JPH0748569A - 新規蛍光基質化合物及びそれを用いたペルオキシダーゼ類の蛍光分析方法 - Google Patents
新規蛍光基質化合物及びそれを用いたペルオキシダーゼ類の蛍光分析方法Info
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- JPH0748569A JPH0748569A JP22659393A JP22659393A JPH0748569A JP H0748569 A JPH0748569 A JP H0748569A JP 22659393 A JP22659393 A JP 22659393A JP 22659393 A JP22659393 A JP 22659393A JP H0748569 A JPH0748569 A JP H0748569A
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- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ペルオキシダーゼを過酸化水素の存在下に酸
化発色試薬で測定する方法で、感度の高い蛍光性化合物
を生じる酸化発色試薬を提供する。 【構成】 一般式 【化１】 （Ｒ1 はカルボキシアルキル基、Ｒ2 は水素又はアルキ
ル基）で示される新規なp-ヒドロキシアセトアニリド誘
導体（例えば4-(4'-カルボキシブタノイルアミノ) フェ
ノール）を酸化発蛍光試薬として用い、蛍光強度によっ
てペルオキシダーゼ濃度を定量測定する。 【効果】 本発明の酸化発蛍光試薬は精製が容易で安定
であり、蛍光測定におけるバックグラウンドが低く、高
感度でペルオキシダーゼ濃度を測定できる。
化発色試薬で測定する方法で、感度の高い蛍光性化合物
を生じる酸化発色試薬を提供する。 【構成】 一般式 【化１】 （Ｒ1 はカルボキシアルキル基、Ｒ2 は水素又はアルキ
ル基）で示される新規なp-ヒドロキシアセトアニリド誘
導体（例えば4-(4'-カルボキシブタノイルアミノ) フェ
ノール）を酸化発蛍光試薬として用い、蛍光強度によっ
てペルオキシダーゼ濃度を定量測定する。 【効果】 本発明の酸化発蛍光試薬は精製が容易で安定
であり、蛍光測定におけるバックグラウンドが低く、高
感度でペルオキシダーゼ濃度を測定できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規な蛍光基質化合物及
びそれを用いた蛍光分析方法、特にペルオキシダーゼ類
の定量に用いられる蛍光分析方法に関するものである。
びそれを用いた蛍光分析方法、特にペルオキシダーゼ類
の定量に用いられる蛍光分析方法に関するものである。
【０００２】本発明の蛍光基質化合物を用いる蛍光分析
は、抗体に標識剤として用いられたペルオキシダーゼ類
を抗原と作用させた後酸化発蛍光させることにより定量
することができる。
は、抗体に標識剤として用いられたペルオキシダーゼ類
を抗原と作用させた後酸化発蛍光させることにより定量
することができる。
【０００３】本発明でいうペルオキシダーゼ類とは、ペ
ルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと略記する）及びそれと同
等の触媒作用を有する物質を包含し、過酸化水素との存
在下に本発明の蛍光基質化合物を酸化発蛍光せしめるも
のであり、以下の説明においてはＰＯＤによって代表さ
れる。
ルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと略記する）及びそれと同
等の触媒作用を有する物質を包含し、過酸化水素との存
在下に本発明の蛍光基質化合物を酸化発蛍光せしめるも
のであり、以下の説明においてはＰＯＤによって代表さ
れる。
【０００４】
【従来の技術】一般に、酵素試薬あるいは抗体を用いる
臨床検査法は酵素の基質特異性あるいは抗体の抗原特異
性のために極めて選択性の高い分析法であり、複雑な生
体マトリックスの影響を受けることなく各種の生体成分
