JPH0488997A - モノクローナル抗体、これを産生するハイブリドーマ細胞株およびこれを用いた標識法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、モノクローナル抗体とこれを産生するハイ
ブリドーマ細胞株、およびこれを用いる標識法に関する
ものである。さらに詳しくは、この発明は、バチルス・
ステアロサーモフィラス（以下Ｂ、Ｓ、菌と略記する）
由来のジアホラーゼに対するモノクローナル抗体と、こ
れを特異的に産生ずるハイブリドーマ細胞株、およびこ
のモノクローナル抗体を用いたＢ、Ｓ、菌由来ジアホラ
ーゼの標識法に関するものである。

（従来の技術） 従来より、酵素と抗体を結合させ酵素標識抗体を作成す
るためには、たとえばグルタルアルデヒドのようなアミ
ノ基に三機能性化学試薬を用いて酵素および抗体の各々
が有するアミノ基を架橋する方法（Ｓ、＾Ｖｒａｌｉｅ
ａＳ、Ｉ１１＋１ｕｎＯＣｈｅｌｌｉＳｔｒ１１１．６
．４３−５２、１９６９）、あるいは酵素のアミノ基と
、抗体を還元することにより生ずるチオール基とを、１
分子中にアミノ基と反応する基とチオール基に反応する
基を有する化学試薬（たとえばＮ−スクシニミジル・マ
レイミドカルボキシレート）を用いて架橋する方法（石
川能、酵素免疫測定法、第３版、医学書院）がある、ま
た、酵素のチオール基と抗体のチオール基を用いて、チ
オール基に対して三機能的な試薬（たとえばオルト・フ
ェニレンジマレイミドなど）を用いて架橋する方法も知
られている。

さらに近年、二重特異性抗体を用いた酵素標識抗体が作
成されるようになってきており、たとえば、抗ウレアー
ゼ抗体と抗コリオゴナドトロピン抗体を細胞融合により
二重特異性抗体とし、この抗ウレアーゼ抗体にウレアー
ゼを結合させたウレアーゼ標識抗体（Ｈ，Ｔａｋａｈａ
ｓｈｉ、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｎ、３４゜１６９３−１６９
８．１９８８）や、同様の二重特異性抗体を用いたホー
スラディシュ・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体（
Ｈ，Ｒ，５ｕｒｅｓｈ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、　８３７９８９−７９９
３．１９８６）等が知られている。

ところで、ジアホラーゼはニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドやニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸による色素の還元反応を触媒する酵素であり、色素
の還元にともない色の変化が発生するため、たとえば免
疫学的組織測定や組織染色のための標識として用いた場
合、その検出が極めて容易であるという優れた特徴を有
している。

なかでも、好熱菌であるＢ、Ｓ、菌から得られるジアホ
ラーゼは、上記の特徴に加え、熱安定性に優れていると
いう利点を有しており、標識酵素として広範な利用が期
待されている。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、このＢ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼは、所
与の測定物質に対する抗体と化学的に結合させて酵素標
識抗体を作成した場合、その酵素活性が約３０％にまで
激減し、十分な感度が得られないという問題がある。そ
のため、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼは、その優れた特
徴にもかかわらず、酵素免疫測定法や組織染色等に十分
に利用されるには至っていない。

この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたもので
あり、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼを標識酵素として酵
素標識二重特異性抗体を作成する場合、その酵素活性を
８０％以上保持させることのできるＢ、Ｓ、菌由来ジア
ホラーゼに対するモノクローナル抗体を提供することを
目的としている。まなこの発明は、上記モノクローナル
抗体の産性能を有するハイブリドーマ細胞株およびＢ、
Ｓ、菌由来ジアホラーゼ標識法を提供することを目的と
してもいる。

（課題を解決するための手段） この発明は、上記の課題を解決するものとして、バチル
ス・ステアロサーモフィラス由来のジアホラーゼに免疫
した動物より調製したリンパ球とミエローマ細胞とを融
合して得たハイブリドーマより産生させてなることを特
徴とするバチルス・ステアロサーモフィラス由来のジア
ホラーゼ詩興反応性のモノクローナル抗体を提供する。

またこの発明は、このモノクローナル抗体を特異的に産
生ずるハイブリドーマ細胞株およびこのモノクローナル
抗体と測定物質に対する抗体とを化学的に架橋させるこ
とを特徴とする標識法を提供する。

以下、この発明について詳しく説明する。

この発明のモノクローナル抗体は、上記の通り、Ｂ、Ｓ
、菌由来ジアホラーゼを免疫した動物から調製したリン
パ球と、ミエローマ細胞とを融合することにより得なハ
イブリドーマを選択、培養することにより採取すること
ができるが、生産効率の点からは、上記ハイブリドーマ
のうちＢ、Ｓ。

菌由来ジアホラーゼに対する抗体を特異的に産生ずる細
胞を選別し、これをクローン化して細胞株としたうえで
、この細胞株の培養によりＢ、Ｓ。

菌由来ジアホラーゼのモノクローナル抗体を得るのが好
ましい。

このような細胞株の作成とモノクローナル抗体の採取法
、およびそのモノクローナル抗体を用いるＢ、Ｓ、菌由
来ジアホラーゼ標識法は以下の通り行うことができる。

（１）　　Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対するモノク
ローナル抗体を特異的に産生ずるハイブリドーマ細胞株
の作成： まず、ハイブリドーマを作成するため、Ｂ、Ｓ。

菌由来ジアホラーゼ抗原に免疫した動物のリンパ球ト、
このリンパ球と融合させるミエローマ（骨髄ｌｌｌ１１
１Ｉ胞）を用意する。

このうち、リンパ球を得るには、市販のＢ、Ｓ。

菌由来ジアホラーゼ（生化学工業社製）を抗原として哺
乳動物、好ましくはマウスまたはラットに免疫する。

抗原の使用量、投与部位、アジュバントの使用等、免疫
の方法は従来の抗血清を得る方法に準ずればよい。例え
ば、マウスを用いる場合、マウス１匹あたり１回につき
０．００１〜１０１ｇ、好ましくは０．０１〜ｌｌ１ｇ
のＢ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼを、初回はアジュバント
（例えば、フロイントの完全アジュバント）とよく混合
して、皮下、腹腔内等に投与し、２週間以上経過後、再
びアジュバント（例えば、フロイントの不完全アジュバ
ント）をよく混合して、皮下、腹腔内等に投与する。さ
らに、２週間以上経過後、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼ
のみを静脈内、皮下、腹腔内等に投与して、十分免疫す
る。このようにして免疫された動物を好ましくは最終免
疫から２〜４日後に殺し、リンパ球を採取する。リンパ
球調製には、肺臓、リンパ節、抹消血等が用いられる。

このリンパ球を培養液に懸濁状態にほぐしておく。

一方、ミエローマは、被免疫動物と同じ種由来のものを
使用することが好ましい。さらに、そのミエローマは薬
剤抵抗性の変異株であることが好ましく、未融合のミエ
ローマがハイブリドーマ選択培地で生育しないものが好
ましい。最も一般には８−アザグアニン抵抗性の細胞ラ
インが用いられる。これは、ヒポキサンチン−グアニン
−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈｙｐｏｘａｎ
ｔ　ｉｎｇｕａｎｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙ
ｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が欠損しており、選択培
地の一種ヒポキサンチンーアミノブテリンーチミジン（
ＨＡＴ）培地に生育できない。また、使用するミエロー
マ自身が抗体を分泌しないものが望ましい０以上の点か
ら、例えば、市販のマウスミエローマＰ３・Ｘ６３・Ａ
ｇ８・６・５・３（Ｘ６３・６・５・３）、Ｐ３・Ｘ６
３・Ａｇ８・Ｕｌ　（Ｐ３Ｕ１）、ラットミエローマ２
１０　・ＲＣＹ３・Ａｇｌ・２・３等を用いるのが好ま
しい。

このミエローマを血清、好ましくは牛胎児血清を含有す
るイーグル最少培地（ＭＥＭ）ＲＰＭ　Ｉ　１６１０培
地（ＲＰＭ　Ｉ　１６４０）等の培地中で培養する。

次に、ＭＥＭ、　ＲＰＭ　Ｉ　１６４Ｇ等の培地に上記
で得たリンパ球およびミエローマをおのおの懸濁し、混
合する。このときの混合比は任意に選択できるが、好ま
しくはリンパ球：ミエローマが細胞数で１＝１〜２０：
１、好ましくは５：１〜１ｏ：１の比率を用いればよい
、混合した細胞は、融合促進剤を用いて融合を行う、融
合方法としては、例えば、イムノロジカルメソッズ２巻
、２８５頁（Ｉｉｍｕｎｏｌｏｏｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　Ｖｏｌ、ＩＩ　、　１９８１゜＾ｃａｄｅｎｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ）に従って行えばよい、融合促進剤として
は、種々の高分子物質やウィルス等を用いることができ
るが、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　
、センダイウィルスを用いればよい、ＰＥＧは、平均分
子量４００〜２０，０００ノものが使用できるが、好ま
しくはｉ、ｏｏｏ〜７，５００のものを用いればよい。

