JPH0479964B2 - - Google Patents
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- JPH0479964B2 JPH0479964B2 JP61015900A JP1590086A JPH0479964B2 JP H0479964 B2 JPH0479964 B2 JP H0479964B2 JP 61015900 A JP61015900 A JP 61015900A JP 1590086 A JP1590086 A JP 1590086A JP H0479964 B2 JPH0479964 B2 JP H0479964B2
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Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
(1) 発明の目的
［産業上の利用分野］
本発明は水溶液中の化学成分、特に蛋白質、核
酸その値の生体高分子物質の分離、精製の用に供
する分離用ハイドロキシルアパタイト
（Hydroxylapatite）Ca10（PO4）6（OH）2の製法に
関するものである。
酸その値の生体高分子物質の分離、精製の用に供
する分離用ハイドロキシルアパタイト
（Hydroxylapatite）Ca10（PO4）6（OH）2の製法に
関するものである。
［従来の技術］
蛋白質、核酸などの生体高分子物質の混合水溶
液中からそれらを単離する方法として、固体粒子
に吸脱着せしめる方法が検討され、各種性能の分
離用固体粒子が考案提供されてきている。
液中からそれらを単離する方法として、固体粒子
に吸脱着せしめる方法が検討され、各種性能の分
離用固体粒子が考案提供されてきている。
チセリウスと彼の共同研究者は1956年、塩化カ
ルシウム溶液と第二燐酸ナトリウム溶液とを室温
（25℃付近）で混合して得られる燐酸カルシウム
沈殿をアルカリ中で煮沸してハイドロキシルアパ
タイトを調製し、これが生体高分子混合液から各
成分を分離精製するのに有用なことを示した。
［エイ・チセリウス、エス・ヒエールテン、エ・
レヴイン；アーカイヴズ オブ バイオケミスト
リイ アンド バイオフイズイツクス（A.
Tiselius，S.Hjerten and O.Levin；Archives
of Biochemistry and Biophysics）65巻、132〜
155頁1956年］ ［発明が解決しようとする問題点］ チセリウス等の方法による分離用ハイドロキシ
ルアパタイトは生体高分子の分離精製に利用され
てきているが、ガラス円筒その他のカラムに充填
してカラムクロマトグラフに供した場合、その粒
子径が微小なため流速が極めて遅いことが難点で
ある。これを解決するため、従来は、セルロース
粒子を混合して使用したり、或いは中間体の燐酸
カルシウムを生成させる際、シリカを核として使
用するとか、アルカリ煮沸に際してPHを一定に維
持することなどが行われてきた。しかし、これら
はいずれも操作が煩雑であり、また、必ずしも報
告通りの結果は得られず、充分な改良はなされて
きていなかつたものである。
ルシウム溶液と第二燐酸ナトリウム溶液とを室温
（25℃付近）で混合して得られる燐酸カルシウム
沈殿をアルカリ中で煮沸してハイドロキシルアパ
タイトを調製し、これが生体高分子混合液から各
成分を分離精製するのに有用なことを示した。
［エイ・チセリウス、エス・ヒエールテン、エ・
レヴイン；アーカイヴズ オブ バイオケミスト
リイ アンド バイオフイズイツクス（A.
