述する
ことにより本発明を説明する。そのような指示薬
は、式〔Ａ〕の構造を有している。そのとき、Ｙ
が＝０であると、その化合物は、クマリン誘導体
であり、Ｙが＝Ｎ−R5であると、２−キノロン
誘導体である。 特に好ましい指示薬は、式： （式中、R3及びR4は低級アルキルである）に
よつて表わされる７−ジアルキルアミノ−２−キ
ノロン類であり、対応する公知のキノロン類〔西
独国特許公開公報第2363459号（German OLS
2363459）〕を、水素化ホウ素ナトリウムを用いる
などにより還元することにより製造することがで
きる。R5置換基を有する環窒素は、必要に応じ
て、水素化ナトリウム、次にハロゲン化アルキル
によりアルキル化し、還元して、Ｎ−置換ジヒド
ロキノロン類を製造することができる。R5は、
水素原子又は低級アルキル、特にメチルであるこ
とが好ましい。 R1置換基は、適当に出発キノロンを選択する
ことにより、既に記載した原子団の範囲内で広く
変化し得る。 R1が−COOR6，−CONHR6もしくは−CON
（R6）2 （この時、R6は水素原子又はアルキルを表わ
す） であるジヒドロキノロン類は、式： （式中、R7はアルキルであり、好ましくは低
級アルキル（第３図参照）である）によつて表わ
される桂皮酸ジエステル類から製造することがで
きる。 そのような桂皮酸ジエステル類は、４−ジ置換
−アミノ−２−ニトロベンズアルデヒド（西独国
特許第2363458号）と適当なマロン酸ジアルキル
を反応させることにより、製造することができ
る。桂皮酸ジエステル(D)中の２重結合は、水素化
ホウ素ナトリウムを用いる等により、還元し、次
に、触媒的に水素添加して窒素官能価を減じてア
ニリン中間体とし（第３図の化合物(5)参照）、こ
れが環化して３−位に−COOR7置換基（式(C)中
のR1置換基）を有するジヒドロキノロンを生成
する。R1（すなわちCOOR7）置換基は、次に多様
な公知の法により変性せしめ、R1が−COOH，−
CONHR6又は−CON（R6）2であるジヒドロキノ
ロン類(C)を得ることができる。例えば、エステル
(C)（R1＝COOR7）を、けん化し、カルボン酸又
は塩を生ぜしめることができ、これを次に適当な
アミンと縮合せしめて、ジヒドロキノロン類(C)
（R1はCONHR6又はCON（R6）2）を製造すること
ができる。 蛍光原性クマリン指示薬(A)（Ｙは酸素、かつ
R2はヒドロキシル）すなわち、ウンベリフエロ
ン誘導体は、適当な７−ヒドロキシクマリン〔ブ
イ．エス．カマト（V.S.Kamat）等著「Tett.
Lett.」23：154（1982）〕の３，４−二重結合を還
元することにより製造することができ、式： で示される指示薬化合物を得ることができる。こ
の化合物は、過酸化水素による酸化によつて、既
に記載したように、３，４二重結合の再導入によ
り式： の蛍光性クマリン類を生じる。 R1置換基は、既に記載した原子団の範囲内で、
広く変化し得る。多様な３−置換クマリン類「式
(F)中、R1はCN，COOC2H5，COCH3，C6H5，
CONH2等〕が公知であり、〔W.R.シヤーマン及
びイー．ロビンズ（E.Robins）著「Anal.
Chem.」40：803（1968）〕又は天然に植物中に存
在する〔アール．シー．エルダーフイールド
（R.C.Elder−field）編集「ヘテロサイクリツク
コンパウンズ（Heterocyclic Compounds）」第
２巻、214−216頁、シヨンウイリーアンドサンズ
社（John Wiley＆Sons）（ニユーヨーク1951）〕。
多くのそのような天然に存在するクマリン類は、
ベンゼン環に置換基を有し、他のものは、合成に
よつて作られている〔ジエイ．アイ．デグロー
（J.I.DeGrow）等著「J.Mmd.Chem.」11：375
（1968）；ジエイ．バネルジ（J.Banerji）等「J.
Chem.Soc.」C3：3992（1971）；及びエム．バンド
パドキアイ（M.Bndo pad kyay）等著「Indian
J.Chem」12：295（1974）〕。 Ｙが酸素であり、R2が−NR3R4であるものに
ついては、蛍光原性指示薬(A)は、適当な７−アミ
ノクマリンの還元により製造して、式： の７−アミノ−３，４−ジヒドロクマリン類を製
造することができる（R3及びR4が水素である指
示薬は、７−アミノ又は、７−ニトロクマリン類
の接触水素添加により得ることができる）。７−
アルキルアミノ又はジアルキルアミノ−３，４−
ジヒドロクマリン類が必要とされている場合、そ
れらは７−アミノジヒドロクマリンのＮ−アルキ
ル化又は７−アミノジヒドロクマリンのシツフ塩
基の接触水素添加により製造することができる。
あるいはまた、Ｎ−アルキルアミノクマリンは適
当な３−アルキルアミノフエノール又は３−ジア
ルキルアミノフエノールを出発物質として用い、
下記の方法により製造することができる。過酸化
水素による酸化によつて作られる蛍光性のある物
質は式： を有する。 ３−置換−７−アミノクマリン類は、４−アミ
ノ−２−ヒドロキシ又は２−Ｏ−保護ベンズアル
デヒド類〔ダブリユー．イー．ソロダール（W.
