JPH0478639B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 インターロイキン２（以下、「IL−２」と略記
する。）は、ヒト、マウス等に存在する免疫伝達
因子であり、抗腫瘍薬、免疫不全症治療薬、自己
免疫疾患治療薬、診断薬、試薬等の応用が期待さ
れている。IL−２は、例えば、脾細胞、血中の
リンパ球、Ｔリンパ球由来の悪性化細胞株等の株
化細胞を用いて産生されまたは遺伝子組み換え技
術により他の生物、微生物を用いて産生される
が、このようにして得られる粗IL−２は、一般
に低濃度のIL−２しか含有しておらず、多くの
夾雑物を含んでいるため、特に医薬として実用に
供するためには、そのようなIL−２を精製する
ことが不可欠である。 IL−２の精製法としては、次のようなものが
報告されている。 ガロらは、人末梢血中のリンパ球の産生した
IL−２を塩析、イオン交換クロマログラフイー
（DEAE−セフアローズ）を行なつた後、ポリエ
チレングリコールを0.1％含有する緩衝液中でゲ
ル過クロマトグラフイーを２度用い、更にSDS
を用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動による
精製を行ない、精製度808倍のIL−２を回収率0.8
％で得ている（R.C.Gallo et al.，J.Immunol.
128 1122（1982））。しかし、この方法は、回収率
が低く、電気泳動による精製は大量調製に適して
いない。またSDSを用いるため、精製サンプル中
の界面活性剤メデシル硫酸ナトリウムを除去する
ことがはなはだ難しく、臨床用に適さない。ガロ
らはゲル過の際、緩衝液中にポリエチレングリ
コールを添加しているが、これはIL−２がイン
ターフエロンと同様に培養上清には極微量しか含
まれておらず、不純蛋白が少なくなると各種の操
作過程により容器、樹脂等へ付着しその回収が困
難となるのを防止するためである。その回収法に
ついての各報告とも種々の工夫がなされているが
難しいのが現状である。 オツペンハイムらは、フエニルセフアローズ、
DEAE−セフアセルゲル過、電気泳動を用いて
人末梢血、扁桃腺、脾臓より産生したIL−２を
精製しているが、精製度は70〜120倍と低く、ま
た等電点電気泳動による精製を行なつているため
大量調製に適しない（J.Oppenheim et al.，J.
Immunol.128 1620（1982）） また、ムーアら（M.A.S. Moore et al.，J.
Exp.Med.156 454（1982））は、人末梢血より採
取したリンパ球より産生させた人IL−２をイオ
ン交換クロマトグラフイー（DEAE−セルロー
ス）、ゲル過による精製の後、２種のアフイニ
テイークロマトグラフイーを試みており、精製度
の点では優れているが（３万倍以上、）原料のIL
−２の比活性が低いため精製度が高くなつている
ことを考慮する必要があること、また収率が低い
等の欠点を有する。 その他では、ギリスら（S.Gillis et al.，J.
