JPH0475465B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は血清、血漿、脊髄液、羊膜液および尿
の様な生物学的液体中の配位子測定法とその試薬
に関する。本発明はまた螢光偏光免疫試験に試薬
として使用できるフルオレスセイン誘導体の新種
に関する。 配位子測定の競合結合性免疫試験は試験試料中
の配位子とトレイサーというラベル付き試薬間の
配位子と試薬に特異的な抗体上の受体結合位置の
限定数に対する競合に基づく。試料中の配位子濃
度は抗体に特異的に結合するトレイサー量を決定
する。生成したトレイサー−抗体結合体量は定量
的に測定でき、試験試料中の配位子量に逆比例す
る。螢光偏光法は螢光ラベル付き化合物が直線偏
光によつて励起された時その回転速度に逆比例し
た偏光度をもつ螢光を発するという原理に基づ
く。したがつて螢光ラベル付きトレイサー−抗体
結合体の様な分子が直線偏光によつて励起された
場合光が吸収されまた発生する時間の間螢光団が
回転から拘束されるので発生光は非常に偏光され
たままでいる。“自由な”トレイサー化合物（即
ち抗体に結合されていない）が直線偏光によつて
励起された場合、その回転は対応するトレイサー
−抗体結合体よりもずつと速く分子はより無秩序
に配列され、したがつて発生光は消偏される。故
に螢光偏光は競合結合性免疫試験において生成さ
れたトレイサー−抗体結合体量測定用の手段とな
る。 種々の螢光ラベル付き化合物がこの分野で知ら
れている。米国特許第3998943号は螢光ラヘルと
してフルオレスセインイソチオシアネイト
（FITC）を用いて螢光ラベル付インシユリン誘
導体、および螢光ラベルとして４−アミノフルオ
レスセイン塩酸塩を用いて螢光ラベル付きモルフ
オリン誘導体の各製造を記載している。カルボキ
シフルオレスセインもまた分析的測定に使われて
いる。R.C.チンはAnalytical Letters、10、787
（1977）にホスフオリパーゼの活性を示すカルボ
キシフルオレスセインの用途を記載している。カ
ルボフルオレスセインはレシチン細胞内脂肪粒子
中に含まれており、それはレシチンの加水分解に
よつて放出された時にのみ螢光を発する。1981年
11月11日出願の米国特許出願第329974号は螢光偏
光免疫試験に試薬として有用な配位子−同族体に
直接カルボキシフルオレスセインが結合している
カルボキシフルオレスセイン誘導体の１種を発表
している。 本発明は試料を式： （式中Ｔは

【式】基を表わしｎは １乃至８の整数としかつＲはＴによつて表わされ
る基のカルボニル炭素に結合している反応性第１
又は第２アミノ基をもちかつ共通の（コモン）抗
体によつて特異的に認定できる様に上記配位子と
共通の少なくも１エピトープ（コモンepitope）
をもつ配位子同族体を表わす）をもつトレイサー
の生物学的に許容される塩および上記配位子およ
び上記トレイサーを特異的に認定できる抗体と混
合した後試料中の上記配位子濃度の尺度として螢
光偏光法によつてトレイサー抗体結合体の量を決
定することにより成る試料中の配位子測定法を包
含する。 本明細書に使用する“配位子”とは分子、特に
結合蛋白質、通常抗原がそこにえられる又は生成
される単一反応性アミノ基をもつ低分子量ハプテ
ンをいう。このハプテンは蛋白質を含まぬ化合物
であり一般に低分子量であるので動物に注入した
時抗体を生成しないが、抗体に反応性である。ハ
プテンに対する抗体は一般に先づ蛋白質にハプテ
ンを結合させ結合生成物を動物に注入することに
よつてつくられる。えた抗体は普通の抗体分離法
で単離できる。 本発明の方法によつて測定できる配位子は広い
分子量範囲にわたる。高分子量配位子も測定でき
るが、最良結果をえるためには一般に50乃至4000
の範囲の低分子量配位子測定に本発明の方法を用
いるとよい。100乃至2000の分子量範囲をもつ配
