JPH049263B2 - - Google Patents

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JPH049263B2
JPH049263B2 JP57072480A JP7248082A JPH049263B2 JP H049263 B2 JPH049263 B2 JP H049263B2 JP 57072480 A JP57072480 A JP 57072480A JP 7248082 A JP7248082 A JP 7248082A JP H049263 B2 JPH049263 B2 JP H049263B2
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は生物物質の蛍光分析方法に関するもの
である。 より詳しくは、本発明の方法は例えばエチレン
ジアミン四酢酸（EDTA）類似物質ないしアナ
ローグのようなキレート形成化合物を介して生物
物質とランタニド（lanthanide）を結合させて形
成したランタニドキレート錯塩（lanthanide
chelate complex）からなる標識ないしマーカー
（marker）を使用する生物活性物質の蛍光分光分
析方法である。 免疫定量分析においては抗体、もしくは抗原ま
たはこれらの結合体には検出が容易な標識が付け
られるが、この標識には現在では一般に放射性同
位元素を使用する。 放射性同位元素を用いた場合の欠点は、その貯
蔵期間が限定されていることであるが、健康上お
よび環境への配慮から薬剤における放射性物質の
使用量を少なくすることが望ましい。放射性物質
による分析方法に代る方法としては標識として蛍
光物質を用いる免疫蛍光分析法がある。 免疫学の分野において、蛍光分析の特殊な問題
は、血清が比較的強い蛍光を有し、これがほとん
どの蛍光標識に対して高いバツクグラウンドレベ
ルを呈することである。 この血清の蛍光は主として種々のタンパク質に
基づくものであるが、これらのタンパク質は比較
的短い励起波長（最大280nm）と発光波長（最大
340nm）を有するので重大なノイズ源とはならな
い。しかし血清は多分タンパク質以外の化合物に
よる他の種類の蛍光をも発生し、これらの蛍光は
比較的長い波長（励起波長340nm、発光波長460
〜470nm）を有するので、処理がより困難なノイ
ズを生じる。 血清に個有の蛍光に加えて、バツクグラウンド
は試料による光の散乱によつても影響される。こ
の散乱は特にストークスシフトの小さい（50nm
以下）の標識を用いると、干渉を生じる。高いバ
ツクグラウンドの蛍光と蛍光の散乱のために、血
清における標識の感度は純粋な緩衝液において使
用される場合に比較して1/50〜1/100に減少する。 蛍光分析における他の問題は、抗体および分析
しようとする生物活性物質が互いに結合するだけ
でなく試験管の内壁のような物体表面に付着する
ことである。この付着した物質は強い固有の蛍光
を有し、また、ガラスやプラスチツク容器の表面
もしばしば蛍光を発するとともに光を散乱させ、
これが測定を妨害する。従つて容器の表面からの
蛍光を測定するのは溶液を測定するよりも困難で
ある。 免疫系に使用される標識の要件はできるだけ強
い蛍光と、比較的長い発光波長（500nm以上）
と、大きいストークスシフトとを有し、結合特性
に悪影響を与えることなく抗体または抗原と共有
結合（covalently）する特性を有していることで
ある。 これらの要件を満足させる蛍光標識がスウエー
デン国特許願第7902078―８号に開示されている。
この標識はランタニドと芳香族β―ジケトン
（aromatic β―diketone）とからなるランタニ
ドキレートで、EDTA類似体によつて物質に結
合されて蛍光ランタニド錯体が形成される。 この標識は特性として50〜1000μsecの長い蛍光
持続時間を有し、このため例えば米国特許第
4058732号に開示された計測方法を使用すること
ができる。この方法では試料を短い持続時間のレ
ーザーパルスで励起し、ノイズ源としての蛍光が
減衰した後にのみ蛍光の検出を行なう。 上述の標識の欠点は、β―ジケトンが免疫反応
を妨害することである。免疫反応が終つてからこ
れを加えると、三元キレート（ternary chelate）
の形成に要する時間が非常に長くなる。その上、
使用されるタンパク質がしばしば例えば試験管の
内壁面のような表面に付着し、満足すべき精度の
測定を困難にする。 本発明の目的は前述のような欠点を除き、非常
に短時間で高精度の測定が可能な方法を提供する
ことにある。 本発明の方法は生物物質にキレート形成化合
物、例えばEDTAを介して結合されたランタニ
ドキレートコンプレツクスからなる標識を付して
蛍光分析を行なうものであるが、測定前にランタ
ニドイオンをキレートコンプレツクスから分離
し、その後短い輻射線パルスを用いて励起し、ノ
イズ源からの蛍光が実質上消失したとき標識から
の蛍光の測定を行なう。ランタニドイオンの分離
は例えばトライトン―X100（Triton―X100）（ア
ルキルアリルポリエーテルアルコール・alkyl
aryl polyether alcohol）の如き洗浄剤を含むPH
3.5以下の溶液を加えることによつて行なうこと
ができる。 ランタニドイオンの分離後にβ―ジケトンを加
えることが望ましい。 β―ジケトンは蛍光を増幅するために加えるも
のであるが、この目的に適したβ―ジケトンの例
を次表に示す。
【表】 水は強い抑制作用を有しているので、特に水溶
液中の蛍光を強めるために、例えばいわゆるルイ
ス塩基（Lewis base）のような共力作用を有す
る化合物を添加する。この種の塩基は例えばｏ―
フエナントロリン（ｏ―phenanthroline）のよう
なＮ複素環式（Ｎ―heterocyclic）化合物からな
る。 又この塩基の別のグループとしてはホスフイン
（phosphines）およびホスフインオキサイド、例
えばトリオクチルホスフインオキサイド
（trioctylphosphineoxide（TOPO））がある。 これらの化合物の特性とこれらの蛍光に及ぼす