Immunol.124 1954（1980））、ライヒら（E.Reich
et al.，J.Exp.Med.154 422（1981））等が、イオ
ン交換クロマトグラフイー、ゲル過クロマトグ
ラフイー、電気泳動等を組合せた精製法を報告し
ているが、回収率、操作性に欠点があり、大量調
製に適しない。 本発明者らは、IL−２の回収率のよい大量調
製法を確立すべく鋭意研究をおこなつた結果、(A)
多孔質ガラスブーズクロマト担体、(B)陽イオン交
換クロマト担体、(C)ゲル濾過クロマト担体、(D)疎
水性クロマト担体および(E)金属キレートクロマト
担体の５種のクロマト担体のうち３種以上を組合
せて用いることにより、IL−２の回収率が高
く、数10以上の大量処理も比較的簡単な操作
で行え、精製度も高いというIL−２の濃縮精
製法に要求される３条件を満たす方法の提供され
ることを知見し、更に前記５種のクロマト担体の
うちの３種以上を組合せて用いる中でも、特定の
担体を特定の順序での組合せで用いることにより
上記３条件がよりよく満たされることを知見し
（後出実施例１〜５、14及び15と実施例６〜13と
を比較せよ）、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、インターロイキン２を含
む水溶液を(A)多孔質ガラスビーズクロマト担体、
(B)陽イオン交換クロマト担体、(C)ゲル濾過クロマ
ト担体、及び（D′）逆相高速液体クロマト担体
をこの順に用いて処理することを特徴とするイン
ターロイキン２の精製濃縮法に関する。なお、こ
の方法において、(C)ゲル濾過クロマト担体を用い
る処理と（D′）逆相高速液体クロマト担体を用
いる処理との間に(D)疎水性クロマト担体及び／又
は(E)金属キレートクロマト担体を用いる処理を付
加することもできる。 本発明の精製濃縮法に付しうるIL−２の種類
には特別の制限はなく、ヒト末梢血血、脾臓、扁
桃腺、ヒトＴ白血病細胞、サル、ウシ、ウマ、ラ
ツト、マウス由来でもよく、また遺伝子工学的手
法で産生されるIL−２培養的由来のものでもよ
い。またIL−２産生用培地としては、血清培地
でも無血清培地でもかまわないが、本発明の方法
は、より不純蛋白の多い血清培地により産生した
ものに大きな効果を発揮する。 本発明で用いるクロマト担体のそれぞれについ
ての用法を以下に示す。 Ａ：多孔質ガラスビースクロマト担体 蛋白質などの夾雑物を含むIL−２溶液をPH
５〜10、好ましくはPH6.5〜8.5で多孔質ガラス
ビーズに接触させてIL−２を吸着させる。PH
が低過ぎるとIL−２の吸着効率が低下し、高
過ぎるとIL−２の安定性が低下する。 ここで用いるIL−２を含む溶液としては、
例えば、培養上清細胞の抽出液、限外過膜法
等による濃縮液、塩析による蛋白沈澱物を再溶
解したもの、あるいは粗精製IL−２溶液であ
つてもよい。 なお、吸着の際のIL−２溶液のイオン強度
は吸着にはあまり大きな影響を与えないが、
NaCl濃度で1.0M以上になると非吸着IL−２の
量が増加するため0.5M以下が望ましい。 このようにして吸着させたIL−２は、例え
ば、次のような方法で溶出される。すなわち(1)
エチレグリコール、グリセリン等を１〜99％、
好ましくは20〜90％含んだ緩衝液を用いて溶出
する。ここに、緩衝液としては、通常用いられ
るものであればいずれでもかまわず、PH領域も
IL−２が安定な領域であればよい。 又は(2)PHが１〜５好ましくは1.5〜3.5である
溶離液で溶出する。溶離液はPHがこの範囲のも
のであればいずれの酸を用いてもかまわない。
又は(3)CNS^-、I^-、Br^-、ClO₄ ^-、Li⁺、Ca²⁺、
アルキルアンモニウムイオン等による塩類を含
む溶離液を用いて溶出する。ここにおいて塩類
の濃度は0.1M以上好ましくは0.4〜1.0Mであれ
ばよい。なお、PH、酸に関しては(1)の溶離液に
同じ。 因みに、多孔質ガラスビーズとしては、例え
ばCPG−10（エレクトロヌクレオニクス社製）
等が挙げられる。 Ｂ：陽イオン交換クロマト担体 陽イオン交換クロマト担体としてはスルホン
酸基、リン酸基、カルボン酸基、スルホプロピ