を容易に定量できるため重要な手法となっている。これ
らの酵素のうちＰＯＤやアルカリホスファターゼは各種
のタンパク等の標識剤として広範囲に用いられており、
抗体にこうしたＰＯＤやアルカリホスファターゼを標識
しておき目的とする化合物（抗原）に作用させたのち酸
化発色系あるいは酵素基質を用いることにより高感度に
目的化合物（抗原）の定量を行なうことができる。
臨床検査法は酵素の基質特異性あるいは抗体の抗原特異
性のために極めて選択性の高い分析法であり、複雑な生
体マトリックスの影響を受けることなく各種の生体成分
を容易に定量できるため重要な手法となっている。これ
らの酵素のうちＰＯＤやアルカリホスファターゼは各種
のタンパク等の標識剤として広範囲に用いられており、
抗体にこうしたＰＯＤやアルカリホスファターゼを標識
しておき目的とする化合物（抗原）に作用させたのち酸
化発色系あるいは酵素基質を用いることにより高感度に
目的化合物（抗原）の定量を行なうことができる。
【０００５】従来用いられてきたＰＯＤ測定試薬として
はo-フェニレンジアミンなどの酸化発色試薬が一般的
で、過酸化水素の存在下で酸化縮合させ縮合体を測定す
ることでＰＯＤ又は過酸化水素を検出するものである。
酸化発色試薬としてはo-フェニレンジアミン以外にフェ
ノール、N,N,- ジメチルアニリン、4-クロロフェノー
ル、N-エチル- N-スルホプロピルアニリン、N-エチル-N
-(2-ヒドロキシ- 3-スルホプロピル)-m-トルイジンなど
が用いられている。
はo-フェニレンジアミンなどの酸化発色試薬が一般的
で、過酸化水素の存在下で酸化縮合させ縮合体を測定す
ることでＰＯＤ又は過酸化水素を検出するものである。
酸化発色試薬としてはo-フェニレンジアミン以外にフェ
ノール、N,N,- ジメチルアニリン、4-クロロフェノー
ル、N-エチル- N-スルホプロピルアニリン、N-エチル-N
-(2-ヒドロキシ- 3-スルホプロピル)-m-トルイジンなど
が用いられている。
【０００６】近年、p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸
（以下ＨＰＰＡと略記する）を用い、過酸化水素とＰＯ
Ｄの存在下で蛍光性化合物を生じることを利用した酸化
発蛍光法が開発されてきた。本方法はpMレベルのＰＯＤ
の定量に用いることができる高感度な分析法と称されて
いる。
（以下ＨＰＰＡと略記する）を用い、過酸化水素とＰＯ
Ｄの存在下で蛍光性化合物を生じることを利用した酸化
発蛍光法が開発されてきた。本方法はpMレベルのＰＯＤ
の定量に用いることができる高感度な分析法と称されて
いる。
【０００７】
【発明が解決使用とする課題】しかしながら、上記ＨＰ
ＰＡはその精製が難しく、蛍光のバックグラウンドの低
いものを得難いことや、検出感度に及ぼすロット間の差
が大きいことなどの欠点があるため広く使用されるには
至っていない。
ＰＡはその精製が難しく、蛍光のバックグラウンドの低
いものを得難いことや、検出感度に及ぼすロット間の差
が大きいことなどの欠点があるため広く使用されるには
至っていない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記のような現状のも
と、本発明者等はＨＰＰＡのこれらの欠点をなくし、さ
らに優れた酸化発蛍光試薬を開発するため鋭意研究を重
ねた結果、本発明の蛍光基質化合物を見出し、それを用
いる酸化発蛍光法を完成したものである。すなわち本発
明は、次の一般式（１）
と、本発明者等はＨＰＰＡのこれらの欠点をなくし、さ
らに優れた酸化発蛍光試薬を開発するため鋭意研究を重
ねた結果、本発明の蛍光基質化合物を見出し、それを用
いる酸化発蛍光法を完成したものである。すなわち本発
明は、次の一般式（１）
【０００９】
【化３】
【００１０】（式中、Ｒ1 はカルボキシアルキル基で、
Ｒ2 は水素又はアルキル基である）で示されるp-ヒドロ
キシアセトアニリド誘導体及びその塩らなる新規蛍光基