E.Solodar）等著「J.Org.Chem.」23：103
（1958）；イー．ブロフト（E.Profft）等著
「Arch.Pharm.」300：１（1967）；又はシツフ塩基
〔エイ．エイ．ゴールドベルグ（A.A.Goldberg）
等著「J.Chem.Soc.」2641（1954）；エイチ．イチ
バガセ（H.IChibagase）「J.Pharm.Soc.Jap」
75：1477（1955）；西独国特許第1293160号（1964
年）、C.W.シエルハンマー（C.W.Shell−
hammer）、K.W.ミユーラー（K.W.Mueller）、
R.レイン（R.Rane）〕をアシル酢酸エステル類又
はマロン酸エステル類を用いてクネーフエナーゲ
ル縮合することにより得ることができる。Ｏ−保
護の場合、環化が起きるには脱保護化が必要であ
る。 Ｙが＝NR8，R2がヒドロキシルである蛍光原
性指示薬(A)、即ち、２−キノロン誘導体は、上記
のようにキノロン類又は桂皮酸エステル類によ
り、又は式： によつて表わされる適当な７−ヒドロキシル−
３，４−ジヒドロ−２−キノロン類〔エヌ．シゲ
マツ（N.Shigematsu）、「Chem.Pharm.Bull.」
９：970（1961）〕から製造することができる。上
記ヒドロキシル基は、その２−テトラヒドロピラ
ニルエーテル〔第５図の化合物(13)参照〕に転換す
るなどの適当な方法で保護される。次に保護され
たキノロンは、必要に応じて、適当な置換又は非
置換ハロゲン化アルキル並びに水酸化ナトリウム
などの塩基を用いて処理するなどにより、Ｎ−ア
ルキル化することができる〔上記、エヌ．シゲマ
ツ（N.Shigematsu）〕。過酸化水素による酸化に
よつて作られる蛍光性を有する物質は、式 によつて表わされる。R1置換基は、既に記載さ
れた原子団の範囲内で広く変化させることができ
る。上記ラクタムを強い塩基を用いて、次に炭酸
ジエチルなどのアシル化剤を用いて反応させるこ
とにより、３−エトキシカルボニル置換基を導入
し、それをさらに、上記の様々な３−置換ジヒド
ロキノロン類に合成することができる。また、７
−ヒドロキシル基は、７−（低級アルキル）アミ
ノ置換基より置換することができ、様々な誘導体
が知られている〔上記エヌ．シゲマツ（N.
Shigemasu）；エイチ．ベーダ（H.Veda）及び
ゼツド．エイチ．ヤン（Z.H.Yan）著、「J.
Jaiwan Pharmaceat.Assoc」１：88（1949）；ワ
イ．タムラ（Y.Tamura）等著、「Chem.Ind.」
（ロンドン）1975，922；そして、ジー．エス．シ
ドヒユー（G.S.Sidhu）等著「アナレン
（Annalen）627：224（1959）参照〕。 第１図の式(A)に関しては、本発明の蛍光原性指
示薬の一般構造を示しながら、R1置換基は本発
明の独創的特徴を離れることなく、広く変化する
ことができる。R1置換基は、一般に、水素原子
又は電子吸引基である。電子吸引基は、非置換の
場合に関して、誘起又は共鳴効果（ジエイ．マー
チ（J.March）著「アドバーンスト オーガニツ
ク ケミストリー：リアクシヨンズ、メカニズム
アンドストラクチヤー（Advanced Organic
Chemistry：Reactions，mechanisms，and
Structure）228頁 マグローヒル社（ニユーヨー
ク））により、Ｃ−３陽子の酸性度を増加する基
であるものとし、シアノ、カルボキシル、カルボ
アルコキシ、カルボキサミド、によつて代表され
る。カルボキシルエステル類は、主として、カル
ボメトキシ、エトキシカルボニル等などのアルキ
ルエステル類であり、カルボキサミドは、Ｎ−ア
ルキルカルボキサミド類（例えば、Ｎ−エチルカ
ルボキサミド、Ｎ−ブチルカルボキサミド）など
の置換基アミド類を含む。R1は、式−COOR6、−
CONHR6又は−CON（R6）2（このとき、R6は水素
原子、又はアルキルである）で表わされるものが
好ましい。３−置換キノロン類及びクマリン類に
関し、上に挙げられた幾つかの引例と、オランダ
国特許出願第6603985号及び6604766号並びに西独
国特許公開公報第2502588号も参照されたい。 本発明は、診断の分野の分析方法において使用
する為の特に優れた過酸化水素反応性を有する指
示薬を提供するものである。最終的に過酸化水素
の測定に基く診断上の検査方法が数多く知られて
いる。例えば、特異的オキシダーゼ（例えば、グ
ルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダー
ゼ、コレステローオキシダーゼ、ウリカーゼ）の
作用に基いた、グルコース、ガラクトース、コレ
ステロール及び尿酸などの様々の分析対象物の測