Tiselius，S.Hjerten and O.Levin；Archives
of Biochemistry and Biophysics）65巻、132〜
155頁1956年］ ［発明が解決しようとする問題点］ チセリウス等の方法による分離用ハイドロキシ
ルアパタイトは生体高分子の分離精製に利用され
てきているが、ガラス円筒その他のカラムに充填
してカラムクロマトグラフに供した場合、その粒
子径が微小なため流速が極めて遅いことが難点で
ある。これを解決するため、従来は、セルロース
粒子を混合して使用したり、或いは中間体の燐酸
カルシウムを生成させる際、シリカを核として使
用するとか、アルカリ煮沸に際してPHを一定に維
持することなどが行われてきた。しかし、これら
はいずれも操作が煩雑であり、また、必ずしも報
告通りの結果は得られず、充分な改良はなされて
きていなかつたものである。
(2) 発明の構成
［問題点を解決するための手段］
本発明者は上記難点を解決することを目的と
し、チセリウス等の方法の各段階を改めて詳細に
検討した結果、粒子径の遥かに大きいハイドロキ
シルアパタイトを調製する特別の条件を発見し、
本発明を完成するに至つた。
し、チセリウス等の方法の各段階を改めて詳細に
検討した結果、粒子径の遥かに大きいハイドロキ
シルアパタイトを調製する特別の条件を発見し、
本発明を完成するに至つた。
即ち、チセリウス等の方法ではハイドロキシル
アパタイトに導く前駆体としての燐酸カルシウム
沈殿を調製するため、塩化カルシウム（CaCl2）
と第二燐酸ナトリウム（Na2HPO4）のそれぞれ
の水溶液を室温（25℃付近）で直接混合していた
が、本発明者は25℃から100℃に至る広い範囲に
わたつて温度を変えて実験し、その影響を検討し
た結果、0.5モルNaCl水溶液に両液を注入して反
応せしめることにより、40〜50℃及び90〜100℃
の二つの温度範囲の条件において塩化カルシウム
溶液と第二燐酸ナトリウム溶液とが混合された場
合、得られた燐酸カルシウム沈殿の粒子サイズは
直径60ミクロン乃至それ以上となり、他の温度領
域に比べて格段に大きく、そしてこれからアルカ
リ中での加熱によつて導かれるハイドロキシルア
パタイトも同様の大きな粒子径を保ち、カラムク
ロマトグラフにおいて従来法によるハイドロキシ
ルアパタイトに可能な展開溶出液流速の10倍に及
ぶ流速が可能となつた。
アパタイトに導く前駆体としての燐酸カルシウム
沈殿を調製するため、塩化カルシウム（CaCl2）
と第二燐酸ナトリウム（Na2HPO4）のそれぞれ
の水溶液を室温（25℃付近）で直接混合していた
が、本発明者は25℃から100℃に至る広い範囲に
わたつて温度を変えて実験し、その影響を検討し
た結果、0.5モルNaCl水溶液に両液を注入して反
応せしめることにより、40〜50℃及び90〜100℃
の二つの温度範囲の条件において塩化カルシウム
溶液と第二燐酸ナトリウム溶液とが混合された場
合、得られた燐酸カルシウム沈殿の粒子サイズは
直径60ミクロン乃至それ以上となり、他の温度領
域に比べて格段に大きく、そしてこれからアルカ
リ中での加熱によつて導かれるハイドロキシルア
パタイトも同様の大きな粒子径を保ち、カラムク
ロマトグラフにおいて従来法によるハイドロキシ
ルアパタイトに可能な展開溶出液流速の10倍に及
ぶ流速が可能となつた。
上記現象は本発明者も当初全く予想しなかつた
ところであるが、この結果から、その生成機作は
次の如く考えられる 即ち、ハイドロキシルアパタイトの前駆体であ
る燐酸カルシウム沈殿の結晶成長が、その際の温
度により強く影響されることである。
ところであるが、この結果から、その生成機作は
次の如く考えられる 即ち、ハイドロキシルアパタイトの前駆体であ
る燐酸カルシウム沈殿の結晶成長が、その際の温
度により強く影響されることである。
燐酸カルシウム沈殿はその生成時の温度が、25
℃より上昇するに従つて次第に大きなブラツシヤ
イト（brushite）CaHPO4・2H2O結晶として成