ル基又はカルボキシメチル基等のイオン交換基
がシリカゲルアルミナ、合成高分子、天然高分
子又は架橋等の修飾をした天然高分子上に結合
したものが数多く知られている。これらはIL
−２が安定なPH域で用いることができるもので
あれば、どれもIL−２の精製に用いることが
できる。 陽イオン交換クロマト担体のうち、カルポキ
シメチル基を有するクロマト担体の用法につい
て述べる。 まず、蛋白等の夾雑物を含んだIL−２溶液
をPH２〜８、好ましくはPH５〜７でカルボキシ
メチル系陽イオン系交換クロマト担体と接触さ
せてIL−２をこれに吸着させる。 この際イオン強度は、IL−２の担体への吸
着効率を高くする観点から低く抑える必要があ
り、使用する緩衝液のPH、塩類の種類によつて
も異なるが、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液の場
合では、濃度を0.15M程度以下に抑える方がよ
い。 吸着させたIL−２を溶出させる方法は、
（）PHの上昇、（）イオン強度の増加、（）
PH及びイオン強度の上昇のいずれの方法も有効
であるが、IL−２の量が微量の場合、低イオ
ン強度では担体、容器等への付着等により回収
率が低下することがあるのでイオン強度を上昇
することにより溶離させる方が好ましい。酢酸
−酢酸ナトリウム緩衝液（PH6.0）の場合では、
0.3M以上好ましくは0.5M以上がよい。因みに
本発明の実施に適当な陽イオンクロマト担体と
してはCMセフアデツクスＣ−25（フアルマシ
ア社製）がある。 Ｃ：ゲル過クロマト担体 ゲル過クロマト担体としては、架橋デキス
トラン系、多孔性合成高分子系、多孔性シリカ
ゲル系等多く知られており、分子量分画の範囲
が数千から十万程度であり、かつ、IL−２を
非特異的に吸着しないものであれば、何れのも
のでも用いることができる。 用いる緩衝液のPHもIL−２が安定な範囲で
あればよいが、酸性条件下では夾雑する蛋白の
析出もあるため、中性付近のPHが望ましい。 イオン強度については、IL−２の担体およ
び容器への吸着を防ぐため、NaClを用いる場
合0.5M以上の濃度が望ましい。 因みに本発明の実施に適当なゲル過クロマ
ト担体としてはセフアデツクスＧ−75（フアル
マシア社製）があり、特に粒径の小さいスーパ
ーフアイン級が適している。 D′：逆相高速体クロマト担体 逆相高速液体クロマト担体としては、多孔性
ポリスチレン系担体及び化学結合型シリカゲル
担体を例として挙げることが出来る。因みに、
本発明の実施に適当な多孔性ポリスチレン系担
体としては、例えば、日立ゲル＃3013（日立製
作所製）（実施例６参照）があり、一方、化学
結合型シリカゲル担体としては、例えば、
Ultrapore RPSC（ベツクマン社製）、Protesil
300 Diphenyl（ワツトマン社製）、Unisil Ｑ
PH（実施例11参照）およびUnisil Ｑ CN（実
施例12参照）（いずれもガスクロ工業社製）な
どが挙げられる。このうち、実施例７〜10及び
13に示したように、化学結合型シリカゲル担
体、とくに、Ultrapore RPSCやProtesil 300
Diphenylのようにポアサイズの大きなもの
（いずれも300Å）を用いると、より高い精製度
が得られる。 これらの担体を用いる場合、IL−２を含む
溶液からのIL−２の吸着は、IL−２及びクロ
マト担体が安定なPH領域であればいずれのPHで
もよいが、特に、化学結合型シリカゲル担体を
用いる場合には、担体の安定性から中性以下の
PH領域であることが望ましい。また、IL−２
溶液の塩濃度についても特に制限はない。更
に、IL−２溶液は水と混和しうる有機溶媒を
60％まで含んでいてもよく、望ましくは有機溶
媒の割合は20％以下である。担体に吸着された
IL−２は、水と混和しうる有機溶媒、望まし
くはメタノール、エタノール、プロパノール又
はアセトニトリルを30％以上望ましくは50％以
上含有する溶離液で溶離することが出来る。こ
の際、実施例７〜13に示したように通常の高速
液体クロマト装置を用いて、有機溶媒の含量を
