JPH0474197A - 新規な免疫調整生理活性ペプチド - Google Patents

新規な免疫調整生理活性ペプチド

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JPH0474197A
JPH0474197A JP2182714A JP18271490A JPH0474197A JP H0474197 A JPH0474197 A JP H0474197A JP 2182714 A JP2182714 A JP 2182714A JP 18271490 A JP18271490 A JP 18271490A JP H0474197 A JPH0474197 A JP H0474197A
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val
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peptide
toxoplasma
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規な生理活性ペプチドに関する。
更に詳細には、本発明は、トキソプラズマ増殖抑制作用
、抗腫瘍作用、抗ウィルス作用に代表される免疫調整作
用を有する新規な実質的に純粋な生理活性ペプチドに関
する。本発明は又、この実質的に純粋な生理活性ペプチ
ドを有効成分として含有する医薬組成物に関する。
（従来の技術） トキソプラズマ（Ｔｏｘａｐｌａｓｍａ　）は哺乳動物
の内皮細胞に寄生する原虫の一種で、家畜の病原原虫体
として、またヒト脳を髄炎の病原体として恐れられてい
る。このトキソプラズマは健康な宿主のマクロファージ
に摂取されても、一般微生物と異なり、マクロファージ
の膜機能から逃亡し、内部出芽による分裂増殖を繰り返
す。
一方、トキソプラズマ過免疫動物では、そのマクロファ
ージは虫体を殺し、消化する作用が観察されている。そ
の血清中には該動物の正常細胞内のトキソプラズマ増殖
を抑制する液性因子（サイトカイン）が存在することが
知られている［５６ｔｈｉ。
に、に、　　ｅＬ　　ａｌ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３
１，１１５１−１５５８（１９７５）］　　。
またトトキソプラズマ過免疫動物の牌臓細胞をトキソプ
ラズマ原虫溶解抗原（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　　Ｉｙｓ
ａＬｅａｎｔｉｇｅｎ　　以下”　Ｔ　Ｌ　Ａ　”と称
す）の存在下で培養した培養土γ１Ｉｉ１１１１こも、
同様に細胞内でのトキソプラズマ増殖を抑制するサイト
カインが存在することが分かつている［５ｈｉｒａｈａ
Ｌａ、Ｔ、、Ｓｈｉｍｉｚｕ、に、＆Ｓｕ７、ｕｋｉ、
Ｎ、　Ｚ、ＰａｒａｓｉＬｅｎｋｄ、４９．ｌｌ−２３
（１９７６）］。
このサイトカインは感作Ｔリンパ球の産生物質と推察さ
れる分子量３〜４万の糖蛋白で、トキソプラズマ増殖抑
制因子（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ＧＩＯＷＬＩＩ　１ｎ
ｌｕｂ＋ｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ：以下”Ｔｏｘｏ−Ｇ
ＩＦ”と称す）と呼ばれてし）る　［Ｓｌ＋１ｒａｌ＋
ａしａ、Ｔ、、Ｓｈｉｍｉｚｕ、に、＆　　５ｕｚｕｋ
ｉ、Ｎ、　　Ｚ。
ＰａｒａｓｉＬｃｎｋｄ、４０．１ｌ−２３（１９７６
）及びＮａｇａｓａｗａ、　Ｉｆ。
ｅＬ　ａｌ、　　１ｍｍｕｎｏｂｉｏ１．１５６．３０
７−３１９（１９８０）］、このＴｏｘｏ−ＧＩＦはマ
クロファージ内での増殖のみならず他の体細胞でのトキ
ソプラズマ増殖をも抑制する。
しかし宿主と同じ動物種の細胞内における原虫の増殖を
阻止するのみで、異種の動物での増殖は阻止できない［
Ｎａｇａｓａｗａ、Ｉｌ、ｅＬ　ａｌ、　１ｍｍｕｎｏ
ｂ＋ｏｌ。
１５６、３０７−３１９　（１９８０）及びＭａｔｓｕ
ｍｏｔｏ、Ｙ、　ｅｔ　ａｌ。
Ｚｂｌ、Ｂａｋｃ、ｌＩｙｇ、Ａ　２５０，３８３−３
９１（１９８１））。このような種属特異性が強いため
、Ｔｏｘｏ−ＧＩＦはヒトや宿主以外の動物のトキソプ
ラズマ感染症の予防、治療に用いることができなかった
。
このような状況下で、本発明者は、先に、トキソプラズ
マ免疫動物血清の加水分解によって得られる低分子量の
物質が種属特異性のないトキソプラズマ増殖抑制活性の
みならず原虫や細菌、ウィルス等に対する抗微生物活性
、さらには抗腫瘍活性を示すことを知見した〔特開昭５
７−１４２９２２号、特開昭５７−１４４９８３号及び
米国特許第４４８２５４３号Ｊ。
このトキソプラズマ免疫動物血清由来加水分解物質はオ
ビオアクチン（Ｏｂｉｏａｃｔｊｎ）と命名された［５
ｕｚｕｋｉ、Ｎ、　　ｅＬ　　ａｌ、　　Ｚｂｌ、Ｂａ
ｋｔＪＩｙｇ、１．Ａｂｔ、Ｏｒｉｇ。
Ａ２５６．３５６−３６６（＋９８４））。このオビオ
アクチンは分子量５０００以下のポリペプチド物質であ
り同種細胞だけでなく、異種細胞内におけるトキソプラ
ズマ増殖を抑制する（Ｓｕｚｕｋｉ、Ｎ、　ｅｔ　ａｌ
、　Ｚｂｌ、Ｂａｋｔ、Ｈｙｇ。
１、Ａｂｔ、Ｏｒｉｇ、　Ａ２５６．３６７−３８０（
１９８４））。