質化合物、並びにそれらを用いるＰＯＤ又はそれと同等
な触媒作用を持つ物質の定量方法を提供するものであ
る。
Ｒ2 は水素又はアルキル基である）で示されるp-ヒドロ
キシアセトアニリド誘導体及びその塩らなる新規蛍光基
質化合物、並びにそれらを用いるＰＯＤ又はそれと同等
な触媒作用を持つ物質の定量方法を提供するものであ
る。
【００１１】本発明の蛍光基質化合物は、文献未載の新
規な且つ有用な物質で、過酸化水素とＰＯＤ又はそれと
同等な触媒作用を持つ物質の存在下で蛍光性化合物を生
じ、高感度でＰＯＤ又はそれと同等の触媒作用を持つ物
質の測定を行なうことができる。
規な且つ有用な物質で、過酸化水素とＰＯＤ又はそれと
同等な触媒作用を持つ物質の存在下で蛍光性化合物を生
じ、高感度でＰＯＤ又はそれと同等の触媒作用を持つ物
質の測定を行なうことができる。
【００１２】一般式（１）で示される化合物はp-ヒドロ
キシアニリンを基本骨格とする化合物を出発物質として
合成するすることができる。例えば 4-( 3'-カルボキシ
プロピオニルアミノ）フェノール（Ｒ1 ：C2H4COOH、Ｒ
2 ：H ）［後記化合物（Ａ）］は4-アミノフェノールに
無水こはく酸を作用させて合成することができる。ま
た、2-メチル- 4-(4'-カルボキシブタノイルアミノ）フ
ェノール（Ｒ1 ：C3H6COOH、Ｒ2 ：CH3 ）［後記化合物
（Ｅ）］は2-メチル- 4-アミノフェノールに無水グルタ
ル酸を作用させて合成することができる。このようにし
て得られる化合物（１）のうち代表的ななものの構造を
以下に示す。
キシアニリンを基本骨格とする化合物を出発物質として
合成するすることができる。例えば 4-( 3'-カルボキシ
プロピオニルアミノ）フェノール（Ｒ1 ：C2H4COOH、Ｒ
2 ：H ）［後記化合物（Ａ）］は4-アミノフェノールに
無水こはく酸を作用させて合成することができる。ま
た、2-メチル- 4-(4'-カルボキシブタノイルアミノ）フ
ェノール（Ｒ1 ：C3H6COOH、Ｒ2 ：CH3 ）［後記化合物
（Ｅ）］は2-メチル- 4-アミノフェノールに無水グルタ
ル酸を作用させて合成することができる。このようにし
て得られる化合物（１）のうち代表的ななものの構造を
以下に示す。
【００１３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【００１４】
【実施例】次に実施例をあげて、さらに具体的に本発明
の化合物の製造法及びそれを用いた過酸化水素及びＰＯ
Ｄの定量法を説明するが、本発明はその要旨を満たすか
ぎり以下の実施例に制約されるものではない。
の化合物の製造法及びそれを用いた過酸化水素及びＰＯ
Ｄの定量法を説明するが、本発明はその要旨を満たすか
ぎり以下の実施例に制約されるものではない。
【００１５】合成した化合物の分析結果を示す略号は以
下のとおりである。
下のとおりである。
【００１６】 ＴＬＣ（シリカゲル薄層クロマトグラ
フ） シリカゲル薄層：Kieselgel 60 F254 （メルク社製）、
2×7cm 。 展開溶媒：10％メタノール／クロロホルム、 2％酢酸。 検出：紫外吸収。 測定値：溶媒先端を 1としたときのスポット位置からの
移動距離をRf値で示す。
フ） シリカゲル薄層：Kieselgel 60 F254 （メルク社製）、
2×7cm 。 展開溶媒：10％メタノール／クロロホルム、 2％酢酸。 検出：紫外吸収。 測定値：溶媒先端を 1としたときのスポット位置からの
移動距離をRf値で示す。
【００１７】 1H-ＮＭＲ（核磁気共鳴） 測定装置：ブルカー社製 AC-200 。 溶媒：CD3OD （規準物質テトラメチルシラン 0.1％含
有）。 測定値：テトラメチルシランをOppmとしてシグナル位置
を表示する。シグナルは二重線をd 、三重線をt 、四重
線をq 、多重線をm とし、シグナル面積をプロトン数
で、カップリング定数J をヘルツで示す。
有）。 測定値：テトラメチルシランをOppmとしてシグナル位置
を表示する。シグナルは二重線をd 、三重線をt 、四重