上昇させながら溶出する、グラジエント溶出を
行なうことが望ましい。 Ｄ：疎水性クロマト担体 疎水性クロマト担体としてはプロピル基、ブ
チル基、オクチル基、オクタデシル基等のアル
キル基、フエニル基等のアリル等、フエニルメ
チル基、ジフエニルメチル基等のアロアルキル
基、またはシアノプロピル基等の置換アルキル
基等が架橋デキストラン等の天然高分子、合成
高分子またはシリカゲル等の上に結合したも
の、および多孔性ポリスチレン等の合成高分子
数多く知られている。これらはIL−２が安定
なPH域で吸脱着できるものであれば、どれも
IL−２の精製に用いることができる。 これら担体を用いてIL−２溶液よりIL−２
を吸着する場合（）溶液のPHを低くする、
（）溶液の塩濃度を高くする、（）溶液中の
有機溶媒の割合を低くするかもしくは含有させ
ないの（）から（）までの何れか１つを用
い、又は２つ以上を組み合わせることにより良
好な結果を得ることができる。また、これらの
担体に吸着されたIL−２を担体から溶出させ
る場合、(1)溶離液のPHを高くする、(2)溶離液の
塩濃度を低くする、(3)溶離液中の有機溶媒の割
合を高くする、の(1)〜(3)までの何れか１つを用
い、又は２つ以上を組み合わせることにより効
率よく溶出回収することができる。 因みに本発明の実施に適当な疎水クロマト担
体としては、例えばフエニルセフアロースCL
−4B（フアルマシア社製）、日立ゲル＃3013（日
立製作所製）があり、これらを用いる疎水クロ
マトによるIL−２の精製について次に述べる。 フエニルセフアロースCU−4Bをクロマト担
体として用いる場合、夾雑物として蛋白等を含
むIL−２溶液をPH２〜８好ましくはPH６〜７
とし、更にイオン強度を高めるため、NaClを
用いる場合であれば最終濃度を0.5M以上、好
ましくは0.75M以上としたのち担体に吸着させ
る。吸着されたIL−２は、イオン強度を低下
させることによつて担体より溶離することがで
きるが、この時用いる溶離液はNaClを用いる
場合0.5M以下好ましくは0.25M以下の濃度が
望ましい。 この吸脱着に際し、担体に吸着させる前の
IL−２溶液、担体の洗浄液、溶離中にグルコ
ース、シヨ糖を0.3M以上となるように添加し
ておくと、IL−２の担体からの回収率、精製
度が共に著しく改善される。 多孔性ポリスチレン系担体である日立ゲル
＃3013をクロマト担体として用いる場合、IL
−２を含む溶液からのIL−２の担体への吸着
は、IL−２が安定なPH域であれば何れのPHで
もよく、又、IL−２溶液の塩濃度についても
特に制限はない。更にIL−２溶液は水溶液で
も水と混和しうる有機溶媒を60％まで含んでい
てもよく、望ましくは有機溶媒の割合は20％以
下である。担体に吸着されたIL−２は、水と
混和しうる有機溶媒望ましくはメタノール、エ
タノール、プラパノール又はアセトニトリルを
30％以上望ましくは50％以上含有する溶離液で
溶離することができる。 さらに、本発明の実施に適当な疎水クロマト
担体として、化学結合型シリカゲルと総称され
る多くの担体があり、例えばUltrapore RPSC
（ベツクマン社製）、Protesil300 Diphenyl（ワ
ツトマン社製）、UnisilQ PHおよびUnisil Ｑ
CN（いずれもガスクロ工業社製）などがあ
げられる。 Ｅ：金属キレートクロマト担体 金属キレートクロマト担体としては、銅キレ
ート樹脂、亜鉛キレート樹脂等が知られてい
る。例えば、銅キレート樹脂は文献（J.Porath
et al.，Nature258 598（1975））の方法により
調製できる。 作成した銅キレート樹脂にIL−２含有水溶
液をPH５以上好ましくはPH６以上で吸着させ
る。この際イオン強度はあまり影響を与えない
が、NaCl濃度で1.5M以上となるIL−２の吸着
効率が低下する。 このようにして吸着したIL−２は、溶出液
のPHを4.5以下好ましくは3.5以下に低下させる
ことによつて溶離する。 IL−２吸脱着の際、グルコース、シヨ糖、
尿素等を添加することにより、回収率、精製度
が向上する。また、銅キレート樹脂は、少量の
樹脂に多量の蛋白質を吸着しうることから、精