定法がある。同様に分析対象物が酵素的にもしく
は非酵素的に反応して、生成物を生じ、その生成
物が、次に、１以上の酵素的なあるいは非酵素的
な段階において反応して最終的に過酸化水素を生
成する酵素学的検査方法がある。 さらに、本発明の指示薬は、過酸化水素の発生
によつて検知可能となる標識化物質が用いられ
る、免疫検定法などの特殊な結合分析法にも用い
ることができる。そのような結合分析法には、標
識が、オキシダーゼ酵素であるか又はある物質を
生成し、その物質が次に酵素と関係してもしくは
関係せず反応して過酸化水素を生成する酵素であ
るような結合分析法が含まれる。そのような方法
の例としては、米国特許第3654090号及び第
3817837号などの文献に記載されている不均質及
び均質酵素標識免疫検定法がある。あるいはま
た、標識は基質、抑制因子、補酵素、又、そのよ
うな酵素に対する補欠分子族であつてもよく、そ
れは、米国特許第4279992号、第4238565号、第
4134792号及び第4273866号並びに英国特許明細書
第1552607号に記載されている。 本発明の指示薬化合物を用いて測定される過酸
化水素を含している検査試料又は反応混合物は当
該分野で公知の過酸化活性物質にも接触させるこ
とが好ましい。ワサビダイコンペルオキシダー
ゼ、もしくはジヤガイモペルオキシダーゼなどの
植物性ペルオキシダーゼを用いることができる。
ペルオキシダーゼ活性を有する無機化合物には、
ヨウ化ナトリウム及びヨウ化アンモニウムなどの
ヨウ化物並びにモリブデン酸塩がある。さらに、
ウロヘミン並びに他の幾つかのペルオキシダーゼ
活性を有するポルフイリン物質も用いることがで
きる。 本発明を、以下の実施例により説明するが、本
発明は、これのみに限定されるものではない。 参考例 蛍光原性キノロン及びクマリン指示薬化合物の
製造 （ ）の中の斜字体の数字は、第３〜６図中の
図で示した構造式をさし、実施例の末尾の表中に
使用されている。 エチル−α−エトキシカルボニル−４−ジメチ
ルアミノ−２−ニトロ桂皮酸塩(1) トルエン400ミリリツトル中の４−ジメチルア
ミノ−２−ニトロベンズアルデヒド〔エイチ．バ
ウマン（H.Bawnann）等、西独国特許第
2363458号〕8.9g（50ミリモル）マロン酸ジメチル
23.7g（148ミリモル）、ピペリジン3.44g（40.4ミリ
モル）及び酢酸2.43g（40.4ミリモル）の混合物
を、付属のデイーンスタークトラツプ（Dean
Stark trap）を用いて、アルゴン下で16時間還
流した。溶液は、室温まで冷却し、水酸化カリウ
ム（KOH）５％水溶液200ミリリツトルを用いて
洗浄した。有機相を分離し、硫酸ナトリウム
（Na2SO4）上で乾燥し、過し、溶媒を蒸発さ
せた。暗赤色の固体残留物を、塩化メチレン
（CH2Cl2）40ミリリツトル中に溶解し、ヘキサン
100ミリリツトルを加えた。１時間放置した後、
溶液を過してオレンジ色の結晶10.4gを得た。
CH2Cl2−ヘキサンからの再結晶化により、分析
用試料（融点：101〜102℃）を生成した。 分析：計算値：C16H20N2O6：Ｃ，57，14；Ｈ，
5.99；Ｎ，8.33 実測値：Ｃ，57.65；Ｈ，6.12；Ｎ，8.34 1H NMR（CDCl3）δ：8.08（ｓ，1H）；7.3−
7.5（m.2H）； 6.84（dd，Ｊ＝３，８Hz，1H）； 4.34（ｑ，Ｊ＝８，2H）；4.23 （ｑ，Ｊ＝８，2H）；3.10（ｓ，
6H）； 1.27（ｑ，Ｊ＝８，6H）． エチル−α−エトキシカルボニル−４−メチ
ルアミノ−２−ニトロ桂皮酸塩(2) 桂皮酸エステル(1)（5.0g，14.8ミリモル）を酢
酸100ミリリツトル中に溶解し、四酢酸鉛7.6g
（17.2ミリモル）を加えた。混合物を室温で１時
間撹拌した後に、溶媒を除去した。トルエン
（100ミリリツトル）を加えてスラリーを濃縮し、
次にクロロホルム（CHCl3）100ミリリツトルを
加え、固形物を完全に粉砕し、溶液をデカント
（傾しや）した。クロロホルム（100ミリリツト
ル）を固形物に加え、混合物を簡単に還流し、
過し、液を前記のCHCl3溶液と混合した。その
有機溶液を濃縮した後、残留物にシリカゲル
350g上でクロマトグラフイを行いアセトンと
CHCl3（容積比：１：19）を用いて溶出した。第
83〜第140分画（15ミリリツトル／分画）を混合
し、濃縮し、これをCH2Cl2（3.45g72％）により
結晶化して生成物（融点：113〜114℃）を得た。 分析：計算値：C15H18N2O6：Ｃ，55，90；Ｈ，
5.63；Ｎ，8.69 実測値：Ｃ，55.57；Ｈ，5.78；Ｎ，
8.59. 1H NMR（CDCl3）δ：8.00（ｓ，1H）；7.33（d.
