JPH0489569A - 劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物に対する特異抗体およびこの抗体を含有する癌診断用試薬 - Google Patents
劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物に対する特異抗体およびこの抗体を含有する癌診断用試薬Info
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- JPH0489569A JPH0489569A JP20274490A JP20274490A JPH0489569A JP H0489569 A JPH0489569 A JP H0489569A JP 20274490 A JP20274490 A JP 20274490A JP 20274490 A JP20274490 A JP 20274490A JP H0489569 A JPH0489569 A JP H0489569A
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
この発明は、劣性癌遺伝子Ｒｂの産生物に対する特異抗
体およびこの抗体を有効成分として含有する癌診断用試
薬に関するものである。
体およびこの抗体を有効成分として含有する癌診断用試
薬に関するものである。
なお、本明細書においては、アミノ酸およびペプチドは
アイユーピーエーシーーアイユービー生化学命名委員会
表示（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ ＣＢＮ）で採用された略記
法に基づいて表示し、例えば以下の略号を使用する。
アイユーピーエーシーーアイユービー生化学命名委員会
表示（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ ＣＢＮ）で採用された略記
法に基づいて表示し、例えば以下の略号を使用する。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基
Ａｒｇ ： Ｌ−アルギニン残基
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラキン残基
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Ｃｙｓ：Ｌ−ンステイン残基
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基
Ｇｌｙ：Ｌ−グリシン残基
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基
１１ｅ：Ｌ−イソロイシン残基
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基
Ｓｅｒ ： Ｌ−セリン残基
Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン残基
Ｔｒｐ：Ｌ−）リプトファン残基
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基
Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基
（従来の技術）
近年における遺伝子工学の進歩は目覚ましいものかあり
、発癌のメカニズムについても遺伝子レベルでの研究が
行われ、発癌に関係する遺伝子も次第に明らかにされつ
つある。この発癌に関係する遺伝子には癌を惹起する遺
伝子（優性癌遺伝子）と、癌を抑制する遺伝子（劣性癌
遺伝子）とがある。
、発癌のメカニズムについても遺伝子レベルでの研究が
行われ、発癌に関係する遺伝子も次第に明らかにされつ
つある。この発癌に関係する遺伝子には癌を惹起する遺
伝子（優性癌遺伝子）と、癌を抑制する遺伝子（劣性癌
遺伝子）とがある。
優性癌遺伝子に関連したペプチドまたは抗体については
、例えば特開昭６３−１４６８９７号公報、特開昭６３
−３１３５９６号公報等に記載された発明か知られてい
る。前者の発明は、ｍｙｃ、 ＨＰＶ、 ｈｓｔ、 ｒ
ａｓ。
、例えば特開昭６３−１４６８９７号公報、特開昭６３
−３１３５９６号公報等に記載された発明か知られてい
る。前者の発明は、ｍｙｃ、 ＨＰＶ、 ｈｓｔ、 ｒ
ａｓ。
ｌｙｎ、 ＴＧＦ、 ｆｏｓ、 ｒａｆ、およびＨＴＬ
Ｖの各癌遺伝子によってコードされる遺伝子産物のアミ
ノ酸配列の一部からなるペプチドであり、また後者の発
明は、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子産物と特異的に反応する抗体の
作製法に関するものであり、いずれの発明も劣性癌遺伝
子とは無関係である。
Ｖの各癌遺伝子によってコードされる遺伝子産物のアミ
ノ酸配列の一部からなるペプチドであり、また後者の発
明は、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子産物と特異的に反応する抗体の
作製法に関するものであり、いずれの発明も劣性癌遺伝
子とは無関係である。
一方、ヒトの劣性癌遺伝子については、第１染色体上に
２個、第３染色体上に２個、第５染色体上に１個、第１
