JPH0794478B2 - ビタミンｋ依存性タンパク質を含む薬剤組成物を調整する方法及びそれに用いる免疫吸着体 - Google Patents

ビタミンｋ依存性タンパク質を含む薬剤組成物を調整する方法及びそれに用いる免疫吸着体

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JPH0794478B2
JPH0794478B2 JP59038886A JP3888684A JPH0794478B2 JP H0794478 B2 JPH0794478 B2 JP H0794478B2 JP 59038886 A JP59038886 A JP 59038886A JP 3888684 A JP3888684 A JP 3888684A JP H0794478 B2 JPH0794478 B2 JP H0794478B2
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は第IX因子および他のビタミンＫ依存性タンパク
質である第II因子、第VII因子、第Ｘ因子、プロトロビ
ン、タンパク質Ｃ並びにタンパク質Ｓの分離および精製
によって治療用途に適した薬剤組成物を調製する方法、
及びこの方法に使用される免疫吸着体に関する。特に
は、高純度タンパク質を血漿または濃縮物からクロマト
グラフ吸着および濃縮技術により分離する方法に関す
る。
従来技術 血液凝固因子は正常な凝固機構において、生命の維持に
必要な役割を果たしている。例えば、第IX因子欠乏症の
患者は重大な出血問題を示している（血友病Ｂ）。従つ
て、科学研究用だけでなく、治療に用いる量の第IX因子
および他のビタミンＫ依存性タンパク質の単離を可能に
することが望まれていた。この目的に対して種々の方法
が文献に記載されている。本発明の方法は、高純度でか
つ高収率で目的とするタンパク質が得られ、特に他の凝
血因子による汚染の比較的低い点において従来技術より
優れているものである。更に、多くの工程を必要とする
従来技術では、時間がかかるのと全工程でのタンパク質
の損失が避けられない。
従来方法の一つとして、S.P.Bajaj等による「人間のプ
ロトロビン、第IX因子および第Ｘ因子の精製のための簡
単化した処理方法」、Preparative Biochemisty,11
（４）,397〜412（1981年）がある。この方法では、血
漿をクエン酸バリウムへの吸着およびそれからの溶離、
硫酸アンモニウム分画、DEAE−セフアデツクスクロマト
グラフイー、そして、pH7.5のクエン酸ナトリウム緩衝
液中でのヘパリン−アガロースクロマトグラフイーによ
つてプロトロビン、第Ｘ因子および第IX因子を分離する
ものである。第IX因子の報告された収率は、80〜220ユ
ニツト/mgの比活性で約35％であつた。他の方法とし
て、J.P.Miletich等による「硫酸塩化したデキストラン
球体を用いての人間の血液凝固因子の第II、第IXおよび
第Ｘの精製」、Methods in Enzymology,第80巻、頁221
〜228に記載のものがある。この方法では、新鮮な冷凍
血漿を解凍し、クエン酸バリウムによる沈殿、ジイソプ
ロピルフルオロリン酸塩とトリス−塩酸中での再懸濁、
硫酸アンモニウムによる沈殿、DE−52セルロースへのク
ロマトグラフイー、そして得られた分画の選択的な硫酸
塩化したデキストラン球体への適用の手順で行うもので
ある。第IX因子を含む分画の濃度は第Ｘ因子の1wt％と
同じ程度に不純物が混じつているとされている。B.Oste
rud等による「人間の血液凝固因子IX」、J.Biological
Chemistry,253巻、No.17、頁5946〜5951（1978年）、で
は、第IX因子の精製を以下の手順、硫酸バリウムへの吸
着およびそれからの溶離、DEAE−セルロースバツチクロ