J＝10，1H）；
7.25（ｄ，Ｊ＝
４，1H）； 6.73（dd，Ｊ＝４，10，1H）； 480（broad ｑ，1H）；4.30 （ｍ，4H）；2.90（ｄ，Ｊ＝５，
3H）； 1.30（ｑ，Ｊ＝８，6H）． エチル−α−エトキシカルボニル−４−メチル
アミノ−２−ニトロジヒドロ桂皮酸塩(4) 水素化ホウ素ナトリウム（NaBH4）（0.2g，
5.8ミリモル）を無水エタノール100ミリリツトル
中の桂皮酸エステル(2)（3.4g，10.5ミリモル）の
スラリーに加え、反応混合物を室温で1.5時間撹
拌した。酢酸（0.5ミリリツトル）を加え、混合
物を濃縮した。残留物を、CHCl3250ミリリツト
ル中で溶解し、重炭酸ナトリウム（NaHCO3）
の飽和溶液100ミリリツトル、そしてH2O（100ミ
リリツトル）を用いて洗浄した。有機相を分離
し、乾燥し（Na2SO4）濃縮してオレンジ色の固
形物3.1gを生成した。分析用試料をメタノール
（MeOH）−水からの結晶化によつて得た。融点
75〜77℃。 分析：計算値：C15H20N2O6：Ｃ，55，55；Ｈ，
6.21；Ｈ，8.64 実測値：Ｃ，55.34；Ｈ，6.08；Ｈ，
8.45. 1H NMR（CDCl3）δ：7.2（ｍ，2H）；6.70（dd.
J＝４，９，
1H）；4.13（ｑ，
Ｊ＝７，4H）；
3.95−3.20（ｍ，
3H）；2.86（ｄ，
Ｊ＝５，3H）；
1.20（ｔ，Ｊ＝
7.6H）． ７−ジメチルアミノ−３−エトキシカルボニル
−３，４−ジヒドロ−２−キノロン(5) 無水エタノール（EtOH）100ミリリツトル中
の桂皮酸エステル(1)5.0g（14.8ミリモル）のスラ
リーに、NaBH4の0.34g（9.2ミリモル）を加え
た。混合物を室温で2.5時間撹拌し、次に、氷酢
酸（AcOH）１ミリリツトルを加え、溶媒を減圧
下で除去した。残留物をCHCl3250ミリリツトル
中に溶解し、飽和NaHCO3溶液100ミリリツトル
を用いて洗浄した。H2O100ミリリツトルを用い
て洗浄後、有機相を乾燥（Na2SO4）し、過
し、溶媒を減圧下で蒸発させて、粗製ジヒドロ桂
皮酸塩(3)4.86gを暗赤色の油状物質として生成し
た。ジオキサン（50ミリリツトル）を加え、溶液
を濃縮した。油状の残留物をジオキサン50ミリリ
ツトル中に溶解し、10％パラジウム−炭素0.5gを
加えた。混合物を水素ガス（H2）の50psi圧力
下、50℃で6.5時間振とうした。反応混合物が室
温まで冷却した後で、触媒をケイソウ土（セライ
ト；；米国、コロライド州デンバーのシヨンズ−
マンビル（Johns−Manville）社製）により過
することによつて除去し、溶媒を容積25ミリリツ
トルまで濃縮した。ジエチルエーテル（５ミリリ
ツトル）を加え、溶液を一晩放置した。過によ
り生成物2.3gを白色の固形物として生成した。融
点：181〜182℃。 分析：計算値：C14H18N2O3：Ｃ，64.10；Ｈ，
6.91；Ｎ，10.68 実測値：Ｃ，64.45；Ｈ，6.87；Ｎ，
11.11. ７−メチルアミノ−３−エトキシカルボニル−
３，４−ジヒドロ−２−キノロン(6) ジエステル(4)2.6g、木炭上の10％Pd及びジオ
キサン75ミリリツトルを水素の50psi圧力下、50
℃、17時間振とうした。触媒をセライトで過す
ることにより除去し、溶媒を除去した。残留物に
シリカゲル200g上でクロマトグラフイを行い、
アセトンとCH2Cl2（容積比：３：17）を用いて溶
出した。第75〜第120分画（17ミリリツトル／分
画）を混合し、濃縮して白色の粉末0.5gを得た。
MeOH−H2Oからの再結晶化により、分析用試
料（融点、171〜172℃）を製造した。 分析：計算値：C13H16N2O3：Ｃ，62，89；Ｈ，
6.50；Ｎ，11.28. 実測値：Ｃ，63.03；Ｈ，6.62；Ｎ，
