JPS59101480A - 蛍光偏光免疫試験用試薬及び配位子測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血清、血漿、を髄液、羊膜液および尿の様な生
物学的液体中の配位子測定法とその試薬に関する。本発
明はまた螢光偏光免疫試験に試薬として使用できるフル
オレスセイン誘導体の新種に関する。

配位子測定の競合結合性免疫試験は試験試料中の配位子
とトレイサーというラベル付き試薬間の配位子と試薬に
特異的な抗体上の受体結合位置の限定数に対する競合に
基づく。試料中の配位子濃度は抗体に特異的に結合する
トレイサー量を決定する。生成したトレイサーー抗体結
合体量は定量的に測定でき、試験試料中の配位子量に逆
比例する。

螢光偏光法は螢光ラベル付き化合物が直線偏光によって
励起された時その回転速度に逆比例した偏光度をもつ螢
光を発するという原理に基づく。したがって螢光ラベル
付きトレイサーー抗体結合体の様な分子が直線偏光によ
って励起された場合光が吸収されまた発生する時間の間
螢光団が回転から拘束されるので発生光は非常に偏光さ
れたま１でいる。”自由な”トレイサー化合物（即ち抗
体に結合されていない）が直線偏光によって励起された
場合、その回転は対応するトレイサーー抗体結合体より
もずっと速く分子はより無秩序に配列され、したがって
発生光は消偏される。

故（Ｃ螢光偏光は競合結合性免疫試験においで生成され
たトレイサーー抗体結合体量測定用の手段となる。

種々の螢光ラベル付き化合物がこの分野で升られている
。

米国特許第８，９９８，９４８号は螢光ラベルとしてフ
ルオレスセインインチオシアネイト（ＦＩＴＣ）を用い
て螢光ラベル付インシュリン誘導体、および螢光ラベル
として４−アミノフルオレスセイン塩酸塩を用いて螢光
ラベル付きモルフォリン誘導体の各製造を記載している
。カルボキシフルオレスセインもまた分析的測定に使わ
れている。Ｒ，Ｃ。

チンはＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｌａｔｔｅｒｓ、　１０
　、７８７（１９７７）にホスフォリパーゼの活性を示
すカルポキシフルオレスセインの用途を記載している。

カルボフルオレスセインはレシチン細胞内脂肪粒子中に
包まれており、それはレシチンの加水分解によって放出
された時にのみ螢光を発する。

１９８１年１１月１１日出願の米国特許出願第３２９，
９７４号は螢光偏光免役試験に試薬として有用な配位子
−同族体に直接力ルボキシフルオレスセインが結合して
いるカルボキシフルオレスセイン誘導体の１種を発表し
ている。

の整数としかつＲはＴによって表わされる基のカルボニ
ル炭素に結合し７ている反応性第１又は第２アミン基を
もちかつ通常の（コモン）抗体によって特異的に認定で
きるＩ５！に上記配位子と通常の少なくも１エピトープ
（コモンｅｐｉ−ｔ　ｏｐｅ　）をもつ配位子同族体を
表わす）をもつトレイサーの生物学的に許容されるＱｇ
よび上記配位子および上記トレイサーを特異的に認定で
きる抗体と混合した後試料中の上記配位子濃度の尺度と
して螢光偏光法によってトレイサー抗体結合体の量を決
定することより成る試料中の配位子測定法を包含する。

本発明は更に上記方法において試薬中に有用である新規
のトレイサーおよびその生物学的に許容される塩ニ関す
る。

本明細書に使用する”配位子°′とは分子、特に結合蛋
白質、通常抗原がそこにえられる又は生成される単一反
応性アミン基をもつ低分子量ハプテンをいう。このハプ
テンは蛋白質を含まぬ化合物であり一般に低分子量であ
るので動物に注入した時抗体を生成しないが、抗体に反
応性である。

ハプテンに対する抗体は一般に先づ蛋白質ニー・ブテン
を結合させ結合生成物を動物に注入することによってつ
くられる。えた抗体は普通の抗体分離法で単離できる。

一本発明の方法によって測定できる配位子は広い分子量
範囲にわたる。高分子量配位子も測定できるが、最良結
果をえるためには一般に５０乃至４０００の範囲の低分
子量配位子測定に本発明の方法を用いるとよい。１００
乃至２０００の分子量範囲をもつ配位子測定が更に好ま
しい。