マトグラフイー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、そ
してヘパリン−アガロースのアフイニテイークロマトグ
ラフで行つている。第IX因子活性は、207ユニツト/mgで
あり、収率は記載されていない。
本発明は以上に述べたような問題点を解決し、第IX因子
または他のビタミンＫ依存性タンパク質を含有する治療
用途に適した薬剤的組成物を調製するための改良された
方法を提供することを目的としている。
発明の要約 本発明はビタミンＫ依存性タンパク質および１種または
それ以上の他のタンパク質を含む源物質から目的とする
ビタミンＫ依存性タンパク質を分離する方法に関する。
本方法はタンパク質への特異的な抗体を用いての吸着操
作で高度に精製されたタンパク質を得ることができる。
第１の段階は、血漿または濃縮物のような源物質からの
タンパク質の免疫吸着を含む。用いられる吸着体はタン
パク質に特異的なモノクローナル抗体であり、そのモノ
クローナル抗体は適当な基質、例えばアガロース球体に
結合されている。タンパク質を吸着した後、基質粒子を
非吸着タンパク質を除去するために大量の緩衝溶液で洗
浄する。吸着したタンパク質を溶液で処理し溶離させ
る。回収されたタンパク質は高純度、即ち不純物はほと
んどなく、治療に用いることも更に精製することもでき
る。
本発明のプロセスでは第IX因子の精製が1500倍の程度で
得られ、これは従来技術を通じて大きな改良である。比
活性は約34.8ユニツト/mgであり、さらに第IX因子の収
率はこの新規な方法において平均約50％、高くて約70％
である。
本方法はビタミンＫ依存性タンパク質として知られてい
る第II因子、第VII因子、第IX因子、第Ｘ因子、プロト
ロンビン、タンパク質Ｃおよびタンパク質Ｓのあらゆる
タンパク質精製フオームにおける回収に容易に適用でき
る。血漿、血漿分画、血漿濃縮物が典型的な源物質とし
て含まれる。タンパク質はまた、DNA組み換え技術、即
ち、バクテリア、酵母または他の細胞の中へタンパク質
を生産するための遺伝子を組み入れたタンパク質の混合
物からも精製することができる。このような遺伝子組み
込み技術は当該技術分野に通常の技術を有するものであ
れば公知のことであり、また、示されたタンパク質が１
種またはそれ以上のタンパク質、細胞の残骸等の混合状
態であることは理解される。
好適な具体例の説明 以下の説明は、従来一つの操作で達成されるとは知られ
ていなかつた純度と濃度にまで第IX因子の分離と精製を
達成するためになされ、用いられる本発明の具体例の詳
細を提供するものである。この説明は、第IX因子の精製
に適用される本発明の好適例であり、本発明を限定する
ものでなく、当該技術分野の領域内にある変化応用は本
発明の範囲に属すると考えるべきである。その他のビタ
ミンＫ依存性タンパク質は同様の操作により精製される
が、その操作は用いられる抗体を生じさせる第IX因子に
代わる他のタンパク質を用いる範囲で改変される。
A.第IX因子に対するモノクローナル抗体の調製第IX因子
に吸着するモノクローナル抗体は、続いて分離基質に結
合されるが、そのモノクローナル抗体は種々の公開され
ている方法により高度に精製される第IX因子の調製する
ことに始まる段階的手順により調製される。第IX因子の
精製は血漿源から得られる物質を用いて達成されるが、
純度が充分に高くないものは高濃度で用いられる。
抗凝血性の正常な血漿の精製はOsterud等により示され
た方法、硫酸バリウムへの吸着および溶離、DEAE−セル
ロースバツチクロマトグラフイー、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、そしてヘパリン−アガロースカラムによ
るアフイニテイ−クロマトグラフイーの順序で行なわれ