天然オビオアクチンは多くの異なるペプチドの集合体で
あると考えられ、それらの各ペプチドの活性中心ペプチ
ドの同定によりその合成が可能になれば、その用途にお
ける効果は飛躍的に増大することが期待される。
しかし、上記のように、天然オヒオアクチンは多くの異
なるペプチドの集合体乃至混合物と考えられ、グロマト
グラフイーの手法により得られる精製分画されたオビオ
アクチンについてアミノ酸解析を行なっても、集合体乃
至混合物中の多くの異なるペプチドのアミノ酸配列を求
めることは至難の技である。
本発明者は、先に、０ＤＳ−＋２０Ｔ逆相クロマトグラ
フイーによる精製オビオアクチンの成る画分のアミノ酸
解析を行なったが、Ｎ末端からの第１位、第２位、第３
位以下の各位置のアミノ酸としてそれぞれ複数のアミノ
酸が検出され、画分に含有されるペプチドのアミノ酸配
列の一義的な決定は不可能であった。しかし、偶然にも
、成るアミノ酸配列が所望の活性を有することを知見し
た（特開！Ｚ１　１７！’１９９６号１ｏ即ち、特開平
１−１７５９９６号明細書は、次式（６）〜（９）のア
ミノ酸配列の群から選ばれるアミノ酸配列を有する実質
的に純粋なペプチドを開示している。
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇ１．ｕ−Ｇｌｕ　
　　　（６）Ｇｌｕ−Ｇ１．＋ｒＧＩｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｕ　　　　　　（７）Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
−Ａｓｐ　　　　　（８）及び八１ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ　　　　　（９）上記の式（
６）〜（９）のうち、式（６）のアミノ酸配列を有する
ペプチドが最も高いトキソプラズマ増殖抑制活性を示す
。そこで、本発明者は、式（６）のアミノ酸配列を有す
るペプチドをオビオペプチドーｌ（以下”０ｂｉｏ−１
”と称す）と命名した。
（発明が解決しようとする問題点） しかし、オビオアクチンを構成する多数の異なったペプ
チドの１部のペプチドの活性中心ペプチドと考えられる
上記の式（６）〜（９）のペプチド以外にも、より多く
の活性中心ペプチドの存在が考えられる。本発明者はこ
れらの他の活性中心ペプチドの存在の確認とその構造の
解明のみならず所望の活性及び作用機序の解析により、
新規てＬｔつ有用なペプチドを開発すべく鋭意研究の結
果。
他の活性中心ペプチドと考えられる新規な５種のペプチ
ドを開発し、そのトキソプラズマ増殖抑制活性を確認し
た。又、それらの５種のペプチドの少なくとも１種と先
に開発した式（６）〜（９）のペプチドの少なくとも１
種とを組合せて得られるペプチド組成物が驚く入きこと
に予期せぬ優れた相乗効果を発揮することをも知見し、
本発明に到達したものである。
（問題を解決するための手段および作用）即ち、本発明
の１つの態様によれば、次式（１）％式％（１） のアミノ酸配列の群から選ばれる１種のアミノ酸配列を
含有する実質的な純粋な生理活性ペプチドが提供される
。
本発明の池の態様によれば、次式（１）〜（５）％式％
（１） のアミノ酸配列をそれぞれ含有する５種の実質的に純粋
なペプチドよりなる群から選ばれる少なくとも１種のペ
プチドと次式（６）〜（９）％式％（６） のアミノ酸配列をそれぞれ含有する４種の実質的に純粋
なペプチドよりなる群から選ばれる少なくとも１種のペ
プチドとを含有してなる生理活性ペプチド組成物が提供
される。
更に他の態様によれば、抗原虫、抗細菌、抗ウィルス又
は抗腫瘍作用に有効な量の上記生理活性ペプチド又は」
１記生理活性ペプチド組成物と少なくとも１種の薬学的
に投与可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含有する医薬組
成物が提供される。
なお、上記の式（１）〜（５）の各々のアミノ酸配列に
おいて左末端のアミノ酸はＮ末端アミノ酸であり、右末
端のアミノ酸はＣ末端のアミノ酸である。
本発明において、トキソプラズマ増殖抑制効果は、［ト
キソプラズマ保有細胞出現率ｊと「トキソプラズマ増殖
抑制活性活性（以下、”Ｔｏｘｏ−ＧＩＦ活性パと称す
）ｊの２つの特性により評価する。それらの特性は、Ｎ
ａｇａｓａｗａ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　Ｊｐｎ、Ｊ、Ｖｅ
ｔ。
Ｓｃｉ、　４３，３０７−３１９（１９８１）及び５ａ
ｋｕｒａｉ、）Ｉ、、　ｅｔ　ａｌ。
Ｊｐｎ、Ｊ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、ｌｌｙｇ、　１０．１
８３−１９５（１９８２）に記載の方法に準拠して測定
することができる。
■トキソプラズマ保有細胞出現率の測定（ａ）マウス　
マクロファージおよびイヌ単球における効果 成熟ＢＡＬＢ／Ｃ系雌マウス腹腔内に滅菌０．２％グリ
コーゲン加生理食塩水１ｍｆｆを注入し、５日後に冷ハ
ンクスＭ（ｌｌａｎｋ　ｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　５ａｌ
ｔ　５ｏｌＩｕ、ｉｏｎ以下’１ｌＢｓｓ”と称す）に
て腹腔内を洗浄し腹腔的浸出細胞（ｐｅｒｉ＋、ｏｎｅ
ａｌ　ｅｘｕｄａｔｅ　ｃｅｌｌ）を採取した。遠心操
作（２５０Ｇ、５分）により２回洗浄した細胞を１×ｌ
Ｏ“ｃｅｌ　Ｉｓ／ｍ　Ｑの割合で１０％−ＩＩＩｃｓ
−Ｔｃ１９９培養液に浮遊させた。この細胞浮遊液を１
ｍｆｆずつ径１５ｍｍの円形カバーグラスを落し込んだ
培養シャーレ（Ｍｕ　Ｉ　Ｌ　１ｄｉｓｈ（ｒａｙ、Ｆ
Ｂ−１６−２４−ＴＣ１米国Ｌｉｎｂｌｏ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａ１社製）内に分注し、５％炭酸ガス培養器内で培養
した。混入する赤血球やリンパ球系細胞を除去するため
に、各培養シャーレを２時間ごとに３回、ｌｌＢｓ５で
静かに洗浄後、−夜炭酸ガス培養器内で培養してカバー
グラス上にマウス　マクロファージのモル−ヤを形成さ
せた。
一方、イヌ単球の調製に際しては、０．０５％ヘパリン
加末梢血液として頚静脈より血液５ｍＱを採血した。こ
の血液をＣｏｎｒａｙ　４００−Ｆｉｃｏｌｌ法［辻公
美、免疫実験操作法、４版、免疫細胞Ｉの４　、４４３
−４４６頁、前田印刷株式会社（＋９７９））にて単核
細胞画分を採取した。得られた細胞画分をＨＢＳＳおよ
び１０％熱１１゛動化仔牛血清（ｌＩＩｃｓ）を添加し
た１１）９培養液（Ｔｃ１９！］）　（医学の歩み）６
２、Ｎｏ、６、昭和４２年８１１５０発行参考）（以下
、゛ｌＯ％−１１１ｃｓ−Ｔｃ１９９培養液パと称す）
にて１回ずつ遠心（８００Ｇ、５分間、４℃）後、約Ｉ
　Ｘ　ｌｏ’ｃＯＩ　Ｉｓ／ｍ　Ｑの割合で１０％−ｔ
ｌｌｃｓ−Ｔｃ１９９培養液に浮遊さセた。この細胞浮
遊液をＩｍｐずつ径１５ｍｍの円形カバーグラスの培養
シャーレ内に分注して、培養器内で培養した。培養後１
２時間を経て、３回１１Ｂｓｓで静かに洗浄後、−夜Ｃ
Ｏ２培養器内で培養し、イヌ単球モル−ヤを作成した。
上記のようにして得られたモル−ヤを１０％Ｉｃ５−Ｔ
ｃ１９９培養液で再び洗浄した後、トキソプラズマＲ１
１株栄養型虫体をマウス　マクロファージおよびイヌ単
球１ｘｌｏ°個あたり１×１０°となるように添加・感
染させた。細胞内に穿入しなかった遊離虫体は感染１時
間後にＨＢＳＳで洗浄除去した。
このカバーグラスに各試料を含む１０％−ＨＩＣ３Ｔｃ
　Ｉ　９９培養液（マウス　マクロファージおよびイヌ
単球Ｉ　Ｘ　１０’個当たりｌ＋ｎＱ）添加し、４８時
間培養した後、Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｓａて染色して細胞内
のトキソプラズマ数を算定した。カバーグラス上の一定
視野での細胞１００個あたりについて、含有虫体数か０
個である細胞の数、含有虫体数が１個から５個である細
胞の数、含有虫体数が６個以上である細胞の数をそれぞ
れ数え百分率を求める。同様な操作をカバーグラスの他
の４ケ所の視野でも行ない、合計５ケ所での値からそれ
ぞれの平均値と標準偏差を求めてトキソプラズマ含有細
胞出現率とした。
（ｂ）ヒト心筋細胞（Ｇｉａｒｄｉ　１ｌｅａｒｔ）お
よび脳細胞（Ｆｌｏｗ　３０００）における効果・細胞
をｌＸｌ０’″ｃｅｌｌｓ／ｍ　Ｑの割合で１０％熱非
働化ウシつ仔血清（Ｆｅ２）添加ＨＥＭ−Ｍ培養液に浮
遊させた。
この浮遊液をＩｎＱずつ直径１５順の円形カバーグラス
を落し込んだ培養シャーレ（Ｍｕｌｔｉｄｉｓｈ−ｔｒ
ａｙ。
ＦＢ−１６−２４−ＴＯ，Ｌｉｎｂｌｏ　Ｃｈｅ＋ａｉ
ｃａｌ　Ｃｏ、製）内に分注し、５％炭酸ガス培養器内
で培養した。−夜炭酸ガス培養器内で培養してカバーグ
ラス上にモル−ヤ細胞層を形成させた。
このモル−ヤ細胞層ＭＥＭ−阿培養液で洗浄した後、ト
キソプラズマＲ１１株虫体を細胞１×１０″個あたす１
　ｘ　ＩＱ’個となるように添加・感染した。細胞内に
穿孔しなかった遊離虫体は感染１時間後にＩＩＩＩｓｓ
て洗浄除去した。
このカバーグラスに各試料を含む培養液にＩｎＱを添加
し、４８時間培養した。培養後、Ｍａｙ　−ＧｒｕｎＷ
ａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色して細胞内のトキソプラズマ
数を算定し、マウス　マクロファージの場合と同様にし
て求めた。
■Ｔｏｘ○−ＧＩＦ活性の測定 トキソプラズマ増殖抑制活性の別の表現方法でるＴｏｘ
ｏ−ＧＩＦ活性は、試料添加によるトキソプラズマ（Ｔ
ｐ）含有細胞（百分率）の減少の割合から求められるも
ので百分率で表示され、次式により与えられる。
試料は各粉末試料を、３ｍＱ、の１０％−旧Ｃ３−ＴＣ
１９９培養液に溶解し、０．４６μｍ孔の膜フィルタで
濾過滅菌したものを用いた。
なお、上記■及び■の測定において、試料濃度は、次に
述べる組オビオアグチン、オビオアグチンの各画分ては
５．０ｍｇ／ｍＱ、本発明の合成ペプチドでは０．５■
／ｍＱとした。
次に、オビオアグチンの活性中心ペプチドと考えられる
本発明の生理活性ペプチドの開発に導いた粗オピオアク
チンの高速液体グロマトグラフイー及び逆クロマトグラ
フィーによる精製オビオアクチンの両分について説明す
る。
（１）粗オビオアクチンの調製 粗オビオアクチンは、特開昭５７−１４２９２２号及び
同５７−１４４９８３号に記載の方法に従って得ること
ができるが、本発明においては、５ｕｚｕｋｉらの方法
［５ｕｚｕｋｉ、Ｎ、　　ｅｔ　　ａｌ、　　Ｚｂｌ、
Ｂａｋｔ、Ｈｙｇ、ｌ、Ａｂｔ、Ｏｒｊｇ。
Ａ２５６．３５６−３６６（＋９８４））に準じて調製
した。すなわち健康ホルスタイン牛（６〜８ヶ月齢）に
トキソプラズマＲ１１株栄養型虫体く帯広畜産大学、大
阪大学微生物病研究所原虫学部門、国立予防衛生研究所
などより入手できる）（ＩＸＩＯ”個）を静脈内接種し
、初感染後５週目に同じトキソプラズマＲＨ株（ｌ　Ｘ
　１０゜個）を同様に静脈内接種して攻撃した。攻撃後
２週口にＴＩ、＾［１ｐ　ｇ　／ｋｇ　ｂｏｄｙ　ｗｅ
ｉｇ旧１．　１ｇａｒａｃＮｌ＋ｉらの方法て調製；　
（Ｉｇａｒａｓｂｉ、ｌ、　ｐｔ、　ａｌ、　Ｚｂｌ、
１（ａｋｔ、ｌｌｙｇ。
、Ａｂ＋、、Ｏｒｉｇ、　Ａ２４４．３７４−３８２（
１９７９Ｎ］を静脈内投与し、その２４時間後に採血し
た。得られた血清の抗体価はラテックス凝集反応試験て
ｌ：３，２００以上を示した。この血清を用いてオビオ
アクチンを調製した。
血清１００ｍＱあたり０．＋ｇのプロテアーセ（プロナ
ーゼを用いた）を添加し３７℃で１２時間インキュベー
ト後、１０規定水酸化ナトリウムを血清１００ｍＱあた
りＩＯ＋ｎＱ滴下して１００℃にて１時間アルカリ加水
分解した。その後、反応液を４℃に冷却し１０規定塩酸
滴下によりｐＨ７，０±０．１まで戻した。
得られた加水分解血清は、１０．　ＯＯＯｒｐｍ（ＩＱ
、　７００Ｇ）にて２０分間遠心して残渣を取り除いた
後、セファクリルＳ−２００（スウェーデン、ファルマ
シア社製）、トーヨーバールＩＩＷ−４０（東洋曹達社
製）にて順次ゲル濾過し、トキソプラズマ増殖抑制効果
を有する画分を得た。これを凍結乾燥して粗オビオアク
チンとした。
（■１）オビオアクチンの精製 （１）ｌ）ＩＥＡＥ−５ｒ’Ｗ高速液体グロマトグラフ
イー前述の如く調製された粗オビオアクチンをＤＥＡＥ
ｓｐｗ（２１，５ｍｍＸ１５ｃｍ）カラム（東洋曹達社
製）を用いて０．０２モル酢酸アンモニウムを基本とし
たＯから１モルの塩化ナトリウム濃度勾配イオン交換ク
ロマトグラフ法にて分画した。得られたクロマトグラム
を第１図に示す。それぞれの両分は凍結乾燥後、５ｅｐ
ｈａｄｅｘ　Ｇ−１５（７７）ｌｙマシア社、スウェー
デン）のゲル濾過にて脱塩し再度凍結乾燥した。各両分
の粉末試料を５■／ＩＩＩαとなるように１０％−旧Ｃ
３−Ｔｃ１９９培養液に溶解して、マウス腹腔マクロフ
ァージを用いてトキソプラズマ増殖抑制効果を評価した
。その結果を第１表に示す。
第１表に示すように、Ｔｏｘｏ−Ｃ＋ＩＦ活性は、第１
画分（Ｆｒ、］）で−３８，２％、第２画分（Ｆｒ、２
）で１０．８％、第３画分（Ｆｒ、３）で２３．１％、
第４画分（Ｆｒ、４）で１６．１％を示した。この結果
から、第３画分を活性分画として集め、次の精製を行な
った。
（２）ｆｌＤｓ−１２０Ｔ　　逆相グロマトグラフイ」
二記第３分画を０ＤＳ−１２０Ｔカラム（東洋曹達社製
）を用いて０，１χトリフオロ酢酸に対して１０％から
１００％のアセトニトリル濃度勾配による逆相クロマト
グラムを行なって得られたクロマトグラムを第２図に示
す。各両分のトキソプラズマ増殖抑制効果を調べた。結
果を第２表に示す。
第２表に示すごとく、第１画分（Ｆｒ、３−１）は９７
．６％、第２画分（Ｆｒ、　３−２）は９６．８％、第
３画分（Ｆｒ、３−３）は９７．３％、第４画分（Ｆｒ
、３−４）は９９．２％のＴｏｘｏ−ＧＩＦ活性を各々
示した。第４画分（Ｆｒ、３−４）については、前記し
たように、本発明者は既にアミノ酸組成を調べ、それに
基づいて新規な生理活性ペプチドを開発した（特開平１
−１７５９９６号）。
そこで、本発明者は、第３画分（Ｆｒ、３−３）のアミ
ノ酸組成の解析を行なった。
（以下余白） （Ｉｌｌ）　Ｆｒ、３−３画分のアミノ酸組成の解析精
製オビオアクチン画分［０ＤＳ−１２０Ｔ第３画分（Ｆ
ｒ、３３−３）８００ｐ］は０．１％チオグリコールを
含む定沸点塩酸（６規定）０．２ｍ　Ｑで封管し、１１
０℃で２４時間加水分解した後、日立８３型アミノ酸分
析装置でＯＰ＾］時亜法（ＢｅｎｓｏＲ，Ｊ、、　ｅＬ
　ａｌ、　ｒ’ｒｏｃ、ＮａＬ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　７２．６１９−６２２（１９７５
）及びＢｏｈｌｅｎ、Ｐ。
Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｙ、　９１．１
７−２６（＋９８４）］よりアミノ酸組成を分析した。
アミノ酸組成の解析はアプライドバイオシステム社（米
国）製プロテインシークエンサ（Ｐｒｏｔｅｉｎｎｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｒ）を用い、Ｅｄｍａｎ分析に基づいて行
なった。収集したＥｄｍａｎサイクルを３−フェニル−
２−チオヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体に添加し、逆相
高圧液体クロマトグラフィーにより各ＰＴＨ−アミノ酸
を同定した。その結果を第３表に示す。
（以下余白） 第３表 精製オビオアクチン８００ｐｍｏｌ（００５−１２０Ｔ
　Ｆｒ、３−３）でのアミノ酸組成（単位はｐｍｏｌ） 上記の第３表に示すように、Ｆｒ、３−３画分のＮ末端
から分析されたアミノ酸は、第１位（第１残基）にアラ
ニン（Ａｌａ、　＋４０ｐｍ）、バリン（Ｖａ　ｌ、５