１染色体上に４個、第１３染色体上に３個、および第２
２染色体上に２個存在することか知られている［バイオ
メゾイカ （ＢＩＯｍｅｄｉｃａ ） 、第３巻、第２号、第１３
８ページ、１９８８年］。その中で第１３染色体長腕の
１３ｑ１４領域でエステラーセＤ遺伝子の近傍に位置し
ていることかほぼ確実な網膜芽細胞腫（ｒｅｔｉｎｏｂ
ｌａｓｔｏｍａ ： Ｒｂ ）感受性遺伝子１ヒユマン
・ジェネテイックス （Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
）、第７２巻、第１６４ページ、１９８６年。以下この
遺伝子をＲｂ遺伝子と記載する］は、小児の網膜に発生
する癌に関係しているか、クローニングされ、しかもＤ
ＮＡの一次構造が決定された初めての劣性癌遺伝子とし
ても知られている。このＲｂ遺伝子に由来する蛋白質（
以下Ｒｂ蛋白質と記載する）は、２対の金属結合ドメイ
ンを有する９２８個のアミノ酸からなり、分子量は１１
０にダルトンであると推定されＥバイオメゾイカ（ＢＩ
Ｏｍｅｄｉｃａ） 、第３巻、第２号、第１３８ページ
、１９８８年、実験医学、第６巻、第５号、第４２９ペ
ージ、１９８８年およびネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ）
、第３２９巻、第６２４ページ、１９８７年］、核内リ
ン酸化蛋白をコードしていることが知られている（代謝
、第２６巻重時増刊号［癌’８９Ｊ、第６９ページ、１
９８９年）。
２個、第３染色体上に２個、第５染色体上に１個、第１
１染色体上に４個、第１３染色体上に３個、および第２
２染色体上に２個存在することか知られている［バイオ
メゾイカ （ＢＩＯｍｅｄｉｃａ ） 、第３巻、第２号、第１３
８ページ、１９８８年］。その中で第１３染色体長腕の
１３ｑ１４領域でエステラーセＤ遺伝子の近傍に位置し
ていることかほぼ確実な網膜芽細胞腫（ｒｅｔｉｎｏｂ
ｌａｓｔｏｍａ ： Ｒｂ ）感受性遺伝子１ヒユマン
・ジェネテイックス （Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
）、第７２巻、第１６４ページ、１９８６年。以下この
遺伝子をＲｂ遺伝子と記載する］は、小児の網膜に発生
する癌に関係しているか、クローニングされ、しかもＤ
ＮＡの一次構造が決定された初めての劣性癌遺伝子とし
ても知られている。このＲｂ遺伝子に由来する蛋白質（
以下Ｒｂ蛋白質と記載する）は、２対の金属結合ドメイ
ンを有する９２８個のアミノ酸からなり、分子量は１１
０にダルトンであると推定されＥバイオメゾイカ（ＢＩ
Ｏｍｅｄｉｃａ） 、第３巻、第２号、第１３８ページ
、１９８８年、実験医学、第６巻、第５号、第４２９ペ
ージ、１９８８年およびネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ）
、第３２９巻、第６２４ページ、１９８７年］、核内リ
ン酸化蛋白をコードしていることが知られている（代謝
、第２６巻重時増刊号［癌’８９Ｊ、第６９ページ、１
９８９年）。
Ｒｂ遺伝子か注目されているのは、この遺伝子が小児の
網膜芽細胞腫ばかりでなく、他の癌（例えば乳癌、肺小
細胞癌等）および腫瘍との関係が報告されたこと、さら
にはＲｂ蛋白質の検出により、癌診断の可能性が想定さ
れることによる。
網膜芽細胞腫ばかりでなく、他の癌（例えば乳癌、肺小
細胞癌等）および腫瘍との関係が報告されたこと、さら
にはＲｂ蛋白質の検出により、癌診断の可能性が想定さ
れることによる。
このような点からＲｂ遺伝子に由来する産生物を特異的
に識別する抗体に関する発明か開示されている（特開平
２−９８６６６号公報）。この発明は、１４個のアミノ
酸残基からなるペプチドを抗原として得られるＲｂ遺伝
子の産生物を特異的に識別する抗体に関するものである
。り一等［ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ）、第３２９巻
、第６４２ページ、１９８７年］か報告したクローニン
グされたＲｂ遺伝子のヌクレオチド配列から予想される
Ｒｂ蛋白質のアミノ酸配列と対比すれば、この従来発明
のペプチドは、Ｃ末端に存在する第９１５番目から第９
２８番目のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する
ペプチドであることが明らかである。また、これ以外に
もＲｂ蛋白質の推定アミノ酸配列のＮ末端から第２４８
番目から第２６２番目の１５個のアミノ酸配列からなる
ペプチド、同じく第３２０番目から第３３４番目の１５
個のアミノ酸配列からなるペプチド、および同しく第９
１４番目から第９２８番目の１５個のアミノ酸配列から
なるペプチドを抗原として抗体を作製した例［ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３３４巻、第１２４ページ、１
９８８年］が知られている。
に識別する抗体に関する発明か開示されている（特開平
２−９８６６６号公報）。この発明は、１４個のアミノ
酸残基からなるペプチドを抗原として得られるＲｂ遺伝
子の産生物を特異的に識別する抗体に関するものである
。り一等［ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ）、第３２９巻