た。この方法による順序は、高度に精製された第IX因子
を提供する。
以下の手順に従つて、血漿から得られた高度に精製され
た第IX因子をマウスに注射した。他の手順でも同様の効
果を期待できる。第０日目、前記タンパク質100μｇを
0.05Mトリス、0.15M塩化ナトリウムを含むpH7.3の緩衝
液0.1mlに溶解（または懸濁）させ、フロイントの完全
アジュバントの同容量で振とうして調製した組成物をマ
ウスの腹膜を通して注射した。第15日目、フロイントの
完全アジュバントをフロイントの不完全アジュバントに
代えた以外は同様のタンパク質56μｇを再び注射した。
第22、30、38および124日目、第15日目の注射を繰り返
した。第239日目、マウスに精製した第IX因子のみを注
射した。第243日目、マウスの脾臓を取り出し、常法に
従つて融合した。この方法はJ.P.Brown等による「モノ
クローナル抗体との免疫沈降反応により同定される正常
および悪性の人細胞のタンパク質抗原」、JOURNAL OF B
IOLOGICAL CHEMISTRY,225巻、頁4980〜4983（1980年）
に記載されている。この標準的手法は35％ポリエチレン
グリコール1000を50％ポリエチレングリコールに代える
程度おいて変化させられる。
陽性クローンは、正常人血漿の等量と各クローンからの
上清液をインキュベートし、第IX因子活性を分析するこ
とにより同定される。クローンは、上清液が実質的に第
IX因子凝血活性を中和したならば陽性と見なされる。ク
ローンが陽性であると決定した後、それらは少なくとも
２度サブクローン化し、第IX因子に対する抗体を生産す
る安定なクローンを得、少なくとも細胞の注入４日前に
0.5mlのプリスタン（pristane）で腹膜を通じて前もつ
て処理したBalb/cマウスの腹腔中に注射した。ハイブリ
ドーア細胞を牛の胎児の血清を含まないDelbeccoで修飾
されたEagle媒質0.5mlにおいて、マウス１匹当り約５×
106細胞の濃度になるように注射した。マウスの腹が膨
れるのを確認して、腹水液をヘパリン中に約10ユニツト
/mlで集めた。多数のマウスからの腹水液は次のモノク
ローナル免疫グロブリン（IgG）の単離のために適当な
容量に分けて貯蔵した。ヘパリン処理腹水液をすぐに使
用しない場合には、−70℃で貯蔵し、使用直前に解凍す
るのがよい。腹水液からのIgGの最終収率は、腹水液100
ml当たり約1gの1gGである。
第IX因子を精製する目的のためのモノクローナルIgGの
特異性は、後述するようにモノクローナルIgGが分離基
質媒体にカツプリングすることにより、そして、分離基
質に結合したIgGが血漿から第IX因子を除きその第IX因
子が続くチオシアン酸ナトリウムを含む溶液で溶離され
ることを示すことにより評価される。
モノクローナルIgGは、続く免疫吸着体を調製するのに
用いられ、採取後すぐまたは貯蔵溶液の冷凍部分を解凍
したヘパリン処理した腹水液から単離される。新鮮また
は凍結物に関わりなく使用され、溶液を４℃とし、等容
量のリン酸塩緩衝液の塩溶液（PBS）で処理し、以下に
示す組成物とする。希釈腹水を４℃で撹拌しながら等容
量の飽和硫酸アンモニウム（SAS）（水中に過剰の硫酸
アンモニウムを入れ沸とうさせ、４℃に冷却し、不溶の
結晶をろ過し水酸化アンモニウムでpH7.0に調整して得
る）を滴下しながら加え沈殿させた。沈殿物と上清液を
２時間以上攪拌し、４℃にて遠心分離した。遠心分離は
好ましくは、60分間、14,000rpm（30,000×ｇ）で行な
う。腹水の上清液はSASでさらに２回沈殿させ、その沈
殿物と上清液を第１回目と同様に攪拌し、遠心分離し
た。３回の沈殿から得られたペレツトを希釈した腹水液
と等量のPBSで再懸濁した後、PBSに対し充分に透析し
た。透析袋に凝固物が現われた時、20℃で遠心分離によ
