JPH047759B2

JPH047759B2 -

Info

Publication number: JPH047759B2
Application number: JP19722086A
Authority: JP
Inventors: Takeyuki Kawaguchi; Hisashi Jo
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1986-08-25
Filing date: 1986-08-25
Publication date: 1992-02-12
Also published as: JPS6354399A

Description

【発明の詳細な説明】＜産業上の利用分野＞本発明は抗体タンパクを固定化する方法に関す
る。更に詳しくは、水溶性抗体タンパクを、その
抗原−抗体反応活性を完全に保持しながら固体基
板上に該タンパクを高密度に固定化する方法に関
する。

＜背景及び従来技術＞抗体タンパクの抗原−抗体反応を利用した診断
技術に於て、抗体タンパクを固体基板上に固定化
する方法がこれまで数多く提案されてきた。これ
らの内、あるものは、抗体タンパクのアミノ基又
はカルボキシル基と反応又は吸着結合できる官能
基を有する固体表面に固定化するものであるが、
この場合、固定化のための反応条件の設定によつ
ては、抗体タンパクの変性や、非特異的反応によ
る活性部位の失活が起りやすいという問題点があ
つた。また、親水性ゲルの中に抗体タンパクを抱
き込ませて、固体基板上に固定化する方法も可能
性のある方法であるが、この場合、抗原タンパク
がゲル中の抗体タンパクに接近でき難くなり、抗
原−抗体反応を利用した診断材料としての感度低
下を招き易い。こうした方法に対して近年、水面
上に脂質膜を展開し、これに水中から水溶性酵素
（例、カタラーゼ，フエリチン，ヘミグロビン，
グルコースオキシダーゼ，etc.）や抗体タンパク
［免疫グロブリンＧ（IgG），IgE，etc］を吸着固
定化する試みが報告されている［バイオキミカ・
エト・バイオフイジカ・アクタ（Biochem.
Biophys.Acta.）225巻，382（1971）やジヤーナ
ル・オブ・セルラー・バイオケミストリー（J.
Cell.Biochem.）29，239（1985）等参照］。

これらは確かにタンパクを、その活性を保持し
たまま固定化する優れた方法であるが、この方法
に於て従来用いられてきた脂質膜は、ステアリン
酸、アラキン酸及びジパルミトイルホスフアチジ
ルコリン（DPPC）等の如く、水に対して可溶性
（少くとも、1μｇ／１水の溶解度）のもの、又
は水中で二分子膜ベシクルを形成しやすいもの
（DPPC等）であつた。従つて、水面上で該膜に
吸着された抗体タンパクは、時間が経つにつれ、
脂質膜と共に再び水中に再溶解したり、一旦固体
基板上に累積した後でも抗原水溶液に浸漬した
際、脱離しやすいという問題点を有していた。

＜発明の目的＞本発明者らは、かかる従来技術の欠点を克服
し、高い抗原−抗体反応活性の保持率と、高密度
な抗体タンパクの固定化を可能にすべく鋭意検討
の結果、本発明に到達したものである。

＜発明の開示＞すなわち本発明は、水相面上に展開された炭素
原子数24〜32の長鎖脂肪酸、その多価金属塩及
び／又はそのエステルの単分子膜に当該水相中に
溶解した水溶性抗体タンパクを接触させることに
より当該水相界面で抗体タンパク−単分子膜複合
体を形成させ、それを固体基板上に積層すること
を特徴とする脂質単分子膜を用いた抗体タンパク
の固定化方法である。

本発明でいう抗体タンパクとは、抗原−抗体反
応を起しうる水溶性タンパクの総称であり、その
分子中に抗原認識部位（Fabと略）と疎水性末端
部位（Fcと略）を有している。

かかる抗体タンパクの具体例としては、免疫グ
ロブリンＧ（IgGと略称），IgE，IgM及びこれら
の抗体，絨毛性性腺刺激ホルモン（HCG）抗体、
ガン胎児性抗原（CEA）抗体等があげられる。

これらの抗体タンパクの固定化にあたつては、
Fab部分を変性しないようにすることが肝要であ
るが、前述の如く従来の化学反応による固定化の
場合Fab部分も反応に関与して抗体タンパクの活
性低下を招いていた。本発明においては抗体タン
パクは、後述の脂質単分子膜中にFc部位で疎水
的に相互作用しながら高密度にくみ込まれるか、
イオン的相互作用により免疫活性を高く保持した
まま単分子膜に吸着固定される。