、第６４２ページ、１９８７年］か報告したクローニン
グされたＲｂ遺伝子のヌクレオチド配列から予想される
Ｒｂ蛋白質のアミノ酸配列と対比すれば、この従来発明
のペプチドは、Ｃ末端に存在する第９１５番目から第９
２８番目のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する
ペプチドであることが明らかである。また、これ以外に
もＲｂ蛋白質の推定アミノ酸配列のＮ末端から第２４８
番目から第２６２番目の１５個のアミノ酸配列からなる
ペプチド、同じく第３２０番目から第３３４番目の１５
個のアミノ酸配列からなるペプチド、および同しく第９
１４番目から第９２８番目の１５個のアミノ酸配列から
なるペプチドを抗原として抗体を作製した例［ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３３４巻、第１２４ページ、１
９８８年］が知られている。
（発明が解決しようとする課題）
一般に、癌細胞であるか否かを免疫学的に診断する場合
、摘出した細胞について種々の化学的処理を行い、癌細
胞、発癌又は癌抑制に関連する遺伝子によって産生され
る物質（例えば、Ｒｂ蛋白質等）を精製し、抗原抗体反
応に付する。しかしながら、精製処理中に目的とする物
質が化学的変化を受ける場合がある（例えば、末端から
一部分が遊離する等）。Ｒｂ蛋白質においてもプロテア
ーゼ処理等の精製処理によりＣ末端からアミノ酸残基の
いくつかが遊離することがあり、この場合には目的とす
る物質を正確に検出できず、その結果正確な診断が不可
能となる。従って、従来から上記のような精製処理によ
っても影響を受けずに目的とする物質を正確に検出し得
る方法または試薬が待望されていた。
、摘出した細胞について種々の化学的処理を行い、癌細
胞、発癌又は癌抑制に関連する遺伝子によって産生され
る物質（例えば、Ｒｂ蛋白質等）を精製し、抗原抗体反
応に付する。しかしながら、精製処理中に目的とする物
質が化学的変化を受ける場合がある（例えば、末端から
一部分が遊離する等）。Ｒｂ蛋白質においてもプロテア
ーゼ処理等の精製処理によりＣ末端からアミノ酸残基の
いくつかが遊離することがあり、この場合には目的とす
る物質を正確に検出できず、その結果正確な診断が不可
能となる。従って、従来から上記のような精製処理によ
っても影響を受けずに目的とする物質を正確に検出し得
る方法または試薬が待望されていた。
この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたもので
あり、従来のＲｂ遺伝子産生物に対する特異抗体とは異
なり、その精製処理によっても影響を受けることがない
アミノ酸配列からなるペプチドを抗原として得られる特
異抗体と、この特異抗体を有効成分として含有し、ヒ１
−Ｒｂ蛋白質のみを正確に検出することのできる癌診断
用試薬を提供することを目的としている。
あり、従来のＲｂ遺伝子産生物に対する特異抗体とは異
なり、その精製処理によっても影響を受けることがない
アミノ酸配列からなるペプチドを抗原として得られる特
異抗体と、この特異抗体を有効成分として含有し、ヒ１
−Ｒｂ蛋白質のみを正確に検出することのできる癌診断
用試薬を提供することを目的としている。
（課題を解決するための手段）
この発明は、上記の課題を解決するものとして、下記の
アミノ酸配列からなるペプチドを抗原として得ることを
特徴とする劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物に対する特異抗体と
、この特異抗体を有効成分として含有する癌診断用試薬
を提供する。
アミノ酸配列からなるペプチドを抗原として得ることを
特徴とする劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物に対する特異抗体と
、この特異抗体を有効成分として含有する癌診断用試薬
を提供する。
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇ １ｕ−Ｔｈｒ−Ｇ Ｉｎ
−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ以下、この発
明の構成について詳しく説明する。
−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ以下、この発
明の構成について詳しく説明する。
この発明においては、劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物の特異抗
体を得るために、Ｒｂ蛋白質の推定アミノ酸配列のＮ末
端から３４９番目のアミノ酸残基を基準にしてＣ末端方
向に１７個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有す
るペプチドを抗原として用いる。このようなアミノ酸配
列からなる抗原性ペプチドは、そのアミノ酸配列が上述
のいかなる従来例とも異なり、精製処理によっても末端
からアミノ酸残基の一部が遊離する等の化学変化を受け
ることがない。
体を得るために、Ｒｂ蛋白質の推定アミノ酸配列のＮ末
端から３４９番目のアミノ酸残基を基準にしてＣ末端方
向に１７個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有す
るペプチドを抗原として用いる。このようなアミノ酸配
列からなる抗原性ペプチドは、そのアミノ酸配列が上述
のいかなる従来例とも異なり、精製処理によっても末端
からアミノ酸残基の一部が遊離する等の化学変化を受け
ることがない。
このようなペプチドを調製するには、公知の常法により
化学的に合成することかできるが、その−例を示せば次
のとおりである。
化学的に合成することかできるが、その−例を示せば次
のとおりである。
自動ペプチド合成装置（ベックマン社製。システム９９
０Ｂ）を用いて固相法により所望のアミノ酸配列のペプ
チドを合成する。次いで７５％弗化水素／２５％アニソ
ール中で０℃、３０分間処理し、上記ペプチドを固相か
ら離脱させ、１ｍＭジチオスライトール含有０．０５Ｍ
酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ７，０）により平衡化した
ＳＰ−セファデックス（商標。ファルマシア社製）カラ
ム（２５×５００ｍ＋＋＋）に吸着させ、上記平衡化緩
衝液５００７ｎ！および１ｍＭジチオスライトール含有
０．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ７，０＞５００ｍ
１のグラジェントにより溶出させ、得られた分画の中か
らフルオロレスヵミンによりペプチド含有分画を検出し
て集め、この分画を濃縮する。
０Ｂ）を用いて固相法により所望のアミノ酸配列のペプ
チドを合成する。次いで７５％弗化水素／２５％アニソ
ール中で０℃、３０分間処理し、上記ペプチドを固相か
ら離脱させ、１ｍＭジチオスライトール含有０．０５Ｍ
酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ７，０）により平衡化した
ＳＰ−セファデックス（商標。ファルマシア社製）カラ
ム（２５×５００ｍ＋＋＋）に吸着させ、上記平衡化緩
衝液５００７ｎ！および１ｍＭジチオスライトール含有
０．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ７，０＞５００ｍ
１のグラジェントにより溶出させ、得られた分画の中か
らフルオロレスヵミンによりペプチド含有分画を検出し
て集め、この分画を濃縮する。
得られた濃縮物を３０％酢酸溶液で平衡化したセファデ
ックスＧ−１０（商標。ファルマシア社製）カラム（１
００Ｘ５００ ｍｍ）に吸着させ、上記と同様の方法に
よりペプチド含有分画を集めて濃縮し、乾固し所望のペ
プチドを得ることができる。
ックスＧ−１０（商標。ファルマシア社製）カラム（１
００Ｘ５００ ｍｍ）に吸着させ、上記と同様の方法に
よりペプチド含有分画を集めて濃縮し、乾固し所望のペ
プチドを得ることができる。
以上のようにしてこの発明の抗体を取得するための抗原
性ペプチドは得られるが、上記の方法に限定されるもの
ではなく、その他公知の化学的合成方法または通常の遺
伝子工学的方法によっても調製することができる。
性ペプチドは得られるが、上記の方法に限定されるもの
ではなく、その他公知の化学的合成方法または通常の遺
伝子工学的方法によっても調製することができる。
このようにして得られた抗原性ペプチドを用いて公知の
方法により抗体を製造するが、その−例を示せば次のと
おりである。メタ・マレイミドベンゾイル・Ｎ−ヒドロ
キシサクシニミド・エステルを用いる方法〔ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第７９巻、第２３３ヘー
シ、１９７６年〕またはカルボジイミド法〔サイエンス
（Ｓｉｅｎｃｅ） 、第１４４巻、第１３４４ページ、
１９６４年〕等によりキャリアー蛋白（例えばウシ血清
アルブミン、ブタチログロブリン等）と上記抗原性ペプ
チドとを結合させ、常法により〔例えば、必要に応じて
アジュバント（例えば、ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎ
ｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）とともに〕免疫用動物（例
えば、マウス、ウサギ、ラット等）に投与し、採血して
常法により抗血清を調製することができる。
方法により抗体を製造するが、その−例を示せば次のと
おりである。メタ・マレイミドベンゾイル・Ｎ−ヒドロ
キシサクシニミド・エステルを用いる方法〔ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第７９巻、第２３３ヘー
シ、１９７６年〕またはカルボジイミド法〔サイエンス
（Ｓｉｅｎｃｅ） 、第１４４巻、第１３４４ページ、
１９６４年〕等によりキャリアー蛋白（例えばウシ血清
アルブミン、ブタチログロブリン等）と上記抗原性ペプ
チドとを結合させ、常法により〔例えば、必要に応じて
アジュバント（例えば、ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎ
ｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）とともに〕免疫用動物（例
えば、マウス、ウサギ、ラット等）に投与し、採血して