製の目的にはもちろんのこと、希薄なIL−２
溶液を濃縮する目的にも有効である。 以上のＡからＥまでの各種クロマト担体を用い
る操作を３種以上組み合せることにより、就中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、（所望によりＤ及び／又はE_pなお、
Ｄ及びＥの順序は問わない。）、及びD′の各種ク
ロマト担体を用いる操作をこの順で組み合せるこ
とにより、従来公知の方法で報告されているIL
−２の回収率を大きく上回る回収率で、高純度に
精製されたIL−２を得ることができる。 それぞれのクロマト担体はカラムに充てんして
用いてもよく、またパツチ法で用いてもよい。ま
た、いわゆる高速液体クロマトグラフイーと呼ば
れる担体及び装置の組み合わせはIL−２を単一
な迄に精製する方法として特にすぐれている。担
体に吸着されたIL−２の溶離は、一種類の溶離
液でもよく、二種類以上の溶離液の組成を段階的
に変化させるいわゆるステツプサイズ法でもよ
く、また溶離液の組成を連続的に変化させるいわ
ゆるグラジエント法によつてよい。各種クロマト
担体の組み合わせの順序は前述のように、Ａ、
Ｂ、Ｃ、（所望によりＤ及び／又はＥ）、及び
D′とする。もちろん、各操作の前処理、後処理
として適宜、濃縮、希釈、PH調整、他物質の添
加、透析、塩析、遠心分離、加熱、冷却、凍結、
凍結乾燥、溶解、過等常用の処理を加えてもよ
く、また、同じ担体を２回以上用いてもよく、同
じグループに属する複数の担体に用いてもよく、
ＡからＥ以外の原理に基づくクロマト担体を用い
る操作を加えてもよい。本発明の方法によれば、
(A)多孔質ガラスビーズクロマト担体を用いる処理
により、培養上清の体積を一挙に100分の１まで
に濃縮するが可能となり、(B)陽イオン交換クロマ
ト担体を用いる処理により、さらにその10分の１
とすることができ、大量処理におけるその後の取
扱いを著しく簡単化することが可能となり、(C)ゲ
ル濾過クロマト担体を用いる処理により、更に高
分子量の蛋白質を除き、純度を高めて次のD′）
の操作を効率よく行なうことが可能となり、そし
て（D′）逆相高速液体クロマト担体を用いる処
理により、回収率よく、極めて高純度のIL−２
を得ることができる。また、(C)ゲル濾過クロマト
担体を用いてる処理と（D′）逆相高速液体クロ
マト担体を用いる処理との間に(D)疎水性クロマト
担体及び／又は(E)金属キレートクロマト担体を用
いる処理を付加することにより、より高純度の
IL−２を得、（D′）の操作における精製効率を高
めることが可能となるのである。 因みに、例えばヒトIL−２の場合、このＡ〜
Ｅのすべての操作を組合せた例では、精製度5000
倍以上、全操作での回収率が50％と他法と較べて
大きく改善され、得られた精製物は５×10⁶〜
10⁷unit／mgの比活性を示した。 なお、IL−２活性の測定は、以下のごとくに
行なつた。検体100μを96穴マイクロタイター
ブレートの１列目に入れ、５％FEBを含有する
ダルベツコ変法イーグル培地（DMEM）で２倍
希釈を繰り返して96穴マイクロブレート上におい
て各100μの希釈系列を作成する。そこにギリ
スら（ネーチヤー（Nature）268巻154頁
（1977））によつて教示された方法に従つて作成し
た活性化Ｔリンパ球株を４×10³個／100μの細
胞密度とし、100μ宛各くぼみに添加する。37
℃、５％炭酸ガスインキユベーター中20時間培養
後、トリチウムチミジン0.5μCiを加え、４時間パ
ルスをおこなつた後、この分野で良く知られた方
法に従つて細胞をハーベストし、細胞内に取り込
まれた放射線量を測定する。IL−２活性の高い
培養上清ほどに活性化Ｔリンパ球内に取り込まれ
るトリチウムチミジン量が多いことから培養上清
中のIL−２産生量を容易に知ることが出来る。 この場合、ConA刺激ラツト脾臓細胞培養液
（脾細胞１×10⁶個／ml、ConA 5μｇ／ml添加48
時間培養）中の該IL−２産生量を１単位／mlと
規定し、相対値より活性単位を算出する。（ギリ
スらジヤーナル・オブ・イムノロジー（J.
