JPH0479880A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明はヒトＴＮＦ変換体として新規なポリペプチドを
提供することに係り、ポリペプチド自身、それを含む医
薬組成物、その製造方法、その遺伝子組換えＤＮＡ、プ
ラスミド、微生物細胞などに関する。

「従来の技術」 ＴＮＦ　（腫瘍壊死因子）は、１９７５年にＣａｒｓｗ
ｅ　ｌ　ｌらにより、予めＢａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍ
ｅｔｔｅ　Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）に感染され、エンド
トキシンて処理したマウスの血清中に存在することか見
出された生理活性物質であり（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７２３６６６（１９
７５））　、１９８４年にＰｅｎｎ１ｃａらにより、ヒ
トＴＮＦのｃＤＮＡをクローニングしヒトＴＮＦ蛋白質
の全−次構造（アミノ酸配列）か明らかにされた（Ｎａ
ｔｕｒｅ　３１２．７２４　（１９８４））　。ＴＮＦ
は腫瘍細胞に対する細胞傷害活性、移植腫瘍に対する出
血性壊死、増殖の抑制なと特異的な抗腫瘍作用を有する
が、最近では高脂血症、血圧低下、発熱なとの副作用も
生じうろことが報告されており、薬効、副作用などでよ
り優れたものを見出すべく研究、開発がなされている。

例えば特開昭６１−４０２２１、同６３−１１９６９２
　、特開平１−２７７４８８各号公報では遺伝子操作技
術によりヒトＴＮＦ蛋白質中の特定のアミノ酸を欠失し
たり、他のアミノ酸に置換したり或は付加したりしてヒ
トＴＮＦ変換体を提供している。

「発明の開示」 本発明者らはヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸配列において
６８番目のプロリンを他のアミノ酸に置換したところ、
抗腫瘍活性が高く、副作用の低い文献未記載のヒ）ＴＮ
Ｆ変換体ポリペプチドが得られることを見出し、その知
見に基いて発明を完成した。

本発明は、配列表配列番号１で示した１番目のＳｅｒか
ら１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列に
おいて６８番目のＰｒｏが他のアミノ酸により置換され
た配列を有するポリペプチドに係る。また当該ポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミド、この
組換えプラスミドにより形質転換された組換え微生物細
胞、組換え微生物細胞によるポリペプチドの製造方法、
医薬組成物、前記アミノ酸配列のＮ末端にメチオニンの
結合したポリペプチド並びに配列表配列番号２で示した
１番目のＴから４６５番目のＧまでで表わされる塩基配
列において２０２〜２０４番目のＰｒｏをコードするＣ
ＣＡを他のアミノ酸をコードするコドンにより置換され
た配列を有するＤＮＡにも係る。

本明細書全般を通じてアミノ酸、ポリペプチド、塩基、
それらの配列を表わすとき下記のリストのものを用いる
。

アミノ酸： 塩基： また本明細書で使用した略号は次のとおり意味する。

Ｓ　Ｄ　Ｓ　：　Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　５ｕ
ｌｆａｔｅＤＴＴ　ニジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉ
ｏｔｈｒｅｉ　ｔｏｌ）ＰＭＳ　Ｆ　：　Ｐｈｅｎｙｌ
ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＦｌｕｏｒｉｄｅＥＤ
ＴＡ　：エチレンジアミン四酢酸 （Ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｄｉａｍｉｎｅ　ｔｅｔｒａａｃ
ｅｔａｔｅ）ＣＰＧ樹脂：　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｐ
ｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ樹脂本発明において６８番目のＰｒ
ｏを置換する他のアミノ酸としてはＡｊ７ａ、　Ｃｙｓ
、　Ａｓｐ、　Ｇｎｕ、ｐＨｅ、ＧＩ！ｙ、　　Ｈｉｓ
、　　Ｉｆｆｅ、　　Ｌｙｓ、　　Ｌｅｕ、　　Ｍｅｔ
、　　Ａｓｎ、　Ｇｌｎ。

Ａｒｇ、　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ、　Ｖａｎ、　Ｔｒｐ又は
Ｔｙｒが挙げられるか、Ａｓｐ、　　Ｍｅｔ又はＴｙｒ
か望ましい。

次に本発明についてその実施態様を詳しく記載するか、
本発明に係る遺伝子操作技術については下に列挙する。

Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ、（１９８２）
：　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｒ，ＷＬＩ　　ｅｔ　　ａｌ（１
９８３）：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、　１００及び１０１゜Ｒ，Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ、　
（１９８７）：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ。

１５３、　１５４及び１５５ 本発明のポリペプチドは種々の方法、手段、機械を用い
て製造することかできるか、代表的な製造方法を下記す
る。

（１）　　ヒトＴＮＦ遺伝子の取得 ヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は前述の
とおり、Ｐｅｎｎ１ｃａらにより明らかにされており、
その塩基配列を適宜変更してヒトＴＮＦ遺伝子を配列表
配列番号３のようにデザインする。

その際、宿主細胞（大腸菌など）に適したコドンを選択
するのか望ましく、また後述のＤＮＡ断片の連結による
クローン化並びに変換体作製のための遺伝子改変か容易
に実施できるように適当な位置に適当な制限酵素切断部
位を配置するのが望ましい。勿論ヒトＴＮＦ遺伝子の上
流には翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、下流には翻訳終止
コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧ）をそれぞれ読み取
り枠に合致させるように設置する必要があり、また翻訳
開始コドンの上流並びに翻訳終止コドンの下流にそれぞ
れ適当な制限酵素切断部位を設置してベクターへの適用
性、クローン化の簡便性を図るのが好ましい。

ヒトＴＮＦ遺伝子は玉鎖・上鎖それぞれについて幾つか
のオリゴヌクレオチドに分けて化学合成し、ブロックご
とに順次適切に連結する方法により作製できる。例えば
配列表配列番号３及び同４においては、ヒトＴＮＦ遺伝
子の各鎖を約５０塩基程度ずつ１０本のオリゴヌクレオ
チドに分け、合計２０本化学合成する。その合成方法と
してはジエステル法〔比Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ、”Ｓｏ
ｍｅ　ＲｅｃｅｎｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｅｓ
ｔｅｒｓｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　□Ｉｎｔｅｒｅ
ｓｔ”、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ。

Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９６１））、トリエ
ステル法（Ｒ，Ｌ。

Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　　Ｊ、　　Ａｍ、
　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、　　８９．　４８０１（
１９６７））及びホスファイト法ＣＭ、　Ｄ、　Ｍａｔ
ｔｅｕｃｃｉｅｔ　ａｌ、　Ｔｅｔｒａｂｅｄｒｏｎ　
Ｌｅｔｔ、、　２１．７１９　（１９８０））が挙げら
れるか、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホスファイト法が
操作性などから好んで用いられる。

合成されたオリゴヌクレオチドは例えば逆相クロマトカ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィ、ポリアクリル
アミドゲルを用いた電気泳動などの通常の精製方法によ
り精製される。その後、オリゴヌクレオチドは例えばＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化しアニー
リング化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結する
。ここではオリゴヌクレオチドを幾つかのブロックに分
け、所望のヒトＴＮＦ遺伝子配列が得られるように順次
連結し、制限酵素で切断又はＴ４ＤＮＡポリメラーゼに
よる平滑化後、電気泳動により精製する。得られたＤＮ
Ａ断片について例えばｐｕｃｓ、同９、同１８、同１９
　（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ。

１９、２５９　（１９８２））のようなベクターに組み
込み、常法によりコンピテントセルを形質転換してクロ
−ン化する。得られたクローンより公知の方法に従って
プラスミドＤＮＡを抽出精製し、ベクターに挿入された
ＤＮＡ断片の塩基配列が目的の遺伝子配列を達成したか
否かを点検する。達成できたヒトＴＮＦ遺伝子の各部分
について、それぞれを含むプラスミドベクターより制限
酵素を用いて切り出し、再度前記ベクターに連結後組み
込むことにより目的の完全長のヒトＴＮＦ遺伝子を有す
るプラスミドベクターを得る。かくして得られたプラス
ミドベクターを制限酵素で切断後、ゲル電気泳動法によ
って分離精製することにより所望のヒ）ＴＮＦ遺伝子を
得ることかできる。

一方、前述の方法に対してはＴＮＦを発現しているヒト
細胞由来のｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを使用する方法を
適宜組合せてもよい。

（２）　　ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築前記（１）で
得られたヒトＴＮＦ遺伝子は適切に発現ベクターに挿入
し、クローン化してヒトＴＮＦ発現ベクターを構築する
。発現ベクターは翻訳開始コドン（ＡＴＣ；）の上流に
転写プロモーター領域並びに翻訳シグナルであるＳＤ（
シャイン・ダルガーノ）配列を有し、翻訳終止コドン（
ＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧ）の下流に転写ターミネータ
−領域を有する必要かある。また転写プロモーターとし
ては、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターｔａｃ
プロモーター、ＰＬプロモーター、円１０５プロモータ
ー、ＡＤＣＩプロモーターなどが使用でき、転写ターミ
ネータ−としてはｔｒｐターミネータ−ｒｒ口ＢＴＩＴ
２ターミネータ−１ＡＤＣｌターミネータ−なとか使用
できる。このような発現ベクターは例えば、ｐＫＫ２２
３−３　（ファルマシア）　、ｐＰＬ−１ａｍｂｄａ　
（同左）なとの市販品の中から容易に入手できるがこれ
らを改良して発現性或は取扱性をより高度化したものを
使用してもよい。

（３）ヒ１−ＴＮＦ変換体発現ベクターの構築ヒトＴＮ
Ｆ変換体ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製方法と
しては例えば次の方法か挙げられる。

（ｉ）前記（１）ヒトＴＮＦ遺伝子の取得で記載した方
法に準じて化学的に合成したオリゴヌクレオチドを適切
に連結することにより作製する。この方法によればアミ
ノ酸、ポリペプチドなどの置換、付加又は欠失の改変は
自在である。

（ｉｉ）前記（１）で作製したヒトＴＮＦ遺伝子を適当
な制限酵素で切断し、遺伝子内の特定領域を除去した後
、変異を導入した塩基配列を有する合成オリゴヌクレオ
チド（例：上上鎖をアニーリング化して連結した二本鎖
ＤＮＡ断片）又は適当な遺伝子を組み込む。この方法に
よれば前記（ｉ）の場合と同様、改変を自在に行なうこ
とができる。

（ｉｉ）変異を導入した塩基配列を有する合成オリゴヌ
クレオチドをプライマーとして用いＤＮＡ鎖を延長する
ことにより、変換体ポリペプチド遺伝子を作製する（部
位特異的変異法（Ｔ、　Ａ、　Ｋｕｎｋｅｌ　ｅｔ　ａ
ｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
　１５４．３６７（１９８７））　）。この方法によっ
ても前記（ｉ）の場合と同様の改変を行なうことかでき
るが、特に任意のアミノ酸を置換することに適している
。

本発明では（ｉｉ）の部位特異的変異法が好適であるの
で、以下これを中心に説明する。

先ず部位特異的変異法を行なうにあたり、鋳型ＤＮＡを
作成する。前記（１）で得られたヒトＴＮＦ遺伝子を、
Ｍｅｓｓｉｎｇら１（ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ。

１５３　、３　（１９８７））によって開発された一重
鎖プラスミドＤＮＡ調製用プラスミドベクター（ｐＵｃ
１１８、ｐＵｃｌ１９なと）に連結し、大腸菌株に導入
する。得られた形質転換体の中より目的のプラスミドを
有するクローンを選択する。

このプラスミドをｄｕｔ−及びｕｎｇ−変異大腸菌株（
ＣＪ２３６株など）に導入し、遺伝子内にウラシルを取
り込ませ、大腸菌株にＭ１３ＫＯ７なとの変異型へルバ
ーファージを感染させて目的の一本鎖プラスミドＤＮＡ
を取得する。

一方、本発明に係る変換導入部位及びその前後の塩基配
列を有する約１５〜５０塩基のオリゴヌクレオチド・プ
ライマーを化学合成する。このプライマーと前述の工程
で得られるウラシル導入−木組プラスミドＤＮＡとをア
ニーリング化した後、例えばＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及
びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、二本鎖化する。二本鎖
となったプラスミドをｕｎｇ＋の大腸菌株に導入し、得
られた形質転換体中より使用したプライマーをプローブ
として用いコロニー・ハイブリダイゼ゛−ジョンを行な
い、目的の変換体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含
むプラスミドを有するクローンを選択する。

前述で得られるプラスミドから制限酵素切断処理により
ヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドのアミノ酸配列をコード
するＤＮＡを切り出し、前記（２）の場合と同様にして
、発現ベクターに挿入し、クローン化することにより、
目的のヒトＴＮＦ変換体発現ベクターを構築することか
できる。

発現ベクターを大腸菌株のような宿主細胞へ導入するこ
とについては例えば塩化カルシウム法により作製した大
腸菌株のコンピテントセルを用いる公知の方法（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔ
ｉｓｅｔ　ａｔ、　（１９８２）　）に従って行なう。

宿主細胞としては大腸菌、枯草菌、酵母なとの微生物細
胞か使用できるか、なかでも大腸菌としてはＪＭ８３、
ＪＭ１０３などのＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株の変異種
か挙げられる。

（４）　　ヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドの取得本発明
においては前記（３）で記載の形質転換された微生物細
胞を培養し、目的のヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドを培
養物中に産生、蓄積させて分離する。微生物細胞、特に
大腸菌の培養方法としては従来から知られている方法、
例えば大腸菌か要求する栄養素を含んだ培養液に大腸菌
を接種し、普通３２〜３７°Ｃで約１２〜２４時間振ど
う又は攪拌することにより短時間に大量に培養する方法
か使用できる。培地は例えばＬ培地、Ｍ９培地なと〔前
記Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ参照〕が使用で
き、必要に応じてアンピシリンなどの抗生物質を添加し
たり、培養開始時或は培養中にｌａｃプロモーターｔａ
ｃプロモーターなとの転写プロモーターの効率を高める
ためにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
を添加することもできる。

本発明のヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドは培養後、普通
、微生物細胞の集合体をトリスバッファーに懸濁させた
状態で超音波処理することにより破砕処理を施し、遠心
分離操作を行ない菌体残渣を除去することにより得られ
る。更に、かくして得られたものは核酸・エンドトキシ
ン除去剤処理、フィルターによるろ過、陰イオン交換ク
ロマトグラフィーその他従来からの蛋白質の分離精製方
法を組み合わせることにより、−層積製することができ
る。

本発明のヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドはヒトＴＮＦの
持つ抗腫瘍作用と同様の作用を有し、しかもヒトＴＮＦ
に比し優れた抗腫瘍活性を示し、副作用も軽減するので
抗腫瘍剤、医薬の活性成分として有効である。本発明の
ヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドはなかでも、前記アミノ
酸配列で第６８番目のＰｒｏがＡｓｐ、　Ｍｅｔ又はＴ
ｙｒに置換されたものが好ましい。その医薬組成物の製
剤に当っては薬理上許容される担体又は稀釈剤とともに
医薬組成物に製剤することかできる。本発明の医薬組成
物の剤型としては、外用剤、経口投与剤、注射剤などが
あげられ、それぞれの剤型にあった投与方法で投与され
る。

実施例１　（ヒトＴＮＦ遺伝子のデザイン）既に報告さ
れているＣＰｅｎｎ１ｃａら、前出〕ヒトＴＮＦ構造遺
伝子のアミノ酸配列を基に、ヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配
列について遺伝子構築および変換体作製の便宜上、配列
表配列番号３のＤＮＡ塩基配列をデザインした。ここで
は適当な間隔で制限酵素認識部位を組み込み、またプラ
スミドベクターと容易に連結できるように翻訳開始コド
ン（ＡＴＧ）の上流に制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断部
位を、翻訳終止コドン（ＴＡＡおよびＴＧＡ）の下流に
は制限酵素ＨｉｎｄＩ［による切断部位をそれぞれ設け
た。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）前記実施例
１でデザインされたＤＮＡは、自動ＤＮＡ合成機（アプ
ライド・バイオシステムズ。

モデル３８１Ａ）を用いて、ホスファイト法にて化学合
成した。合成は配列表配列番号４で示した塩基配列を有
するＵ−１−，１０及びＬ−１〜１０の２０本のオリゴ
ヌクレオチドに分割して行い、合成されたオリゴヌクレ
オチドのＣＰＧ樹脂（フナコシ社販売）からの切り出し
及び保護基脱離は、アプライド・バイオシステムズ社の
マニュアルに従った。各オリゴヌクレオチドの分離精製
は逆相クロマトカラムを用いたＨＰＬＣ（高速液体クロ
マトグラフィー）又は７Ｍウレアを含むポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ゲル濃度ｌＯ〜２０９６）により行
った。

ＨＰＬＣ法については、ヌクレオジル５Ｃ１８カラム（
φ４．６　Ｘ　ｌ　５０　＋ｎｍ　；ケムコ社販売）を
用いた逆相クロマトグラフィーによって、アセトニトリ
ルを含むトリエチルアミノ酢酸（１００ｍＭ）バッファ
ー（ｐＨ７，０）で溶出することにより分離精製した。

上記溶出は、アセトニトリルの直線濃度勾配を５〜３５
％（３０分）とし、約１５分のピークを回収した。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に関しては、各合成
オリゴヌクレオチド試料を電気泳動により分離し、紫外
線シャドウィング法による泳動パターンの観察結果より
目的の大きさのバンド部分を切り出し、そのポリアクリ
ルアミドゲル断片を約１〜２［［１ｍ３の大きさに切り
きざみ、約２ｍｎの溶出バッフｙ　　（０，５Ｍ　ＮＨ
４０ＡＣ及び１ｍＭ　ＥＤＴＡ　）を加え、３７°Ｃて
一晩振とうした。各オリゴヌクレオチドを含む溶出バッ
ファーを回収し、フェノール抽出（５０％フェノール’
／　５０９６クロロホルム溶液使用）、イソブタノール
抽出を行い、エタノール沈殿操作により各オリゴヌクレ
オチドの精製試料とした。

合成・精製したオリゴヌクレオチドの一部について、マ
キサム・ギルバード法（Ａ、Ｍ、Ｍａｘａｍ　ｅｔ　ａ
ｌＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５
４９９　（１９８０）　）により、目的の塩基配列を存
していることを確認した。

以下（実施例３．４及び５）の遺伝子組換えに係わる操
作において、制限酵素及び他の関連酵素の反応条件等は
、おもにＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（前出
）記載の方法に準じた。なお、上記酵素等はおもに宝酒
造より入手しており、宝酒造のマニュアルも参考にした
。

実施例３（合成オリゴヌクレオチドの連結によるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の構築） （１）　　まず第１図に従ってヒトＴＮＦ遺伝子の構築
を試みた。

前記実施例２で得られる合成オリゴヌクレオチドを３つ
のグループ（Ｕ及びＬ−１〜４、Ｕ及びＬ−５〜７並び
にＵ及びＬ−８〜１０）に分けてクローニングを行った
。すなわち、Ｕ−２，３，４，６，７，９及びｌＯ並び
にＬ−１，２，３，５，６，８及び９の各オリゴヌクレ
オチド（１〜２μｇ）の５′末端を２〜５ユニツトのＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を用いて、それ
ぞれ別々にリン酸化する。リン酸化反応は１０μｌの水
溶液中（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！ｐＨ７，６，１
０ｍＭＭｇＣ１２，０，１ｍＭ　Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ
、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｌｏｍＭＤＴＴ及び１ｍＭ
　ＡＴＰ）、３７°Ｃで１時間行い、反応終了後、７０
°Ｃで１０分間処理することによりＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを失活させた。新たに、１〜２μｇのＵ−１
，５及び８並びにＬ−４，７及びｌＯの各オリゴヌクレ
オチドをそれぞれ別々に含む上記と同組成の水溶液ｌＯ
μｌを用意し、それぞれＵ及びＬの同じ番号同士で各オ
リゴヌクレオチド（Ｕ−１−１０及びＬ−１−１０）水
溶液を混合しく２０μｌ）、１００°Ｃで５分間煮沸後
徐冷することによりアニール化した。次に、得られた１
０本のアニーリング体（二本鎖ＤＮＡ断片）を、各グル
ープごとに連結反応のための水溶液（６６ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｆｆｉ　ｐＨ７，６，６，６ｍＭ　ＭｇＣ！！
２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＡＴＰ及び１００μｇ
／ｍ１ＢＳＡ）に添加しく総液量１２０〜１６０μり、
４０°Ｃ加温後徐冷によるアニール化の後、７００ユニ
ツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１６
°Ｃで１５時間連結反応を行った。反応終了後、各反応
液をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度６９６
）によす分離し、エチジウムブロマイド染色法による泳
動パターンの観察結果より目的の大きさ（１７６ｂｐ、
　１５０　ｂｐ及び１５３　ｂｐ）のバンド部分を切り
出し、エレクトロ・エリコーション法により目的とする
３本のＤＮＡ断片を回収した。さらに、回収した各試料
に対してフェノール抽出（５０％フェノール１５０％ク
ロロホルム溶液使用）、イソブタノール抽出を行い、エ
タノール沈殿操作により目的のＤＮＡを精製した。上記
方法に準じて、精製した３本の二本鎖ＤＮＡ断片をそれ
ぞれ別々にその５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いてリン酸化し、連結反応のための水溶液中にて
混合の後、４０℃の加温によりアニール化を行い、Ｔ４
　ＤＮＡリガーゼを加えて連結した。エタノール沈殿操
作によりこの連結ＤＮＡを回収し、１ｍＭＤＴＴ及びｌ
　００　ｕ　ｇ／ｙｎｌＢｓＡを含む５０μ１（７）ハ
イー／ルトバッフｙ　　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ
？　ｐＨ７，５，１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｍ
ｇＣ１２）に溶解させ、１５ユニツトの制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ　（宝酒造）及び１５ユニツトの制限酵素Ｈｉｎｄ
　ＩＩＩ　（宝酒造）を添加して、３７°Ｃて２時間切
断反応を行った。反応終了後、上記方法に準じて、ポリ
アクリルアミドケル電気泳動（ゲル濃度４９６）により
目的とするＤＮＡ断片（約４８０ｂｐ）を分離精製した
。

一方、プラスミドベクターｐｔＪｃ９　　（凡用大学遺
伝情報実験施設より分与）の５μｇを、前記の方法に準
じて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩで切断
し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１９６）により
約２．７　ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。

先に精製した約４８０ｂｐのＤＮＡ断片（ヒトＴＮＦ遺
伝子を含む）とこのｐＵＣ９断片を、前記の方法に準じ
て、２０μｌの連結反応液中にて混合し、３５０ユニツ
トのＴ４　ＤＮＡリガーゼを添加し、１６°Ｃで３時間
連結反応を行った。塩化カルシウム法（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ参照〕により作製したＥ、ｃｏｌ
ｉ　Ｋ−１２ＪＭ８３株（凡用大学遺伝情報実験施設に
より分与）のコンピテントセルを、上記連結反応液によ
り常法に従って形質転換した（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１
ｏｎｉｎｇ参照〕・ 得られたアンピシリン耐参照口−ンより、公知の方法を
用いてプラスミドを調製し、前記の方法に準じて、制限
酵素（ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）処理後、アガロ
ースゲル電気泳動によりその泳動パターンを解析するこ
とにより、ヒトＴＮＦ遺伝子のρＵＣ９ベクターへの挿
入を調べた。その結果、約２５０ｂｐの遺伝子の挿入か
確認でき、そのクローンについて挿入された遺伝子の塩
基配列をダイデオキシ法ＣＦ、Ｓａｎｇｅｒ、　５ｃｉ
ｅｎｃｅ、　２１４．１２０５　（１９８１））により
調べたところ、１ＥｃｏＲＩ部位から下流に約１３０ｂ
ｐとＨｉｎｄＩＩＩ部位から上流に約９０ｂｐの目的と
するヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を有する遺伝子断片で
あることが確認された。このクローン及びプラスミドを
それぞれｐｔＪＡ４１／ＪＭ８３及びｐＵＡ４１と命名
した。

（２）引き続き、第２図に従ってヒトＴＮＦ遺伝子の構
築を試みた。

前記（１）工程でのクローニングでヒトＴＮＦ遺伝子の
塩基配列において未達成な領域周辺を２つのグループ（
Ｕ及びＬ−３〜６並びにＵ及びＬ−６〜９）に分け、前
記（１）工程と同様にして、各オリゴヌクレオチドをリ
ン酸化し、アニーリング化した後、Ｔ４　ＤＮＡリガー
ゼにより連結した。前記方法に準じて、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ゲル濃度６９６）により分離精製し
、得られた２本のＤＮＡ断片（２０１ｂｐ及び２００ｂ
ｐ）をそれぞれ別々に１００μｌの６７ｒｎＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，８）、６、７ｍＭ　ＭｇＣ１２，
１６，６ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４，６，７μＭ　ＥＤ
ＴＡ。

ＩｍＭ　ＤＴＴ、２００μｇ／ｍ１ＢＳＡ及び各３３０
μＭデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、　
ｄＧＴＰ、　ｄｃＴＰ及びＴＴＰ）水溶液にて溶解し、
２〜５ユニットのＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）
を添加し、３７°Ｃで３０分間反応することによりＤＮ
Ａ断片の両末端を平滑化した。反応終了後、６８°Ｃで
１００分間処理することによりＴ４　ＤＮＡポリメラー
ゼを失活させ、エタノール沈殿により目的の２本のＤＮ
Ａ断片を回収した。

一方、５μｇのｐｔＪｃ９ベクターを１ｍＭＤＴＴ及び
１００μｇ／ｍｆｆ１　ＢＳＡを含む５０μｌのミデイ
アム・ソルトバッフ７−　（ｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｊ’、　ｐＨ７，５，５０ｍＭＮａＣ！及び１０ｍＭ　
ＭｇＣ１２）に溶解させ、１５ユニツトの制限酵素Ｈｉ
ｎｃＩ［（宝酒造）を添加し、３７°Ｃで２時間の反応
後、エタノール沈殿により回収した。得られた切断・開
環したｐＵｃ９ベクターに、先に平滑化後回収した２本
のＤＮＡ断片をそれぞれ別々に、前記方法に準じて、Ｔ
４　ＤＮＡリガーゼを用いて組み込み、Ｅ、ｃｏｌｉ　
Ｋ−１２ＪＭ８３株を形質転換した。得られたそれぞれ
のクローンについて、前記（１）工程と同様にして、挿
入されたＤＮＡの塩基配列を調べ、目的の塩基配列であ
ることを確認した。これらのクローンをそれぞれｐＵＡ
４２／ＪＭ８３及びｐＵＡ４３／ＪＭ８３と命名し、プ
ラスミドをｐＵＡ４２及びｐｔＪＡ４３と命名した。

上記（１）及び（２）工程で得られたｐＵＡ４１を制限
酵素ＥｃｏＲＩ　（ハイ・ソルトバッファ−）及びＳａ
ｃ　Ｉ（宝酒造：ロウ・ソルトバッファ−）、制限酵素
Ｈａｅ　Ｉ［（宝酒造）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ミデイア
ム・ソルトバッファー）で、ｐＵＡ４２を制限酵素５ａ
ｃＩ（ロウ・ソルトバッファー）及び■ｐａＩ（宝酒造
：　ＫＣｌバッファー）で並びにｐＵＡ４３を制限酵素
Ｈｐａ　Ｉ及びＨａｅＩ［（ＫＣｌバッファー）で、前
記方法に準じて、それぞれ切断した。ロウ・ソルトバツ
ファ−（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ’　ｐｔ（７，５
及び１０ｍＭ　ＭｇＣｊ’　２）とハイ・ソルトバツフ
ア−又はＫＣｌ＜ツノァー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｊｌ’　ｐＨ８，５，１００ｍＭ　ＫＣｎ及びｌｏｍＭ
Ｍｇ（Ｊ’２）の組み合わせについては、切断反応を２
回に分け、反応の間にエタノール沈殿操作を行うことに
より対応した。ｐＵＡ４１からのＥｃｏＲＩ　−３ａｃ
　ｌＤＮＡ断片（１２７ｂｐ）及びＨａｅＩＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩ［ＤＮＡ断片（８０ｂｐ）、ｐＵＡ４２からのＳ
ａｃ　Ｉ　−Ｈｐａ　Ｉ　　ＤＮＡ断片（１４７ｂｐ）
並びにｐＵＡ４３からのＨｐａ　Ｉ　−ＨａｅＩＩ　Ｄ
ＮＡ断片（１２６ｂｐ）を、前記方法に準じて、それぞ
れポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）に
より分離精製した。

一方、５μｇのｐＵｃ１９プラスミドベクター（凡用大
学遺伝情報実験施設より分与）を、前記の方法に準じて
、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩて切断し、約
２．７　ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動
（ゲル濃度１９６）により分離精製した。先に精製した
４本のＤＮＡ断片を図示（第２図）したように順次添加
し、前記方法に準じて、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて
連結して行き、最後に上記の精製ｐｔＪｃ１９ベクター
（約２．７　Ｋｂｌｌ断片）に組み込み、ＪＭ８３株を
形質転換した。この形質転換体に含まれるプラスミドＤ
ＮＡについて、前記方法に準じて、挿入されたＤＮＡの
塩基配列を調べたところ、目的とする完全長（約４８０
ｂｐ）のヒトＴＮＦ遺伝子を含むプラスミドベクター（
約３．２　Ｋｂｐ）を有するクローンであることが確認
できた。このクローンを　ｐＵＡ４４／ＪＭ８３と命名
し、プラスミドをｐＵＡ４４と命名した。

実施例４（ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築）（１）　　
大腸菌ｔａｃプロモーターを有する発現ベクターｐＫＫ
　２２３−３　（ファルマシア社より入手）をより扱い
やすくする目的で以下の改良を試みた。

ｉ）発現ベクターを低分子量化する。

ｉ）制限酵素ＢａｍＨの認識部位を唯一とする。

１ｉｉ）　ｔａｃプロモーターの方向をアンピシリン耐
性遺伝子の方向と逆向きにする。

第３図にその方法を図示した。

プラスミドベクターｐＢＲ３２２（凡用大学遺伝情報実
験施設より分与）の５μｇを、実施例３の方法に準じて
、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩ［で切断後、その
両末端をＴ４　ＤＮＡポリメラ上ゼを用いて平滑化した
。実施例３の方法に準じて、アガロースゲル電気泳動（
ゲル濃度１％）により約４．４　ＫｂｐのＤＮＡ断片を
分離精製し、その開環部位にＢｇｌ■リンカ−（制限酵
素ＢｇｌＩＩ認識部位を含む１Ｏｂｐの二本鎖ＤＮＡ断
片：宝酒造より入手）をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて
挿入連結した。前記実施例３の方法に準じて得た形質転
換体の中より、そのプラスミドについて制限酵素による
切断の可否を調べることにより、目的の制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＨｉｎｄ■認識部位を欠き、制限酵素ＢｇｌＩ
Ｉ認織部位を新生したプラスミドｐＢＲ９３３３（約４
．４　Ｋｂｐ）を有するクローンを得た。

上記で得たプラスミドｐＢＲ９３３３の５μｇを、実施
例３の方法に準じて、ハイ・ソルトバツフア−に溶解し
、制限酵素ＢｇｌＩＩ（宝酒造）及びＰｖｕ　ＩＩ（宝
酒造）で切断し、複製起点を含む約２．３ＫｂｐのＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）によ
り分離精製した。一方、発現ベクターｐＫＫ２２３−３
（約４．６　ｋｂｐ）の５μｇを上記同様ハイ・ソルト
バッファーに溶解し、制限酵素ＢａｍＨＩ　（宝酒造）
及び５ｃａｌ（宝酒造）で切断した。制限酵素Ｂａｍ旧
による切断反応は、添加酵素量を通常の約１／２とし、
反応時間を５〜３０分間とする部分切断により行った。

切断処理後、ｔａｃプロモーター及びｒｒｎＢＴ＋Ｔ＋
ターミネータ−等を含む約１．ｌＫｂｐのＤＮＡ断片を
上記同様アガロースケル電気泳動により分離精製した。

先に精製した複製起点を含む約２．３　ｋｂｐのＤＮＡ
断片に上記の約１．　ｌ　ＫｂｐのＤＮＡ断片を前記に
準じてＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結し、実施
例３の方法に準じて、塩化カルシウム法により作製した
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２ＪＭ１０３株（冗句大学遺伝情
報実験施設）のコンピテントセルに導入した。得られた
形質転換体の中より、目的とするｔａｃプロモーター等
を含む発現ベクター（約３．１（ｂｐ）を有するクロー
ンを選択し、この発現ベクターをＩＩＫＫＩＯＩ　と命
名した。

（２）第４図に従って、次の工程を説明する。

前記（１）工程で得た発現ベクターｐＫＫｌｏ１の５μ
ｇを、前記方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨ
ｉｎｄＩ［で切断し、複製起点および転写調節領域等を
含む約３．４　ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースケル電
気泳動（ゲル濃度１％）により分離精製した。

また、前記実施例３で得られたヒトＴＮＦ遺伝子を含む
プラスミドｐＵＡ４４　（約３．２　ｋｂｐ）を、同様
にして、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌＩ［で切
断し、ヒ１−　ＴＮＦ遺伝子全域を含む約４８０ｂｌ）
のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製
した。

このヒトＴＮＦ遺伝子全域を含むＤＮＡ断片を、先に発
現ベクターｐＫＫ１０１より精製した約３．４ｋｂｐの
ＤＮＡ断片に、前記方法に準じて、Ｔ４　ＤＮＡリガー
ゼを用いて挿入連結し、前記の方法に準じてＥ、　ｃｏ
ｌｉ　Ｋ−１２ＪＭ１０３株に導入した。得られた形質
転換の中より目的のヒトＴＮＦ発現ベクタ（約３．９Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを選択し、この発現ベクターを
ｐＫＦ４１０２と命名した。

実施例５（ヒトＴＮＦ変換体発現ベクターの構築）（１
）第５図に従って説明する。

前記実施例３て得られたプラスミドｐＵＡ４４を、前記
方法に準じ、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子（全域を含む約４８０ｂｐ
）のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精
製した。一方、Ｍｅｓｓｉｎｇら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１５３　、３　（１９８７
））によって開発された一木組プラスミドＤＮＡ調製用
プラスミドベクターｐＵｃｌ１９　　（宝酒造より人手
）を、同様にして、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ
ｌｌＩで切断し、ＩＣ領域を含む約３．２ＫｂｐのＤＮ
Ａ断片をアガロースケル電気泳動により分離精製した。

このＩＣ領域（Ｍ１３ファージＤＮＡのｉｎｔｅｒｇｅ
ｎｉｃ　ｒｅｇｉｏｎ）の存在により、プラスミドｐＵ
ｃｌ１９は、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７感染後優先
的に一本鎖ＤＮＡとなりファージ粒子に包み込まれ菌体
外に放出される。上記で精製したヒトＴＮＦ遺伝子全域
を含む約４８０ｂｐのＤＮＡ断片とＩＣ領域を含む約３
．２ＫｂｐのｐｔＪｃ１１９断片を前記に準じてＴ４　
ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、前記実施例３の方法に
準じてＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２ＪＭ８３株に導入した
。得られた形質転換体の中より、目的のプラスミド（約
３．７Ｋｂｐ）を有するクローンを選択し、このクロー
ンをｐｕｃｔ　１９−ｈＴＮＦ／ＪＭ８３と命名し、プ
ラスミドをｐＵｃｌ　１９−ｈＴＮＦと命名した。

上記で得たプラスミドｐｅｅｌ　１９−ｈＴＮＦを、そ
のＤＮＡ内にウラシルを取り込ませ保持するために、前
記実施例３の方法に準じて、塩化カルシウム法により作
製した大腸菌ＣＪ２３６株（ｄｕｔ−、ｕｎｇ−）のコ
ンピテントセルに導入した。ＣＪ２３６株はチミジン合
成酵素遺伝子に変異（ｄｕじ）を持つため、チミンの替
わりにウラシルを取り込んだＤＮＡを作ることかでき、
さらにｕｎｇ−変異によりそのウラシルをＤＮＡ中に保
持しておくことかできる。このＣＪ２３６株はバイオ・
ラドより入手した。上記導入により得られたクローン（
ｐＵｃｌ１９−ｈＴＮＦ／ＣＪ２３６）をヘルパーファ
ージＭ１３ＫＯ７（宝酒造社より入手）の感染後、ｌ　
００　ｔｔ　ｇ／ｍｌ！アンピシリン、７０μｇ／ｍｌ
カナマイシンおよび３０μｇ　／　ｍ　Ｉ！シクロムフ
ェニコールを含む２ＸＹＴブロース（１，６％トリプト
ン、ｌ　９６酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ及びｐ１７
．６）にて培養することにより、目的のウラシルを導入
した一重鎖プラスミドＤＮＡ　（約３．７Ｋｂａｓｅｓ
）をファージ粒子に包み込んだ形で菌体外に放出させた
。放出させたファージ粒子を培養下漬より回収し、−木
組ファージＤＮＡの調製方法に準じて、目的の一重鎖プ
ラスミドＤＮＡを調製した。

（２）次に第６図に従って説明する。

プラス鎖オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子に対し変異導入を行うために、配列表記列番号５で示
したプライマー４２９１、同４２９２及び同４２９３を
デザインした。このオリゴヌクレオチドの化学合成及び
精製は、前記実施例２の方法に準じて行った。

ヒトＴＮＦ遺伝子への部位特異的変異導入は、バイオ・
ラドのシステム（Ｍｕｔａ−ＧｅｎｅｏＭｉｎ　ｖｉｔ
ｒ。

ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ）に準じて行った。す
なわち、上記で作製した約０．５μｇのプライマーの５
′末端を、前記方法に準じて、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼによりリン酸化した一部と、先に調製したウラシ
ル導入−重鎖プラスミドＤＮＡ　（ｐＵｃ　１１９ｈＴ
ＮＦ）の約２０００ｇとの間で、Ｉ　Ｏμｌのアニーリ
ング・バッファ　−（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ’　
ｐ）１７．４゜２　ｍＭ　ＭｇＣＡ　２及び５０　ｍＭ
　ＮａＣＪ’　）中にてアニーリング（約７０°Ｃに加
温後徐冷）を行った。アニリング終了後、１０倍シンセ
シス・バッファー（５ｍＭ各デオキシリボヌクレオチド
三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、　ｄｃＴＰ及びＴＴＰ
）　、１０ｍＭ　ＡＴＰ、　１００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣ
ｆｆｐＨ７，４，５０ｍＭ　ＭｇＣ１２及び２０ｍＭ　
ＤＴＴ）を１／１０容量加え、■ユニットのＴ４　ＤＮ
Ａポリメラーゼおよび２〜４ユニツトのＴ４　ＤＮＡリ
ガーゼを用いて二本鎖化反応（３７°Ｃ及び９０分間）
を行った。ＴＥバッツノ　−（ｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＪ’　ｐＨ７，５及び１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を約８容量
加え、凍結することにより反応を停止した。前記実施例
３の方法に準じて、塩化カルシウム法により作製したＥ
、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２ＴＧＩ株（ｕｎｇ”　：アマシャ
ム社）のコンピテントセルに、上記反応液を処理し二本
鎖ＤＮＡを導入した。

ｕＢ＋株にヘテロ二本鎖ＤＮＡを導入することにより、
鋳型であるウラシルを含むＤＮＡ鎖は不活性化され複製
の対象とならない。そのため変異の導入頻度は５０％を
上回る効率なものとなる。得られた形質転換体の中より
、変異導入のために使用したプライマーをプローブとし
たコロニー・ノーイブリダイゼーション法を用いて、目
的の変換体ＤＮＡを含むプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）
を有するクローンを選択した。選択されたクローンにつ
いて、そのプラスミドの変異導入部位周辺の塩基配列を
ダイデオキシ法ＣＦ、　Ｓａｎｇｅｒ　：前出〕により
調べ、デザイン通りの変換体ＤＮＡに変異していること
を確認した。これらのプラスミドをそれぞれｐＵＣ１１
９−Ｆ４２９１　、　ｐＵｃｌ１９−Ｆ４２９２及びｐ
Ｕｃｌ　１９−Ｆ４２９３と命名した。

変異導入により得られた目的のヒトＴＮＦ変換体遺伝子
を、実施例４のヒトＴＮＦ発現ベクターの構築方法に準
じて、ｔａｃプロモーターを有する発現ベクターＰＫ！
（１０１に組み込みヒトＴＮＦ変換体発現ベクターを構
築した。ヒトＴＮＦ変換体遺伝子（約４８０ｂｐ）は、
上記で得られた約３．７ＫｂｐのプラスミドｐＵｃ１１
９−Ｆ４２９１　、　ｐＵｃ１１９−Ｆ４２９２および
ｐＵｃｌ　１９−Ｆ４２９３より、前記方法に準じて、
それぞれ、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに
よる切断後分離精製した。目的とするそれぞれのヒトＴ
ＮＦ変換体発現ベクター（ｐＫＦ４２９１　、　ｐＫＦ
４２９２及びｐＫＦ４２９３）は、ヒトＴＮＦ発現ベク
ター（ｐＫＦ４１０２）と同様、宿主としてＥ、ｃｏｌ
ｉ　Ｉ（−１２ＪＭ１０３株を用いて取得した。

上記３種類の変換体発現ベクターは、発現誘導により、
以下に示す変換を有する新規生理活性ポリペプチドを大
腸菌内に生産する。

ベクターｐＫＦ４２９１　：ポリペプチドＦ４２９１（
ヒトＴＮＦの６８番目のＰｒｏをＡｓｐに変換）をコー
ドする。

ベクターｐＫＦ４２９２　：ポリペプチドＦ４２９２（
ヒトＴＮＦの６８番目のＰｒｏをＭｅｔに変換）をコー
ドする。

ベクターＩ］ＫＦ４２９３　：ポリペプチドＦ４２９３
（ヒトＴＮＦの６８番目のＰｒｏをＴｙｒに変換）をコ
ードする。

実施例６（ヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体の大腸菌に
よる発現及び精製） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐｌ（Ｆ
４１０２）及び実施例５で得られたヒトＴＮＦ変換体発
現ベクター（ｐＫＦ４２９１．　ｐＫＦ４２９２　、ｐ
ＫＦ４２９３）を有するＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２ＪＭ
１０３株を、２５〜５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび
ｏ、　ｏｏｔ％ビタミンＢｌを含むＭ９培地（０，６９
６Ｎａ２ＨＰＯ＜、０．３％に８２ＰＯ，，０，０５％
ＮａＣｉ’、０．１％ＮＨ４Ｃｌ　、　２ｍＭ　ＭｇＳ
Ｏ４，０，２％グルコース及び０．１ｍＭ　ＣａＣｌ　
２）　２０　ｍ　ｌに接種し、３７°Ｃ，１８時時間上
う培養を行った。この培養液２０ｍ１を上記培地ｌリッ
トル中に加え、３７°Ｃ１２〜３時間振どう培養を行っ
た。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭとなるように添加
し、さらに３７°Ｃ，１８時間振どう培養を続けた。

遠心分離操作による大腸菌菌体の回収後、ＴＰバッファ
ー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ’　ｐＨ８，０及び１
００　μＭ　ＰＭＳＦ）を用いて菌体の洗浄を行った。

洗浄後、菌体ダラム当たりｌＯ容量（ｒｒｌ）のＴＰバ
ッファーに菌体を懸濁させ、超音波発生装置（ヒート・
システムズ；モデルＷ−２２５）を用いて菌体を超音波
破砕処理した。得られた懸濁液を遠心分離することによ
り、菌体残渣を除去し上清画分を回収した。この超音波
破砕処理以降の精製工程は、おもに低温下（０°Ｃ〜４
°Ｃ）で行った。

この上清を０．４５μｍフィルターにてろ過した後、セ
パビーズＦＰ−ＤＡ１３　（三菱化成工業）を用いた陰
イオン交換クロマトグラフィー（カラムサイズ：φ２．
５　Ｘ　１．５　ｃｍ及び流速：０．５ｍＡ／分）で分
画し、後記５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及
びＬ９２９細胞を用いた実施例７の方法に準じて活性の
有無を検定することによって活性画分を得た。溶出には
ＮａＣｌを含むＴＰバッファーを用い、ＮａＣｉ７濃度
を０．０５Ｍから０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍへと段
階的に上げ、ヒトＴＮＦはＯ，１ＭＮａ（Ｊ’で、ヒト
ＴＮＦ変換体（Ｆ４２９Ｌ　Ｆ４２９２及びＦ４２９３
）は０．５　Ｍ　Ｎａ（Ｊ’でそれぞれ溶出した。

さらに大腸菌菌体由来のエンドトキシン等を除去するた
めに、核酸・エンドトキシン除去剤Ｃ−９（栗田工業製
造、大日本製薬販売）処理を添付マニュアルに準じて行
った。かくして、ヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体の１
段階精製試料を得た。

この試料を使用して、後記実施例７及び８の抗腫瘍活性
の評価を行った。

上記試料を０．２０μｍフィルターにてろ過した後、Ｆ
ＰＬＣシステムによる制御下のモノＱ■（ＨＲ１０／１
０及びＨＲ５１５）プレパックカラム（ファルマシアＬ
ＫＢバイオテクノロジー社製）を用いた陰イオン交換ク
ロマトグラフィーで、ＮａＣｌを含むＴＰＱバッファ　
−（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ７　ｐＨ８，０及び１
０ＭＭ　ＰＭＳＦ）によって溶出し、分画を後記５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＬ９２９細胞を
用いた実施例７の方法に準じて活性の有無を検定するこ
とによって活性画分を得た。溶出方法は、ＦＰＬＣシス
テムの制御下で下記プログラムに従って行った。第３ス
テツプは、精製純度を上げるために５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動において単一バンドとなるまで数
回繰り返した。

第１ステップ：モノＱ■（ＨＲ１０／ｌｏ）カラム使用
（流速：４ｍ１１分） ０〜５分；　０−０．２Ｍ　ＮａＣ１直線濃度勾配５〜
１６分；　０．２　Ｍ　ＮａＣ１７８〜ＩＯ分；　０．
２−０．５　Ｍ　ＮａＣ］直線濃度勾配２０〜２４分；
　０．５　Ｍ　ＮａＣｆ上記方法に従った活性画分の分
画結果（ＮａＣ１濃度及び保持時間）は、ヒトＴＮＦが
０．２Ｍ、５．３分、ヒトＴＮＦ変換体Ｆ４２９１が０
．２Ｍ、５．６分、同Ｆ　４２９２が０．２Ｍ、５．３
分及び同Ｆ　４２９３か０．２Ｍ。

５．８分であった。

第２ステップ：モノＱ■（ＨＲ５１５）カラム使用（流
速：Ｌｍｌ／分） θ〜２．５分；　Ｏ−０，２Ｍ　ＮａＣｌ！直線濃度勾
配２．５〜８分；　０．２　Ｍ　ＮａＣ１７８〜ＩＯ分
；　０．２−０．５　Ｍ　Ｎａ（Ｊ’直線濃度勾配ｌＯ
〜１２分−〇。５ＭＮａＣｎ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣＪ’濃度
及び保持時間）は、ヒトＴＮＦが０．２Ｍ、３．７分、
ヒトＴＮＦ変換体Ｆ　４２９２が０．２Ｍ、４．７分及
び同Ｆ　４２９３か０．２Ｍ、３．７分であった。

第３ステップ：モノＱ＠（ＨＲ５１５）カラム使用（流
速：１ｍｌ／分） θ〜６分；　Ｏ−０，１５Ｍ　ＮａＣ／直線濃度勾配６
〜１１分；　Ｏ，ｌ　５−０．２Ｍ　Ｎａ（Ｊ’直線濃
度勾配置１−１３分；　０．２−０．５　Ｍ　ＮａＣ＃
直線濃度勾配置３〜１５分；　０．５　Ｍ　ＮａＣｎ上
記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣｎ濃度及び
保持時間）は、ヒトＴＮＦがＯ，１６Ｍ、６．５分、ヒ
トＴＮＦ変換体Ｆ　４２９１が０．１８Ｍ、７．１分、
同Ｆ　４２９２が０．１６Ｍ、７．３分及び同Ｆ　４２
９３かＯ，１６Ｍ、６．９分であった。

かくしてヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体の精製試料を
得た。この試料を使用して後記実施例７の抗腫瘍活性の
評価を行った。

上記精製の過程および精製試料についてＳＤＳポリアク
リルアミドケル電気泳動を行い、ヒＩ・ＴＮＦ及び変換
体ポリペプチドの発現および精製の確認をした。各試料
を１０＋ｙ＋Ｍ　ＤＴＴを含有するＬａｅｍｍｌ　ｉ’
　ｓサンプル６バツフ７−　（６２，５ｍＭ　Ｔｒｉｓ
Ｈ（Ｊ？　ｐｔ（６，８，２％ＳＤＳ　、０．０１％Ｂ
ＰＢ及び１０％グリセロール）に加え、Ｌａｅｍｍｌｉ
　　（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７６３０　（１９７０））
の方法に準じ、１５％の分離用ゲルを用いて泳動を行っ
た。電気泳動終了後、分離用ゲル中の蛋白質をクマシー
・ブリリアント・ブルーで染色することにより確認をし
た。第７図にその結果の一部を示した。それぞれの発現
ベクタによるヒトＴＮＦ及び変換体ポリペプチドの発現
量はほぼ同程度であり、得られた染色ゲルをクロマト・
スキャナー（島原、Ｃ５−９２０型）にかけてその発現
効率を算出したところ、大腸菌総菌体蛋白質の約２０％
であった。また、最終精製試料は、得られた染色ケルに
おいて単一バンドであった。

その泳動位置より、ヒトＴＮＦ及び変換体ポリペプチド
の分子量を算出し第１表に示した。

なお、蛋白質の物性の一つとして、ヒトＴＮＦ及び変換
体ポリペプチドの等電点をアンフオライン（Ｌ　Ｋ　Ｂ
社製）を用いた等電点ゲル電気泳動法により測定し、得
られた結果を第１表に示した。

第１表　ヒトＴＮＦ及び変換体ポリペプチドの等電点及
び分子量 変換体ポリペプチド （変換部位／アミノ酸） ヒトＴＮＦ Ｆ　４２９１（”　”Ｐｒｏ＋Ａｓｐ）Ｆ　４２９２（
’　”Ｐｒｏ−＋Ｍｅｔ）Ｆ　４２９３（６”Ｐｒｏ→
Ｔｙｒ） 等電点 ５．６ ５．４ ５．６ ５．６ 分子量 （Ｋｄ） １７、Ｏ １７，０ １７、Ｏ Ｉ７．０ 実施例？　（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性の評価）実施
例６で得られたヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体ポリペ
プチドの一段階精製試料及び精製試料について、マウス
由来結合組繊細胞Ｌ　９２９（ＡＴＣＣＣＣＬＩ）に対
する細胞傷害活性をＡｇｇａｒｗａｌら（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６０．２３４５　（１９
８５）　）の方法に準じて求めた。すなわち、９６ウエ
ルの組織培養用のマイクロプレート（コーニング社製）
に３ＸＩＯ’細胞１０．１ｍｌ／ウェルでＬ９２９細胞
を植え、５％炭酸ガス存在下３７°Ｃで一晩培養した。

培地としては、１０％のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅ
ｃｃｏによって修飾されたイーグルのミニマム・エッセ
ンシャル培地（シグマ社製）を用いた。翌日、最終濃度
ｌμｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを添加した上記培地
に培地を交換し、この培地にて段階希釈した試料を各ウ
ェルに処理した。さらに２０時間の培養後、０．５％ク
リスタル・バイオレット溶液（０，５％クリスタル・バ
イオレット／２０％メタノール）にてプレートに付着し
た生細胞を染色（室温、１５分間）した。ｌ　ｍＭ　Ｃ
ａＣｌ２及び１ｍＭＭｇＣｌ！２を含むリン酸バッフｙ
　−ＰＢＳ　（ｌｏｍＭ　Ｎａ　・Ｋ　ｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ　、　０．８％Ｎａ（Ｊ’及び０．０２％ＫＣｊ７
）で充分洗浄した後、３０％エタノールを含む０．０１
Ｎ塩酸溶液０．１ｍｎを用いてプレートに残ったクリス
タル・バイオレットを抽出し、その吸光度（Ａ４９２）
をＥＩＡリーダー（バイオ・ラド社製、モデル２５５０
）で測定した。この吸光度は生存細胞数に比例する。そ
こで、試料無処理ウェルの吸光度の５０％の値に相当す
る吸光度を示すウェルにおける試料の最終希釈率を求め
、この試料希釈率の逆数をその試料の１ｒｒｌ当たりの
ユニット数〔ユニット／ｍ１７）と定義する。

上記方法に準じて求めたＬ９２９細胞傷害活性（ユニッ
ト／ｍＡ）から各試料の比活性（ユニット／　ｍｇ−ｐ
ｒｏｔｅｉｎ）を算出するために、各試料の蛋白定量を
行った。定量はＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　７２．２４８　（１９７６））に
準じ、標準試料としてウシ血清アルブミンを用いて蛋白
濃度（ｍｇ／ｍｎ）を求めた。これらの結果より、ヒト
ＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体試料について算出した比活
性を第２表に示した。

第２表　ヒトＴＮＦ及び変換体ポリペプチドのＬ９２９
細胞傷害活性 ヒトＴＮＦ　　　　　　　　２．７ｘｌＯ７８，０ｘｌ
Ｏ７Ｆ４２９１（”Ｐｒｏ−＋Ａｓｐ）　　６．２ｘｌ
Ｏ６２，４ｘｌＯ７Ｆ４２９２（”Ｐｒｏ−＋Ｍｅｔ）
　　　６．２ＸｌＯ’　　　　３．８ｘ１０７Ｆ４２９
３（”Ｐｒｏ−＋Ｔｙｒ）　　３．８ｘｌＯ６３，９ｘ
１０７上記第２表からヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドは
ヒトＴＮＦと同様マウス由来結合組繊細胞Ｌ９２９に対
する細胞傷害活性作用を有することかわかる。

実施例８　（ｉｎ　ｖｉｖｏ抗腫瘍活性の評価）実施例
６て得られたヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体の一段階
精製試料について、マウス可移植線維芽肉腫ＭｅｔｈＡ
腫瘍に対する抗腫瘍治療活性を求めた。試験は、生理食
塩水に懸濁したｌＸｌ０６細胞／　０．２　ｍ　Ｉ！の
ＭｅｔｈＡ腫瘍細胞をＢＡＬＢ／ｃ　７ウス（雄、５週
令、チャールズ・リバー）の背中部皮下に移植し、８日
後腫瘍径か６〜ｌｏｕ＋ｍに達したのを確認し、生理食
塩水にて段階希釈した試料（０，２ｒｒｌ／マウス）を
尾静脈より投与することにより行なった。致死量を最高
投与量とし、数段階の希釈により各投与試料を作製した
。

投与装置２週間、腫瘍増殖等の観察を続けた。

腫瘍増殖については、腫瘍容積（腫瘍塊の長径×短径２
／２）を計測し、試料投与日（０日）の腫瘍容積に対す
る腫瘍容積率を求め、この値か２または５となる試料投
与日からの日数（Ｄ２またはＤ５）を算定する。そして
、コントロール群（生理食塩水投与）に対する比率を算
出し、Ｄ２％コントロール値及びＤ５９６コントロール
値を求めた。

その値が大きい程、腫瘍増殖能か低下しており高い抗腫
瘍活性を示すことを意味する。

上記に準じて得られた結果を第３表に掲載した。

第３表からヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドはヒトＴＮＦ
に比し、死亡率が０９６のときの最大投与量では腫瘍容
積率か高いので、抗腫瘍治療効果か高いことかわかる。

配列番号　：２ 翫１りの長さ：４６５ 配列の型　・核酸 鎖の数　　ニー重鎖 トポロジー；直鎖状 配列の種類：他の核酸合成りＮＡ 配列 （イ） ＴＣＡＴＣＴｒＣＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧ　ＴＧＡＣ
ＡＡＧＣＣＴ　ＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧ　■訂ＡＧＣＡＡ
Ａ　ＣＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＭＧＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡ
ＧＴＧＧＣＴ　ＧＭＣＣＧＣＣＧＧ　ＧＣＣＭＴＧＣＣ
ＣＴＣＣＴＧＧＣＴＭ　ＴＧＧＡＧＴ部ＡＧ耐ソリ番号
　：３ 酊ｊりの長さ：４７４ 配列の型　：核　酸 鎖の数　　、二本鎖 トポロジー：直鎖状 ｆＪりの種類：他の核酸合成りＮＡ ｋνクリ Ｂ　１　）番号　　：開始コドン（’ＡＴＧ）からの番
号叶２〕マ又はム：オリゴヌクレオチド作製のための切
断位置（ｍ３）１ｉ１１１（ｆｆ酵素：ヒトＴＮＦ遺伝
子構築のために設けた制限酵巽穏忍−−田立 註４〕英小文字：ヒトＴＮＦ遺伝子のプラスミドベクタ
ーへの連結のために設けた制限酵鳩腹鉦基九ｊす配列番
号　＝４ 翫ツリの長さ：２７（Ｕ−１）、 ５０（Ｕ−４）、 ４８（Ｕ−７）、 ５３（Ｕ−１の、 ５０（Ｌ−３）、 ４９（Ｌ−６）、 ５１（Ｌ−９）、 飯ｊりの型　：核酸 鎖の数　　ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 翫ソリの種類：他の核酸合成りＮＡ ３０（Ｕ〜２）、４９（Ｕ−３）、 ５０（Ｕ〜５）、５２（Ｕ−６）、 ４９（Ｕ−８）、５１（Ｕ−９）、 ２９（Ｌ−１）、５２（Ｌ−２）、 ５０　（Ｌ−４）、４９（Ｌ−５）、 ５１（Ｌ−７）、４９（Ｌ−８）、 ４９　（Ｌ−１０） （発明の効果） 本発明によれば、ヒトＴＮＦのアミノ酸配列において６
８番目のアミノ酸を他のアミノ酸に変換することにより
、ヒトＴＮＦに比し、抗腫瘍活性が高く副作用の低い新
規なヒトＴＮＦ変換体か提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は合成オリゴヌクレオチドの連結によ
るヒ）ＴＮＦ遺伝子の構築方法を、第３図及び第４図は
ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築方法を並びに第５図及び
第６図は部位特異的変異法によるヒトＴＮＦ変換体の遺
伝子の作製方法をそれぞれ説明するための図であり、第
７図は大腸菌により発現されたヒトＴＮＦ及びヒトＴＮ
Ｆ変換体の精製試料の電気泳動結果を示す図である。 配列番号　＝５ 配列の長さ：２１　（ブライマー４２９１）２１（ブラ
イマー４２９２） ２１（ブライマー４２９３） 翫ｊりの型　：核酸 鎖の数　　ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 翫ｌ１１の種類：他の核酸合成りＮＡ 昨二＊変異導入塩基〕 Ｕ−＋ 第 図 ↓ ｐＵｃ９に組み込む ＵＡ４１ 〔注〕 Ｏ−５゛末端リン酸化（−） ・−　　　　　　　　（＋） 獲得したクローン ｐｔｌｃ９に組み込む ｐＬ１０９に組み込む 獲得したりＯ−ン ｐＵＡ４＋ ＵＡ４２ ＵＡ４３ ＵＡ４１ 第 図 ｐＫＫ　＋　０１ ＵＡ４４ ｐＫＦ４＋０２ 第　３　　図 ＥｃｏＲｌ　／ポリンシュ 第 図 蛋白質分子量マーカー 超音波破砕総画体 超音波破砕上清 ヒトＴＮＦ／−段階精製試料 ヒトＴＮＦ／精製試料 蛋白質分子量マーカー Ｆ４２９１／−段階精製試料 Ｆ４２９１／精製試料 Ｆ４２９２／−段階精製試料 Ｆ４２９２／精製試料 Ｆ４２９３／−段階精製試１ Ｆ４２９３／精製試料 ←−ヒトＴＮＦ変換体 （ｌＴ、ｏにｄ） 手続補正書（自発） 平成３年７月４日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、配列表配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
   ５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において
   、６８番目のＰｒｏが他のアミノ酸により置換された配
   列を有することを特徴とするポリペプチド。 ２、６８番目に置換される他のアミノ酸がアスパラギン
   酸、メチオニン又はチロシンである請求項１のポリペプ
   チド。 ３、配列表配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
   ５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において
   ６８番目のＰｒｏが他のアミノ酸により置換された配列
   を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むことを
   特徴とする組換えプラスミド。 ４、前記組換えプラスミドがｐＫＦ４２９１、ｐＫＦ４
   ２９２又はｐＫＦ４２９３である請求項３の組換えプラ
   スミド。 ５、配列表配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
   ５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において
   ６８番目のＰｒｏが他のアミノ酸により置換された配列
   を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え
   プラスミドにより形質転換された組換え微生物細胞。 ６、前記組換え微生物細胞が大腸菌である請求項５の組
   換え微生物細胞。 ７、配列表配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
   ５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において
   ６８番目のＰｒｏが他のアミノ酸により置換された配列
   を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え
   プラスミドにより形質転換された組換え微生物細胞を培
   地中で培養し、当該アミノ酸配列を有するポリペプチド
   を産生し分離することを特徴とするポリペプチドの製造
   方法。 ８、配列表配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
   ５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において
   ６８番目のＰｒｏが他のアミノ酸により置換された配列
   を有するポリペプチドを有効成分として含有することを
   特徴とする医薬組成物。 ９、配列表配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
   ５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において
   ６８番目のＰｒｏが他のアミノ酸により置換され、かつ
   そのＮ末端にＭｅｔを有する配列を有することを特徴と
   するポリペプチド。 １０、配列表配列番号２で示した１番目のＴから４６５
   番目のＧまでで表わされる塩基配列において２０２〜２
   ０４番目のＰｒｏをコードするＣＣＡを他のアミノ酸を
   コードするコドンにより置換された配列を有することを
   特徴とするＤＮＡ。