線をq 、多重線をm とし、シグナル面積をプロトン数
で、カップリング定数J をヘルツで示す。
【００１８】 FAB-ＭＳ（高速原子衝撃型イオン化質
量分析） 測定装置：日本電子社製 JMS-AX505W 。 測定試料：サンプル0.1mg をジメチルスホキシド(DMSO)
20μl にとかし、2-ニトロベンジルアルコール(NBA)5μ
l を加えてサンプル溶液とし、そのうち 1μlを取り測
定に用いる。 測定値：親ピークを(M+1)+で示す。
量分析） 測定装置：日本電子社製 JMS-AX505W 。 測定試料：サンプル0.1mg をジメチルスホキシド(DMSO)
20μl にとかし、2-ニトロベンジルアルコール(NBA)5μ
l を加えてサンプル溶液とし、そのうち 1μlを取り測
定に用いる。 測定値：親ピークを(M+1)+で示す。
【００１９】実施例１ 化合物（Ａ）の製造 p-ヒドロキシアニリン20g(0.183mol) をテトラヒドロフ
ラン（以下、 THF と略す）500ml に溶かし、無水こはく
酸20g(0.200mol) を加え、室温で 4時間撹拌した。反応
液を減圧下濃縮し、得られた結晶を水 500mlに懸濁さ
せ、1Mの水酸化ナトリウム水溶液を加えてpHを 6に保っ
て溶解させたのち、活性炭2gを加えて濾過した。濾液に
1Mの塩酸水溶液を加えてpHを 2とし、白色沈殿を析出さ
せ濾取した。水洗を繰返したのち減圧下乾燥し、エタノ
ール 400mlから再結晶して白色の化合物（Ａ）を得た。
収量は 30.8gで、収率は80％であった。
ラン（以下、 THF と略す）500ml に溶かし、無水こはく
酸20g(0.200mol) を加え、室温で 4時間撹拌した。反応
液を減圧下濃縮し、得られた結晶を水 500mlに懸濁さ
せ、1Mの水酸化ナトリウム水溶液を加えてpHを 6に保っ
て溶解させたのち、活性炭2gを加えて濾過した。濾液に
1Mの塩酸水溶液を加えてpHを 2とし、白色沈殿を析出さ
せ濾取した。水洗を繰返したのち減圧下乾燥し、エタノ
ール 400mlから再結晶して白色の化合物（Ａ）を得た。
収量は 30.8gで、収率は80％であった。
【００２０】得られた化合物（Ａ）の測定値は次のとお
りであった。
りであった。
【００２１】ＴＬＣ（10％メタノール／クロロホルム、
2％酢酸）：Rf＝0.45。
2％酢酸）：Rf＝0.45。
【００２２】1H- ＮＭＲ（CD3OD)：2.20(t, J=6.2, 2
H)、2.36(t, J=6.2, 2H)、6.66(d, J=10.2, 2H）、7.32
(d, J=10.2, 2H) 。
H)、2.36(t, J=6.2, 2H)、6.66(d, J=10.2, 2H）、7.32
(d, J=10.2, 2H) 。
【００２３】FAB-ＭＳ：210 (M+1)+。
【００２４】化合物（Ａ）のナトリウム塩は、上記で得
られた遊離酸を水 200mlに懸濁し等量の1Mの水酸化ナト
リウム水溶液を加え溶解させたものを再度活性炭処理
し、濾液を減圧下濃縮したのち2Lのアセトンに注ぎ、生
じた白色結晶を濾取しアセトンで洗浄後、減圧下乾燥す
ることにより得られた。収量は 31.9g、収率は75％であ
った。
られた遊離酸を水 200mlに懸濁し等量の1Mの水酸化ナト
リウム水溶液を加え溶解させたものを再度活性炭処理
し、濾液を減圧下濃縮したのち2Lのアセトンに注ぎ、生
じた白色結晶を濾取しアセトンで洗浄後、減圧下乾燥す
ることにより得られた。収量は 31.9g、収率は75％であ
った。
【００２５】実施例２ 化合物（Ｂ）の製造 p-ヒドロキシアニリン 20g(0.183mol)を THF 500mlに溶
かし、無水グルタル酸22.8g(0.200mol) を加え、室温で
4時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた結晶を
水 500mlに懸濁させ、1Mの水酸化ナトリウム水溶液を加
えてpHを 6に保って溶解させたのち、活性炭2gを加えて
濾過した。濾液に1Mの塩酸水溶液を加えてpHを 2とし、
白色沈殿を析出させ濾取した。水洗を繰返したのち減圧
下乾燥し、エタノール 400mlから再結晶して白色の化合
物（Ｂ）を得た。収量は 30.3g、収率は74％であった。
かし、無水グルタル酸22.8g(0.200mol) を加え、室温で
4時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた結晶を
水 500mlに懸濁させ、1Mの水酸化ナトリウム水溶液を加
えてpHを 6に保って溶解させたのち、活性炭2gを加えて
濾過した。濾液に1Mの塩酸水溶液を加えてpHを 2とし、
白色沈殿を析出させ濾取した。水洗を繰返したのち減圧
下乾燥し、エタノール 400mlから再結晶して白色の化合
物（Ｂ）を得た。収量は 30.3g、収率は74％であった。
【００２６】ＴＬＣ（10％メタノール／クロロホルム、
2％酢酸）：Rf＝0.50。
2％酢酸）：Rf＝0.50。
【００２７】1H- ＮＭＲ（CD3OD)：1.60〜1.75(m, 2H)
、1.90〜2.00(m, 2H) 、2.15〜2.25(m, 2H) 、6.44(d,
J =10.5, 2H)、7.13(d, J=10.5, 2H) 。
、1.90〜2.00(m, 2H) 、2.15〜2.25(m, 2H) 、6.44(d,
J =10.5, 2H)、7.13(d, J=10.5, 2H) 。
【００２８】FAB-ＭＳ：224 (M+1)+。
【００２９】化合物（Ｂ）のナトリウム塩は、上記で得
られた遊離酸を水 200mlに懸濁し等量の1Mの水酸化ナト
リウム水溶液を加え溶解させたものを再度活性炭処理
し、濾液を減圧下濃縮したのち2Lのアセトンに注ぎ、生
じた白色結晶を濾取し、アセトンで洗浄後、減圧下乾燥
した。収量は 32.5g、収率は72％であった。
られた遊離酸を水 200mlに懸濁し等量の1Mの水酸化ナト
リウム水溶液を加え溶解させたものを再度活性炭処理
し、濾液を減圧下濃縮したのち2Lのアセトンに注ぎ、生
じた白色結晶を濾取し、アセトンで洗浄後、減圧下乾燥
した。収量は 32.5g、収率は72％であった。
【００３０】実施例３ 化合物（Ｄ）の製造 2-メチル- 4-アミノフェノール20g(0.162mol) を THF 5
00mlに溶かし、無水こはく酸17.8g(0.178mol) を加え、
室温で 4時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた
結晶を水 500mlに懸濁させ、1Mの水酸化ナトリウム水溶
液を加えてpHを6に保って溶解させたのち、活性炭2gを
加えて濾過した。濾液に1Mの塩酸水溶液を加えてpHを 2
とし、白色沈殿を析出させて濾取した。水洗を繰返した
のち減圧下乾燥し、エタノール 400mlから再結晶して白
色の化合物（Ｄ）を得た。収量は28.6g、収率は79％で
あった。
00mlに溶かし、無水こはく酸17.8g(0.178mol) を加え、
室温で 4時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた
結晶を水 500mlに懸濁させ、1Mの水酸化ナトリウム水溶
液を加えてpHを6に保って溶解させたのち、活性炭2gを
加えて濾過した。濾液に1Mの塩酸水溶液を加えてpHを 2
とし、白色沈殿を析出させて濾取した。水洗を繰返した
のち減圧下乾燥し、エタノール 400mlから再結晶して白
色の化合物（Ｄ）を得た。収量は28.6g、収率は79％で
あった。
【００３１】ＴＬＣ（10％メタノール／クロロホルム、
2％酢酸）：Rf＝0.45。
2％酢酸）：Rf＝0.45。
【００３２】1H- ＮＭＲ(CD3OD) ：2.07(s, 3H) 、2.20
(t, J=6.3, 2H)、2.35(t, J=6.3, 2H)、6.66(d, J=10.
2, 1H) 、7.15〜7.25(m,2H)。
(t, J=6.3, 2H)、2.35(t, J=6.3, 2H)、6.66(d, J=10.