Immunol.）120巻2027頁（1978）参照）。 実施例 １ （担体A.B.C.DおよびＥの併用） コンカナバリンA10μｇ／mlで24時間刺激した
ATCC CRL 8129 細胞（ヒトＴリンパ球白血
病細胞、RPMI培地牛胎児血清１％で培養）を使
用して得たヒトIL−２を含有する培養上清20
（蛋白濃度0.57mg／ml、IL−２比活性980unit／
mg）を限外過装置ホロフアイバー HIP5（アミ
コン社製）により濃縮し容量を3.5にした後、
塩酸、水酸化ナトリウムによりPHを7.7に調整し
た。 このIL−２溶液を多孔質ガラスビーズクロマ
ト担体であるCPG−10（孔径350Å、120−200メ
ツシユ、Electro−Nucleonics 社製）のカラム
（カラムサイズは44mm径×70mm、容量106ml）に通
液し、IL−２を吸着させた。なおこのカラムは、
あらかじめ0.2M Naclを含む0.1Mトリス−塩酸
緩衝液（PH7.7）で充分平衡化しておいたもので
ある。 その後、0.2M NaClを含む0.1Mトリス−酢酸
緩衝液（PH7.7）400ml、次に0.1Mトリス−酢酸
緩衝液（PH8.0）300mlを通液し、カラム内を洗浄
した後、0.75Mのチオシアン酸カリウムを含む
0.1Mトリス−酢酸緩衝液（PH8.0）350mlでIL−
２を溶離させた。溶出曲線は図１に示した。同図
で、実線は吸光度を、点線はIL−２活性を示す。
得られたIL−２溶離液に飽和硫安水1.4を加え、
１夜４℃で放置後析出した蛋白を6000rpm、30分
で遠心分離し、上清を除いたあと、140mlの
0.07M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（PH6.0）に
溶解させた。えられたIL−２溶液を市販の透析
膜容器に入れ、50倍量の同緩衝液中で一晩４℃で
透析し、PH、イオン強度を一定とした。 その後陽イオン交換クロマト担体CMセフアデ
ツクスＣ−25（フアルマシヤ社製）のカラム（カ
ラムサイズ32mm口径×120mm、容量95ml）に通液
しIL−２を吸着させた。 尚、カラムは予め十分な量の0.07M酢酸−酢酸
ナトリウム緩衝液（PH6.0）にて平衡化したもの
を用いた。 その後、カラムを0.07M酢酸−酢酸ナトリウム
緩衝液（PH6.0）150mlで洗浄した後、0.5M酢酸
−酢酸ナトリウム緩衝液（PH6.0）150mlでIL−２
を溶離させた。 溶出曲線は図２に示した。実線、点線の別は図
１に同じ。 溶離したIL−２溶液に固形硫安を加え飽和度
を80％とし、１夜４℃で放置した後6000rpm30分
で遠心分離し上清を除いたあと20mlの0.05Mリン
酸緩衝液（PH7.0）に溶解させた。 えられたIL−２溶液をゲル過カラムクロマ
トグラフイーに供した。担体としては、セフアデ
ツクスＧ−75スーパーフアイン（フアルマシア社
製）、カラムは44mmφ×90cmのものを用いた。ゲ
ル過カラムの平衡化には、1.25Mの塩化ナトリ
ウムを含む0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用い、
溶出の際にも同じ緩衝液を用いた。流速は10ml／
hr。 なお、ゲル過カラムクロマトグラフイーの溶
出曲線は図３に示した。IL−２活性は分子量
15000〜20000付近に溶出する。 ゲル過クロマトグラフイーで得られたIL−
２画分にグルコースを1.0M濃度になるように添
加し、フエニル−セフアロースCL−4B（フアル
マシア社製）のカラム（16mmφ×35mm、容量7.0
ml）に通液しIL−２を吸着させた。フエニルセ
フアロースカラムは、事前に1.0Mグルコース、