り除いた。透析されたIgGを室温で５％の水酸化アルミ
ニウム水溶液と共に攪拌して吸着させ、吸着後20℃で遠
心分離した。吸着処理は第１回目の後少なくとも３回以
上、それぞれ2.5％水酸化アルミニウム溶液を用いて繰
り返される。吸着されたIgGは４℃にして、上記の如くS
ASで再沈殿させた。沈殿させたペレツトは使用するまで
−20℃で貯蔵される。モノクローナルIgG精製の他の方
法は、ここで用いた方法と同様にもしくはよりよいもの
であり、例えば、Bruck,C.、Portetelle,D.、Glimeur,
C.、Bollen,A。の記述による「DEAEアフイニテイーゲル
ブルークロマトグラフイーによる腹水液からのマウスモ
ノクローナル抗体の一段階精製」がJournal of Immunol
ogical Mcthods,53巻、頁313〜319（1982年）に記載さ
れている。
B.免疫吸着体の調製 免疫吸着体は、カツプリングのためのモノクローナルIg
Gを調製し、カツプリングのための固体基質を調製し、
モノクローナルIgGを固体基質に結合させるために２つ
の成分を反応させることにより好適に調製される。
（ｉ）カツプリングのためのIgGの調製 新しく沈殿させたIgGまたは以前に冷凍した沈殿を解凍
したものも用いることができる。その物質をPBSに対し
て透析し、PBS中にある間に、IgGの容量と濃度（A280/
1.4＝mg/mlIgG）を決定する。次いで、IgG溶液50ml当た
り、ジイソプロピルフルオロリン酸エステルの10〜30μ
ｌ、好ましくは20μｌで処理した。得られた溶液を30分
間、ドラフト中室温で攪拌し、その処理したIgGを使用
直前にカツプリング緩衝液に対し一晩透析した。見い出
されている最も好適なカツプリング用緩衝液は、好まし
くは水酸化ナトリウムでpH9に調整された0.25M重炭酸ナ
トリウム溶液である。
（ii）カツプリングのための固体基質の調製 モノクローナル抗体はタンパク質、特には第IX因子自体
に高い親和性を有するものでなければあらゆる物質に結
合されるが、そのような物質として、ガラズビーズ、ア
ガロースおよびそれらの誘導体が好ましい。最も好まし
くは、架橋結合されたアガロースで、セフアロース4B
（Pharmacia Fine Chemicals,Piscataway,N.J.の登録商
標）として知られたゲルで市販されている。
好ましい免疫吸着体樹脂を調製する方法は、一般に文献
に記載の方法と同様であり、例えば、J.Porath等による
方法、Journal of Chromatography,86巻、頁53〜56（19
73年）がある。見い出された最も好適な方法は以下の如
くである。即ち、容量約2lのセフアロース4Bを酸で洗浄
した2l用の焼結グラスフイルターロートに入れた。樹脂
を水洗し、ろ過して水気のある状態にした。水洗した樹
脂を回転子を入れた大容量（約4l）のガラスビーカーに
移した。次いで、5Mの２塩基性リン酸カリウム溶液の１
部と5Mの３塩基性リン酸カリウム溶液の２部を混合して
調製した750mlの冷リン酸カリウム緩衝溶液を樹脂に加
えた。充分に冷却した水を加えて最終容量を3lとした。
次に、この混合物を４℃に冷却し、マグネチツクスター
ラ上の水−水浴中で４〜10℃に保持した。ドラフト内
で、臭化シアンを回転子を入れた栓付きガラスビンの30
0mlの水中に加えた。混合物を溶液になるまで迅速に攪
拌した。この臭化シアン溶液を先の冷セフアロース混合
物に２分間以上攪拌しながら加えた。攪拌を続けて８分
間行ない、その溶液を4lの耐圧ビンに固定した冷2l焼結
ガラスフイルターロートに移した。次いで、臭化シアン
処理した樹脂を約20lの冷水で（ろ液のpHが中性になる
まで）洗浄した。水洗した樹脂は冷却したカツプリング
用緩衝液と速やかに平衡状態とし、大きな回転子を入れ
た4lのブラスチツクビーカーに移した。