５ｐｍ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、６２ｐｍ）、グリシ
ン（Ｇｌｙ、９０ｐｍ）、プロリン（Ｐｒｏ、ｌｏｏｐ
ｍ）などが検出された。第２位にはＶａｌ　（１１２ｐ
ｍ）、Ｇｌｕ　（１００ｐｍ）、Ａｌａ（７０ｐｍ）な
どが検出された。第３位にはＶａｌ（１０３ｐｍ）、　
Ｇｌｕ（ｌｏＯｐｍ）、第４位にはＰｒｏ（１０１ｐｍ
）、第５位Ｖａｌ（１００ｐｍ）、第６位Ｖａｌ　（ｌ
１２ｐｍ）　、第７位Ｔｙｒ（５１ｐｍ）、Ｐｒｏが主
たる成分てあった。以」二の結果から精製オヒオアクチ
ンの１つは、Ｎ末端がＡｌａ、　Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌ
ｕ、Ｖａｌとする少なくとも５成分の混合物であり、第
２位以降はＧｌｕ、　Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｒｏの連鎖に
よる可能性が高いことが強く示唆された。
また、この精製オビオアクチンＦｒ、　３−３は、その
後同様のグロマトグラフイーに何回かけてもこれ以上の
精製ができない。その理由は、Ｆｒ、　３−３が」１記
のようなＮ末端かへテロの類似ペプチドの混合物である
ためと考えられる。
以」二の結果から推定されることは、精製オビオアクチ
ン第３画分（Ｆｒ、３−３）は、Ｎ末端にＡｌａ、　Ｐ
ｒｏ、ｃｒｙあるいはＧｌｕを有し、次いでＧｌｕ、　
Ａｈａ、　Ｐｒｏ、Ｖａｌを２〜６分子有するであろう
という程度で、これからは一義的には、オビオアクチン
第３画分Ｆｒ。
３−３の活性中心ペプチドのアミノ酸配列を決めること
はできない。
そこで、本発明には、考えられる極めて多くのアミノ酸
配列について、それらに相当する多数のペプチドを合Ｉ
戊し、それらペプチドのトキソプラズマ増ゼｆ抑制活性
について訂価し、次式（１）〜ｔ”ｒｏ−Ｖａｔ−Ｖａ
ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　（１）Ｇｌｕ−
ｒ’ｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｔ　　　　　　　　　　　　　
　　（２）Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ　
　　　　　　　　　　（３）Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、　　　　　　　　（４）Ｇｌ
ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ
、　　　　（５）のアミノ酸配列の群から選ばれる１種
のアミノ酸配列を含有する実質的な純粋な新規な生理活
性ペプチドの開発に成功したものである。
上記式（１）〜（５）で表わされるアミノ酸配列を有す
るペプチドの中で、式（４）と式（５）のアミノ酸配列
を有するペプチドが最も高いＴｏｘ。
ＧＩＦ活性を示すことを知見し、それらを夫々オビオー
２　（Ｏｂｉｏ−２）及びオビオー３　（Ｏｂｉｏ−３
）と命名した。
更に驚くべきことに、本発明の５種のペプチドの少なく
とも１種と特開平１−１７５９９６号に開示された４種
のペプチドの少なくとも１種とを混合して得られる生理
活性ペプチド組成物が極めて改善されたＴｏｘｏ−Ｇｆ
Ｆ活性を発揮するという相乗効果を見出した。その場合
、各ペプチドの混合比は特に限定的でなく、目的と効果
に応じて適宜所望の混合比で用いることができる。一般
には、各成分ペプチドの量は、各等量乃至その半分以上
の量が好ましく用いられる。
（以下余白） 本発明の生理活性ペプチドは、従来から知られているペ
プチド合成法［例えば、（にｅｎｔ、Ｓ、Ｂ、、　ｅＬ
ａｌ）Ｕ、Ｒａｇｎａｒｓｅｎ編ｒＰｅｐＴ、１ｄｅｓ
　　１９８４Ｊ　　（ＡｌｍｑｖｉｓＬａｎｄ　Ｗｉｋ
ｓｅｌｌ、　ＳＬｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ、１９
８４）ｐ１８５．参照〕により製造することができる。
又、もし望まれるならば、各ペプチドをコードするＤＮ
Ａを用い、適当なホスト・ベクター系により、組換ＤＮ
Ａ技術によって産生ずることも可能である。
このように、本発明の生理活性ペプチドは実質的に純粋
な形で得ることができる。
次に、本発明者の各生理活性ペプチド（以下、屡々″合
成ペプチド′″と称す）の活性について述べる。
（Ａ）マウス　マクロファージにおけるＴｏｘｏ−ＧＩ
Ｆ蚕ユ 各合成ペプチドを０．７ｍＭ濃度で培養液に溶解して、
マウス腹腔マクロファージを用いてＴｏｘｏ−ＧＩＦ活
性を測定した。
結果を下記の第４表に示す。
第４表に示されるように各ペプチドのＴｏｘｏ−ＧＩＦ
活性値は、合成ペプチドＮｏ、Ｉは３０．２％、Ｎ０９
２は２７．４％、Ｎｏ、３は３０．２％、Ｎｏ、４は６
１．１％、Ｎｏ、５では５１４７％を示した。またいず
れのペプチドもこの濃度（０，７ｍＭ）では細胞毒性を
示さなかった。
Ｎｏ、　４　（Ｏｂｉｏ−２）およびＮｏ、５（Ｏｂｉ
ｏ−３）か最も強い活性を示す。これらの分子量はそれ
ぞれ約６４２および約６９９である。またＮｏ、Ｉ、Ｎ
０９２及びＮｏ、　３についてもトキソプラズマ増殖抑
制や免疫賦活なとの作用を有する薬剤として使用できる
。
粗オビオアクチンのＴｏｘｏ−ＧＩＦ活性は通常５ｍｇ
／ｍｌで測定されるのに対し、本発明の合成ペプチド、
例えばＮｏ、４　（Ｏｂｉｏ−２）のＴｏｘｏ−ＧＩＦ
活性は０．２５ｍｇ／ｍｌで十分な活性が検出できるこ
とから、粗オビオアクチンに比べ本発明の合成ペプチド
は重量比からみて１０〜２０倍、モル比からみて４０〜
１４０倍相当の活性を示す。
第５表に示すようにいずれの細胞でもあきらかなＴｏｘ
ｏ−ＧＩＦ活性が認められ、粗オビオアクチンと同様、
本発Ｉ９１の合成ペプチドは種属特異性を示さないこと
が確認された。
（以下余白） Ｎｏ、　４　（Ｏｂ　１ｏ−２）を用いて評価したとこ
ろ、下記の（Ｃ）メチルコランスレン誘発腫瘍（ＭＣ腫
瘍）マウメチルコランスレン（２０−Ｍｅｔｈｙｌｃｈ
ｏｌａｎ＋、ｈｒｅｎｅ和光純薬）を０．５ｍｇ投与し
たＢＡＬＢ／ｃマウス誘発腫瘍魂より摘出したＭＣ腫瘍
細胞をＲＰＭＩ−１６４０培養液に２ＸＩＯ“個／ｍｌ
となる細胞懸濁液に調製した。６週齢の雄マウス背部皮
下に細胞調整液０．０２５ｍ１（５Ｘ　ＩＱ’ＭＣ腫瘍
／マウス）を筋肉内投与してＭＣ腫瘍細胞を移植して担
癌マウスとした。
０ｂｉ−２および０ｂｉ−３、各３０μｇ／マウスの量
を上記ＭＣ腫瘍細胞調整液を投与後１週間毎に背部皮下
に筋肉内注射して腫瘍増殖抑制効果を検討した。担癌マ
ウスは各実験に５匹ずつ用い、その平均をとった。その
結果を無投与マウスについての比較データと共に第３図
に示す。
第３図に示す如く、腫瘍細胞移植後２８日目における平
均腫瘍部面積は、無処理生理食塩水投与の対照群（第１
群）では４３２±Ｉ０．５＋ａｍ’　、第２群（Ｏｂｉ
ｏ−２）および第３群（Ｏｂｉｏ−３）では２０８±４
０．１ｍｍ’、２１９±４０．１ｍｍ’であった。０ｂ
ｉｏ−２あるいは０ｂｉｏ−３投与群は、非投与群に比
較して有意に腫瘍増殖を抑制することが明らかになった
。
（Ｄ）ｉｆｉｌ、合使用の相乗効果 高いＴｏｘｏ−ＧＩＦ活性を示した合成ペプチド（Ｏｂ
ｉ−２）および（Ｏｂｉ−３）と他の既知合成ペプチド
（Ｏｂｉ−１）との相乗作用の有無についても検討した
。下記の第６表に示すように各ペプチドを混合して添加
してたところ、Ｔｏｘｏ−ＧＩＦ効果は相乗的に上昇し
た。
（以下余白） （Ｅ）ＭＣ腫瘍担癌マウスにおける肺臓内単核細胞て、
肺臓内単核細胞、とくに大型円形粕１１泡（半球マクロ
ファージ）に生体内で強く作用する物質下記の第７表に
示すごとく、無処置担癌マウスの肺臓内単核細胞数は、
健康マウス値の１０％にまで減少した。一方、Ｏｂｉｏ
−１および０ｂｉｏ−２投与担癌マウスでは、肺臓内単
核細胞数の減少は極めて軽度で、正常マウスの数の６５
−７０％を保持していた。
これらの肺臓の病理組織学的所見では、０ｂｉｏ−２及
び３投与群、および非投与群担癌マウス牌濾胞は、とも
に殆ど変化は認められなかった。しかし、０ｂｉｏ−２
及び３投与群では牌赤色髄内の小型単核細胞（小リンパ
球）および大型単球が髄内、とくに血管周囲に集筬する
のが目立つのに対して、非投与群では小型リンパ球が僅
かに散在するのみであった。更に、非投与マウスにおけ
る腫瘍組織部位には広範な出血巣が顕著に認められるの
に反して、０ｂｉｏ−２および３投与マウスでは殆ど観
察されなかった。
であることか明らかになった。
（以下余白） このように、合成ペプチド（Ｏｂｉｏ−２，０ｂｊｏ−
３）を担癌マウスにきわめて少量（３０μｇ／週１回）
投与し息子本発明物質の医療用用途につき説明する。
−１−記したように、本発明の生理活慴ペプチドは、免
疫賦活イ１′用即ち各種原生等の原生動物、細α１類、
ウィルス類等の各種微生物の増殖抑制作用及び制ガン作
用を有し、また低毒性であり、ヒト及びその他の哺乳動
物用医薬組成物の活性成分として有効である。又、特に
注目すべきは、担痒マウスに従来の抗癌剤、例えばフト
ラフール（Ｆ’ｒ２０７）（大腸薬品社製）、と併用使
用すると生存日数が増加することも認められている。
本発明のペプチドをヒト及び動物の医療用に用いる場合
、抗原虫、抗細菌、抗ウィルス又は抗腫瘍作用に有効な
量の本発明の生理活性ペプチドと少なくとも１種の薬学
的に投与可能な担体、希釈側又は賦形剤を含有する医薬
組成物の形態で用いられる。また、上記医薬組成物には
、必要に応じて通常の各種の添加剤例えば安定剤、溶解
補助剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等が添加配
合でき、また他の医薬品を添加配合することもてき本発
明ペプチドの使用形態は、好ましくは注射剤（液剤、懸
濁剤、乳剤等）とされるが、特にこれに限定されるわけ
てはない。上記注射剤は通常の投与方法にて、例えば」
１記の医薬組成物単独で又はブドウ糖、アミノ酸等の一
般的補液と併用して静脈内投与され得る。また必要に応
じて筋肉内、皮下、皮内もしくは腹腔内投与することも
できる。
更に本発明ペプチドは、注射剤以外、例えば経口投与に
適した形態をとることもできる。
本発明の医薬組成物中に配合される合成ペプチドの量及
び投与量は、投与方法、投与形態、使用目的、あるいは
患者の症状等に応じ適宜に選択される。通常有効成分を
約１〜８０重量％含有する注射剤の形態を例にとれば、
有効成分が約０．００１〜ｌＯ■／ｋｇ／日となる範囲
で投与されるのが望ましく、投与は１日１回である必要