1.25M塩化ナトリウムを含む0.05Mリン酸緩衝液
（PH7.0）で平衡化しておいたものを用いた。 吸着させた後、カラムの平衡化に用いたのと同
じ緩衝液でカラムを洗浄した後、1.0Mグルコー
ス、0.1塩化ナトリウムを含む0.05Mリン酸緩衝
液（PH7.0）60mlでIL−２を溶離させた。 フエニルセフアロースクロマトグラフイーの溶
出曲線を図４に示す。 得られたIL−２溶液に1.0M濃度となるように
尿素を添加した後、ポーラスらの方法（Nature，
258、598（1975））によつて調製した銅キレートカ
ラム（カラムサイズ10mmφ×15mm、容量1.2ml、
グルコース1.0M、尿素1.0M、塩化ナトリウム
0.1Mを含む0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡
化させておいたもの）に通液し、IL−２を吸着
させた。 カラムを0.1M塩化ナトリウム1.0Mグルコース
および1.0M尿素を含む0.05Mリン酸緩衝液（PH
7.0）10ml、1.0Mグルコースおよび1.0M尿素を含
む0.05Mリン酸緩衝液（PH6.0）10mlで洗浄した
後、1.0Mグルコースおよび1.0M尿素を含む
0.05Mクエン酸ナトリウム−塩酸緩衝液（PH3.0）
10mlでカラムに吸着されたIL−２を溶離させた。 銅キレートクロマトグラフイーの溶出曲線を図
５に示す。尚、このようにしてえられたヒトIL
−２は、等電点電気泳動（フアルマシア社製
FBE3000）による分析より等電点8.0〜8.1であつ
た。またSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（フアルマシア社製 GE−４）による分析よ
り、分子量約17000であつた。 精製の結果を表１に示した。 【表】 実施例 ２ （担体A.C.DおよびＥの併用） 実施例１と同様にして得たIL−２の含有培養
上清14（蛋白濃度0.53mg／ml、IL−２比活性
1080unit／mg）に固形硫安を加え飽和度75％にな
るよう溶解させ一夜４℃で放置した。析出した蛋
白を6000rpm30分間で遠沈分離した後、0.2M塩
化ナトリウムを含んだ0.1Mトリスー塩酸緩衝液
（PH7.7）1500mlに溶解した。 このIL−２溶液をあらかじめ0.2M塩化ナトリ
ウムを含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.7）で
平衡化させておいたCPG−10カラム（容量85ml）
に通液し、IL−２を吸着させた。 その後上記平衡緩衝液200mlで、次に0.1Mトリ
ス−酢酸緩衝液（PH8.0）150mlで洗浄後、エチレ
ングリコールを50％（ｖ／ｖ）含む0.1Mトリス
−酢酸緩衝液（PH8.0）300mlでIL−２を溶離させ
た。 次に溶離したIL−２溶液に１の飽和硫安水
を加え軽く撹拌し、一夜４℃で放置した。析出し
た蛋白を5000rpm30分間で遠沈分離した後、
0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）60mlに溶解し、ゲ
ル過カラムクロマトグラフヒーに供した。樹脂
としては、セフアデツクスＧ−75スーパーフアイ
ンを用いた。緩衝液は実施例１と同様のものを用
い、流速は40ml／hrとした（カラムサイズ44mmφ
×90cm）。 ゲル過クロマトグラフイーで得られたIL−
２活性画分にグルコースを1.0M濃度になるよう
に添加し、フエニルセフアロースカラム（32mmφ
×30mm、容量24ml）に通液しIL−２を吸着させ
た。次にカラムを平衡化緩衝液（0.05リン酸緩衝
液（PH7.0）＋1.25M NaCl＋1.0Mグルコース）で