（iii）モノクローナル抗体の固体基質へのカツプリン
グ 上記の如く調製した固体基質樹脂は、PBSと平衡状態に
ある時は使用できる状態にあり、それ以後は貯蔵される
べきではない。従つて、樹脂混合物は、カツプリング反
応用緩衝液に対して前もつて１晩透析したIgGと結合さ
せた。この結合した樹脂/IgG 懸濁混合物を24時間４℃
で攪拌した。カツプリング時の上清液の無希釈サンプル
のA280は、標準試料として牛の血清アルブミン（BSA）
を用いてまたは標準試料としてBSAと共にバイオ−ラド
（Bio−Rad）タンパク質分析（ブラツドフオード試薬）
により決定される。次に、カツプリングしたリガンドの
パーセンテージを計算する。上記した手順で行なわれる
時、この値は通常約95％である。抗体とカツプリングし
なかつた樹脂上に残つている活性サイトは、0.1Mグリシ
ンを含有する冷カツプリング用緩衝液で焼結ガラスフイ
ルターロート上の樹脂を洗浄することによりブロツクさ
れる。次いで、この樹脂を樹脂と抗体を結合させた時の
それぞれのカツプリング用緩衝液と等容量になるように
上記溶液で再懸濁した。懸濁液をゆつくり４℃で１晩攪
拌した。次いで、この樹脂をPBSで充分に洗浄した。そ
の組成を以下に示す。カツプリングし、ブロツクされた
上記樹脂は、付加的に0.5Mカルシウムイオン、好ましく
は塩化カルシウムを含むPBSで予備溶離される。樹脂を
再びPBSのみで洗浄し、４℃で貯蔵するかまたは使用で
きる用意ができるまで、室温で連続したポンプの働いて
いるカラム内におかれる。セフアロースに対するIgGの
カツプリング密度は、セフアロース球体１当り２〜5g
IgG、好ましくは３〜4gIgGであろう。
C.第IX因子の分離と精製 人や動物の血漿および市販の第IX因子の濃縮物のような
第IX因子の試料調製は、本発明の方法を用いることがで
き、本方法は物質の特定のタイプに限定されない。好適
な物質、成功した結果を与えたものとしては、それぞれ
目的とするタンパク質を含む人の血漿、血漿分画および
濃縮物、市販または一部実験室で精製されたものであ
る。以下の記載では、正常な人の血漿を用いたもので詳
細を説明する。
新しく採取したものでない血漿は通常の手段でクエン酸
塩化された冷凍保存される。使用準備ができた時、35〜
40℃、好ましくは37℃の温度で解凍し、カラムに直接入
れる。
本発明の説明では最初に直接にクロマトグラフ用カラム
に免疫吸着体がカップリングされた粒子を入れて使用し
たが、適当な容器の中へ抗体と結合する樹脂粒子を入れ
てバツチ法で分離し、その後再構成した濃縮物または血
漿を加え、上記で概要を示したように目的とするタンパ
ク質を回収する方法も本発明の範囲にあるものである。
以下、さらに詳細に説明する。
クロマトグラフ工程を遂行するには、以下の具体例が好
ましい。
樹脂をカラム、例えばAmicon 86001（Amicon Corp.,Lex
igton,Mass. の登録商標）に充填し、ぜん動性ポンプ
で速やかに流れるようにする。人の血漿を第IX因子源と
して使用する時、抗体を保持する球体の各容量に対し約
３〜７、好ましくは５部の血漿が処理される。血漿はゆ
つくりとカラムに注がれ、流速は免疫吸着体上に血漿か
らの第IX因子の望ましい量が吸着される接触時間を与え
るものである。より長い接触時間がタンパク質の少なく
とも約50％、好ましくは75％、より好ましくは、95％以
上を吸着させるのに必要であり、その時間は１〜６時
間、好ましくは２〜４時間で一般的に満足される。
源物質をカラムに入れた後、50部のトリス−塩化リチウ
ム緩衝液（0.1Mリジン塩基と0.5M塩化リチウム、pH8）
で洗浄し、溶離タンパク質を有効に除去する。除去率は
好ましくは少なくとも90％、より好ましくは最大の除去
である。次いで、第２の洗浄をトリス−塩酸緩衝液（0.
05Mトリス−塩酸、pH8）でカラムからリチウムイオンを
最大限に除去する条件で行なう。約２〜４時間の接触時
間で満足される。
精製第IX因子の溶離は、ジエチルアミン、塩化カルシウ
ム、チオシアン酸ナトリウ塩、臭化カリウム、酢酸（好
ましくは濃度約0.1〜1.0M）またはpH2〜３、好ましくは
約2.2の塩酸−グリシン混合物の如き溶離液を含む緩衝
液で行なわれる。他の適当な溶離剤は、当該技術分野の
通常の技術で簡単に同定することができる。直線的な濃
度勾配の溶離液が良い結果を与えるが、本発明の目的を
達成するためには必要はなく、一定のイオン濃度を有す
る溶液がさらに適当である。流出速度はセフアロースの
充填によりカラム内の圧力を上げないでタンパク質の溶
離を効果的に行うべきである。このように、第IX因子を
チオシアン酸ナトリウムで溶離する時、チオシアン酸ナ
トリウムの溶離液を2M〜4M、好ましくは3Mを流し、その
流速は3lカラムにおいて平方インチ当たり９ポンド以上
の導入部の圧力を与え、圧力の上昇をしないように行な
う。ジエチルアミンの溶離では、0.3〜0.7M、好ましく
は0.5Mの濃度で行なわれる。ジエチルアミンを溶離液と
して用いた場合、分画はジエチルアミンを中和するため
に1Mグリシン中に集められるべきである。続いて、その
カラムはPBSまたは中性緩衝液で洗浄される。
第IX因子活性を含む分画を貯蔵し、その全容量および活
性を決定する。溶離された第IX因子を溶離液のイオンを
除くためにPBSに対して透析し、次いで分析する。溶離
された第IX因子は濃度約10〜30ユニツト/mlであり、治
療または分析に用いることができる。
第IX因子を集めた液は限外ろ過のような通常の方法によ
り10〜20mlに濃縮することができる。この目的のために
は、窒素圧50psi下でYM−10メンブランとアミコン攪拌
セル（Amicon stirred cell）がよいことがわかつた。
ゆつくりとした攪拌を窒素圧を低下した後30分間続け、
濃縮液の容量と活性を決定した。ためた液は温度を４℃
に保つならば短期間、例えば１晩貯蔵してもよい。
上記した免疫吸着体カラムはカラムから精製したタンパ
ク質を除く溶離により再生される。カラムはこのように
何回でも繰り返し使用できる。
分析は通常の部分トロンボプラスチン時間分析（Partia
l thromboplastin time assay）で行なわれる。
すべての緩衝液において、EDTA 4ナトリウム塩の10mMを
含んだもの、および／またはすべての処理行程を４℃で
行なうことは、第IX因子の活性およびタンパク質分解を
最小にする。
緩衝液の組成を以下に示す。
リン酸緩衝塩溶液 1.6gのリン酸ナトリウム１塩基性１水和物 8.4gのリン酸ナトリウム２塩基性無水物 61.4gの塩化ナトリウム 水を加えて7lとする。pHを7.2に調整。
上記で説明した手順で７回の実験を行ない、平均回収率
52％、その範囲32％〜71％であつた。精製度は平均2400
倍、比活性は34.8ユニツト/mgであつた。以下の実施例
１で示すデータは、上で述べた本発明で得られたものの
代表である。冷凍された正常人の血漿を37℃で解凍し、
次いで４℃で処理したものである。
実施例１ 実験A:第IX因子活性の1.5ユニツト/ml、0.021ユニツト/
mgを含む人の血漿100mlを免疫吸着体カラムに入れ、最
初に血漿を次いで第IX因子を上述した方法に従つて溶離
した。溶離された第IX因子は31ユニツト/mgの比活性を
有しており、約1500倍の精製度を示した。第IX因子の回
収率63.3％。溶離分画のピークにおいては、第IX因子の
濃度の12倍であつた。
実験B:第IX因子活性の0.94ユニツト/ml、0.013ユニツト
/mgを含む人の血漿100mlを、すべての緩衝液にEDTA 4ナ
トリウム塩の10mMを含ませた以外は上記手順と同様にし
て回収した。溶離した第IX因子は17ユニツト/mgの比活
性を有し、約1300倍の精製度を示した。回収率は61％。
溶離分画のピークにおいては、第IX因子の濃度の８倍で
あつた。
発明の効果 以上説明したように、本発明に係る薬剤的組成物の調製
方法によって、血漿または濃縮物からの平均回収率52
％、その範囲32％〜71％、精製度平均2400倍、比活性3
4.8ユニツト/mgという従来技術と比較して多大な改良を
示す値を得ることができた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 ・Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．59（Ｎｏ．３) Ｐ．664−670（1982) ・社団法人日本生化学会編「生化学実験 講座１ タンパク質の化学Ｉ−分離精製 −」東京化学同人、1976年３月29日発行、 313・333頁

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）ビタミンＫ依存性タンパク質からな
    る群から選ばれるタンパク質に特異的なモノクローナル
    抗体を結合した吸着体粒子上に、前記ビタミンＫ依存性
    タンパク質からなる群から選ばれるタンパク質と１種ま
    たはそれ以上の他のタンパク質との混合物からなる源物