本発明の方法によって測定できる代表的配位子にはニス
トリオルエストロン、エストラジオル、コルチソル、テ
ストストロン、フロゲステロン、デオキシコール酸、リ
トコール酸およびそれらのエステルおよびアミド誘導体
の様なステロイド；Ｂ−１２、フォリン酸の様ナヴイタ
ミン；チロキシン、トリアイオドチロキシン、ヒスタミ
ン、セロトニン、ＰＧＥ、ＰＧＦＸＰＧＡの様なプロス
タダランジン；テオフィリンの様な抗喘息剤、ドクソル
ビシンやメソトレキセイトの様なアンチネオプラステン
ク剤：ジソピラミド、リドカイン、プロ力インアミド、
プロプラノロール、キニジン、Ｎ−アセチループロカイ
ンアミドの様な抗不整脈剤；フエノパルビタール、フエ
ニチオン、フリミドン、ヴアルプロイン酸、カルバマゼ
ピンおよびエンスキシミドの様な抗痙れん剤；ペニシリ
ン、セファロスピリンおよびヴアンコマイシンの様な抗
生物質；サリチレイトの様な抗関節炎剤；ノルトリブチ
リン、アミトリブチリン、イミプラミンおよびデシプラ
ミンの様なトリシクリックスを言む抗抑田剤：等並びに
それらの代謝産物がある。更に本発明の方法により測定
できる配位子はモルヒネ、ヘロイン、ヒドロモルフオン
、オキシモルフオン、メタポン、コディン、ヒドロコド
ン、ジヒドロコディン、ジヒドロヒドロキシコデイノン
、フォルコシン、デキストロメンルファン、フエナゾシ
ンおよびデオニンの様す弊害をもつ薬剤およびそれらの
代謝産物がある。

本明細書で使用する配位子同族体とは受体の結合位置に
ついて配位子と競合しうる１又は２以上の決定要素又は
エビトビツクな位置をきめる実質的部分に配位子と同じ
空間的および極性構成をもつ１価又は多価基をいう。こ
の配位子同族体の特徴はそれが配位子の抗体により認定
される様に問題の配位子に十分構造的類似性をもつこと
である。たいてい配位子同族体は分子表面の大部分につ
いて問題の配位子と同じ又は実質的に同じ構造および荷
電分布（空間的および極性構成）をもつ。しげしげノ・
ブテンの結合位置が配位子への結合に使われる様な抗体
生成用抗原製造におけると同じであるので、抗体のテム
プレイトとなる配位子同族体の同じ部分がトレイブー中
の配位子同族体によってさらされるであろう。

一般ＫＲＶＣよって表わされる配位子同族体の種類は反
応性アミン（第１又は第２）に結合している水素原子の
除去により又はアミノ基−Ｎ−がＴにより表わされた基
のカルボニル炭素への結合位置において配位子に元から
ある１又は２以上の原子を置換する配位子のアミン誘導
体生成により対応する配位子から誘導される。活性アミ
ノ基からの水素除去によりＲによって表わされる配位子
同族体を生成する配位子の例には例えばプロ力インアミ
ド、チロキシンおよびキニジンがある。配位子のアミノ
誘導体が配位子同族体として有用な配位子の例にはテオ
フィリン、ヴアルプロイン酸、フエノバルビタール、フ
ェニトイン、フリミドン、シソピラミド、ジゴキシン、
クロラムフエニコル、サリチレイト、アセグミノフエン
、カルバマゼピン、デシプラミンおよびノルトリブチリ
ンがある。更に配位子は１又は２以上の反応性基の添カ
ロ又は削除によって構造的に変性して抗体に結合するに
必要なエピトープ位置を保持する配位子同族体を生成で
きる。しかしこの変性配位子同族体はイミノ基をとおし
てＴによって表わされる基のカルボニル炭素に結合する
。

ＴＶ７Ｃよって表わされる基のｎは２乃至４であること
が好ましい。

本発明のトレイサーは一般にその酸とイオン化状態との
間の平衡状態にあり、本発明の方法においてはイオン化
状態にあるとき有効である。したがって本発明は酸又は
イオン化状態のいづれＶこおけるトレイサーも包含し、
便宜上そのイオン化状態にあるトレイサー・は生物学的
に許容される塩の形で存在する。本明細書でいう“生物
学的に許容される塩”とは本発明の方法に使う場合本発
明のトレイサーをイオン化状態に存在させるナトリウム
、カリウム、アンモニウム等の様な塩をいう。一般に本
発明のトレイサーは塩として溶液中にあり、特定塩は使
用される緩衝液から、即ちりん酸ナトリウム緩衝液の存
在でえられ、本発明のトレイサーは一般にナトリウム塩
としてそのイオン化状態で存在する。

本発明の方法によれば測定しようとする配位子を含む試
料を式（Ｉ）をもつトレイサーの生物学的に許容される
塩および配位子とトレイサーに特異的な抗体と混合する
。試料中にある配位子とトレイサーは限定されている抗
体位置を競合し配位子−抗体およびトレイサーー抗体複
合物を生成する。トレイサーと抗体の濃度を一定とする
ことによって生成された配位子−抗体複合物対トレイサ
ーー抗体複合物の比率は試料中にある配位子量に直接比
例する。故に、混合物を偏光によって励起しトレイサー
とトレイサー抗体複合物によって発生する螢光の偏光を
測定すれば試料中の配位子量を定量測定できる。

理論的に抗体に複合しないトレイサーの螢光偏光は小さ
くゼロに近い。特定抗体と複合すると生成したトレイサ
ーー抗体複合物は比較小さいトレイサー分子よりもおそ
い抗体分子の回転をするので偏光増加が認められる。故
に配位子がトレイサーと抗体位置を競合する場合トレイ
サーー抗体複合物の螢光の認められた偏光はトレイサー
とトレイサーー抗体複合物の値の間の値となる。もし試
料が配位子の高濃度を含むならば認められる偏光値は遊
離配位子の値に近い、即ち小さい。試験試料の配位子が
小濃度ならば偏光値は結合した配位子の値に近い、即ち
高い。免疫試験の反応混合物を垂直偏光で、次いで水平
偏光で次々に励起し発生光の垂直成分のみを分析するこ
とによって反応混合物中の螢光の偏光を正確に測定でき
る。測定する配位子の偏光と濃度の間の正確な関係は既
知濃度をもつ補正物の測光値測定によってできる。配位
子濃度はこの様にしてつくられた標準曲線から外挿でき
る。

本発明の方法実施におけるｐｌｉは式（１）をもつトレ
イサーをそのイオン化状態におくに十分なｐＨでなけれ
ばならない。このｐＨは約３乃至１２、普通約５乃至１
０、最も好壕しくは約６乃至９である。試験中ｐＨを上
のとおりとじ才だ保つため種々の緩衝液が使われる。代
表的緩衝液はほう酸塩、りん酸塩、炭酸塩、トリス、バ
ルビタール等がある。使用する特殊緩衝液は本発明には
重要でないが、個々の試験には使用抗体と測定する配位
子を考えて特定緩衝液が好ましい。緩衝液の陽イオン部
分は一般に溶液中のトレイサー塩の陽イオン部分を決定
するだろう。

本発明の方法は中位の温度で実施され一定温度がよい。

温度は通常Ｏ乃至５０℃、好ましくは約１５乃至４０℃
である。

分析できる配位子濃度は一般に約１Ｏ−２乃至１０−”
Ｍ。

より普通に約１０−４乃至１０−１０Ｍの範囲で変る。

高濃度配位子は元の試料を稀釈した後試験できる。

分析する配位子濃度の他に試験を定性的に、準定量的に
又は定量的に行なうかどうかの考察、使用装置およびト
レイサーと抗体の特性が通常使用するトレイサーと抗体
の濃度を決定するであろう。試料中の配位子濃度が他の
試薬、即ちトレイサーと抗体の濃度範囲を決定するが、
通常試験感度を最適とするため個々の試薬濃度は経験的
に決定される。トレイサーと抗体の濃度はこの分野の技
術をもつ者によって容易に確定できる。

本発明の好ましいトレイサーは５−カルポキシフルオレ
スセイン又は６−カルポキシフルオレスセインの誘導体
又はそれらの混合物として特徴づけられ式：によって表
わされる。

下記に示す実施例は本発明の範囲内の特定トレイサーの
製造法をこの技術分野の知識ある者に示すだめのもので
、本発明を限定するものではない。下記実施例中で製造
される化合物を示す構造式中の〔ＣＦ３は式：をもつ部
分を表わす。式中カルボニル炭素は実施例中の出発物質
が５−カルボキシフルオレスセイン、６−カルポキシフ
ルオレスセイン又はそれらの混合物であるかどうかによ
って５又は６の位置に結合する。

実施例１ ジメチルホルムアミド２ｄ中に６−カルポキシフルオレ
スセイン８３〜（０，２２ミリモル）の溶液ＶＣＮ−ヒ
トαキシスクシニミド２８ｍ９　（０，２４ミリモル）
とＮ　、　Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド５５
〜（０，２７ミリモル）を加えた。反応混合物をアルゴ
ン雰囲気のもとで０℃で１時間撹拌し更に４℃で１６時
間撹拌して式：をもつカルボキシフルオレスセインのＮ
−ヒドロキシスクシニミド活性エステルを得た。

実施例２ ２％水酸化ナトリウム水溶ｅ、１００ｍ７！とジオキサ
ン１００Ｍ中に５−アミノヴアレリアン酸５．８５ｇ（
０：０５モル）を含む溶液中にジオキサ７４０ａ中にジ
ーｔ−プチルジカーボネイ）　１０．９　ｇ（０，０５
モル）を含む溶液を滴〃口した。

反応混合物を１８時間撹拌後ｌＮｌ１Ｃ１ｌを用いてｐ
Ｈａｅ性とした。混合物を３回ジクロロメタンで抽出し
有機層を併せ水洗し硫酸ナトリウム上をとおして乾燥し
５−（ｔ〜ブトギシ力ルポニルアミノ）ヴアレリアン酸
白色結晶性固体１０．１　、！？　（９８，５％収率）
をえた。

５−Ｃｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヴアレリアン酸
０．４３４．Ｎｏ−００２モル）にジクｏｏメタン３ｒ
ｎＩＶ中にＮ　、　Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイ
ミド０．４１２ｇ（０，００２モル）とＮ−ヒドロキシ
スクシニミド０．２５ｇ（０，００２２モル）を含む液
を撹拌しながらカロえ１８時間反応させて油状残渣とし
て５−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヴアレリアン
酸のＮ−ヒドロキシスクシニミド活性エステルをえた。

油状残渣にメタノール３Ｑｍ中にＬ〜チロキシンナトリ
ウム塩５水化物１．９５　、！７　（ＣＩ　Ｏ０２２モ
ル）を含む液を刀ｎえた。

１８時間反応を進行させた後反応混合物をイオン交換樹
脂管ＣＢｉｏ−Ｒａｄ　ＡＧ■５（１’−、￥８＃＋型
→にとおしメタノールで溶離した。溶離液を真空濃縮し
て式：をもつ中間物１，９６．！１Ｊ（９０％収率）を
えた。

中間物ｏ、ｔ２５ｇ（ｏ、ｏｏｏ１５モル）をトリフル
オロ酸ｅ２．０αと８０分間処理し減圧蒸発してトリフ
ルオロ酢酸を除きえた残渣をＮ　、　Ｎ’−ジメチルホ
ルムアミド１．５１ｎＩＶにとかした。えた溶液をトリ
エチルアミンで塩基性ｐＨとした。えた混合物にカルボ
キシフルオレスセインのＮ−ヒドロキシスクシニミド活
性エステル７ｓｍｇ（ｏ、ｏｏ０１５９モル）を〃口え
１８時間反応させた。反応混合物にジエチルエーテルを
加えて沈澱させ、沈澱を予備逆相ＴＬＣＫよりメタノー
ル：水：酢酸（７５：２５：０．５）混合物を用いて精
製して式： ヲモつチロキシン−６−カルポキシフルオレスセイン結
合物０．０７Ｌ９をオレンジ色固体としてえた。

実施例３ 水酸化ナトリウム４．５ｉ０．１１２５モル）を含むジ
オキサン：水１：１混合物１００ａ中のβ−アラニン１
０ｇ（０，１１２２モル）を含む液にジオキサン４０ｄ
中にジーｔ−プチルジカーボネイト２６．９５ｇ（Ｑ、
１２３５モル）を含む液を滴加した。反応混合物を１６
時間撹拌後ＩＮＨＣ８でｐＨ３ｅ性としこれをジクロロ
メタンで３回抽出した。有機層を併せ稀塩酸液で洗い硫
酸マグネシウム上で乾燥して５−ｔ−ブトオキシカルボ
ニルアミノ）プロピオン酸ｉ７．Ｎ９Ｂ、５％収％）を
えた。

塩化メチレン２５α中にとかした３−（ｔ−ブトキシカ
ルボニルアミノ）プロピオン酸２．１．！ｉ＋（０，０
１０モル）の液にＮ、Ｎ′−ジシクロへキシルカルボジ
イミド１．３４　ｇ（０，０１１６モル）とＮ−ヒドロ
キシスクシニミド２．６２ｇ（０，０１２７モル）を〃
口えた。アルゴン雰囲気のもと室温で反応を２０時時間
性させ油状残渣をえてこれを塩化メチレンに再溶解し渥
過した。Ｆ液を真空濃縮し８−（ｇ−ブトキシカルボニ
ルアミノ）プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシニミド
活性エステル白色固体をえた。

メタノール２ａ中にＬ−チロキシンナトリウム塩５水化
物０．５ｇ（０，０００６モル）を含む液に３−（ｔ−
ブトキシカルボニルアミノ）プロピオン酸のＮ−ヒドロ
キシスクシニミド活性エステル０．２４ｇ（０，０００
８モル）を加えた。反応が進むと残渣が生成し反応完了
と共にＩ　ＮＮａＯＨを加えて残渣をとかした。反応生
成物をシリカゲル管を使いメタノ・−ル：塩化メチレン
１：４混合液で溶離して精製した。溶離物を濃縮して式
： をもつ中間物をえた。

塩化水素を含むジオキサンの飽和溶液中に中間物０．２
ｇ（０，０００２１モル）をとかしえた溶液を室温で２
時間撹拌した。ジオキサン：塩酸を真空除去しえた残渣
をＮ　、　Ｎ’−ジメチルホルムアミド１．５ａにとか
した。えた液をトリエチルアミンを使って中性７）Ｈに
調整した。えた混合物に６−カルポキシフルオレスセイ
ンのスクシニミド活性エステル１０７ｍ９（０，０００
２２モル）を加えた。アルゴン雰囲気のもとて反応を１
６時時間性させ粗生成物をえてこれを予備逆相ＴＬＣに
よって精製しメタノール：水：酢酸（７０：８０：０．
４）混合物を使って式：ヲモつチロキシン−６−カルポ
キシフルオレスセイン結合物１０．０？ｎ９（収率４％
）をえた。

実施例４ ６−アミノカプロン酸１０　ｇ（０，０７６２８ミリモ
ル）を含む液を絶えず撹拌しながら水酸化ナトリウム３
．０５ｇ（０，０７６２５ミリモル）を含むジオキサン
：水１：１混合物２００ａを含む混合物に加えた。えた
溶液にジオキサン８０ａ中にジーｔ−プチルジカーボネ
イト１６．５４．Ｖ（０，０７６２８モル）を言む液を
滴／ＩＩした。反応混合物を１６時間撹拌した後ＩＮ塩
酸でｐＨ３酸性とした。この液をジクロロメタンで８回
抽出し有機層を併せ真空濃縮し残渣を塩化メチレンにと
かした。塩化メチレン液を稀塩酸で洗い飽和重炭酸ナト
リウム液で抽出して水層を併せた。水層をＩＮ塩酸でｐ
Ｈ３とした後塩化メチレンで抽出した。

塩化メチレン抽出液を硫酸マグネシウム上をとおし乾燥
し真空濃縮して５−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）
カプロン酸１８ｇ（収率７５％）をえた。

塩化メチレン：ジメチルホルムアミド１：１混合物１０
σ中にアルゴン雰囲気のもと室温で５−（ｔ−ブトキシ
カルボニルアミノ）カプロン酸１．０９　（０，００４
８２モル）をとかした。えた溶液にＮ−ヒドロキシスク
シニミド０．５５．９（０，００４７８モル）と次に＃
、＃’−ジシクロへキシルカルボジイミド１０７　、Ｖ
　（０，００５１９モル）を〃口えた。

反応を２０時間させた後セライトをとおして濾過しＦ液
を濃縮し残渣を塩化メチレンに再溶解した。塩化メチレ
ン液を濾過濃縮して白色固体をえた。この固体０．５８
ｇ（０−００１７７モル）ヲメタノール４α中にＬ−チ
ロキシンナトリウム塩５水化物０．５ｇ（０，０００５
６モル）を含む液に加えた。これをアルゴン雰囲気のも
とて室温で３時間撹拌した後濃縮して式： をもつ黄褐色粉末として中間物をえた。

中間物０．１１（０，０００１モル）を塩化メチレンニ
トリフルオロ酢酸ｌ：１混合物にアルゴン雰囲気のもと
て０℃でとかした。４５分後場化メチレンとトリフルオ
ロ酢酸を真空除去しえた残渣をジメチルホルマミド１ｍ
１７とかしえた溶液をトリエチルアミンでｐＨ８とした
。ジメチルホルマミド１ｍＫとかした６−カルポキシフ
ルオレスセイン０．３８ｇ（０，０００１モル）を１，
１′−カルボニルジイミジゾール０．０１６ｇ（０，０
００１モル）と反応させて製造した６−カルポキシフル
オレスセインイミジゾライドを含む液に上記溶液を加え
た。

反応混合物をアルゴンのもと室温で４時間撹拌し粗生成
物をえた。これを逆相薄層クロマトグラフ法で精製しメ
タノール：水：酢酸（７０：３０：０，４）混合物を用
いて式：ヲモつチロキシン−６−カルポキシフルオレス
セイン結合物ｏ−ｏ５４ｇ（収率４３％）をえた。

実施例５ Ｎ、Ｎ仁ジメチルホルムアミド２ａ中のＮ　、　Ｎ’−
ジシクロへキシルカルボジイミド０．３５８．ＮＯ，０
Ｏ１７モル）とＮ−ヒドロキシスクシニミド（１１９７
ｇ（０，００１７モル）をＮ−ｔ−ブトキシカルボニル
グリシン０．３ｇ（０，００１７モル）と処理した。１
８時間反応させた後反応混合物をテトラヒドロフラン５
ｍＡ’で稀釈し濾過し沖液を減圧濃縮して白色固体Ｎ−
１−ブトキシカル−二ルダリシンーＮ−ヒドロキシスク
シニミドエステルヲエタ。

メタノール２０酎中にＬ−チロキシンナトリウム塩５水
化物１．１３７．９（０，００１２８モル）を宮む溶液
とＮ−を−ブトキシ力ルポニルダリシンＮ−ヒドロキシ
スクシニミドエステル０．３５ｇ（０，００３モル）を
１８時間処理した。

混合物をＢ１０−Ｒａｄ　ＡＧ■５０Ｗ−Ｘ８ＣＨ＋型
→のイオン交換樹脂管にとおしメタノールで処理した後
減圧濃縮して白色固体１．０ｙをえた。

白色固体０．１２５ｇ（０，０００１３４モル）をトリ
フルオフ酢酸３．Ｑｍノと３０分反応芒せた後酸を減圧
蒸発除去しえた残渣をＮ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド
１．５αにト、’＋＞Ｌトリエチルアミンを使って溶液
のｐＨをアルカリ性とした。

エタ混合物に５−カルボキシフルオレスセインＮ−ヒド
ロキシスクシニミドエステル０．００７５ｇ（０，００
０１５９モル）を加え１８時間反応させて粗生成物をえ
た。これを逆相薄層クロマトグラフ法でＮ製しメタノー
ル：　水：Ｍ（７５：２５＋０．５）混合物を用いて式
：ヲモつオレンジ色固体チロキシン−５−カルボキシフ
ルオレスセイン結合物をえた。

実施例６ Ｎ　、　Ｎ’−ジメチルホルムアミド１０ｄ中にガンマ
−アミノ酪酸１．０８．！ｉ’（０，０１０モル）とＮ
−ペンジルオキシヵルホ′ニルオキシスクシニミド２，
４９１０．０１モル）ヲ２２℃で１８時間撹拌した。え
た透明溶液を濃縮し残渣に水を加ええた油は白色結晶と
なった。これを乾燥した残渣をシリカゲル管を使ってＮ
製しジクロロメタン：メタノ−／Ｌ’（９５：５）混合
物で溶離してガンマ−（ベンジルオキシカルボニルアミ
ノ）酪酸をえた。

ガンマ−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）酪酸０−
２３７．！１７　（０，００１モ＃）をジクｏｏメ：ｊ
ｌン２ｖｔｌ中のＮ　、　Ｎ’−ジクロロへキシルカル
ボジイミド０．２０６ｇ（０，００１モル）オよＵＮ−
ヒドロギシスクシニミド０．１８５．９　（０，００１
２−Ｅル）　、！＝２２℃で２時間処理した。

反応混合物を濾過しＰ液を減圧撰縮してガンマ−（ベン
ジルオキシカルボニルアミノ）酪酸のスクシニミドエス
テルを油状残渣としてえた。これをメタノール５ｒＬｌ
中ＯＬ−チロキシンナトリウム塩５水化物０．８８’ｌ
（０，００１モ＃）と１８時間反応させた。反応混合物
をＢｉｏ−Ｒａｄ　ＡＧ■５０Ｗ−Ｘ８（Ｈ十型）のイ
オン交換樹脂管をとおしメタノールを用いた後蒸発して
ガラス状白色結晶をえた。これをシリカゲル管クロマト
グラフ法を用いて精製しジクロロメタン：メタノール（
９：　１　）混合物を用いて溶離し白色固体をえた。

この白色固体０−２５ｇ（０−００００２５モル）に３
０チ臭化水素酸を含む酢酸０．４１を３０分間に加えた
。過剰のジエチルエーテルを加えると臭化水素酸塩が沈
澱した。これを洗い乾燥した後トリエチルアミンの存在
においてＮ。

Ｎ′−ジメチルホルムアミドＱ、４ｒＩＬｌ！中５−カ
ルボキシフルオレスセインＮ−ヒドロキシスクシニミド
エステル０．２１（０，０００５８モル）と１６時間反
応させてえた生成物を逆相薄層クロマトグラフ法を用い
て精製しメタノール：水：酢酸（７０：３０：０，５）
混合物を用いて式：をもつオレンジ色固体チロキシン−
５−カルボキシフルオレスセイン結合物をえた。

前記したとおり本発明のトレイサーは螢光偏光免疫試験
での使用に有効な試薬である。次の実施例は螢光偏光法
を使う免疫試験における本発明のトレイサーの適合性を
示している。この試験は次の一般法によって行なう：１
）既知量の試験又は標準血清を試験管にとり緩衝液でう
すめる。

２）任意に表面活性剤を含む既知濃度の本発明トレイサ
ーを容管に加える。

３）既知濃度の抗血清を管に加える。

４）反応混合物を室温において培養する。

５）試料中の配位子量の尺度として螢光偏光法によって
抗体に結合したトレイサー量を測定する。

実施例７ チロキシン試験 Ａ　必要な物質： １）ＱＯＩ％牛ガンマグロブリンと０．０１％アジ化ナ
トリウムを含み０．１Ｍりん酸ナトリウム液より成る７
）Ｈ”１．５ＢＧＧ緩衝液。

２）ＢＧＧ緩衝液中に実施例２でつくられた濃度約６０
ｎＭのチロキシンカルボキシフルオレスセイン誘導体よ
り成るトレイサー。

８）ＢＢＧ緩衝液中に適当に稀釈されたチロキシンに対
しあげられた竿尻血清より成る抗血清。

４）チロキシンを含む人の血清試料又は他の生物学的液
体。

５）血清変性剤−水中８Ｍ尿素、３チドデシル硫酸ナト
リウム、１％ジチオエリスリトール、５０ｒｎＭアスコ
ルビン酸、２ｍ、ＡＩナトリウムエディティト。

６）クヴエットとして使用する１０Ｘ７５＋ｎｍガラス
培養管。

７）精度±０．００１単位をもつ螢光偏光測定用螢光針
。

Ｂ、試験方法 １、試験管内の血清変性剤５０μｅに標準又は未知試料
を５０μβ力口えた。試料を入れた管に栓を１−て内容
物を混合した。

２、変性試料２９μｅをピペットにとり稀釈容器中の予
処理試薬２５１Ｍと抗血清２５αを含むＢＧＧ緩衝液５
００μｇに稀釈して各クヴエソＩＣ試料２０μＥを入れ
た。

次に稀釈試料１７５μβをクヴエット中にピペットでと
り次いでＢＧＧ緩衝液８０５μｌをとった。この点で血
清素地螢光をよんだ。

３、クヴエソト中に稀釈試料７５μｅ１トレイサー２５
μｅおよびＢＧＧ緩衝液７８０μｇをピペットでとって
トレイサーを加えた。

４、全部のクヴエソトの内容物をよく混合し３５℃で４
分間培養した。

５、螢光偏光を血清螢光素地と未知値決定のためつくら
れた標準曲線に対し補正した螢光針でよみとった。

Ｃ００乃至２４μｇ／ｄｅの濃度のチロキシンを含む血
清標準の一連の結果を下に示す。各濃度は２回測定の平
均値である。

０　　　　　　　　　０．２２８ ８　　　　　　　　　０．２０９ ６　　　　　　　　　０．１９７ １２　　　　　　　　　０．１７８ １８　　　　　　　　　０．１５５ ２４　　　　　　　　　０．１４８ 螢光の偏光はチロキシン濃度の増加につれて正常に減少
すると思われ標準曲線を構成させる。同様の方法で処理
された未知試料は標準曲線と照合して定量できる。

患者の血清分析に上記方法を用いて放射線免疫試験法（
アボットのＴ４−ＰＥＧ試験）によって補正し結果をえ
た。

補正係数０．０９６２をえた。

上記結果から明らかなとおり本発明のトレイサーは螢光
偏光免疫試験における有用な試薬である。上記の性質の
他に本発明のトレイサーは高度の熱安定性、高度の結合
偏光、高量子収率をもちまた生成および精製が比較的容
易である。