11.54. 1H NMR（D6DMSO）δ：10.10（ｓ，1H）；
6.86（d.J＝８，
1H）；６，86
（ｄ，Ｊ＝８，
1H）；6.10（ｍ，
2H）；5.57
（broad ｑ，
1H）；4.07（ｑ，
Ｊ＝７，2H）；
3.49（ｔ，Ｊ＝
８，1H）；2.95
（ｄ，Ｊ＝８，
2H）；2.60（ｄ，
Ｊ＝５，3H）；
1.15（ｔ，Ｊ＝
７，3H）． ７−ジメチルアミノ−３−カルボキシ−３，４
−ジヒドロ−２−キノロンカリウム塩(7) 無水エタノール55ミリリツトル中のエチルエス
テル1.43g（5.45ミリモル）のスラリーに、水を溶
かしたKOH16ミリリツトル（8.3ミリモル）を加
えた。混合物をアルゴン下室温で、24時間撹拌し
た。反応物を過し、カリウム塩(7)（融点：193
〜195℃）1.3g（84％）を得た。 分析：計算値：C12H13N2O3K・３／4H2O：
Ｃ，50.44；Ｈ，5.11；Ｎ，
9.80. 実測値：Ｃ，50.54；Ｈ，5.46；Ｈ，
9.82. ７−ジメチルアミノ−３−（Ｎ−エチルカルボ
キサミド）−３，４−ジヒドロ−２−キノロン
(8) 乾燥ジメチルホルムアミド（DMF）45ミリリ
ツトル中の前段階のカルボキシレート塩(7)1.3g
（4.8ミリモル）のスラリーを、氷浴中で５℃に冷
却し、イソブチルクロロホルム塩0.72g（0.68ミリ
リツトル、5.2ミリモル）を３分間かけて一滴ず
つ加えた。反応混合物を放置して室温にもどし15
分間撹拌した。次に、DMF15ミリリツトル中の、
前もつて蒸留し、水酸化ナトリウム（NaOH）
上に保存したエチルアミン６ミリリツトルを急速
に加えた。２時間攪拌した後、溶液を濃縮し、残
留物にシリカゲル150g上でクロマトグラフイを
行い、CH3OHとCH2Cl2（容積比：１：19）を用
いて溶出した。第45〜第75分画（12ミリリツト
ル／分画）は、アミド(8)を含有しており、このア
ミドをジエチルエーテル−ヘキサンから結晶化
し、白色の固形物0.2g（融点：216−28℃）を得
た。 分析：計算値：C14H19O2N3：Ｃ，64.35；Ｈ，
7.33；Ｎ，16.08. 実測値：Ｃ，64.97；Ｈ，7.78；Ｎ，
16.24. 1HMR1δ：8.10（broad ｓ，1H）；7.60（broad，
1H）；7.05（ｄ，Ｊ＝９，1H）；7.05
（ｄ，Ｊ＝９，1H）；6.33（dd，Ｊ＝
４，９，1H）；6.07（ｄ，Ｊ＝４，
1H）；3.60−3.20（ｍ，5H）；2.90（ｓ，
6H）；1.13（ｔ，Ｊ＝７，3H）． ７−ジメチルアミノ−３−（Ｎ−エチルカルボ
キサミド）−２−キノロン(9) 桂皮酸エステル(1)1.0g（3.0ミリモル）、無水
EtOH40ミリリツトル、H2O1ミリリツトル、濃
塩酸（HCl）0.4ミリリツトル及び鉄屑
（ironFilings）1.5g（26.9mg−atom）の混合物を
激しく撹拌しながらアルゴン下、2.5時間還流し
た。さらに鉄屑1.7g（30.4mg−atom）を加え、３
時間加熱を続けた。混合物を熱過し、液を蒸
発させた。残留物を2.55Mメタノール性HCl50ミ
リリツトル中に溶解し、室温で20分間放置した。
次に、溶媒を蒸発させ、残留物をCHCl3150ミリ
リツトル及び飽和NaHCO3溶液50ミリリツトル
に分配した。有機相を噴離し、水性相をCHCl375
ミリリツトルを用いて洗浄した。有機相を混合
し、乾燥し（NaSO4）過し、濃縮して、暗褐
色の固形物0.49gを得た。水性相をイソブタノー
ル120ミリリツトルを用いて抽出し、それを乾燥
し（Na2SO4）、過し、留去して、さらに0.08g
を製造した。２つの残留物を混合し、MeOH30
ミリリツトル中でスラリー化し、エチルアミン
（EtNH2）70％−水（H2O）30％の10ミリリツト
ルを加えた。混合物を室温で３目間撹拌し、次
に、ステンレススチール製のボンベ中に置き、
100℃で６時間加熱した。溶媒を蒸発させてから、
残留物にシリカゲル75g上でクロマトグラフイを
行いCH2Cl2とMeOH（容積比：19：１）を用いて
溶出した。 第25〜第34分画（ミリリツトル／分画）を混合
し、濃縮して体積７ミリリツトルとした。過に
より、黄色の針状結晶0.19g（融点：299〜300℃）
を得た。 分析：計算値：C14H17N3O2：Ｃ，74.85；Ｈ，
6.61；Ｎ，16.20. 実測値：Ｃ，74，84；Ｈ，6.74；Ｎ，
16.19. 1NMR（CDCl3）δ：7.53（ｄ，Ｊ＝９，1H）；
6.60（dd，Ｊ＝４，９，
1H）；6.40（broad ｍ，
1H）′；3.53（ｍ，
2H）；3.10（ｓ，6H）；
1.25（ｔ，Ｊ＝７，3H）． ７−ジメチルアミノ−３−（Ｎ−エチルカルボ
キサミド）−１−メチル−２−キノロン(10) 水素化ナトリウム（10mg、0.2ミリモル）の50
％油分散液をヘキサンを用いて２回洗浄し、ジオ
キサン１ミリリツトルを加えた。スラリーに、ジ
オキサン／DMF（１：１）の混合物２ミリリツト
ル中のキノロン(9)50mg（0.2ミリモル）を加えた。
混合物を室温で30分間撹拌し、次に、ヨードメタ
ン0.56g（４ミリモル）を急速に加えた。溶液を30
分間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、残留物を
CHCl350ミリリツトル中に溶解した。溶液を
H2O30ミリリツトルを用いて、洗浄し、有機相
を乾相し（Na2SO4）、過し、留去した。生成
物の沈殿が生じ、残留物をCHCl3の５ミリリツト
ル中に溶解し、ジエチルエーテル20ミリリツトル
を用いて、すりつぶした。過により、黄色の固
形物（融点：248−250℃）32mgを製造した。エタ
ノールからの再結晶化により、黄色の針状結晶
（融点：252−253℃）を得た。 分析：計算値：C154H21N3O2：Ｃ，75.09；Ｈ，
7.00；Ｎ，15.37. 実測値：Ｃ，75，08；Ｈ，6.93；Ｎ，
15.31. 1NMR（CDCl3）δ：8.40（ｓ，1H）；7.58（ｄ，
Ｊ＝９，1H）；6.68（dd，
Ｊ＝４，９，1H）；6.23
（ｓ，3H）；３，２−3.7
（ｍ，2H）；3.13（ｓ，
6H）；1.26（ｔ，Ｊ＝８，
3H）． ７−ジメチルアミノ−３−（Ｎ−エチルカル
ボキサミド）−３，４−ジヒドロ−１−メチル
−２−キノロン(11) 前段階の２−キノロン(10)0.3g（1.15ミリモル）
及び無水EtOH25ミリリツトル中のNaBH40.1g
（2.6ミリモル）の混合物を24時間撹拌した。さら
にNaBH40.1gを加え、反応混合物を室温で一晩
撹拌した。再び、NaBH40.1gを加え、反応混合
物を70℃で24時間加熱した。次に、NaBH40.3g
を加え、24時間加熱を続けた。溶媒を蒸発させ、
残留物にシリカゲル100g上でクロマトグラフイ
を行い、MeOHとCH2Cl2（容積比：2.5％）を用
いて溶出した。第55〜第85分画（12ミリリツト
ル／分画）を混合し、濃縮して、淡い黄色の固形
物（融点：105−107℃）でシヒドロキノロン
0.14gを得た。 分析： 1NMR（CDCl3）δ7.10（ｄ，Ｊ＝８，
1H）；6.33（ｓ，1H）；3.40（ｓ，3H）；3.24
（ｍ，5H）；２，97（ｓ，6H）；1.18（ｔ，
Ｊ＝８，3H）． ７−ヒドロキシ−３−エトキシカルボニル−
３，４−ジヒドロ−１−メチル−２−キノロン
(16) 乾燥ジオキサン８ミリリツトル中の７−ヒドロ
キシ−３，４−ジヒドロ−２−キノロン(12)（エ
ヌ．シゲマツ（N.Shigematsu）．「Chem.Pharm.