    質から前記ビタミンＫ依存性タンパク質からなる群から
    選ばれるタンパク質を吸着し、 （ｂ）リチウムを含有する緩衝水溶液を用いて、前記吸
    着体粒子から前記ビタミンＫ依存性タンパク質からなる
    群から選ばれるタンパク質を欠いた源物質を除去し、さ
    らに、 （ｃ）溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着したビタ
    ミンＫ依存性タンパク質からなる群から選ばれるタンパ
    ク質を溶離して、治療用途に適した活性で高い純度で精
    製され濃縮されたかたちのビタミンＫ依存性タンパク質
    からなる群から選ばれるタンパク質組成物を回収する、
    各ステップを具備し、 プロテアーゼインヒビターを添加することなしに実行さ
    れる、ことを特徴とする、活性で高い純度で精製され濃
    縮されたかたちで得られたビタミンＫ依存性タンパク質
    からなる群から選ばれるタンパク質を含有する治療用途
    に適した薬剤組成物を調製する方法。
  2. 【請求項２】前記源物質が血漿、血漿分画または血漿濃
    縮物であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の調製方法。
  3. 【請求項３】前記源物質が前記ビタミンＫ依存性タンパ
    ク質からなる群から選ばれるタンパク質を生産するため
    の遺伝子を含む細胞により発現されているものであるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の調製方法。
  4. 【請求項４】前記ビタミンＫ依存性タンパク質からなる
    群から選ばれるタンパク質が第IX因子であることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項記載の調製方法。
  5. 【請求項５】前記ビタミンＫ依存性タンパク質からなる
    群から選ばれるタンパク質が第IX因子であることを特徴
    とする特許請求の範囲第２項記載の調製方法。
  6. 【請求項６】前記ビタミンＫ依存性タンパク質からなる
    群から選ばれるタンパク質が第IX因子であることを特徴
    とする特許請求の範囲第３項記載の調製方法。
  7. 【請求項７】ステップ（ｃ）で用いる溶離液がチオシア
    ン酸ナトリウムであることを特徴とする特許請求の範囲
    第１項記載の調製方法。
  8. 【請求項８】ステップ（ｃ）で用いる溶離液が臭化カリ
    ウム水溶液であることを特徴とする特許請求の範囲第１
    項記載の調製方法。
  9. 【請求項９】ステップ（ｃ）で用いる溶離液がジエチル
    アミンであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
    載の調製方法。
  10. 【請求項１０】ステップ（ｃ）で用いる溶離液が塩化カ
    ルシウム水溶液であることを特徴とする特許請求の範囲
    第１項記載の調製方法。
  11. 【請求項１１】ステップ（ａ）における前記吸着体粒子
    がアガロースであることを特徴とする特許請求の範囲第
    １項記載の調製方法。
  12. 【請求項１２】前記リチウムは塩化リチウムとして供給
    されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の調
    製方法。
  13. 【請求項１３】高度に精製され濃縮された活性のあるビ
    タミンＫ依存性タンパク質を含む治療用に適した製薬上
    の組成物を調製するために用いる改良された免疫吸着体
    であって、前記免疫吸着体は、固体粒子に結合されたIg
    Gモノクローナル抗体からなり、前記IgGモノクローナル
    抗体はビタミンＫ依存性タンパク質に特異的に結合し、
    その後溶離剤を含む溶液によって、結合したビタミンＫ
    依存性タンパク質を変性なしに前記IgGモノクローナル
    抗体から高度に精製され活性を有する形で解離可能であ
    ることを特徴とする免疫吸着体。
  14. 【請求項１４】前記固体粒子が樹脂からなることを特徴
    とする特許請求の範囲第13項記載の免疫吸着体。
  15. 【請求項１５】前記樹脂がアガロースからなることを特
    徴とする特許請求の範囲第14項記載の免疫吸着体。
  16. 【請求項１６】前記ビタミンＫ依存性タンパク質が第IX
    因子である特許請求の範囲第13項記載の免疫吸着体。
  17. 【請求項１７】前記固体粒子が樹脂からなることを特徴
    とする特許請求の範囲第16項記載の免疫吸着体。
  18. 【請求項１８】前記樹脂がアガロースからなることを特
    徴とする特許請求の範囲第17項記載の免疫吸着体。
  19. 【請求項１９】前記免疫吸着体がアガロース１リットル
    当たり３〜4gのモノクローナル抗体結合密度を有するこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第16項記載の免疫吸着
    体。
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