長するが、45℃を頂点として、それ以上では逆に
ブラツシヤイト結晶は次第に微小化する。そし
て、80℃近辺から上では、微小ブラツシヤイトは
脱水されて微小なモネタイト（monetite）
CaHPO4の結晶となる。更に、温度が上昇して90
℃以上になると、生成燐酸カルシウム沈殿の粒子
径は突如として増大且つ硬化する。90℃を越える
温度での不連続的な変化は、この高温では発生期
の極微小ブラツシヤイト結晶が直ちに脱水されて
モネタイトになると同時に凝結して強固な粒子を
形成するものと考えられる。80〜90℃で生成した
モネタイト結晶、或いは市販のモネタイトにはこ
の凝結能はなく、微細結晶に止まる。
℃より上昇するに従つて次第に大きなブラツシヤ
イト（brushite）CaHPO4・2H2O結晶として成
長するが、45℃を頂点として、それ以上では逆に
ブラツシヤイト結晶は次第に微小化する。そし
て、80℃近辺から上では、微小ブラツシヤイトは
脱水されて微小なモネタイト（monetite）
CaHPO4の結晶となる。更に、温度が上昇して90
℃以上になると、生成燐酸カルシウム沈殿の粒子
径は突如として増大且つ硬化する。90℃を越える
温度での不連続的な変化は、この高温では発生期
の極微小ブラツシヤイト結晶が直ちに脱水されて
モネタイトになると同時に凝結して強固な粒子を
形成するものと考えられる。80〜90℃で生成した
モネタイト結晶、或いは市販のモネタイトにはこ
の凝結能はなく、微細結晶に止まる。
次にかくして生成させた燐酸カルシウム沈殿を
アルカリ中で加熱することによつてハイドロキシ
ルアパタイトに転移させるのであるが、従来、こ
の際、原材料の塩化カルシウム（CaCl2）１モル
に対し、１モル以上の割合の大量のアルカリが添
加されていた。
アルカリ中で加熱することによつてハイドロキシ
ルアパタイトに転移させるのであるが、従来、こ
の際、原材料の塩化カルシウム（CaCl2）１モル
に対し、１モル以上の割合の大量のアルカリが添
加されていた。
本発明者はこれについても吟味を加えた結果、
アルカリ添加量を低減することが可能であり、原
材料のCaCl21モルに対して0.4〜0.6モルの割合、
最も好ましくは0.5モルの割合で苛性ソーダ
（NaOH）を添加するのが良いことを見出した。
アルカリ添加量を低減することが可能であり、原
材料のCaCl21モルに対して0.4〜0.6モルの割合、
最も好ましくは0.5モルの割合で苛性ソーダ
（NaOH）を添加するのが良いことを見出した。
従来の方法では過剰のアルカリを除去するため
に大量の水乃至は燐酸塩緩衝液による洗浄を必要
としたが、本発明者がここに提案する方法による
時は製品の洗浄・仕上が著しく簡易化されるもの
である。
に大量の水乃至は燐酸塩緩衝液による洗浄を必要
としたが、本発明者がここに提案する方法による
時は製品の洗浄・仕上が著しく簡易化されるもの
である。
又製品のハイドロキシルアパタイトは従来、燐
酸塩緩衝液中に貯蔵されてきた。本発明の実施の
態様に於ても、勿論これを利用もするが、更に本
発明者はより便宜な態様をもこれに加えるもので
ある。
酸塩緩衝液中に貯蔵されてきた。本発明の実施の
態様に於ても、勿論これを利用もするが、更に本
発明者はより便宜な態様をもこれに加えるもので
ある。
即ち、生成したハイドロキシルアパタイトを沸
騰温度以上220℃に至る温度で加熱乾燥しても、
分離剤としての良好な性能を保持したままで乾燥
粉粒体を得られることを見出した。
騰温度以上220℃に至る温度で加熱乾燥しても、
分離剤としての良好な性能を保持したままで乾燥
粉粒体を得られることを見出した。
乾燥製品は貯蔵・輸送に多大な便宜を与えるも
のである。
のである。
［実施例及び比較例］
以下、実施例及び比較例によつて、実施の態様
とその効果を具体的に示す。
とその効果を具体的に示す。
比較例
0.5M（モル濃度）CaCl2水溶液及び0.5M
Na2HPO4水溶液の各々２を用意し、各々を毎
分2.5mlの割合で、所望の一定温度に保ち、且つ
可及的緩慢に撹拌しつつある１の0.5M NaCl