Ball」９：970（1961年）〕のスラリーに、ジヒド
ロピラン８ミリリツトル及びｐ−トルエンスルホ
ン酸５mgを加えた。反応混合物を不活性ガス雰囲
気下、90分間撹拌し、次にH2O150ミリリツトル
を用いて希釈した。エーテルの50ミリリツトル分
量の３分量を用いて、それを抽出し、抽出物を混
合して無水炭酸カリウム（K2CO3）上で乾燥し
た。過及び蒸発により、油状粉質2gを得、ヘ
キサンを用いてすりつぶし、結晶化した。それを
乾燥し、２−テトラヒドロピラニルエーテル(13)
（融点：129〜131℃）の白色の結晶1.18g（78％）
を得た。 トルエン50ミリリツトル及びH2O1ミリリツト
ル中のNaOH1gの溶液４ミリリツトルの混合物
中の(13)の2.47g（10ミリモル）及びベンジルトリエ
チルアンモニウムクロリド228mgのスラリーを不
活性雰囲気下、室温で撹拌した。ヨウ化メチル
（1.26ミリリツトル ミリモル）を加え、反応混
合物を急速に47℃（油浴）で20時間撹拌した。次
に、CHCl3の250ミリリツトル分量を用いて希釈
した。CHCl3抽出物をトルエン相と混合し、乾燥
し、留去した。油状残留物をヘキサンから結晶化
し、白色の固形物（融点：53−55℃）として(14)を
2.56g（93％）得た。 乾燥テトラヒドロフラン（THF）２ミリリツ
トル中の新しく蒸留したイソプロピルシクロヘキ
シルアミン0.315ミリリツトルの溶液を25ミリリ
ツトルフラスコ中に入れた。同様のアミン0.315
ミリリツトルを５ミリリツトルフラスコ中の
THF1.5ミリリツトルに溶解することにより、第
二の溶液を製造した。両方の溶液を、不活性雰囲
気下撹拌しながら−78℃まで冷却し、ｎ−ブチル
リチウムの1.6Mヘキサン溶液の1.2ミリリツトル
を1.5分に亘り注入器から１滴ずつ反応させ、リ
チウムイソプロピルシクロヘキシルアミドを生成
した。第一の溶液には、THFの１ミリリツトル
中の(14)500mgを６分間に亘り、一滴ずつ加えた。
反応混合物は、−78℃で５分間に亘り撹拌し、次
にTHF0.5ミリリツトル中の炭酸ジエチル0.12ミ
リリツトルの溶液を、注入器により10分間に亘り
一滴ずつ加えた。さらに３分間経過の後、リチウ
ムイソプロピルシクロヘキシルアミドの第二の溶
液を加え、次に炭酸ジエチルをさらに0.12ミリリ
ツトル加えた。−78℃で20分間経過の後に、反応
混合物を室温まで加熱し、10分間撹拌し、次に
H2O2ミリリツトル中の酢酸0.2ミリリツトルを用
いて中和した。反応混合物をH2O100ミリリツト
ルとエーテル35ミリリツトルに分配した。エーテ
ル相を分離し、乾燥し、過し、留去し、そして
残留物を高真空下で乾燥し、黄色の油状物質を得
た。それにシリカゲル60g上で、クロマトグラフ
イを行い、CH2Cl2とEtOH（容積比29：１）を用
いて溶出し、９ミリリツトル分画を集めた。第29
〜第51分画を混合し、留去し、透明な淡黄色油状
物質でエステル(15)の548mg（収率86％）を得た。 AcOHとH2O（容積比：３：１）中のテトラヒ
ドロピラニルエーテル(15)の溶液を室温で17時間撹
拌した。混合物を濃縮し、トルエン10ミリリツト
ルを加え、次に留去して、白色の固形物（融点：
121〜123℃）を得た。 分析：計算値：C13H15NO3：Ｃ，62.64；Ｈ，
6.07；Ｎ，5.62. 実測値：Ｃ，62，98；Ｈ，6.25；Ｎ，
5.27. 1NMR（CDCl3）δ：7.45（droad，1H）；7.05
（ｄ，Ｊ＝８，1H）；
6.67（ｓ，1H）；6.57
（dd，Ｊ＝２，８，
1H）；4.20（ｔ，Ｊ＝７，
2H）；3.40（ｓ，3H）；
3.8−3.0（ｍ，3H）；1.20
（ｑ，Ｊ＝７，3H）． 〔２，３，６，７，９，10〕−ヘクサヒドロ−
10−エトキシカルボニル−11−オキソ−1H，
5H，11H−〔１〕ベンゾピラン〔６，７，８−
ij〕キノリジン(17) クマリン314（イースマンオーガニツクケミカル
ズ社（Eastman Organic Chemicals）製、
0.1g）、10％Pd／C0.05g及び酢酸25ミリリツトル
の混合物を水素50psi圧力及び温度50℃下に置き、
24時間振とうした。触媒をセライトにより過す
ることにより除去し、溶液を濃縮した。褐色の残
留物にシリカゲル40g上でクロマトグラフイを行
い、アセトンとメチレンクロリド（容積比：１：
19）を用いて溶出した。第３〜第17分画（15ミリ
リツトル／分画）を混合し、真空下で濃縮した。
生成物をメチレンクロリド−ヘキサンから結晶化
し、白色の針状物質（融点141−143℃）0.03gを
得た。 分析：計算値：C18H21O4N：Ｃ，68.61；Ｈ，
6.71；Ｎ，4.44. 実測値：Ｃ，68.25；Ｈ，6.96；Ｎ，
4.49. 第６図に示した一般式の化合物は、R1が水素
原子、シアノ又は−COOR6，−CONHR6もしく
は、−CON（R6）2（このとき、R6は水素原子、アル
キルである）であり、かつＹがＯ又はＮ−R5（こ
のときR5は水素又は低級アルキルである）であ
るものに関して、適当な出発クマリン又は２−キ
ノロンを選択することにより製造することができ
る。 ７−ジメチルアミノ−３，４−ジヒドロ−２−
キノロン MeOH40ミリリツトル中の７−ジメチルアミ
ノ−２−キノロン〔エイ．ライス（A.Rice）
「Ann.Chim.」48：958−996（1958年）〕1.0g（5.7ミ
リモル）の溶液に、マグネシウム1.3g（5.7ミリモ
ル）を加えた。反応混合物を、蒸気浴で、ゆるや
かに温め、次に、室温で２時間撹拌した。次に酢
酸（８ミリリツトル）を加え、溶液を過した。