位子測定が更に好ましい。 本発明の方法によつて測定できる代表的配位子
にはエストリオルエストロン、エストラジオル、
コルチゾル、テストストロン、プロゲステロン、
デオキシコール酸、リトコール酸およびそれらの
エステルおよびアミド誘導体の様なステロイド；
Ｂ−12、フオリン酸の様なヴイタミン；チロキシ
ン、トリアイオドチロキシン、ヒスタミン、セロ
トニン、PGE、PGF、PGAの様なプロスタグラ
ンジン；テオフイリンの様な抗喘息剤、ドクソル
ビシンやメソトレキセイトの様なアンチネオプラ
スチツク剤；ジソピラミド、リドカイン、プロカ
インアミド、プロプラノロール、キニジン、Ｎ−
アセチル−プロカインアミドの様な抗不整脈剤；
フエノバルビタール、フエニチオン、プリミド
ン、ヴアルプロイン酸、カルバマゼピンおよびエ
ソスキシミドの様な抗痙れん剤；ペニシリン、セ
フアロスピリンおよびヴアンコマイシンの様な抗
生物質；サリチレイトの様な抗関節炎剤；ノルト
リプチリン、アミトリプチリン、イミプラミンお
よびデシプラミンの様なトリシクリツクスを含む
抗抑圧剤；等並びにそれらの代謝産物がある。更
に本発明の方法により測定できる配位子はモルヒ
ネ、ヘロイン、ヒドロモルフオン、オキシモルフ
オン、メタポン、コデイン、ヒドロコドン、ジヒ
ドロコデイン、ジヒドロヒドロキシコデイノン、
フオルコジン、デキストロメソルフアン、フエナ
ゾシンおよびデオニンの様な弊害をもつ薬剤およ
びそれらの代謝産物がある。 本明細書で使用する配位子同族体とは受体の結
合位置について配位子と競合しうる１又は２以上
の決定要素又はエピトピツクな位置をきめる実質
的部分に配位子と同じ空間的および極性構成をも
つ１価又は多価基をいう。この配位子同族体の特
徴はそれが配位子の抗体により認定される様に問
題の配位子に十分構造的類似性をもつことであ
る。たいてい配位子同族体は分子表面の大部分に
ついて問題の配位子と同じ又は実質的に同じ構造
および荷電分布（空間的および極性構成）をも
つ。しばしばハプテンの結合位置が配位子への結
合に使われる様な抗体生成用抗原製造におけると
同じであるので、抗体のテムプレイトとなる配位
子同族体の同じ部分がトレイサー中の配位子同族
体によつてさらされるであろう。 一般にＲによつて表わされる配位子同族体の種
類は反応性アミン（第１又は第２）に結合してい
る水素原子の除去により又はアミノ基

【式】 がＴにより表わされた基のカルボニル炭素への結
合位置において配位子に元からある１又は２以上
の原子を置換する配位子のアミノ誘導体生成によ
り対応する配位子から誘導される。活性アミノ基
からの水素除去によりＲによつて表わされる配位
子同族体を生成する配位子の例には例えばプロカ
インアミド、チロキシンおよびキニジンがある。
配位子のアミノ誘導体が配位子同族体として有用
な配位子の例にはテオフイリン、ヴアルプロイン
酸、フエノバルビタール、フエニトイン、プリミ
ドン、ジソピラミド、ジゴキシン、クロラムフエ
ニコル、サリチレイト、アセダミノフエン、カル
バマゼピン、デシプラミンおよびノルトリプチリ
ンがある。更に配位子は１又は２以上の反応性基
の添加又は削除によつて構造的に変性して抗体に
結合するに必要なエピトープ位置を保持する配位
子同族体を生成できる。しかしこの変性配位子同
族体はイミノ基をとおしてＴによつて表わされる
基のカルボニル炭素に結合する。 Ｔによつて表わされる基のｎは２乃至４である
ことが好ましい。 本発明のトレイサーは一般にその酸とイオン化
状態との間の平衡状態にあり、本発明の方法にお
いてはイオン化状態にあるとき有効である。した
がつて本発明は酸又はイオン化状態のいづれかに
おけるトレイサーも包含し、便宜上そのイオン化
状態にあるトレイサーは生物学的に許容される塩
の形で存在する。本明細書でいう“生物学的に許
容される塩”とは本発明の方法に使う場合本発明
のトレイサーをイオン化状態に存在させるナトリ
ウム、カリウム、アンモニウム等の様な塩をい
う。一般に本発明のトレイサーは塩として溶液中
にあり、特定塩は使用される緩衝液から、即ちり
ん酸ナトリウム緩衝液の存在でえられ、本発明の
トレイサーは一般にナトリウム塩としてそのイオ
ン化状態で存在する。 本発明の方法によれば測定しようとする配位子
を含む試料を式（）をもつトレイサーの生物学
的に許容される塩および配位子とトレイサーに特
異的な抗体と混合する。試料中にある配位子とト
レイサーは限定されている抗体位置を競合し配位
子−抗体およびトレイサー−抗体複合物を生成す
る。トレイサーと抗体の濃度を一定とすることに
よつて生成された配位子−抗体複合物対トレイサ
ー−抗体複合物の比率は試料中にある配位子量に
直接比例する。故に、混合物を偏光によつて励起
しトレイサーとトレイサー抗体複合物によつて発
生する螢光の偏光を測定すれば試料中の配位子量
を定量測定できる。 理論的に抗体に複合しないトレイサーの螢光偏
光は小さくゼロに近い。特定抗体と複合すると生
成したトレイサー−抗体複合物は比較小さいトレ
イサー分子よりもおそい抗体分子の回転をするの
で偏光増加が認められる。故に配位子がトレイサ
ーと抗体位置を競合する場合トレイサー−抗体複
合物の螢光の認められた偏光はトレイサーとトレ
イサー−抗体複合物の値の間の値となる。もし試
料が配位子の高濃度を含むならば認められる偏光
値は遊離配位子の値に近い、即ち小さい。試料試
料の配位子が小濃度ならば偏光値は結合した配位
子の値に近い、即ち高い。免疫試験の反応混合物
を垂直偏光で、次いで水平偏光で次々に励起し発
生光の垂直成分のみを分析することによつて反応
混合物中の螢光の偏光を正確に判定できる。測定
する配位子の偏光と濃度の間の正確な関係は既知
濃度をもつ補正物の偏光値測定によつてできる。
配位子濃度はこの様にしてつくられた標準曲線か
ら外挿できる。 本発明の方法実施におけるPHは式（）をもつ
トレイサーをそのイオン化状態におくに十分なPH
でなけれはならない。このPHは約３乃至12、普通
約５乃至10、最も好ましくは約６乃至９である。
試験中PHは上のとおりとしまた保つため種々の緩
衝液が使われる。代表的緩衝液はほう酸塩、りん
酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等がある。
使用する特殊緩衝液は本発明には重要でないが、
個々の試験には使用抗体と測定する配位子を考え
て特定緩衝液が好ましい。緩衝液の陽イオン部分
は一般に溶液中のトレイサー塩の陽イオン部分を
決定するだろう。 本発明の方法は中位の温度で実施され一定温度
がよい。温度は通常０乃至50℃、好ましくは約15
乃至40℃である。 分析できる配位子濃度は一般に約10^-2乃至
10^-13M、より普通に約10^-4乃至10^-10Mの範囲で
変る。高濃度配位子は元の試料を稀釈した後試験
できる。 分析する配位子濃度の他に試験を定性的に、準
定量的に又は定量的に行なうかどうかの考察、使
用装置およびトレイサーと抗体の特性が通常使用
するトレイサーと抗体の濃度を決定するであろ
う。試料中の配位子濃度が他の試薬、即ちトレイ
サーと抗体の濃度範囲を決定するが、通常試験感
度を最適とするため個々の試薬濃度は経験的に決
定される。トレイサーと抗体の濃度はこの分野の
技術をもつ者によつて容易に確定できる。 本発明の好ましいトレイサーは５−カルボキシ
フルオレスセイン又は６−カルボキシフルオレス
セインの誘導体又はそれらの混合物として特徴づ
けられ式： によつて表わされる。 下記に示す実施例は本発明の範囲内の特定トレ
イサーの製造法をこの技術分野の知識ある者に示
すためのもので、本発明を限定するものではな
い。下記実施例中で製造される化合物を示す構造
式中の〔CF〕は式： をもつ部分を表わす。式中カルボニル炭素は実施
例中の出発物質が５−カルボキシフルオレスセイ
ン、６−カルボキシフルオレスセイン又はそれら
の混合物であるかどうかによつて５又は６の位置
に結合する。 実施例 １ カルボキシフルオレスセインのＮ−ヒドロキシ
スクシニミド活性エステルの製造 ジメチルホルムアミド２ml中に６−カルボキシ
フルオレスセイン83mg（0.22ミリモル）の溶液に
Ｎ−ヒドロキシスクシニミド28mg（0.24ミリモ
ル）とＮ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド55mg（0.27ミリモル）を加えた。反応混合物を
アルゴン雰囲気のもとで０℃で１時間攪拌し更に
４℃で16時間攪拌して式： をもつカルボキシフルオレスセインのＮ−ヒドロ
キシスクシニミド活性エステルを得た。 実施例 ２ ２％水酸化ナトリウム水溶液100mlとイゾキサ
ン100ml中に５−アミノヴアレリアン酸5.85ｇ
（0.05モル）を含む溶液中にジオキサン40ml中に
ジ−ｔ−ブチルジカーボネイト10.9ｇ（0.05モ
ル）を含む溶液を滴加した。反応混合物を18時間
攪拌後1N HClを用いてPH３酸性とした。混合物
を３回ジクロロメタンで抽出し有機層を併せ水洗
し硫酸ナトリウム上をとおして乾燥し５−（ｔ−
ブトキシカルボニルアミノ）ヴアレリアン酸白色
結晶性固体10.1ｇ（93.5％収率）をえた。 ５−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヴアレ
リアン酸0.434ｇ（0.002モル）にジクロロメタン
３ml中にＮ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド0.412ｇ（0.002モル）とＮ−ヒドロキシスク
シニミド0.25ｇ（0.0022モル）を含む液を攪拌し
ながら加え18時間反応させて油状残渣として５−
（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヴアレリアン
酸のＮ−ヒドロキシスクシニミド活性エステルを
えた。油状残渣にメタノール30ml中にＬ−チロキ
シンナトリウム塩５水化物1.95ｇ（0.0022モル）
を含む液を加えた。 18時間反応を進行させた後反応混合物をイオン
交換樹脂管（Bio−Rad AG 50W−X8H⁺型）
にとおしメタノールで溶離した。溶離液を真空濃
縮して式： をもつ中間物1.96ｇ（90％収率）をえた。 中間物0.125ｇ（0.00015モル）をトリフルオロ
酢酸2.0mlと30分間処理し減圧蒸発してトリフル
オロ酢酸を除きえた残渣をＮ，N′−ジメチルホ
ルムアミド1.5mlにとかした。えた溶液をトリエ
チルアミンで塩基性PHとした。えた混合物にカル
ボキシフルオレスセインのＮ−ヒドロキシスクシ
ニミド活性エステル75mg（0.000159モル）を加え
18時間反応させた。反応混合物にジエチルエーテ
ルを加えて沈澱させ、沈澱を予備逆相TLCによ
りメタノール：水：酢酸（75：25：0.5）混合物
を用いて精製して式： をもつチロキシン−６−カルボキシフルオレスセ
イン結合物0.071ｇをオレンジ色固体としてえた。 実施例 ３ 水酸化ナトリウム4.5ｇ（0.1125モル）を含む
ジオキサン：水１：１混合物100ml中のβ−アラ
ニン10ｇ（0.1122モル）を含む液にジオキサン40
ml中にジ−ｔ−ブチルジカーボネイト26.95ｇ
（0.1235モル）を含む液を滴加した。反応混合物
を16時間攪拌後1NHClでPH３酸性としこれをジ
クロロメタンで３回抽出した。有機層を併せ稀塩
酸液で洗い硫酸マグネシウム上で乾燥して３−ｔ
−ブトオキシカルボニルアミノ）プロピオン酸17
ｇ（93.5％収％）をえた。 塩化メチレン25ml中にとかした３−（ｔ−ブト
キシカルボニルアミノ）プロピオン酸2.1ｇ
（0.010モル）の液にＮ，N′−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド1.34ｇ（0.0116モル）とＮ−ヒドロ
キシスクシニミド2.62ｇ（0.0127モル）を加え
た。アルゴン雰囲気のもと室温で反応を20時間進
行させ油状残渣をえてこれを塩化メチレンに再溶
解し過した。液を真空濃縮し３−（ｔ−ブト
キシカルボニルアミノ）プロピオン酸のＮ−ヒド
ロキシスクシニミド活性エステル白色固体をえ
た。 メタノール２ml中にＬ−チロキシンナトリウム
塩５水化物0.5ｇ（0.0006モル）を含む液に３−
（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロピオン酸
のＮ−ヒドロキシスクシニミド活性エステル0.24
ｇ（0.0008モル）を加えた。反応が進むと残渣が
生成し反応完了と共に1N NaOHを加えて残渣を
とかした。反応生成物をシリカゲル管を使いメタ
ノール：塩化メチレン１：４混合液で溶離して精
製した。溶離物を濃縮して式： をもつ中間物をえた。 塩化水素を含むジオキサンの飽和溶液中に中間
物0.2ｇ（0.00021モル）をとかしえた溶液を室温
で２時間攪拌した。ジオキサン：塩酸を真空除去
しえた残渣をＮ，N′−ジメチルホルムアミド1.5
mlにとかした。えた液をトリエチルアミンを使つ
て中性PHに調整した。えた混合物に６−カルボキ
シフルオレスセインのスクシニミド活性エステル
107mg（0.00022モル）を加えた。アルゴン雰囲気
のもとで反応を16時間進行させ粗生成物をえてこ
れを予備逆相TLCによつて精製しメタノール：
水：酢酸（70：30：0.4）混合物を使つて式： をもつチロキシン−６−カルボキシフルオレスセ
イン結合物10.0mg（収率４％）をえた。 実施例 ４ ６−アミノカプロン酸10ｇ（0.07623ミリモル）
を含む液を絶えず攪拌しながら水酸化ナトリウム
3.05ｇ（0.07625ミリモル）を含むジオキサン：
水１：１混合物200mlを含む混合物に加えた。え
た溶液にジオキサン80ml中にジ−ｔ−ブチルジカ
ーボネイト16.54ｇ（0.07623モル）を含む液を滴
加した。反応混合物を16時間攪拌した後1N塩酸
でPH３酸性とした。この液をジクロロメタンで３
回抽出し有機層を併せ真空濃縮し残渣を塩化メチ
レンにとかした。塩化メチレン液を稀塩酸で洗い
飽和重炭酸ナトリウム液で抽出して水層を併せ
た。水層を1N塩酸でPH３とした後塩化メチレン
で抽出した。塩化メチレン抽出液を硫酸マグネシ
ウム上をとおし乾燥し真空濃縮して５−（ｔ−ブ
トキシカルボニルアミノ）カプロン酸13ｇ（収率
75％）をえた。 塩化メチレン：ジメチルホルムアミド１：１混
合物10ml中にアルゴン雰囲気のもと室温で５−
（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）カプロン酸1.0
ｇ（0.00432モル）をとかした。えた溶液にＮ−
ヒドロキシスクシニミド0.55ｇ（0.00478モル）
と次にＮ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド1.07ｇ（0.00519モル）を加えた。反応を20時
間させた後セライトをとおして過し液を濃縮
し残渣を塩化メチレンに再溶解した。塩化メチレ
ン液を過濃縮して白色固体をえた。この固体
0.58ｇ（0.00177モル）をメタノール４ml中にＬ
−チロキシンナトリウム塩５水化物0.5ｇ
（0.00056モル）を含む液に加えた。これをアルゴ
ン雰囲気のもとで室温で３時間攪拌した後濃縮し
て式： をもつ黄褐色粉末として中間物をえた。 中間物0.10ｇ（0.0001モル）を塩化メチレン：
トリフルオロ酢酸１：１混合物にアルゴン雰囲気
のもとで０℃でとかした。45分後塩化メチレンと
トリフルオロ酢酸を真空除去しえた残渣をジメチ
ルホルマミド１mlにとかしえた溶液をトリエチル
アミンでPH８とした。ジメチルホルマミド１mlに
とかした６−カルボキシフルオレスセイン0.38ｇ
（0.0001モル）を１，1′−カルボニルジイミジゾ
ール0.016ｇ（0.0001モル）と反応させて製造し
た６−カルホキシフルオレスセインイミジゾライ
ドを含む液に上記溶液を加えた。 反応混合物をアルゴンのもと室温で４時間攪拌
し粗生成物をえた。これを逆相薄層クロマトグラ
フ法で精製しメタノール：水：酢酸（70：30：
0.4）混合物を用いて式： をもつチロキシン−６−カルボキシフルオレスセ
イン結合物0.054ｇ（収率43％）をえた。 実施例 ５ Ｎ，N′−ジメチルホルムアミド２ml中のＮ，
N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド0.353ｇ
（0.0017モル）とＮ−ヒドロキシスクシニミド
0.197ｇ（0.0017モル）をＮ−ｔ−ブトキシカル
ボニルグリシン0.3ｇ（0.0017モル）と処理した。
18時間反応させた後反応混合物をテトラヒドロフ
ラン５mlで稀釈し過し液を減圧濃縮して白色
固体Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルグリシン−Ｎ−
ヒドロキシスクシニミドエステルをえた。 メタノール20ml中にＬ−チロキシンナトリウム
塩５水化物1.137ｇ（0.00128モル）を含む溶液と
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルグリシンＮ−ヒドロ
キシスクシニミドエステル0.35ｇ（0.003モル）
を18時間処理した。混合物をBio−Rad AG
50W−X8（H⁺型）のイオン交換樹脂管にとおし
メタノールで処理した後減圧濃縮して白色固体
1.0ｇをえた。 白色固体0.125ｇ（0.000134モル）をトリフル
オロ酢酸3.0mlと30分反応させた後酸を減圧蒸発
除去しえた残渣をＮ，N′−ジメチルホルムアミ
ド1.5mlにとかしトリエチルアミンを使つて溶液
のPHをアルカリ性とした。えた混合物に５−カル
ボキシフルオレスセインＮ−ヒドロキシスクシニ
ミドエステル0.0075ｇ（0.000159モル）を加え18
時間反応させて粗生成物をえた。これを逆相薄層
クロマトグラフ法で精製しメタノール：水：酢酸
（75：25：0.5）混合物を用いて式： をもつオレンジ色固体チロキシン−５−カルボキ
シフルオレスセイン結合物をえた。 実施例 ６ Ｎ，N′−ジメチルホルムアミド10ml中にガン
マーアミノ酪酸1.03ｇ（0.010モル）とＮ−ベン
ジルオキシカルボニルオキシスクシニミド2.49ｇ
（0.01モル）を22℃で18時間攪拌した。えた透明
溶液を濃縮し残渣に水を加ええた油は白色結晶と
なつた。これを乾燥した残渣をシリカゲル管を使
つて精製しジクロロメタン：メタノール（95：
５）混合物で溶離してガンマー（ベンジルオキシ
カルボニルアミノ）酪酸をえた。 ガンマー（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
酪酸0.237ｇ（0.001モル）をジクロロメタン２ml
中のＮ，N′−ジクロロヘキシルカルボジイミド
0.206ｇ（0.001モル）およびＮ−ヒドロキシスク
シニミド0.135ｇ（0.0012モル）と22℃で２時間
処理した。反応混合物を過し液を減圧濃縮し
てガンマー（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
酪酸のスクシニミドエステルを油状残渣としてえ
た。これをメタノール５ml中のＬ−チロキシンナ
トリウム塩５水化物0.889ｇ（0.001モル）と18時
間反応させた。反応混合物をBio−Rad AG
50W−X8（H⁺型）のイオン交換樹脂管をとおし
メタノールを用いた後蒸発してガラス状白色結晶
をえた。これをシリカゲル管クロマトグラフ法を
用いて精製しジクロロメタン：メタノール（９：
１）混合物を用いて溶離し白色固体をえた。 この白色固体0.25ｇ（0.000025モル）に30％臭
化水素酸を含む酢酸0.4mlを30分間に加えた。過
剰のジエチルエーテルを加えると臭化水素酸塩が
沈澱した。これを洗い乾燥した後トリエチルアミ
ンの存在においてＮ，N′−ジメチルホルムアミ
ド0.4ml中５−カルボキシフルオレスセインＮ−
ヒドロキシスクシニミドエステル0.25ｇ
（0.00053モル）と16時間反応させてえた生成物を
逆相薄層クロマトグラフ法を用いて精製しメタノ
ール：水：酢酸（70：30：0.5）混合物を用いて
式： をもつオレンジ色固体チロキシン−５−カルボキ
シフルオレスセイン結合物をえた。 前記したとおり本発明のトレイサーは螢光偏光
免疫試験での使用に有効な試薬である。次の実施
例は螢光偏光法を使う免疫試験における本発明の
トレイサーの適合性を示している。この試験は次
の一般法によつて行なう： (1) 既知量の試験又は標準血清を試験管にとり緩
衝液でうすめる。 (2) 任意に表面活性剤を含む既知濃度の本発明ト
レイサーを各管に加える。 (3) 既知濃度の抗血清を管に加える。 (4) 反応混合物を室温において培養する。 (5) 試料中の配位子量の尺度として螢光偏光法に
よつて抗体に結合したトレイサー量を測定す
る。 実施例 ７ チロキシン試験 Ａ 必要な物質： (1) 0.01％牛ガンマグロブリンと0.01％アジ化
ナトリウムを含み0.1Mりん酸ナトリウム液
より成るPH7.5BGG緩衝液。 (2) BGG緩衝液中に実施例２でつくられた濃
度約60nMのチロキシンカルボキシフルオレ
スセイン誘導体より成るトレイサー。 (3) BBG緩衝液中に適当に稀釈されたチロキ
シンに対しあげられた羊抗血清より成る抗血
清。 (4) チロキシンを含む人の血清試料又は他の生
物学的液体。 (5) 血清変性剤−水中8M尿素、３％ドデシル
硫酸ナトリウム、１％ジチオエリスリトー
ル、50mMアスコルビン酸、2mMナトリウ
ムエデイテイト。 (6) クヴエツトとして使用する10×75mmガラス
培養管。 (7) 精度±0.001単位をもつ螢光偏光測定用螢
光計。 Ｂ 試験方法 １ 試験管内の血清変性剤50μに標準又は未
知試料を50μ加えた。試料を入れた管に栓
をして内容物を混合した。 ２ 変性試料29μをピペツトにとり稀釈容器
中の予処理試薬25mlと抗血清25mlを含む
BGG緩衝液500μに稀釈して各クヴエツト
に試料20μを入れた。次に稀釈試料175μ
をクヴエツト中にピペツトでとり次いで
BGG緩衝液805μをとつた。この点で血清
素地螢光をよんだ。 ３ クヴエツト中に稀釈試料75μ、トレイサ
ー25μおよびBGG緩衝液780μをピペツト
でとつてトレイサーを加えた。 ４ 全部のクヴエツトの内容物をよく混合し35
℃で４分間培養した。 ５ 螢光偏光を血清螢光素地と未知値決定のた
めつくられた標準曲線に対し補正した螢光計
でよみとつた。 Ｃ ０乃至24μｇ／dlの濃度のチロキシンを含む
血清標準の一連の結果を下に示す。各濃度は２
回測定の平均値である。チロキシン濃度（μｇ／dl） 偏光 ０ 0.223 ３ 0.209 ６ 0.197 12 0.173 18 0.155 24 0.143 螢光の偏光はチロキシン濃度の増加につれて
正常に減少すると思われ標準曲線を構成させ
る。同様の方法で処理された未知試料は標準曲
線と照合して定量できる。 患者の血清分析に上記方法を用いて放射線免
疫試験法（アボツトのT₄−PEG試験）によつ
て補正し結果をえた。補正係数0.0962をえた。 上記結果から明らかなとおり本発明のトレイ
サーは螢光偏光免疫試験における有用な試薬で
ある。上記の性質の他に本発明のトレイサーは
高度の熱安定性、高度の結合偏光、高量子収率
をもちまた生成および精製が比較的容易であ
る。 螢光偏光免疫試験に試薬として有用である以
外に本発明のチロキシンカルボキシフルオレス
セイン誘導体は次の実施例の方法による不飽和
チロキシン結合性蛋白質位置（“Ｔアツプテイ
ク”）測定に螢光偏光試験のトレイサーとして
有用である。 実施例 ８ Ａ 試薬 １ 予処理液−0.1Mりん酸ナトリウム緩衝液
（PH7.25）中に0.15％ドデシル硫酸ナトリウ
ム、0.564Mトリエチレンジアミン
（DABCO）および0.1％アジ化ナトリウムを
含む液。 ２ T₄−フルオレスセイントレイサー−0.005
％ドデシル硫酸ナトリウム、0.1％牛ガンマ
グロブリンおよび0.1％アジ化ナトリウムを
含む0.1Mりん酸ナトリウム緩衝液中に実施
例５でつくられた化合物４が2.4×10^-7M濃
度で使われる。 ３ Ｔアツプテイクキヤリブレイター−０、
0.5、1.0、1.5、2.0および2.5のアツプテイク
値をもつ４％人血清マトリツクス中の羊アン
チ−Ｔ抗血清。10のアツプテイク値は正常血
清のＴアツプテイクに相当する。 ４ 稀釈緩衝液−0.1％牛ガンマグロブリンと
0.1％アジ化ナトリウムを含む0.1Mりん酸ナ
トリウム液。 偏光された螢光測定はすべて偏光分光螢光計
（アボツトTD_x ^TM螢光偏光分析器）を用いて行な
つた。 Ｂ 試験方法 １ 未知試料1μを予処理液25μに加ええた
混合液を稀釈緩衝液を加えて1μとした。
えた試験液を混合し偏光した螢光素地を測定
した。 ２ 工程１の試験液に未知試験第２ 1μ、
予処理液25μ、T₄フルオレスセイントレイ
サー25μを加え最後に緩衝液を加えて容量
２mlとした。えた液を混合し偏光した螢光を
測定した。 ３ 混合液の最終偏光した螢光強さから素地の
偏光した螢光強さを差引いてトレイサー結合
による螢光偏光をえた。 ４ えた偏光値は各試料のＴアツプテイクに比
例する。 ５ 試料の螢光偏光を既知Ｔアツプテイク値の
キヤリブレイターを使つてつくつた標準曲線
と比較してＴアツプテイク値を示す。 本発明の特定修正法について記載したが、本発
明の真意と範囲を逸脱しない限り種々の代替、変
更および修正法もなしうることは明白でありまた
この同様の実施態様は本発明に包含されると考え
られるので、これらの詳細は本発明を限定するも
のと解釈すべきではない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式： 又は （上式中Ｔは【式】基を表し、但し ｎは１乃至８の整数とし、且つＲは共通抗体によ
   つて特異的に認識される様に、配位子と共通のエ
   ピトープ少なくも１を持つ配位子同族体を表す）
   で示される化合物、もしくはその生物学的に許容
   される塩からなる螢光偏光免疫試験用試薬。 ２ Ｒがチロキシン同族体である特許請求の範囲
   第１項に記載の試薬。 ３ Ｒが式： を持つ特許請求の範囲第２項に記載の試薬。 ４ ｎが２乃至４である特許請求の範囲第３項に
   記載の試薬。 ５ ｎが３である特許請求の範囲第４項に記載の
   試薬。 ６ 試料を式： 又は （式中Ｔは【式】基を表し、但しｎ は１乃至８の整数とし、且つＲは共通抗体によつ
   て特異的に認識される様に、配位子と共通の少な
   くも１エピトープを持つ配位子同族体を表す）で
   示される化合物、もしくはその生物学的に許容さ
   れる塩からなるトレイサー及び上記配位子と上記
   トレイサーを特異的に認識できる抗体と混合した
   後、試料中の配位子量の尺度として、螢光偏光法
   によつて抗体に結合したトレイサー量を測定する
   ことを特徴とする、上記試料中の配位子測定法。 ７ Ｒが50乃至4000の分子量を持つ特許請求の範
   囲第６項に記載の方法。 ８ Ｒがチロキシン同族体である特許請求の範囲
   第７項に記載の方法。 ９ Ｒが式： を持つ特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １０ ｎが２乃至４の整数である特許請求の範囲
   第６項又は９項に記載の方法。 １１ ｎが３である特許請求の範囲第１０項に記
   載の方法。