水溶液中に注入する。注入の間中混合溶液の温度
を上記一定値に維持せしめる。
Na2HPO4水溶液の各々２を用意し、各々を毎
分2.5mlの割合で、所望の一定温度に保ち、且つ
可及的緩慢に撹拌しつつある１の0.5M NaCl
水溶液中に注入する。注入の間中混合溶液の温度
を上記一定値に維持せしめる。
所望の一定温度として、25，40，45，55，70，
85及び95℃の各温度を採り上げて実験した。各実
験温度での操作によつて生成した燐酸カルシウム
沈殿を反応溶液から採取し、それぞれについて充
分に水洗し、５の0.25M NaOHに懸濁し、撹
拌しつつ１時間煮沸する。得られたハイドロキシ
ルアパタイトを70℃の温湯で良く洗い、次いで
10mM燐酸塩緩衝液（PH6.9）で洗つた後、同じ
緩衝液中に貯蔵する。
85及び95℃の各温度を採り上げて実験した。各実
験温度での操作によつて生成した燐酸カルシウム
沈殿を反応溶液から採取し、それぞれについて充
分に水洗し、５の0.25M NaOHに懸濁し、撹
拌しつつ１時間煮沸する。得られたハイドロキシ
ルアパタイトを70℃の温湯で良く洗い、次いで
10mM燐酸塩緩衝液（PH6.9）で洗つた後、同じ
緩衝液中に貯蔵する。
各温度で生成された燐酸カルシウム由来のハイ
ドロキシルアパタイトの静止沈殿１mlを底にナイ
ロン網を置いた内径8.5mmのガラス円筒に充填し、
10mM燐酸塩緩衝液を水柱80cmの圧力下で通過さ
せてその流速を測定すると共に、ハイドロキシル
アパタイト層の落ち着き高さを観測し、その占め
る充填層体積Ｖ（ml）を計算した。
ドロキシルアパタイトの静止沈殿１mlを底にナイ
ロン網を置いた内径8.5mmのガラス円筒に充填し、
10mM燐酸塩緩衝液を水柱80cmの圧力下で通過さ
せてその流速を測定すると共に、ハイドロキシル
アパタイト層の落ち着き高さを観測し、その占め
る充填層体積Ｖ（ml）を計算した。
なお、上記流速測定値から水柱１cm圧、充填層
高１cm当りの値を計算し、これを基準化流速Ｕ
（ml／min／cm／cmHH）で示す。
高１cm当りの値を計算し、これを基準化流速Ｕ
（ml／min／cm／cmHH）で示す。
また、10mM燐酸塩緩衝液に仔牛胸腺DNAを
100μｇ／mlの濃度に含む溶液を水柱80cmの圧力
下で流し、カラムからの排出液中にDNAが検知
される迄の通液量からDNA吸着量Ｃ（mg）を算出
した。
100μｇ／mlの濃度に含む溶液を水柱80cmの圧力
下で流し、カラムからの排出液中にDNAが検知
される迄の通液量からDNA吸着量Ｃ（mg）を算出
した。
各ハイドロキシルアパタイトの前駆体である燐
酸カルシウム沈殿を生成した温度を横軸に取り、
対応するハイドロキシルアパタイト試料による落
ち着き充填層体積Ｖ、基準化流速Ｕ、並びに
DNA吸着量Ｃを縦軸に取つて画いたグラフが第
１図である。
酸カルシウム沈殿を生成した温度を横軸に取り、
対応するハイドロキシルアパタイト試料による落
ち着き充填層体積Ｖ、基準化流速Ｕ、並びに
DNA吸着量Ｃを縦軸に取つて画いたグラフが第
１図である。
図に見る通り落着充填層体積Ｖ、ならびに基準
化流速Ｕが、前駆体である燐酸カルシウムの生成
温度によつて大きく異なることが明らかとなつ
た。
化流速Ｕが、前駆体である燐酸カルシウムの生成
温度によつて大きく異なることが明らかとなつ
た。
そして45℃および95℃で生成した燐酸カルシウ
ムからのハイドロキシルアパタイト（以下それぞ
れH45，H95と略記）で極大が見られる。
ムからのハイドロキシルアパタイト（以下それぞ
れH45，H95と略記）で極大が見られる。
殊に流速に於て大巾な違いが生じ、チセリウス
が提示し、従来用いられてきた室温付近の25℃で
生成された燐酸カルシウムからのハイドロキシル
アパタイト（以下H25と略記）のそれの10倍にも
達つしている。
が提示し、従来用いられてきた室温付近の25℃で
生成された燐酸カルシウムからのハイドロキシル
アパタイト（以下H25と略記）のそれの10倍にも
達つしている。