作用については例えば次の文献に開示されてい
る。 Halverson 1964 J.Chem.Phys.41，157；
Kareseva ＆ Karesev，1975 Koord.Khim.
１，926；Muraveva 1977，Zh.Neorg，Khim.
22，3009；Makarchuk 1979 Ukr.Khim.Zh.45，
656；Taketatsu 1979，Anal.Chim.Acta 108，
429 and Britain 1980，Inorg.Chem.19，640. 本発明によれば、例えば10〜100μMの２―
NTA、10〜100μMのTOPOおよび0.1〜0.5％の
トライトン―X100を含むPH2.8〜3.5の緩衝液（例
えばフタレート―HCL）からなる系中で測定を
行なうことができる。 添付図のグラフは上述の系における蛍光を時間
の関数として小さい丸を結ぶ曲線で示し、比較の
ためランタニドがタンパク質と結合した系の場合
を小さい四角を結ぶ線で示す。 ユーロピウムを使用しこれをひつじ抗うさぎ免
疫グロブリン（sheep―anti―rabbit IgG）の免
疫グロブリンに結合させたモデルによつて、また
同じタンパク質をうさぎの免疫グロブリンを抗源
とした固相において抗体として使用することによ
り本発明の方法を試験した。両方法ともほぼ同じ
基準カーブが得られた。 本発明の方法の利点は早期（従来の８〜10時間
に比べて処理の約30分後）により高精度でかつよ
り強い蛍光強度で測定を行なうことができること
である。 本発明の方法が適用できる生物物質としては上
記抗体および抗原以外にも多くのものがあるが、
そのうちのいくつかを例示すると、例えばペプチ
ドホルモン、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモ
ンなどのホルモン、酵素、結合タンパク質、受容
タンパク質などのタンパク質またはペプチド、免
疫グロブリンなどの抗体、ビタミン、ウイルス、
ウイルスDNA、ウイルスタンパク質、微生物、
微生物DNA、微生物毒素、これらの物質に対す
る抗体などがある。 以下、本発明の諸態様を要約するが本発明はこ
れらに限られないこともちろんである。 (1) 生物活性物質にEDTA類似体のごときキレ
ート形成化合物を介してランタニドを結合させ
て形成したランタニドキレートコンプレツクス
からなる標識を付して行なう生物物質の蛍光分
光分析において、検出前にランタニドイオンま
たは全キレートを生物物質から分離し、輻射線
の短いパルスを使用して溶液中で励起を行な
い、ノイズ源からの蛍光が実質上消失したとき
前記標識からの蛍光を検出するようにした生物
物質の蛍光分析方法。 (2) PH値が3.5以下の緩衝液と分離用洗浄剤とを
加えることによつて前記分離を行なう(1)項の方
法。 (3) 前記洗浄剤がトライトンX100である(2)項の
方法。 (4) 前記分離後にβ−ジケトンを加える(1)項の方
法。 (5) 前記分離後にルイス塩基を加える(1)項の方
法。 (6) 前記塩基がトリオクチルホスフインオキサイ
ド（TOPO）である(5)項の方法。
【図面の簡単な説明】
図は本発明の効果を説明するグラフである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 生物物質にキレート形成化合物を介してラン
    タニドを結合させて形成したランタニドキレート
    コンプレツクスからなる標識を付し、輻射線の短
    いパルスによつて励起し、ノイズ源からの蛍光が
    実質上消失したとき前記標識からの蛍光を測定す
    る蛍光分析において、 測定前に洗浄剤を含むPH3.5以下の溶液を添加
    して前記キレートコンプレツクスからランタニド
    イオンを分離し、分離されたランタニドイオンを
    蛍光体に変換して前記溶液中での測定を可能なら
    しめたことを特徴とする生物物質の蛍光分析方
    法。 ２ 前記ランタニドがユーロピウムである特許請
    求の範囲第１項に記載の生物物質の蛍光分析方
    法。 ３ 前記洗浄剤がアルキルアリルポリエーテルア
    ルコールである特許請求の範囲第１項に記載の生
    物物質の蛍光分析方法。 ４ ランタニドイオンを分離した後に、β―ジケ
    トンおよび（または）ルイス塩基をさらに加える
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
    生物物質の蛍光分析方法。 ５ 前記β―ジケトンが、２―ナフトイルトリフ
    ルオロアセトン、１―ナフトイルトリフルオロア
    セトン、ｐ―メトキシベンゾイルトリフルオロア
    セトン、ｐ―フルオリベンゾイルトリフルオロア
    セトン、ベンゾイルトリフルオロアセトン、フロ
    イルトリフルオロアセトン、ナフトイルフロイル
    メタン、ジテノイルメタン、ジベンゾイルメタン
    からなるグループから選ばれたものである特許請
    求の範囲第１項に記載の生物物質の蛍光分析方
    法。 ６ 前記ルイス塩基がトリオクチルフオスフイン
    オキサイドである特許請求の範囲第４項に記載の
    生物物質の蛍光分析方法。 ７ 前記キレート形成化合物がEDTAまたはそ
    の類似体である特許請求の範囲第１項に記載の生
    物物質の蛍光分析方法。
JP57072480A 1981-04-30 1982-04-28 Fluorimetry method for biological substance Granted JPS57186170A (en)

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JPS57186170A JPS57186170A (en) 1982-11-16
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DE3272260D1 (en) 1986-09-04

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