螢光偏光免疫試験に試薬として有用である以外に本発明
のチロキシン力ルボキシフルオレスセイン誘導体は次の
実施例の方法による不飽和チロキシン結合性蛋白質位置
（“Ｔアップティク″）測定に螢光偏光試験のトレイサ
ーとして有用である。

実施例８ Ａ、試薬 １、予処理液−０，１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７，２５）中に０．１５％ドデシル硫酸ナトリウム、０
．５６４ＭトリエチレンジアミンＣＤＡＢＣＯ）および
０．１チアジ化ナトリウムを含む液。

２．１４−フルオレスセイントレイサー−ＣＩ　００５
　％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％牛ガンマグロブ
リンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含む（１１Ｍり
ん酸ナトリウム緩衝液中に実施例５でつくられた化合物
４が２．４Ｘ１０−７Ｍ１！に度で使われる。

３、　　Ｔアンプティクキャリプレイター−０，０，５
，１，０，１，５，２，０および２．５のアップティク
値をもつ４％人血清マトリックス中の羊アンチーＴ抗血
清。１０のアップティク値は正常血清のＴアップティク
に相当する。

４、稀釈緩衝液−一０．１％牛ガンマグロブリンと０．
１％アジ化ナトリウムを含むＱＩＭりん酸ナトリウム液
。

偏光された螢光測定はすべて偏光分光螢光針（アボンド
ＴＤＴＭ螢光偏光分析器）を用いて行なった。

Ｂ、試験方法 １、未知試料１μＥを予処理液２５μｅに加ええた混合
液を稀釈緩衝液を加えて１ａとした。えた試験液を混合
し偏光した螢光素地を測定した。

２、工程１の試験液に未知試料第２１μｅ１予処理液２
５μｍ２ＸＴ、フルオレスセイントレイサ−２５μＢ、
−加工最後に緩衝液を加えて容量２ｒｎｌとした。えた
液を混合し偏光した螢光を測定した。

３、混合液の最終偏光した螢光強さから素地の偏光した
螢光強さを差引いてトレイサー結合による螢光偏光をえ
た。

４、えた偏光値は各試料のＴアップティクに比例する。

５、試料の螢光偏光を既知Ｔアップティク値のキャリブ
レイク−を使ってつくった標準曲線と比較してＴアップ
ティク値を示す。

本発明の特定修正法について記載したが、本発明の真意
と範囲を逸脱しない限り種々の代替、変更および修正法
もなしうろことは明白でありまたこの同様の実施態様は
本発明に包含されると考えられるので、これらの詳細は
本発明を限定するものと解釈すべきではない。

手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 餡和５８年特許願第２０８４３９号 ２、発明の名称 置換されたカルボキシフルオレセイン ３、補正ｔする者 事件との関係　　特許出願人 名称　　アボット　　ラボラトリーズ 赤坂大成ビル（電話５８２−７１６１）願書に添付の手
書き明細書 ６、補正の内容 別紙のとおり手書き明細書會タイプ浄曹に補正した。

ただし、内容の補正はない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式： １乃至８の整数としかつＲは通常の抗体によって特異的
   に認識される様に配位子と通常のエピトープ少なくも１
   をもつ配位子同族体を表わす）で示されることを特徴と
   する化金物およびその生物学的に許容される塩。 ２、　　Ｒがチロキシン同族体である特許請求の範囲第
   １項に記載の化合物。 ３、　　Ｒが式。 をもつ特許請求の範囲第２項に記載の化合物。 ４、　ｎが２乃至４である特許請求の範囲第３項に記載
   の化合物。　　　　　５、　　ｎが３である特許請求の
   範囲第４項に記載の化合物。 ６、試料を式： 又は 乃至８の整数とし、かつＲは通常の抗体によって特異的
   に認識される様に配位子と通常の少なくも１エピトープ
   をもつ配位子同族体を表わす）で示されるトレイサーお
   よびその生物学的に許容される塩および上記配位子と上
   記トレイサーを特異的に認識できる抗体と混合した後試
   料中の配位子量の尺度として螢光偏光法によって抗体に
   結合したトレイサー量を測定することを特徴とする上記
   試料中の配位子測定法。 ７、　　Ｒが５０乃至４，０００の分子量をもつ特許請
   求の範囲第６項に記載の方法。 ８、　　Ｒがチロキシン同族体である特許請求の範囲第
   ７項に記載の方法。 ９、　　Ｒが式： をもつ特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １０、　　ｎが２乃至４の整数である特許請求の範囲第
   ６項又は９項に記載の方法。 １１、　　ｎが３である特許請求の範囲第１０項に記載
   の方法。