液を濃縮し残留物にシリカゲル220g上でクロ
マトグラフイを行い、CH2Cl2とMeOH（容積比：
97.5：2.5）を用いて溶出した。第50〜第60分画
（12ミリリツトル／分画）を混合し、濃縮して、
白色の固形物（融点：154〜156℃）のジヒドロキ
ノロン0.14gを得た。 分析： 1HNMR（CDCl3）δ：7.00（ｄ，Ｊ＝
８，1H）；6.40（dd，Ｊ＝2.8，1H；6.13
（ｄ，Ｊ＝２，1H）；2.93（ｓ，6H）；2.73
（ｍ，4H）． 実施例 過酸化水素の検出 下記の表に列挙したジヒドロキノロン類及びジ
ヒドロクマリン類の燐酸ナトリウム緩衝液
（1.0μM.PH7.0又は7.5）を、適当な化合物のエタ
ノール又はDMF−エタノール溶液の緩衝液を用
いて、次々に希釈することにより製造した。溶液
を37℃浴中で温め、次に、１mg／ミリリツトルの
ワサビダイコンペルオキシダーゼ酵素の40マイク
ロリツトルを１度に加えた。キユベツト中の内容
物を混合し、蛍光性を少くとも50秒間（水晶セル
及びその内容物は37℃に一定に保つた）監視し
た。次に、冷水中に希釈し８時間より短い時間０
℃に保存した過酸化水素の１定量を、ジヒドロキ
ノロン対ペルオキシダーゼの所望の比に適した分
量加えた。次に蛍性を600秒間に亘り監視した。
化合物(5)，(6)，(7)，(11)，(16)及び(17)に蛍光性の
値
は、研究の対象物と同様の蛍光出力を達成するの
に必要となるであろう蛍光性の基準となる７−ヒ
ドロキシ−３−（Ｎ−エチルカルボキサミド）ク
マリン（米国特許第4273715号）の濃度（nM）
の単位で報告した。化合物(8)は、光子／秒で報告
されている。全てのスリツト幅は、２ナノメータ
ー（nm）に設定した。 蛍光性は、SLM8000分光蛍光計（米国、イリ
ノイ州、ウルバナのSLMインスツルメンツ社
SLMInstruments，Inc.）製）にかけ、水晶セル
中で測定した。スペクトルを処理する為にヒユー
レツト−パツカード（Hewlett−Packard
8915A）8915Aコンピユーターを使用した。 結果を表１に示し、本発明の化合物が過酸化水
素の存在に対して有用な蛍光反応を示すことを実
証する。 上記の本発明の他の変種や変型を、本発明の精
神及び範囲を離れることなく、数多く製造できる
ことは明らかである。
第１及び第２図は、それぞれ本発明の化合物一
般及び好ましいジアルキルアミノ誘導体の酸化の
予想される反応メカニズムである。第３乃至第６
図は、本発明の指示薬化合物を製造する為の特定
の合成径路のフローダイヤグラムである。
般及び好ましいジアルキルアミノ誘導体の酸化の
予想される反応メカニズムである。第３乃至第６
図は、本発明の指示薬化合物を製造する為の特定
の合成径路のフローダイヤグラムである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 式 （式中、Ｚは 式 【式】又は式【式】 を表わし、；R1は水素原子、シアノ基又は−
COOR6、−CONR6若しくは−CON（R6）2基を表
わし、ここでR6は水素原子又はアルキル基を表
わし；R2はヒドロキシル基又は−NR3R4基を表
わし、ここでR3及びR4は同一又は異なつて水素
原子又は低級アルキル基を表わし；Ｙは酸素原子
又は Ｎ−R5基を表わし、ここでR5は水素原子又は
低級アルキル基を表わす）で示される化合物、及
び過酸化活性物質を含むことを特徴とする試料中
の過酸化水素測定用組成物。 ２ 過酸化活性物質がペルオキシダーゼである特
許請求の範囲第１項記載の組成物。
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|---|---|---|---|
| US06/594,242 US4558130A (en) | 1984-03-27 | 1984-03-27 | Fluorogenic dihydroquinolone and dihydrocoumarin indicators for hydrogen peroxide |
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|---|---|
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| JP (1) | JPS60209567A (ja) |
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| FR2632307B1 (fr) * | 1988-06-02 | 1991-10-04 | Paris Sud Universite | Nouveaux derives de tetrahydro-2,3,6,7,1h,5h,11h-1 benzopyrano (6,7,8, ij) quinolizinone-11 utilisables comme marqueurs de composes organiques en vue de la detection de ces composes par chimiluminescence ou fluorescence |
| DE4111861A1 (de) * | 1991-04-11 | 1992-10-15 | Schwabe Willmar Gmbh & Co | Benzopyranone, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung |
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