その使用濃度は、４０〜６０ｖｏ１．％が好ましい。

融合させた細胞は、洗浄して融合促進剤を除去し、５〜
１５ｖｏ１．％の血清を含むＭＥＭまたはＲＰ　Ｍ　Ｉ
　１６４Ｇ培地に懸濁し、９６穴培養血等に０．５〜５
Ｘ１０’／穴の割合で分注する。さらに、各人に選択培
地（例えば、ＨＡＴ培地）を加え、適宜選択培地を交換
すれば、１０〜１４日後には未融合のミエローマは死滅
し、バイブリドーマのみ生育する。因に、リンパ球は長
時間生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）では生育できず、やは
り１０〜１４日後には死滅する。

次に、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対するモノクロー
ナル抗体を特異的に産生ずるハイブリドーマを検索、選
別する。そのための方法としてはＥＬＩＳＡ法を用いる
ことができる。すなわち、たとえば市販のＦ、ＬＩＳＡ
用プレート等の固相に、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼを
吸着させ、これにハイブリドーマ上清を加え、洗浄後、
市販の免疫動物免疫グロブリンに対する標識抗体（たと
えば、ＨＲＰ標識抗体あるいは１２５Ｉ標識抗体）を添
加する。その結果ハイブリドーマ上清中にＢ、Ｓ。

菌由来ジアホラーゼに対する抗体が存在する場合には、
それが固相のＢ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに結合し、さ
らに免疫グロブリンに対する標識抗体がこれに結合して
、標識によるシグナルが得られる。一方、上清中にＢ、
Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対する抗体が存在しない場合
には、固相のＢ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼには何も結合
せず、従ってシグナルも得られない、このように、標識
によるシグナルの有無を手がかりとして、ハイブリドー
マの選択を行なうことができる。

次いで、このようにして得たＢ、Ｓ、菌由来ジアホラー
ゼに対するモノクローナル抗体を特異的に産生ずるハイ
ブリドーマを選択的に培養することにより、ハイブリド
ーマ細胞株を創製することができる。

なお、この方法に従って予めＢ、Ｓ、菌由来ジアホラー
ゼで免疫したマウスのＩＩＩＩ！ｍリンパ球とマウスの
ミエローマ細胞を融合して創製したハイブリドーマ細胞
株の１種を、ハイブリドーマＵＤＩＨ２Ｆ６と命名した
。この株を、平成２年７月１１日に通商産業省微生物工
業研究所に寄託の手続を行い　微工研菌寄第１１６０１
号（ＦＥＲＮ　Ｐ−１１６０１）として受は入れられた
。このＵＤＩＨ２Ｆ６は、−１２０℃以下でほぼ永久的
に凍結保存が可能であってたえず頒布可能な状態に置か
れている。

このハイブリドーマＵＤＩＨ２Ｆ６は通常用いられる培
地で増殖可能である。例えば、牛胎児血清を５〜２０％
含有するＲＰＭ１１６４０又はＭＥＭを培地として用い
　３７℃、炭酸ガス濃度５ｖｏ１．％含有空気下でよく
増殖する。また、ミエローマの造腫瘍性をも有している
ので、生体内（例えば、同系の動物、ヌードマウスなど
）で増殖し、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対するモノ
クローナル抗体を産生ずることができる。

（２）　　Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対するモノク
ローナ抗体の多量採取： 上記の通り作成したハイブリドーマ細胞株を培養するこ
とにより、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対するモノク
ローナル抗体を大量に採取することができる。このモノ
クローナル抗体の採取方法には、大きく分けて２通りの
方法がある。１つは、培地を用い、フラスコ等の培養容
器で培養し、その上澄液から抗体を採取する方法である
。例えば、５〜１０ｖｏ１．％の血清を含むＭＢＭまた
はＲＰＭ１１６４０培地に、０．５〜５Ｘ１０’個のハ
イブリドーマ細胞株を植えると、２〜４日で１０〜２０
倍に生育し、その培養後の上澄液から抗体を採取する方
法である。もう１つの方法は、このようにして培養容器
で培養したハイブリドーマ細胞株を、同系の動物に接種
する方法である。すなわち、ハイブリドーマ細胞株１０
５〜１０７個を同系の動物の皮下または腹腔内等に投与
し、７〜２０日後ハイブリドーマ細胞株が増殖し、腫瘍
が大きくなったときに、血清および腹水を採取する方法
である。腹腔内に投与する場合には、事前（３〜７日前
）に２．６，１０．１４−テトラメチルペンタデカン等
の鉱物油を投与すると、より多量の腹水が得られる。

このようにして得られた抗体は、必要に応じ精製して使
用することができる。たとえば硫安分画、イオン交換ク
ロマトグラフィー、プロティンＡを固定したアフィニテ
ィータロマドグラフィー等、通常タンパク質に適用され
うる手段を用いて精製することができる。

このようにして、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対する
モノクローナル抗体を容易に、かつ多量に得ることがで
きる。

（３）　モノクローナル抗体を用いる酵素標識二重特異
性抗体の作成： まず、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対する抗体と、測
定物質に対する抗体を、通常のタンパク質の架橋に用い
る化学試薬（たとえばＮ−スクシニミジル・マレイミド
カルボキシレート、あるいはオルト・フェニレンジマレ
イミドなど）を用いて架橋し、二重特異性抗体を作成す
る、さらにこの二重特異性抗体にＢ、Ｓ、菌由来ジアホ
ラーゼを１〜１００倍量、好ましくは２〜１０培量、１
）Ｈ４−１０、好ましくはｐＨ６〜８の範囲の緩衝液中
で混合し、タンパク分離に通常用いる方法（たとえば、
ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーなど）により
、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼ標識抗体を作成すること
ができる。

以下、実施例を示し、この発明について具体的に説明す
る。

実施例１ （ハイブリドーマの作成） Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対するモノクローナル抗
体を産生ずるハイブリドーマを作成した。

８週令のマウスＢａ１ｂ／ｃ（オリエンタルバイオサー
ビスより入手）に、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼ（生化
学工業より入手）を完全フロインドアジュバント（半回
化学より入手）と１＝１に混合乳化し、腹腔内に投与し
、３週間後に５０μｇのＢ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼを
静注して追加免疫し、３日後に肺臓を取り出し、ＭＢＭ
培地（半回化学より入手）にほぐして懸濁洗浄した。一
方、マウスのミエローマＸ６３・６・５・３（京都大学
より入手）を２日前から培養し、対数増殖期にある細胞
を遠心分離で集めた。胛細胞１０８個をミエローマＸ６
３・６・５・３・１０７と混合し、遠心によりベレット
した後、３７℃の水浴中で５０％のＰＥＧ４０００−Ｒ
ＰＭ１１６４０　（ギブコ社より入手）１ｍｌを徐々に
１分間で加え、さらに、１分間緩やかに撹拌後、９　ｍ
ｌのＲＰＭ１１６４０培地を徐々に加えて、Ｐ　Ｅ　０
４０００を稀釈した。遠心分離によりＰＥＧ溶液を除去
し、ベレットに１０％牛脂児血清を含むＨＡＴ培地２０
ｍ１を加えて、２皿の９６穴培養皿（コーニング社より
入手）の甚大に０．１ｍｌずつ分注した。４゜８．１１
１００計３回にわたり半分量の培養基を捨て、新しいＨ
ＡＴ培地を加えた。

その結果、１４日後には１９２大中６５穴でハイブリド
ーマの生育が観察された。

実施例２ （ハイブリドーマ細胞株の作成） Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対するモノクローナル抗
体を特異的に産生ずるハイブリドーマ細胞株を作成した
。

まず、実施例１で得たハイブリドーマのうち、Ｂ、Ｓ、
菌由来ジアホラーゼに対する抗体を産生ずる細胞株をＥ
ＬＩＳＡ法を用いて検索した。

まず、ＥＬＩＳＡプレート（コーニング社製）に５０ｎ
Ｎ炭酸ナトリウム衝撃液、ＥＩＨ９，６に溶解したＢ、
Ｓ’、菌由来ジアホラーゼを各式につき５０μｊづつ分
注し、２５℃の温度で２時間放１した。この液を除去し
た後、甚大に１．０％ＢＳＡ、０、１５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む２０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２
）を充満させ、２５℃の温度で１時間放置した。さらに
この液を除去し、０．２％トウイーン２０．０．２％Ｂ
ＳＡ、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０１Ｎリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）からなる洗浄液で各ウ
ェルをよく洗浄し、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼ固定化
プレートを作成した。

次いで、このプレートに実施例１で得たハイブリドーマ
の上清５０μｍを添加し、２５℃の温度で２時間放置し
た後、洗浄液で充分に洗浄し、ＨＲＰｉ！識ヤギ抗マウ
スＩｇＧ（フナコシより購入）１μｚ／１ｍｌを各式に
５０μｍ加え２５℃の温度で２時間放置した。さらに、
洗浄後、パーオキシダーゼ測定試薬（バイオラット社製
）５０μ」を加え、２５℃の温度で２０分間反応させ、
１０％５ＤＳ５０μｍの添加によりバーオキシンダーゼ
活性を停止させ、４１５ｎｉにおける吸光度（Ａ４１５
　）を測定した。また対照にはハイブリドーマ上滑のか
わりにＨＡＴ培地のみを反応させたものを用いた。

その結果、対照として用いた上清無添加時のシグナルに
比べ、高いシグナルを示した上清が得られた。この上清
の穴の株を選択し、限界稀釈法にてクローニングを行い
、モノクローンのハイブリドーマ細胞株ＵＤＩＨ２Ｆ６
を得た。

実施例３ （Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対するモノクローナル
抗体の採取） 実施例２で得たハイブリドーマ細胞株 ＵＤＩＨ２Ｆ６を培養し、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼ
に対するモノクローナル抗体を採取した。

まず、ＵＤＩＨ２Ｆ６を１０％牛脂児血清含有ＲＰ　Ｍ
　Ｉ　１６４０培地で培養し、細胞濃度が２Ｘ１０’細
胞／ｍｌに達した時点で培養物３００ｍ１を遠心分離し
、その上清から、５０％飽和硫安分画により粗抗体画分
を分離し、透析したのち、プロティンＡ−セファロース
（ＤＨ９，０）に吸着させ、クエン酸緩衝液（ｐＨ３，
０＞で溶出してＢ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対する抗
体（以下、ＵＤＩＡ２Ｆ６と記載する）６，４■を得た
。

次に、このＵＤＩＡ２Ｆ６をジアホラーゼ活性測定用試
薬系に添加してＢ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対するそ
の阻害度を測定した。すなわち、５００ｎＨ）リエタノ
ールアミンーＨＣｌ　（ｐＨ，７，０）６０μｊ　、５
ＩＩＭＮＡＤＨ６０μｊ）、５０ｍＨエチレンジアミン
四酢酸６０μｍ、５％セチルトリメチルアンモニウムプ
ロミド６０μｊ、およびＨ２Ｏ２００μｍからなる活性
測定用試薬系にＵＤＩＡ２Ｆ６を１００μｍ添加し、こ
れを３０℃の温度で３分間インキュベートした後、５１
Ｈニトロブル一テトラゾリウム６０μｍを添加し、３０
゛Ｃの温度で１０分間反応させ、 ｌＮＨＣｌ５０μｍを添加し反応を停止させて、５５０
ｎａにおける吸光度（Ａｓｓｏ）を測定した。

このようにして得られたＡｓｓ。（Ａｓｓ。

ＵＤＩＡ２Ｆ６）を、対照としてｔＪＤＩＡ２Ｆ６の代
わりに同量の緩衝液を添加した場合のＡ　ｓ　ｓ。

（Ａ　ｓｓｏ　ｃｏｎｔ　）で除し、阻害度を求めた。

その結果、Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼに対するＵＤＩ
Ａ２Ｆ６の阻害度は０．８であった。

実施例４ （ジアホラーゼ標識抗体の作成） まず、４．０■のＵＤＩＡ２Ｆ６を１００ｍＭクエン酸
緩衝液（ｐＨ，３，５）に透析し、ペプシン２５μｇを
添加して３７℃の温度で６時間インキュベートした０次
に、これをウトロゲルＡｃＡ４４カラムクロマトにかけ
、ＵＤＩＡ２Ｆ６Ｆ　（ａｂ′）２を分離し　さらにこ
れを還元して ＵＤＩＡ２Ｆ６Ｐａｂ’を得た。

また、抗ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）（メディックス・バ
イオゲミカ社より入手）に対しても上記同様の操作を行
い、ＣＥＡＦａｂ’を得た。

次に、ＵＤＩＡ２Ｆ６Ｆａｂ’　２．Ｏｑにオルトフェ
ニレンジマレイミド１００μｍを加え、３０’Ｃの温度
で１０分間インキュベートして、Ｆａｂ’のチオール基
にマレイミド基を導入し、このＵＤＩＡ２Ｆ６７レイミ
ド化Ｆａｂ’に抗ＣＥＡ抗体２．０■を加え、クルトロ
ゲルＡｃＡ４４カラムを用いてＢ、Ｓ、菌由来ジアホラ
ーゼとガン胎児性抗原に対する二重特異性抗体を得た。

そして、この二重特異性抗体にジアホラーゼを添加し、
ジアホラーゼ標識抗体を作成した。

実施例５ （Ｂ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼ標識抗体を用いた酵素免
疫測定） 実施例４で作成したＢ、Ｓ、菌由来ジアホラーゼ標識抗
ＣＥＡ抗体を用い、サンドウィッチ酵素免疫測定を行っ
た。

まず実施例２と同様の方法により抗ＣＥＡ抗体固定化Ｅ
ＬＩＳＡプレートを作成し、これに濃度０．５．１０お
よび２０μｆ／■のＣＥＡ５０μｍと上記Ｂ、Ｓ、菌由
来ジアホラーゼ標識抗ＣＥＡ抗体５０μｍを添加した。

なお、比較例としては上記抗体のかわりに、抗ＣＥＡ抗
体Ｆａｂ’とジアホラーゼをＮ−スクシニミジル−マレ
イミドカルボキシレートで直接架橋したもの（濃度１　
ｔｔ　ｔ　／　ｍＩ　）を５０μＪ添加した。

次にこのＥＬＩＳＡプレートを３７℃の温度で３時間イ
ンキュベートし、抗原抗体反応を行なわせた。すなわち
、グレートの液相を除去し、実施例２に記載と同様の洗
浄液でプレートを充分に洗浄した後、５０ｉ１リエタノ
ールアミンーＨＣＩ、５ｉＨＮＡＤＨ，０，５％セチル
トリメチルアンモニウムプロミド、および５１１Ｍエチ
レンジアミン四酢酸からなるジアホラーゼ測定溶液を加
え、３０分間反応させた後、ｌＮＨｅ１５０μｍを添加
して反応を停止させ、それぞれのＡ　ｓ　ｓ　ｏを測定
した。

その結果は、第１表および第１図に示した通り゛である
。

第 表 この第１表および第１図からも明らがな様に、この発明
の酵素標識二重特異性抗体を用いた酵素免疫測定は、比
較例として示した従来の酵素！！識抗体を用いる方法に
比べ、はるかに高精度でＣＢＡを検出、定量することが
可能であった。

もちろんこの発明は、以上の例によって限定されるもの
ではなく、その細部の手続きや操作、あるいはその適用
範囲等については様々な態様が可能であることは言うま
でもない。

（発明の効果） 以上詳しく説明した通り、この発明のモノクローナル抗
体により、Ｂ、Ｓ、菌由来のジアホラーゼを、その活性
をほとんど損うことなく広く酵素免疫測定や組織染色等
に有用な標識酵素として用いることが可能となる。しか
もこのモノクローナル抗体を特異的に産出するハイブリ
ドーマ細胞株の樹立により、Ｂ、Ｓ、菌由来のジアホラ
ーゼに対するモノクローナル抗体を多量に、かつ容易に
得ることが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、検体中のＣＢＡ量を酵素免疫的に測定した場
合の、ＣＢＡ量と吸光度との相関図である。 第 図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス・ステアロサーモフィラス由来のジアホ
   ラーゼに免疫した動物より調製したリンパ球とミエロー
   マ細胞とを融合して得たハイブリドーマより産生させて
   なることを特徴とするバチルス・ステアロサーモフィラ
   ス由来のジアホラーゼ特異反応性のモノクローナル抗体
   。
2. （２）請求項（１）記載のモノクローナル抗体産生ハイ
   ブリドーマ細胞株。
3. （３）請求項（１）記載のモノクローナル抗体と測定物
   質に対する抗体とを化学的に架橋させる標識法。