これはH45，H95が粒子径が大きく、しかもカ
ラム充填に於て、殆ど圧縮されないことを示唆す
る。一方DMA吸着量は70〜85℃生成燐酸カルシ
ウムからのハイドロキシルアパタイトに於て低い
がそれ以外は殆ど変わらず、特に本発明で焦点と
なつている45℃と95℃は25℃の場合と同等以上の
能力を保有ししていることが判る。
ラム充填に於て、殆ど圧縮されないことを示唆す
る。一方DMA吸着量は70〜85℃生成燐酸カルシ
ウムからのハイドロキシルアパタイトに於て低い
がそれ以外は殆ど変わらず、特に本発明で焦点と
なつている45℃と95℃は25℃の場合と同等以上の
能力を保有ししていることが判る。
なお又、H25，H45及びH95の各ハイドロキシ
ルアパタイトを充填したカラムについて蛋白質と
して仔牛血清アルブミンを、RNAとして酵母リ
ボ核酸を、DNAとして仔牛胸腺デオキシリボ核
酸を展開した成績を第２図に示すが、H45，H95
は両者共に従来法のH25と変わらない分離・分画
精度を達することが確認される。
ルアパタイトを充填したカラムについて蛋白質と
して仔牛血清アルブミンを、RNAとして酵母リ
ボ核酸を、DNAとして仔牛胸腺デオキシリボ核
酸を展開した成績を第２図に示すが、H45，H95
は両者共に従来法のH25と変わらない分離・分画
精度を達することが確認される。
実施例 １
0.5M（モル濃度）CaCl2と0.5M Na2HPO4の水
溶液を各２用意し、45℃に保つて可及的緩慢に
撹拌しつつある１の0.5M NaCl水溶液中に
各々毎分2.5mlの割合で注入して混合、反応させ
る。生成した燐酸カルシウム（ブラツシヤイト）
の大きな結晶をよく水洗して１の水に懸濁し、
100mlの10M NaOHを加えて１時間煮沸する。
得られたハイドロキシルアパタイトを水及び燐酸
緩衝液で良く洗浄し、使用迄そのまま貯蔵する。
溶液を各２用意し、45℃に保つて可及的緩慢に
撹拌しつつある１の0.5M NaCl水溶液中に
各々毎分2.5mlの割合で注入して混合、反応させ
る。生成した燐酸カルシウム（ブラツシヤイト）
の大きな結晶をよく水洗して１の水に懸濁し、
100mlの10M NaOHを加えて１時間煮沸する。
得られたハイドロキシルアパタイトを水及び燐酸
緩衝液で良く洗浄し、使用迄そのまま貯蔵する。
実施例 ２
0.5M（モル濃度）CaCl2と0.5M Na2HPO4の水
溶液を各２用意し、95〜100℃に保つて可及的
緩慢に撹拌しつつある１の0.5M NaCl水溶液
中に各々毎分2.5mlの割合で注入して混合、反応
させる。生成した燐酸カルシウム（モネタイト）
の大きく硬い粒子をよく水洗して１の水に懸濁
し、100mlの5M NaOHを加えて１時間煮沸す
る。得られたハイドロキシルアパタイトは水で洗
浄し、貯蔵する。
溶液を各２用意し、95〜100℃に保つて可及的
緩慢に撹拌しつつある１の0.5M NaCl水溶液
中に各々毎分2.5mlの割合で注入して混合、反応
させる。生成した燐酸カルシウム（モネタイト）
の大きく硬い粒子をよく水洗して１の水に懸濁
し、100mlの5M NaOHを加えて１時間煮沸す
る。得られたハイドロキシルアパタイトは水で洗
浄し、貯蔵する。
実施例 ３
実施例２と同様に操作して得た湿つたハイドロ
キシルアパタイトを加熱し、乾燥する。
キシルアパタイトを加熱し、乾燥する。
最終温度を220℃に至らしめ、乾燥粉末を得る。
(3) 発明の効果
本発明の特許請求の範囲１、並びに２、記載の
方法によれば、生体高分子物質の分離用クロマト
グラフ充填剤として優れた分離・分画精度を持
ち、しかも、高い展開液流速が可能なことによつ
て迅速に作業を進められる、分離用ハイドロキシ
ルアパタイトが調製できる。
方法によれば、生体高分子物質の分離用クロマト
グラフ充填剤として優れた分離・分画精度を持
ち、しかも、高い展開液流速が可能なことによつ
て迅速に作業を進められる、分離用ハイドロキシ
ルアパタイトが調製できる。
第１図はハイドロキシルアパタイト前駆体であ
る燐酸カルシウムを生成する際の温度とそれから