はなく、１日３〜４回に分けることができる。他の形態
での投与の場合も、上記注射剤の場合を目安として投与
量を適当に選択することができる。
（実施例） 次に実施例により本発明を更に詳細に説明するが、木兄
１’）Ｊはこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ 式（４）のペプチド（Ａ　１ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ）の合成及び精製 （］　）　Ｌ−Ｂｏｃ（Ｌｅｒｔ−ブトキシカルボニル
基）法によるペプチドの固相合成 装ｊｌｌ　　：　Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃ
ｈ社製　ペプチド合成装置Ｍｏｄｅｌ　９６００ 試薬類二合成装置にシーケンスを入力した後、合成のシ
ュミレーションを行なうど、種類及び必要量等が指示さ
れる。
レジン Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｒｅｓｉｎ アミノ酸 Ｂｏｃ−Ａｌａ Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ） Ｂｏｃ−Ｐｒ。
Ｂｏｃ−Ｖａｌ 反応補助試薬 ＤＣＭ（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｃｈａｎｅ）ＤＭＦ（Ｄ
ｉｍｅｔｈｙｌｒｏｒｍａｍｉｄｅ）ＤＣＭ／ＤＭＦ　
＝　ｌ　／　Ｉ Ｃａｐｐｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ １−ＡｃｅＬｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ　ｉｎ　ＤＭＦＢ
ａｓｅｗａｓｈ ＤＩＰＥＡ（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉ
ｎｅ）　ｉｎＣＭ Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ４５、ＯＸ　Ｔ
ＦＡ　（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ　Ａｃ１ｄ）
２．５％Ａｎｉｓｏｌｅ ５２．５％ＤＣＭ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｉ）ＩＰＣＤＩ　（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏ
ｄｊ　ｊ＋ｎ１ｄｅ）ｉｎ　ＤＣＭ 以上の試薬くすべて渡辺化学■製、ペプチド合成用）を
、ボトルにセットし、合成をスタートする。
合成方法 合成はＣ末端よりＮ末端に向けて進む。まず反応容器に
あｊッかしめ入れであるＢａｒ−Ｖ、′］ｌ刊１ｐｓｉ
ｎ（シーケンスＣ末端アミノ酸）のＮ末端保護基（Ｂ　
ｏ　＋：：基）を外す（Ｄｅｂｌｏｃｋ）。
次にＡｃｔｉｖａＬｏｒにより十分活性化されたアミノ
酸（Ｂｏｃ−Ｖａｌ）とともにアルゴンガスにより撹拌
され、カップリングが行なわれる。Ｃ末端のはじめの２
残基が十分結合が十分結合した時点（この過程に必要な
時間は、先の合成シュミレーションで計算される）で、
２残基目のアミノ酸の保護基を外す。
この時点において、カプリングに失敗した（つまり、２
残基目のアミノ酸が結合されていない）部分のカップリ
ングが行なわれる。この操作が入ることにより、この部
分は以後合成の対象とならず、最終的に合成されたペプ
チドにｌ残基、あるいは数残基のアミノ酸が欠落した物
が混じることが防止される。
以後、同様に脱保護、活性化、カップリング、キャッピ
ングの操作が自動的に繰り返され、目的のペプチドが合
成される。
（２）固相（Ｒｅｓｉｎ）からのペプチドの切り出し。
合成が終了した時点でのペプチド鎖は、Ｃ末端がＲｅｓ
　ｉｎと結合している。また、側鎖の保護基も付いたま
まである。これを利用可能な状態にするには、合成ペプ
チドの切り出し、側鎖の脱保護を行なう必要がある。
ｔ−Ｂｏｃ法の場合は、この操作においてＨＦ（フッ化
水素）を用いるのが一般的である。合成ペプチド（Ｒｅ
ｓｉｎに結合した状態）に、等量のアニソールを加えた
後、切り出し装置内１１Ｆ中Ｏ℃にて１時間反応させる
ことにより、この過程は終了する。
（３）ペプチドの抽出 切り出しが終了しＨＦを除去した物に、ＴＦＡを加え、
冷エーテルをいれたフラスコ内にガラスフィルター（３
Ｇ３）にて濾過する。このとき、フィルター上にＲｅ５
ｉｎが残る。
エーテル内の白色沈殿物を遠心分離により沈殿させ、上
清は捨てる。沈殿にさらに冷エーテルを加え、撹拌し、
遠心分離する。これを２〜３回繰返し、粗ペプチドに混
入する非極性不純物を除いた後、沈殿を回収し乾固させ
る。
（４）クロマトグラフィーによる精製 カラム　ＯＤＳ系　逆相カラム（ＴＳＫｇｅｌ　ＯＤＳ
−ＢＯＴｍ等）分析　４，８ＸＩ５ｃｍ 分取　２１．５Ｘ３０ｃｍ 溶離液　Ａｏ、１％　ＴＦＡを含む純水Ｂ：Ｏ，１％　
ＴＦＡを含むアセトニトリルへ：Ｂ＝９５．５〜３０ニ
ア０リニアグラジェント分析　３０分 分取　９０〜１２０分 検出　　ＵＶ　２３０ｎｍ 上記の条件により、切り出し、脱保護した粗ペプチドの
分析・分取を行なう。
目的のペプチドは明らがなメインビークとして確認でき
る（構成するアミノ酸の種類、つまりそれらの疎水性や
Ｏ，Ｉ＄ＴＦＡ（ｐＨ２，０前後）におけるイオン化の
程度等によりおおよそのリテンションタイムの推測も可
能）が、念のため他のピークもとっておく方が好ましい
。また、なんらかの理由てメインピークか１本に絞れな
い場合なとは精製物のアミノ酸分析、プロティンシーケ
ンサ−分析、マニアルのエドマン分解などについて再分
析を行なう。
以」−のようにして、式（４）の合成ペプチドを得、そ
の組成を確認した。
実施例２〜５ 実施例１におけるアミノ酸原料を式（５）、式（１）、
式（２）及び式（３）の各ペプチドに相当するアミノ酸
原料に変える以外は実施例１と同様の操作で、各ペプチ
ドを合成し、その組成を確認した。
参考例１ 実施例Ｉにおけるアミノ酸原料を式（６）のペプチド（
Ｏｂｉｏ−１）に相当するアミノ酸原料に変えた以外は
実施例１と同様の操作で０ｂｉｏ−１を合成し、その組
成を確認した。
【図面の簡単な説明】
第１図は粗オビオアクチンの高速液体クロマトグラムを
示し、第２図は第１図の第３の両分の逆相クロマトグラ
ムを示し、第３図は本発明の合成ペブ千］くの筋肉両投
りによるｔＥＪ　癌マウス腫瘍細胞増殖抑制効果を示す
。 時打出願人　　鈴　木　直　義 ＦＩＧ、１

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、次式（１）〜（５）： Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（１） Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（２） Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（３）Ａｌａ
    −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（４）Ｇｌ
    ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ
    （５）のアミノ酸配列の群から選ばれる１種のアミノ酸
    配列を含有する実質的な純粋な生理活性ペプチド。 ２、次式（１）〜（５）： Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（１） Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（２） Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（３）Ａｌａ
    −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（４）Ｇｌ
    ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ
    （５）のアミノ酸配列をそれぞれ含有する５種の実質的
    に純粋なペプチドよりなる群から選ばれる少なくとも１
    種のペプチドと次式（６）〜（９）：Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−
    Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（６）Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
    −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（７）Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓ
    ｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（８）Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇ
    ｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（９）のアミノ酸配列をそれぞれ
    含有する４種の実質的に純粋なペプチドよりなる群から
    選ばれる少なくとも１種のペプチドとを含有してなる生
    理活性ペプチド組成物。 ３、抗原虫、抗細菌、抗ウィルス又は抗腫瘍作用に有効
    な量の請求項（１）に記載の生理活性ペプチドと少なく
    とも１種の薬学的に投与可能な担体、希釈剤又は賦形剤
    を含有する医薬組成物。 ４、抗原虫、抗細菌、抗ウィルス又は抗腫瘍作用に有効
    な量の請求項（２）に記載の生理活性ペプチド組成物と
    少なくとも１種の薬学的に投与可能な担体、希釈剤又は
    賦形剤を含有する医薬組成物。
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DK91306332.7T DK0466498T3 (da) 1990-07-12 1991-07-12 Fysiologisk aktive peptider med immunoregulatoriske aktiviteter
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