洗浄した後1.0Mグルコース、0.15M塩化ナトリ
ウムを含む0.05Mリン酸緩衝液100mlでIL−２を
溶離させた。 得られたIL−２溶離液に1.2M濃度まで尿素を
添加した後、銅キレート樹脂（カラムサイズ16mm
φ×15mm、容量３ml、グルコース1.0M、尿素
1.2M、塩化ナトリウム0.15Mを含む0.05Mリン酸
緩衝液（PH7.0）で平衡化した。）に 吸着させた後、上記平衡化緩衝液、1.0Mグル
コースおよび1.2M尿素を含む0.1M酢酸−酢酸ナ
トリウム緩衝液（PH5.5）各15mlで洗浄した後、
1.0Mグルコースおよび1.2M尿素を含む0.05Mク
エン酸ナトリウム−塩酸緩衝液（PH2.8）７mlで
IL−２を溶離させた。 精製結果を表２に示した。 【表】 実施例 ３ （単体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの併用） 実施例１と同様にして得たIL−２含有培養上
清９（蛋白濃度0.49mg／ml、IL−２比活性
720unit／mg）を実施例１で述べた方法により1.5
に濃縮し、CPG−10クロマトカラム（樹脂容
量48ml）に通液し、IL−２を吸脱着させた。吸
脱着条件は、実施例１に示したものと同じ。 その後得られたIL−２溶液150mlに飽和硫安水
450mlを加え、一夜４℃で塩析し、析出した蛋白
沈殿を0.07M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（PH
6.0）80mlに再溶解させ、実施例１で述べた方法
でCM−セフアデツクスＣ−25のカラムクロマト
グラフイーに供した。 得られたIL−２溶液を再度硫安塩析処理した
後、ゲル過クロマト担体のセフアデツクスＧ−
100（フアルマシア社製）を用いるゲル過クロマ
トグラフイーに供した。 以上の操作で得られたIL−２画分を２分して
以下の２種類の方法により、フエニルセフアロー
スクロマトグラフイーに供した。 (a) 実施例１に記したようにゲル過クロマトグ
ラフイーで得られたIL−２溶液に1.0M濃度の
グルコースを添加した後、実施例１の方法で精
製を行つた。 (b) グルコース無添加のもとで、フエニルセフア
ロースカラム（樹脂容量2.5mlあらかじめ
1.25M塩化ナトリウムを含んで0.05Mリン酸緩
衝液（PH7.0）で平衡化）に通液しIL−２を吸
着させた。その後上記平衡化緩衝液10mlで洗浄
した後、0.1M塩化ナトリウムを含む0.05Mリ
ン酸緩衝液15mlでIL−２を溶離を試みたが、
IL−２活性の回収率が低かつたので、さらに
その溶離緩衝液（0.1M塩化ナトリウムを含む
0.05Mリン酸緩衝液）に50％容量のエチレング
リコールを加えた溶離液８mlをカラムに流し残
りのIL−２を溶離させ、両方の活性画分をあ
わせた。 以上の精製結果を表３に示した。 【表】 ス(D)
【表】 ス(D)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ インターロイキン２を含む水溶液を(A)多孔質
   ガラスビーズクロマト担体、(B)陽イオン交換クロ
   マト担体、(C)ゲル濾過クロマト担体、及び（D′）
   逆相高速液体クロマト担体をこの順に用いて処理
   することを特徴とするインターロイキン２の精製
   濃縮法。 ２ (C)ゲル濾過クロマト担体を用いる処理と
   （D′）逆相高速液体クロマト担体を用いる処理と
   の間に(D)疎水性クロマト担体及び／又は(E)金属キ
   レートクロマト担体を用いる処理を付加した特許
   請求の範囲第１項記載のインターロイキン２の精
   製濃縮法。