常法により抗血清を調製することができる。
このようにして得られた抗血清から常法、たとえば硫酸
アンモニウム等による塩析法、ゲル濾過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、不溶化抗原法、プロティンＡ、Ｇ法
等により抗体を精製することができる。例えば、塩析法
で粗分面を分取し、不溶化抗原法により精製することが
できる。
アンモニウム等による塩析法、ゲル濾過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、不溶化抗原法、プロティンＡ、Ｇ法
等により抗体を精製することができる。例えば、塩析法
で粗分面を分取し、不溶化抗原法により精製することが
できる。
その他常法により免疫動物のリンパ球をミエローマと融
合させてハイブリドーマを形成せしめ、抗体を特異的に
産生ずるハイブリドーマをスクリーニングして分離し、
このハイブリトーマを培養してモノクロナール抗体を得
ることもできる。
合させてハイブリドーマを形成せしめ、抗体を特異的に
産生ずるハイブリドーマをスクリーニングして分離し、
このハイブリトーマを培養してモノクロナール抗体を得
ることもできる。
以上のようにして得られた抗体を少なくとも１μｇ／−
の濃度で他の必要な薬剤成分とともに滅菌水に溶解して
溶液状の癌診断薬とすることかできる。また粉末状の抗
体を１μｇつつアンプル等に密封し、使用時開封後水１
７ｎｌおよび他の必要な薬剤成分を添加して溶解し、診
断に使用する事もできる。さらに、高濃度で水に溶解し
、使用時に希釈して使用することもできる。
の濃度で他の必要な薬剤成分とともに滅菌水に溶解して
溶液状の癌診断薬とすることかできる。また粉末状の抗
体を１μｇつつアンプル等に密封し、使用時開封後水１
７ｎｌおよび他の必要な薬剤成分を添加して溶解し、診
断に使用する事もできる。さらに、高濃度で水に溶解し
、使用時に希釈して使用することもできる。
この発明の試薬は例えば次のように使用することができ
る。組織標本にこの発明の試薬を反応させ、結合した抗
体の有無または濃度を測定し、その組織中の抗原の有無
または濃度を検出する。あるいは検体から抗原を抽出し
、常法により電気泳動にかけ、のちウェスタン・プロッ
ト法により適宜膜に転移させ、分離した抗原の有無また
は濃度をこの発明の試薬を用いて検出することもできる
。
る。組織標本にこの発明の試薬を反応させ、結合した抗
体の有無または濃度を測定し、その組織中の抗原の有無
または濃度を検出する。あるいは検体から抗原を抽出し
、常法により電気泳動にかけ、のちウェスタン・プロッ
ト法により適宜膜に転移させ、分離した抗原の有無また
は濃度をこの発明の試薬を用いて検出することもできる
。
次に、劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物に対する特異抗体を作製
した実施例を以下に示す。
した実施例を以下に示す。
実施例 １
（ペプチドの調製）
劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物に対する特異抗体を得るための
抗原として用いるペプチドを調製した。
抗原として用いるペプチドを調製した。
ます、全自動ペプチド合成機（ファルマシアＫＬＢ社製
。Ｂｉｏｌｙｎｘ ４１７０）を用い、Ｆｍｏｃポリア
ミド活性エステル法「イー・クロス及びシェー・マイエ
ンホーフ７ （Ｅ 、 Ｇｒｏｓｓ ＆Ｊ、 Ｍｅ
ｉｅｎｈｏｆｅｒ）編、「す・ペプタイズ、７ｔｌ）’
／ス、シンセシス、バイオロジーＪ （Ｔｈｅ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ。
。Ｂｉｏｌｙｎｘ ４１７０）を用い、Ｆｍｏｃポリア
ミド活性エステル法「イー・クロス及びシェー・マイエ
ンホーフ７ （Ｅ 、 Ｇｒｏｓｓ ＆Ｊ、 Ｍｅ
ｉｅｎｈｏｆｅｒ）編、「す・ペプタイズ、７ｔｌ）’
／ス、シンセシス、バイオロジーＪ （Ｔｈｅ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ。
Ａｎａｌｙｓｉｓ、 ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、 Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ） 、第７巻、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ） 、１９８６年］により次のア
ミノ酸配列を有するペプチドを合成した。
ｏｇｙ） 、第７巻、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ） 、１９８６年］により次のア
ミノ酸配列を有するペプチドを合成した。
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＡｒｇＬｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ次いで９５％トリフ
ルオロ酢酸１５％チオアニソール中で２５℃の温度で１
時間処理し、上記ペプチドを固相から離脱させ、減圧濃
縮し、エーテルを添加してペプチドを沈澱させた。得ら
れた沈澱を１０％酢酸に溶解し、０．１％トリフルオロ
酢酸を含有する蒸留水で平衡化したＰｅｐＲＰＣ（商標
。
ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＡｒｇＬｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ次いで９５％トリフ
ルオロ酢酸１５％チオアニソール中で２５℃の温度で１
時間処理し、上記ペプチドを固相から離脱させ、減圧濃
縮し、エーテルを添加してペプチドを沈澱させた。得ら
れた沈澱を１０％酢酸に溶解し、０．１％トリフルオロ
酢酸を含有する蒸留水で平衡化したＰｅｐＲＰＣ（商標
。
ファルマシア社製）を充填したカラムに通液して吸着さ
せ、上記平衡化液および０．１％トリフルオロ酢酸含有
アセトニトリルのグラジェントにより溶出させ、得られ
た分画を濃縮乾固し、所望のペプチドを得た。
せ、上記平衡化液および０．１％トリフルオロ酢酸含有
アセトニトリルのグラジェントにより溶出させ、得られ
た分画を濃縮乾固し、所望のペプチドを得た。
なお、このようにして得られたペプチドを全自動ペプチ
ドシーケンサ−（ＡＢＩ社製。４７７Ａ）で分析した結
果、上記の配列と一致していた。
ドシーケンサ−（ＡＢＩ社製。４７７Ａ）で分析した結
果、上記の配列と一致していた。
実施例 ２
（抗体の調製および精製）
実施例１で得たペプチドを抗原として劣性癌遺伝子Ｒｂ
産生物に対する特異抗体を作製した。
産生物に対する特異抗体を作製した。
まず、実施例１で得たペプチドをＭＢＳ法（実験医学、
第６巻、第１Ｏ号、第１４５ページ、１９８８年）によ
りキーホールリンペットヘモシアニンと結合させ、抗原
を調製した。得られた抗原１００μｇをフロイントの完
全アジュバントとともにマウスの背反下に注射し、その
後１週間間隔て４回同量を注射した。最後の注射から５
日後に採血し、所望の抗体を含む血清を得た。
第６巻、第１Ｏ号、第１４５ページ、１９８８年）によ
りキーホールリンペットヘモシアニンと結合させ、抗原
を調製した。得られた抗原１００μｇをフロイントの完
全アジュバントとともにマウスの背反下に注射し、その
後１週間間隔て４回同量を注射した。最後の注射から５
日後に採血し、所望の抗体を含む血清を得た。
次に、プロティンＡ−セファロースＣＬ４Ｂ （商標。
ファルマシア社製）１７ｎｌのカラムをパスツールピペ
ットを用いて作製し、５７ｎｌの１００ ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）でカラムの洗浄と平衡化を行い
、上記血清１７ｎｌに０．１容の１００ ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ （ｐＨ８，０）を添加し、カラムに重層して
吸着させ、１０ｒｎｌの１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ８，０） 、次いでｌＯ−の１０ ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ （ｐＨ８，０）でカラムを洗浄して夾雑物
を除去した。のち１００ｍＭグリシン（ｐＨ３，０）を
カラムに通液して免疫グロブリンを溶出させ、溶出液を
０．５ＷＩずつ分取し、各分画を５０μｇの１ＭＴｒｉ
ｓＨＣＩ （ｐＨ８，０）で中和し、分画の一部を採
取して２８０ｎｍの吸光度から分画の免疫グロブリン濃
度を測定し、第２分画から第６分画を集め、マウス血清
ｌ−当たり約７■の免疫グロブリンを得た。
ットを用いて作製し、５７ｎｌの１００ ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）でカラムの洗浄と平衡化を行い
、上記血清１７ｎｌに０．１容の１００ ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ （ｐＨ８，０）を添加し、カラムに重層して
吸着させ、１０ｒｎｌの１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ８，０） 、次いでｌＯ−の１０ ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ （ｐＨ８，０）でカラムを洗浄して夾雑物
を除去した。のち１００ｍＭグリシン（ｐＨ３，０）を
カラムに通液して免疫グロブリンを溶出させ、溶出液を
０．５ＷＩずつ分取し、各分画を５０μｇの１ＭＴｒｉ
ｓＨＣＩ （ｐＨ８，０）で中和し、分画の一部を採
取して２８０ｎｍの吸光度から分画の免疫グロブリン濃
度を測定し、第２分画から第６分画を集め、マウス血清
ｌ−当たり約７■の免疫グロブリンを得た。
以下に、このようにして得た劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物に
対する特異抗体についての試験例を示す。
対する特異抗体についての試験例を示す。
試験例 １
（抗体の純度について）
抗体として精製した免疫グロブリン中の夾雑物の有無を
試験した。
試験した。
すなわち実施例２で得た免疫グロブリンの各分画をレム
リ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、第２２７巻、第６８０ページ、１９７０年］によ