導かれたハイドロキシルアパタイトの性能との関
係を示す。 図中Ｖ及びＣはハイドロキシルアパタイト静止
沈殿１ml当りのカラム充填後の体積（ml）並びに
吸着DNA量（mg）をそれぞれ示し、Ｕは展開液
基準化流速（ml／min／cm／cmHH）を示す。第
２図はH45，H95並びに比較としてH25を充填し
たカラムによる仔牛血清アルブミン（Ｐ）、酵母
リボ核酸（Ｒ）及び仔牛胸腺デオキシリボ核酸
（Ｄ）についてのクロマト分画パターンを示す。
る燐酸カルシウムを生成する際の温度とそれから
導かれたハイドロキシルアパタイトの性能との関
係を示す。 図中Ｖ及びＣはハイドロキシルアパタイト静止
沈殿１ml当りのカラム充填後の体積（ml）並びに
吸着DNA量（mg）をそれぞれ示し、Ｕは展開液
基準化流速（ml／min／cm／cmHH）を示す。第
２図はH45，H95並びに比較としてH25を充填し
たカラムによる仔牛血清アルブミン（Ｐ）、酵母
リボ核酸（Ｒ）及び仔牛胸腺デオキシリボ核酸
（Ｄ）についてのクロマト分画パターンを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 塩化カルシウム溶液と第二燐酸ナトリウム溶
液とを40℃乃至50℃の温度範囲、最も好ましくは
45℃の温度において混合し、得られる燐酸カルシ
ウム沈殿をアルカリ中で加熱してハイドロキシル
アパタイトとすることを特徴とする分離用ハイド
ロキシルアパタイトの製法。 ２ 塩化カルシウム溶液と第二燐酸ナトリウム溶
液とを90℃乃至100℃の温度範囲、最も好ましく
は95℃の温度において混合し、得られる燐酸カル
シウム沈殿をアルカリ中で加熱してハイドロキシ
ルアパタイトとすることを特徴とする分離用ハイ
ドロキシルアパタイトの製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61015900A JPS62176906A (ja) | 1986-01-29 | 1986-01-29 | 分離用ハイドロキシルアパタイトの製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61015900A JPS62176906A (ja) | 1986-01-29 | 1986-01-29 | 分離用ハイドロキシルアパタイトの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62176906A JPS62176906A (ja) | 1987-08-03 |
| JPH0479964B2 true JPH0479964B2 (ja) | 1992-12-17 |
Family
ID=11901653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61015900A Granted JPS62176906A (ja) | 1986-01-29 | 1986-01-29 | 分離用ハイドロキシルアパタイトの製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62176906A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0624963B2 (ja) * | 1989-08-01 | 1994-04-06 | 東亞合成化学工業株式会社 | ヒドロキシアパタイトの製造方法 |
| JP5506190B2 (ja) * | 2008-12-26 | 2014-05-28 | 愛知県 | 醸造酒用タンパク質除去剤 |
-
1986
- 1986-01-29 JP JP61015900A patent/JPS62176906A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62176906A (ja) | 1987-08-03 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |