JPH047760B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は抗体タンパクを固定化する方法に関す
る。更に詳しくは、水溶性抗体タンパクを、その
抗原−抗体反応活性を完全に保持しながら固体基
板上に該タンパクを高密度に固定化する方法に関
する。

＜背景及び従来技術＞ 抗体タンパクの抗原−抗体反応を利用した診断
技術に於て、抗体タンパクを固体基板上に固定化
する方法がこれまで数多く提案されてきた。これ
らの内、あるものは、抗体タンパクのアミノ基又
はカルボキシル基と反応又は吸着結合できる官能
基を有する固体表面に固定化するものであるが、
この場合、固定化のための反応条件の設定によつ
ては、抗体タンパクの変性や、非特異的反応によ
る活性部位の失活が起りやすいという問題点があ
つた。また、親水性ゲルの中に抗体タンパクを抱
き込ませて、固体基板上に固定化する方法も可能
性のある方法であるが、この場合、抗原タンパク
がゲル中の抗体タンパクに接近でき難くなり、抗
原−抗体反応を利用した診断材料としての感度低
下を招き易い。こうした方法に対して近年、水面
上に脂質膜を展開し、これに水中から水溶性酵素
（例、カタラーゼ，フエリチン，ヘミグロビン，
グルコースオキシダーゼ，etc.）や抗体タンパク
［免疫グロブリンＧ（IgG），IgE，etc］を吸着固
定化する試みが報告されている［バイオキミカ・
エト・バイオフイジカ・アクタ（Biochem.
Biophys.Acta.）225巻，382（1971）やジヤーナ
ル・オブ・セルラー・バイオケミストリー（J.
Cell.Biochem.）29，239（1985）等参照］。

これらは確かにタンパクを、その活性を保持し
たまま固定化する優れた方法であるが、この方法
に於て従来用いられてきた脂質膜は、ステアリン
酸、アラキン酸及びジパルミトイルホスフアチジ
ルコリン（DPPC）等の如く、水に対して可溶性
（少くとも、1μｇ／１水の溶解度）のもの、又
は水中で二分子膜ベシクルを形成しやすいもの
（DPPC等）であつた。従つて、水面上で該膜に
吸着された抗体タンパクは、時間が経つにつれ、
脂質膜と共に再び水中に再溶解したり、一旦固体
基板上に累積した後でも抗原水溶液に浸漬した
際、脱離しやすいという問題点を有していた。

＜発明の目的＞ 本発明者らは、かかる従来技術の欠点を克服
し、高い抗原−抗体反応活性の保持率と、高密度
な抗体タンパクの固定化を可能にすべく鋭意検討
の結果、本発明に到達したものである。

＜発明の開示＞ すなわち本発明は、水相面上に展開された炭素
原子数14〜23の長鎖脂肪酸の多価金属塩及び／又
はエステルの単分子膜に当該水相中に溶解した水
溶性抗体タンパクを接触させることにより当該水
相界面で抗体タンパク−単分子膜複合体を形成さ
せ、それを固体基板上に積層することを特徴とす
る脂質単分子膜により抗体タンパクを固定化する
方法である。

本発明でいう抗体タンパクとは、抗原−抗体反
応を起しうる水溶性タンパクの総称であり、その
分子中に抗原認識部位（Fabと略）と疎水性末端
部位（Fcと略）を有している。

かかる抗体タンパクの具体例としては、免疫グ
ロブリンＧ（IgGと略称），IgE，IgM及びこれら
の抗体，絨毛性性腺刺激ホルモン（HCG）抗体、
ガン胎児性抗原（CEA）抗体等があげられる。

これらの抗体タンパクの固定化にあたつては、
Fab部分を変性しないようにすることが肝要であ
るが、前述の如く従来の化学反応による固定化の
場合Fab部分も反応に関与して抗体タンパクの活
性低下を招いていた。本発明においては抗体タン
パクは、後述の脂質単分子膜中にFc部位で疎水
的に相互作用しながら高密度にくみ込まれるか、
イオン的相互作用により免疫活性を高く保持した
まま単分子膜に吸着固定される。

上記の抗体タンパクを固定化するための脂質単
分子膜としては、水面上で固体上の凝縮単分子膜
を形成し、水に実質的に溶解しないものが好まし
い。そのようなものとして、炭素原子数14〜22の
長鎖脂肪酸の多価金属塩及び／又はエステルが用
いられる。このような脂肪酸としてはミリスチン
酸（C₁₃H₂₇COOH），パルミチン酸
（C₁₅H₃₁COOH），ステアリン酸
（C₁₇H₃₅COOH），アラギン酸（C₁₉H₃₉COOH），
ベヘン酸（C₂₁H₄₃COOH）が代表的なものとし
て挙げられる。従つてCnH2n＋1COM（ｎ＝14〜
22，Ｍ＝アルカリ土類金属、カドミウム、アルミ
ニウム等の多価金属イオン）で表わされる長鎖脂
肪酸の多価金属塩及び前記脂肪酸のメタノール又
はエタノールとのエステルである。

これらは例えばカルボン酸又はそのエステルの
状態でベンゼンやクロロホルム等の有機溶媒に溶
解させ、0.5〜1.5ミリモル／の溶液となしたの
ち、これを蒸溜水又は多価金属塩（例えば、塩化
バリウム、塩化カドミウム、塩化アルミニウム）
を含む、PH6.5〜7.5の水溶液表面上に展開するこ
とにより、本発明に用いる単分子膜となしうる。
次いで、該単分子膜を、その表面圧力が１〜
30mN（ミリＮ）／ｍになるように圧縮したのち、
そのままの圧縮条件で膜面下の水相に前記の抗体
タンパクを注入する。所定時間（通常、30分〜１
時間）、該抗体タンパクと水面上の単分子膜とを
接触させておくことにより、タンパクと該単分子
膜との複合化が完了する。この時点で抗体タンパ
クと単分子膜との複合体膜を、表面圧力30〜50ミ
リＮ／ｍにて再び圧縮したのち、固体基板上にラ
ングミユア・ブロジエツト法又は水平付着法（詳
細は新実験化学講座第18巻第439頁参照）により
一層又は複数層積層することができる。

その際の抗体タンパクの固体基板上への固定化
量は、積層時の水面展開膜の基板への転移比及び
UV−吸収スペクトル強度より算出される。

かくして得られた基板上の複合体は、抗体タン
パクの抗原−抗体反応活性を酵素免疫診断法
（EIA）により求めた結果、すぐれた活性を示す
ものであつた。

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明す
る。

実施例 １ ステアリン酸（C₁₇H₃₅CO₂H）10mgを25mlの蒸
留クロロホルムに溶解し、562cm²の水槽表面積を
有する表面圧−面積曲線（以下、π−Ａ曲線と略
す）測定用水槽に張つた塩化バリウム３×10^-5M
炭酸水素カリウム４×10^-4M混合水溶液上にウル
トラマイクロピペツトを用いて、上記溶液150μ
を徐々に滴下した。滴下終了後水面展開膜を５
分間静置してからヒトIgG水溶液を濃度0.03mg／
mlになるように水槽中へ注入した。１時間静置後
仕切板の移動を開始しπ−Ａ曲線を測定した。そ
の結果、π−Ａ曲線はステアリン酸を単独展開し
た場合に比して膨脹したものとなつた。

この水面展開膜を30ミリＮ／ｍの表面圧力下で
圧縮しながら、疎水化処理（シランカツプリング
処理）を施した石英板上に垂直浸漬引き上げ法
（以降LB法と略）によつて２層累積した。

平均累積比は0.74であつた。紫外吸収スペクト
ル測定によると、石英板上のヒトIgGの被覆率は
3.0×10^-8mol／m²であつた。

次いでこの累積膜にペルオキシターゼ標識抗ヒ
トIgG抗体（20μ／ml）液を作用させた後、オ
ルトフエニレンジアミン、過酸化水素混合溶液中
に浸漬した処、呈色（褐色）が認められ、累積膜
中のヒトIgGの抗原活性が保持されていることが
わかつた。

比較例 実施例１と同様に調製したステアリン酸溶液
150μをπ−Ａ測定用水槽に張つた蒸溜水上に
徐々に滴下した。滴下終了後水面展開膜を５分間
静置してから表面圧30ミリＮ／ｍに保つよう仕切
板を移動させた処、水面展開膜の面積は減少しつ
づけ、ステアリン酸の蒸溜水中への溶解が見られ
た。

実施例 ２ 実施例１に於て、ステアリン酸の代りに、パル
ミチン酸を用いて同様に塩化バリウムと炭酸水素
カリウムの稀薄水溶液表面上に展開した後、30分
静置後、30ミリＮ／ｍの表面圧下で圧縮しなが
ら、石英ガラス基板に２層累積した。その際の累
積比は0.72であつた。このものは、実施例１と同
様にして抗原活性を評価した処、水溶液状態での
抗原活性と同等の活性を有していた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 水相面上に展開された炭素原子数14〜22の長
   鎖脂肪酸の多価金属塩及び／又はエステルの単分
   子膜に当該水相中に溶解した水溶性抗体タンパク
   を接触させることにより当該水相界面で抗体タン
   パク−単分子膜複合体を形成させ、それを固体基
   板上に積層することを特徴とする脂質単分子膜に
   より抗体タンパクを固定化する方法。