上記の抗体タンパクを固定化するための脂質単
分子膜としては、水面上で固体上の凝縮単分子膜
を形成し、水に実質的に溶解しないものが好まし
い。そのようなものの具体例としては、炭素原子
数24〜32の長鎖脂肪酸、その多価金属塩及び／又
はそのエステルが用いられる。そのような性質を
有する化合物としては、リグノセリン酸
（C₂₃H₄₇COOH），セロチン酸（C₂₅H₅₁COOH），
モンタン酸（C₂₇H₅₅COOH），メリシン酸
（C₂₉H₅₉COOH），ラクセロン酸（C₃₁H₆₃COOH）
及びCnH2n＋1COOM（ｎ＝23〜31，Ｍ＝アルカ
リ土類金属、カドミウム、アルミニウム等の多価
金属イオン）で表わされる長鎖脂肪酸の多価金属
塩及びそれら脂肪酸のメタノール又はエタノール
とのエステルである。これらは例えばカルボン酸
又はそのエステルの状態でベンゼンやクロロホル
ム等の有機溶媒に溶解させ、0.5〜1.5ミリモル／
の溶液となしたのち、これを蒸溜水又は多価金
属塩（例えば、塩化バリウム、塩化カドミウム、
塩化アルミニウム）を含む、PH6.5〜7.5の水溶液
表面上に展開することにより、単分子膜となしう
る。次いで、該単分子膜を、その表面圧力が１〜
30mN（ミリＮ）／ｍになるように圧縮したのち、
そのままの圧縮条件で膜面下の水相に前記の抗体
タンパクを注入する。所定時間（通常、30分〜１
時間）、該抗体タンパクと水面上の単分子膜とを
接触させておくことにより、タンパクと該単分子
膜との複合化が完了する。この時点で抗体タンパ
クと単分子膜との複合体膜を、表面圧力30〜50ミ
リＮ／ｍにて再び圧縮したのち、固体基板上にラ
ングミユア・ブロジエツト法又は水平付着法（詳
細は新実験化学講座第18巻第439頁参照）により
一層又は複数層積層することができる。

その際の抗体タンパクの固体基板上への固定化
量は、積層時の水面展開膜の基板への転移比及び
UV−吸収スペクトル強度より算出される。

かくして得られた基板上の複合体は、抗体タン
パクの抗原−抗体反応活性を酵素免疫診断法
（EIA）により求めた結果、すぐれた活性を示す
ものであつた。

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明す
る。

実施例１リグノセリン酸（C₂₃H₄₇CO₂H）８mgを25mlの
蒸留クロロホルムに溶解し蒸溜水を張つた。π−
Ａ測定用水槽上に上記溶液100μを徐々に滴下
した。滴下終了後、水面展開膜を５分間静置した
後表面圧20mN／ｍになるまで仕切板を移動し
た。ヒトIgG水溶液を水槽中濃度0.03mg／mlにな
るように水中から注入した後１時間静置した。こ
の水面展開膜を、30mN／ｍの表面圧下で圧縮し
ながら、疎水化処理（シランカツプリング処理）
を施した石英板上に垂直浸漬引上げ法（以下、
LB法と称す）により２層累積した処、平均累積
比は0.7であつた。紫外吸収スペクトルから求め
た石英板上に累積したヒトIgGの被覆率は1.6×
10^-8mol／m²であつた。この累積膜にペルオキシ
ターゼ標識抗ヒトIgG抗体（20μ／ml）液を作
用させた後、オルトフエニレンジアミン、過酸化
水素混合溶液中に浸漬して累積膜中の抗原活性を
調べた処、活性を保持していることがわかつた。

実施例２実施例１に於て、リグノセリン酸を用いる代り
に、ラクセロン酸（C₃₁H₆₃COOH）を用いて水
面展開膜を形成し水中よりヒトIgGを吸着させた
のち、石英ガラス基板上に累積した処、平均累積
比は0.82であつた。また、実施例１と同様にして
このものの抗原活性を調べた処、水中に溶解して
いるIgGと同じ程度の高い活性を保持していた。

比較例１ステアリン酸溶液を用いて実施例１と同様にし
て水面上に単分子膜を展開し、その後、水中にヒ
トIgGを注入した。５分間静置後、表面圧30ミリ
Ｎ／ｍを保つよう仕切り板を移動させた処、水面
展開膜の面積は減少し続け、ステアリン酸のIgG
水溶液中への部分溶解が見られた。この水面展開
膜を、石英ガラス板上にLB法によつて２層累積
した処、その累積比は0.41と低く、累積中に膜の
部分的剥離が観察された。この膜の抗原活性を実
施例１と同様にして評価した処、水溶液状態での
IgG活性の1/3〜1/4に低下していた。

Claims

【特許請求の範囲】

１水相面上に展開された炭素原子数24〜32の長
鎖脂肪酸、その多価金属塩及び／又はそのエステ
ルの単分子膜に当該水相中に溶解した水溶性抗体
タンパクを接触させることにより当該水相界面で
抗体タンパク−単分子膜複合体を形成させ、それ
を固体基板上に積層することを特徴とする脂質単
分子膜を用いた抗体タンパクの固定化方法。