るＳＤＳゲル電気泳動に供し、常法により染色し、各分
画の夾雑蛋白質の存在を試験した。
リ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、第２２７巻、第６８０ページ、１９７０年］によ
るＳＤＳゲル電気泳動に供し、常法により染色し、各分
画の夾雑蛋白質の存在を試験した。
結果は第１図に示した通りである。この第１図は、各分
画のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動図であり、第１
列は分子量マーカー（バイオラッド社製）、第２列はマ
ウス血清、第３列及び第４列は素通りした分画、第５列
〜第１１列は溶出分画、第１２列は市販１ｇＧ （カ
ッペル社製）の電気泳動像を示したものである。この第
１図から明らかなように溶出分画は主として免疫グロブ
リンからなり、他の夾雑蛋白質は実質的に存在しないか
または存在しても極微量であることが確認された。
画のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動図であり、第１
列は分子量マーカー（バイオラッド社製）、第２列はマ
ウス血清、第３列及び第４列は素通りした分画、第５列
〜第１１列は溶出分画、第１２列は市販１ｇＧ （カ
ッペル社製）の電気泳動像を示したものである。この第
１図から明らかなように溶出分画は主として免疫グロブ
リンからなり、他の夾雑蛋白質は実質的に存在しないか
または存在しても極微量であることが確認された。
試験例 ２
（抗体の特異性について）
抗体の劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物に対する特異性を試験し
た。
た。
すなわち、Ｒｂ遺伝子に異常のあるＷＥＲＩ細胞［サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４２巻、第１５６３ペ
ージ、１９８８年］およびＲｂ遺伝子に関して正常なＡ
ｌｅｘａｎｄｅｒ細胞「ネイチ’ｒ （Ｎａｔｕｒｅ
）、第３２９巻、第６４２ページ、１９８７年］および
Ｈｅ１ａ細胞をそれぞれ１ｙｓｉｓ緩衝液（２％ＮＰ−
４０，０，２％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸、５
０ ｍＭＮａｃｌ。
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４２巻、第１５６３ペ
ージ、１９８８年］およびＲｂ遺伝子に関して正常なＡ
ｌｅｘａｎｄｅｒ細胞「ネイチ’ｒ （Ｎａｔｕｒｅ
）、第３２９巻、第６４２ページ、１９８７年］および
Ｈｅ１ａ細胞をそれぞれ１ｙｓｉｓ緩衝液（２％ＮＰ−
４０，０，２％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸、５
０ ｍＭＮａｃｌ。
１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、２５ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ７，４）により可溶化させ
、のち１０．０００Ｘｇで１５分間遠心し、上清を採取
し、得られた上清に実施例２で得た抗体を添加し、常法
により免疫沈降を行い、Ｒｂ蛋白質を沈降させた。
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ７，４）により可溶化させ
、のち１０．０００Ｘｇで１５分間遠心し、上清を採取
し、得られた上清に実施例２で得た抗体を添加し、常法
により免疫沈降を行い、Ｒｂ蛋白質を沈降させた。
沈降物を試験例１と同様のレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の
方法による７、５％ＳＤＳゲル電気泳動で分離した。
方法による７、５％ＳＤＳゲル電気泳動で分離した。
分離したＲｈ蛋白質を常法によりニトロセルロース膜に
ウェスタン・トランスファーを行い、のち上記抗体およ
びアルカリホスファターセを結合抗マウスＩｇＧ抗体（
バイオラッド社製）を用いてＲｂ蛋白質の検出を行った
。
ウェスタン・トランスファーを行い、のち上記抗体およ
びアルカリホスファターセを結合抗マウスＩｇＧ抗体（
バイオラッド社製）を用いてＲｂ蛋白質の検出を行った
。
結果は第２図に示したとおりである。この第２、図は、
免疫沈降物のウェスタンプロット図であり、第１列はＨ
ｅ１ａ細胞抽出液、第２列はＨｅ１ａ細胞抽出液に実施
例１で調製した抗原性ペプチドを添加したもの、第３列
はＡｌｅｘａｎｄｅｒ細胞抽出液、第４列はＷＥＲＩ細
胞抽出液のウェスタンプロット像を示したものである。
免疫沈降物のウェスタンプロット図であり、第１列はＨ
ｅ１ａ細胞抽出液、第２列はＨｅ１ａ細胞抽出液に実施
例１で調製した抗原性ペプチドを添加したもの、第３列
はＡｌｅｘａｎｄｅｒ細胞抽出液、第４列はＷＥＲＩ細
胞抽出液のウェスタンプロット像を示したものである。
この第２図から明らかなようにＨｅ１ａ細胞およびＡｌ
ｅｘａｎｄｅｒ細胞では抗Ｒｂ蛋白抗体により分子量１
１５にダルトンの蛋白質が検出されたが、ＷＥＲＩ細胞
では抗Ｒｂ蛋白抗体により分子量１１５にダルトンの蛋
白質が検出されなかった。また、この発明の抗原性ペプ
チドにより抗Ｒｂ蛋白抗体を吸収し、のち同様の実験を
行ったが、分子量１１５にダルトンの蛋白質が検出され
なかった。
ｅｘａｎｄｅｒ細胞では抗Ｒｂ蛋白抗体により分子量１
１５にダルトンの蛋白質が検出されたが、ＷＥＲＩ細胞
では抗Ｒｂ蛋白抗体により分子量１１５にダルトンの蛋
白質が検出されなかった。また、この発明の抗原性ペプ
チドにより抗Ｒｂ蛋白抗体を吸収し、のち同様の実験を
行ったが、分子量１１５にダルトンの蛋白質が検出され
なかった。
これらの事実からこの発明の抗体は、Ｒｂ遺伝子産生物
を特異的に認識することが確認された。
を特異的に認識することが確認された。
また上記ペプチドによる抗Ｒｂ蛋白抗体の吸収操作によ
り、検出した分子量１１５にダルトンの蛋白質がＲｂ蛋
白であり、この種の免疫学的検出法でしばしば問題とな
る非特異的な蛋白質の検出ではないことが、簡便に判定
できることも判明した。
り、検出した分子量１１５にダルトンの蛋白質がＲｂ蛋
白であり、この種の免疫学的検出法でしばしば問題とな
る非特異的な蛋白質の検出ではないことが、簡便に判定
できることも判明した。
（発明の効果）
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、（１）
Ｒｂ遺伝子の産出物、とくにＲｂ蛋白質を特異的に
識別し得る抗体が提供される。
Ｒｂ遺伝子の産出物、とくにＲｂ蛋白質を特異的に
識別し得る抗体が提供される。
（２） この抗体を含有する試薬は、各種癌の診断、検
査に利用することができる。
査に利用することができる。
（３） さらにこの抗体を得るために使用した抗原ペプ
チドはヒトＲｂ蛋白質にのみ存在するので、ヒトＲｂ蛋
白質を発現するように、ヒトＲｂ蛋白質を動物に導入し
た場合であっても、その動物由来のＲｂ蛋白質の共存下
でヒトＲｂ蛋白質のみを特異的に検出できる。
チドはヒトＲｂ蛋白質にのみ存在するので、ヒトＲｂ蛋
白質を発現するように、ヒトＲｂ蛋白質を動物に導入し
た場合であっても、その動物由来のＲｂ蛋白質の共存下
でヒトＲｂ蛋白質のみを特異的に検出できる。
第１図は、この発明の抗体として精製した免疫グロブリ
ン中の夾雑物の有無を示したＳＤＳポリアクリルアミド
電気泳動図である。 第２図は、この抗体の特異性を示した免疫沈降物のウェ
スタンプロット図である。 代理人 弁理士 西 澤 利 夫（ｋｄ） 一一一 ！−
ン中の夾雑物の有無を示したＳＤＳポリアクリルアミド
電気泳動図である。 第２図は、この抗体の特異性を示した免疫沈降物のウェ
スタンプロット図である。 代理人 弁理士 西 澤 利 夫（ｋｄ） 一一一 ！−
Claims (1)
- （１）下記のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原とし
て得ることを特徴とする劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物に対す
る特異抗体。 Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（２）下記のアミ
ノ酸配列からなるペプチドを抗原として得る劣性癌遺伝
子Ｒｂ産生物に対する特異対抗を有効成分として含有し
てなることを特徴とする癌診断用試薬。 Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20274490A JPH0489569A (ja) | 1990-07-31 | 1990-07-31 | 劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物に対する特異抗体およびこの抗体を含有する癌診断用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20274490A JPH0489569A (ja) | 1990-07-31 | 1990-07-31 | 劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物に対する特異抗体およびこの抗体を含有する癌診断用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0489569A true JPH0489569A (ja) | 1992-03-23 |
Family
ID=16462444
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20274490A Pending JPH0489569A (ja) | 1990-07-31 | 1990-07-31 | 劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物に対する特異抗体およびこの抗体を含有する癌診断用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0489569A (ja) |
-
1990
- 1990-07-31 JP JP20274490A patent/JPH0489569A/ja active Pending
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