2, 1H) 、7.15〜7.25(m,2H)。
【００３３】FAB-ＭＳ：224 (M+1)+。
【００３４】化合物（Ｄ）のナトリウム塩は、上記で得
られた遊離酸を水 200mlに懸濁し、等量の1M水酸化ナト
リウム水溶液を加えて溶解させ、活性炭処理したのち、
濾液を濃縮し、2Lのアセトンに注いで生じた白色結晶を
濾取し、アセトンで洗浄後、減圧下乾燥した。収量は 2
9.4g、収率は74％であった。
られた遊離酸を水 200mlに懸濁し、等量の1M水酸化ナト
リウム水溶液を加えて溶解させ、活性炭処理したのち、
濾液を濃縮し、2Lのアセトンに注いで生じた白色結晶を
濾取し、アセトンで洗浄後、減圧下乾燥した。収量は 2
9.4g、収率は74％であった。
【００３５】実施例４ 化合物（Ｆ）の製造 2-メチル- 4-アミノフェノール20g(0.162mol) を THF 5
00mlに溶かし、無水3-メチルグルタル酸22.8g(0.178mo
l) を加え、室温で 4時間撹拌した。反応液を減圧下濃
縮し、得られた結晶を水 500mlに懸濁させ、1Mの水酸化
ナトリウム水溶液を加えてpHを 6に保って溶解させたの
ち、活性炭2gを加えて濾過した。濾液に1Mの塩酸水溶液
を加えてpHを 2とし、析出した白色沈殿を濾取した。水
洗を繰返したのち減圧下乾燥し、イソプロピルアルコー
ル 400mlから再結晶して白色の化合物（Ｆ）を得た。収
量は 25.6g、収率は67％であった。
00mlに溶かし、無水3-メチルグルタル酸22.8g(0.178mo
l) を加え、室温で 4時間撹拌した。反応液を減圧下濃
縮し、得られた結晶を水 500mlに懸濁させ、1Mの水酸化
ナトリウム水溶液を加えてpHを 6に保って溶解させたの
ち、活性炭2gを加えて濾過した。濾液に1Mの塩酸水溶液
を加えてpHを 2とし、析出した白色沈殿を濾取した。水
洗を繰返したのち減圧下乾燥し、イソプロピルアルコー
ル 400mlから再結晶して白色の化合物（Ｆ）を得た。収
量は 25.6g、収率は67％であった。
【００３６】ＴＬＣ（10％メタノール／クロロホルム、
2％酢酸）：Rf＝0.45。
2％酢酸）：Rf＝0.45。
【００３７】1H- ＮＭＲ(CD3OD) ：1.55(d, J=6.7, 3
H)、1.70〜1.80(m, 1H）、1.90〜2.00(m, 2H) 、2.05
(s, 3H) 、2.15〜2.25(m, 2H) 、6.63(d, J=10.2, 1H)
、7.12〜7.25(m, 2H) 。
H)、1.70〜1.80(m, 1H）、1.90〜2.00(m, 2H) 、2.05
(s, 3H) 、2.15〜2.25(m, 2H) 、6.63(d, J=10.2, 1H)
、7.12〜7.25(m, 2H) 。
【００３８】FAB-ＭＳ：238 (M+1)+。
【００３９】化合物（Ｆ）のナトリウム塩は、上記で得
られた遊離酸を水 200mlに懸濁し、等量の1M水酸化ナト
リウム水溶液を加えて溶解させ、活性炭処理したのち、
濾過し、濾液を濃縮し、2Lのアセトンに注ぎ、生じた白
色結晶を濾取し、アセトンで洗浄後、減圧下に乾燥し
た。収量は 26.8g、収率は64％であった。
られた遊離酸を水 200mlに懸濁し、等量の1M水酸化ナト
リウム水溶液を加えて溶解させ、活性炭処理したのち、
濾過し、濾液を濃縮し、2Lのアセトンに注ぎ、生じた白
色結晶を濾取し、アセトンで洗浄後、減圧下に乾燥し
た。収量は 26.8g、収率は64％であった。
【００４０】実施例５ ＰＯＤ標準液による検量線の作成 これらの化合物を用い、ＰＯＤ濃度変化に伴う蛍光強度
の変化を観察した。試薬は以下のものを用いた。基質に
は化合物（Ａ）〜（Ｆ）及びＨＰＰＡを用いた。本発明
化合物は付加しているカルボキシル基により容易に測定
用緩衝液に溶解することができる。
の変化を観察した。試薬は以下のものを用いた。基質に
は化合物（Ａ）〜（Ｆ）及びＨＰＰＡを用いた。本発明
化合物は付加しているカルボキシル基により容易に測定
用緩衝液に溶解することができる。
【００４１】測定用緩衝液：50mMリン酸緩衝液、pH7.6
、塩化ナトリウム濃度5.7g/L。 基質液：25mM本発明化合物／測定用緩衝液。 酵素希釈液： 0.2％ウシ血清アルブミン／測定用緩衝
液。 過酸化水素溶液：20mM過酸化水素／測定用緩衝液。 酵素液： 0.1nM〜100nM POD(分子量44,000）／酵素希釈
液。 標準液：1ppm硫酸キニーネ。
、塩化ナトリウム濃度5.7g/L。 基質液：25mM本発明化合物／測定用緩衝液。 酵素希釈液： 0.2％ウシ血清アルブミン／測定用緩衝
液。 過酸化水素溶液：20mM過酸化水素／測定用緩衝液。 酵素液： 0.1nM〜100nM POD(分子量44,000）／酵素希釈
液。 標準液：1ppm硫酸キニーネ。
【００４２】測定用緩衝液 4ml、基質液 400μl 及び過
酸化水素溶液 200μl を混合し、37℃の水浴に 5分間浸
し、酵素液 5μl を加えて37℃に10分間保った後の蛍光
強度を各蛍光極大波長で測定した。各化合物の蛍光励起
波長及び発光波長を表１に示し、得られた値から作成し
た検量線を図１に示す。
酸化水素溶液 200μl を混合し、37℃の水浴に 5分間浸
し、酵素液 5μl を加えて37℃に10分間保った後の蛍光
強度を各蛍光極大波長で測定した。各化合物の蛍光励起
波長及び発光波長を表１に示し、得られた値から作成し
た検量線を図１に示す。
【００４３】図１から各化合物とも 0.1pMから100pM の
ＰＯＤ濃度範囲で良好な直線性を示すことがわかる。ま
た、それらの化合物の検出感度は、比較のために用いた
3-(4-ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（ＨＰＰＡ）
の検出感度より数倍高く、且つ蛍光ブランクも低いこと
が明かである。
ＰＯＤ濃度範囲で良好な直線性を示すことがわかる。ま
た、それらの化合物の検出感度は、比較のために用いた
3-(4-ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（ＨＰＰＡ）
の検出感度より数倍高く、且つ蛍光ブランクも低いこと
が明かである。
【００４４】
【表１】 蛍光スペクトル特性 化合物 励起波長(nm) 蛍光波長(nm) （Ａ） 326 432 （Ｂ） 328 432 （Ｃ） 328 432 （Ｄ） 328 432 （Ｅ） 328 432 （Ｆ） 328 432 ＨＰＰＡ 322 411
【００４５】実施例６ ＰＯＤの測定 化合物（Ｂ）を用い未知濃度のＰＯＤ量を測定した。用
いた試薬は以下のようである。
いた試薬は以下のようである。
【００４６】測定用緩衝液：50mMリン酸緩衝液、pH7.6
、塩化ナトリウム濃度5.7g/L。 基質液：25mM化合物（Ｂ）／測定用緩衝液。 過酸化水素溶液：20mM過酸化水素／測定用緩衝液。 標準液：1ppm硫酸キニーネ。 酵素希釈液：（0.2 ％ウシ血清アルブミン／測定用緩衝
液）。 サンプル：0.1mg POD 付加アビジン（シグマ社製）／10
ml酵素希釈液。
、塩化ナトリウム濃度5.7g/L。 基質液：25mM化合物（Ｂ）／測定用緩衝液。 過酸化水素溶液：20mM過酸化水素／測定用緩衝液。 標準液：1ppm硫酸キニーネ。 酵素希釈液：（0.2 ％ウシ血清アルブミン／測定用緩衝
液）。 サンプル：0.1mg POD 付加アビジン（シグマ社製）／10
ml酵素希釈液。
【００４７】測定用緩衝液 4ml、基質液 400μl 及び過
酸化水素溶液 200μl を混合し、37℃の水浴に 5分間浸
し、サンプル溶液 5μl を加えて37℃で10分間一定温度
に保った後、励起波長328nm 、蛍光波長432nm 、1ppm硫
酸キニーネを標準液として蛍光強度を測定した。
酸化水素溶液 200μl を混合し、37℃の水浴に 5分間浸
し、サンプル溶液 5μl を加えて37℃で10分間一定温度
に保った後、励起波長328nm 、蛍光波長432nm 、1ppm硫
酸キニーネを標準液として蛍光強度を測定した。
【００４８】測定された対蛍光強度は2.51を示し、図１
の検量線からサンプル溶液のＰＯＤ濃度は 1×10-11Mで
あることが分かった。
の検量線からサンプル溶液のＰＯＤ濃度は 1×10-11Mで
あることが分かった。
【００４９】
【発明の効果】本発明の蛍光基質化合物は、文献未載の
新規な且つ有用な物質で、過酸化水素とＰＯＤ又はそれ
と同等な触媒作用を持つ物質の存在下で蛍光性化合物を
生じ、高感度でＰＯＤ又はそれと同等の触媒作用を持つ
物質の測定を行なうことができる。
新規な且つ有用な物質で、過酸化水素とＰＯＤ又はそれ
と同等な触媒作用を持つ物質の存在下で蛍光性化合物を
生じ、高感度でＰＯＤ又はそれと同等の触媒作用を持つ
物質の測定を行なうことができる。
【００５０】本発明の蛍光基質化合物はカルボキシル基
を有しているため水に対する溶解性が高く、合成が容易
であり、中性溶液で活性炭処理を行なったのち、濾液を
酸性にして析出させることにより容易に精製でき、且つ
安定な化合物であるため、蛍光バックグラウンドが低
く、ＰＯＤ測定における感度がＨＰＰＡより数倍ないし
十数倍高い。また、発蛍光波長がＨＰＰＡよりも長波長
側にあるためサンプルからの蛍光の妨害を受け難い。
を有しているため水に対する溶解性が高く、合成が容易
であり、中性溶液で活性炭処理を行なったのち、濾液を
酸性にして析出させることにより容易に精製でき、且つ
安定な化合物であるため、蛍光バックグラウンドが低
く、ＰＯＤ測定における感度がＨＰＰＡより数倍ないし
十数倍高い。また、発蛍光波長がＨＰＰＡよりも長波長
側にあるためサンプルからの蛍光の妨害を受け難い。
【図１】本発明の化合物及びＨＰＰＡについてのＰＯＤ
濃度に対する蛍光強度の検量線である。
濃度に対する蛍光強度の検量線である。
Claims (2)
- 【請求項１】 一般式（１）、 【化１】 （式中、Ｒ1 はカルボキシアルキル基で、Ｒ2 は水素又
はアルキル基である）で示される新規p-ヒドロキシアセ
トアニリド誘導体及びその塩からなる新規蛍光基質化合
物。 - 【請求項２】 過酸化水素とペルオキシダーゼ類の存在
下に酸化発蛍光物質として一般式（１）、 【化２】 （式中、Ｒ1 はカルボキシアルキル基で、Ｒ2 は水素又
はアルキル基である）で示されるp-ヒドロキシアセトア
ニリド誘導体及びその塩類より選ばれた蛍光基質化合物
を用いて蛍光強度によりペルオキシダーゼ類の濃度を測
定することを特徴とする蛍光分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5226593A JP2561233B2 (ja) | 1993-08-02 | 1993-08-02 | 蛍光分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5226593A JP2561233B2 (ja) | 1993-08-02 | 1993-08-02 | 蛍光分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0748569A true JPH0748569A (ja) | 1995-02-21 |
| JP2561233B2 JP2561233B2 (ja) | 1996-12-04 |
Family
ID=16847621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5226593A Expired - Fee Related JP2561233B2 (ja) | 1993-08-02 | 1993-08-02 | 蛍光分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2561233B2 (ja) |
-
1993
- 1993-08-02 JP JP5226593A patent/JP2561233B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| INDIAN J.CHEM.=1976 * |
| J.MED.CHEM.=1979 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2561233B2 (ja) | 1996-12-04 |
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