JPH0493659A - ヒトα↓１―アンチキモトリプシンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトａ１−アンチキモトリプシンに特異的に
結合するモノクローナル抗体を利用したヒトα　−アン
チキモトリプシンのＩＰｊ定方決方法するものである。

（従来の技術） ヒトα１−アンチキモトリプシンは１９７８年にその性
状が明らかになった糖タンパク質である（　ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　１７巻２６号５６５１−５６５８頁）
。詳しくはアミノ酸４０８残基からなり、約２６％の糖
を含む分子全豹６８，０００の糖タンパク質であり、そ
の主な生体内作用は、肥満細胞のキマーゼや好中球のカ
テブシンＧなどのキモトリプシン様プロテアーゼの阻害
である。ヒトα１−アンチキモトリプシンはα、−アン
チトリプシンと同様にアキュート・フェイズ・プロティ
ンであることも・知られており、肺や腎での感染防止と
プロテアーゼ・プロテアーゼインヒビターの平衡化に関
与していると考えられている（蛋白質・核酸・酵素第３
４巻　８号　９４９−９６２頁　１９８９年）。生体内
での主な産生臓器は肝臓で、健常人の血清中濃度は３０
０〜６００μｇ　／　ｍ　１に達する。最近ではその臨
床的な知見も幾つか得られており、特に骨癌、肉腫、カ
ポシ肉腫、癌腫、悪性メラノーマのマーカーとなること
が報告されている（Ｐａｔｈｏｌ　Ｒｅｓ　Ｐｒａｃｔ
　１８２巻　３３１３−３４３頁　１９８７年、Ａｍ　
Ｊ　Ｓｕｒｇ　Ｐａｔｈｏｌ　１１巻１３３−１３９頁
１９８７年）。

その他では、炎症反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、脳
傷害においてもヒトα１−アンチキモトリプシンの血清
中濃度の増加か観察されている。このように近年ヒトα
１−アンチキモトリプシンは臨床的なマーカーとして注
目されているが、その作用や機能はいまだ明らかではな
い。さらにアルツハイマー病患者の血清中及び髄液中で
ヒトα１−アンチキモトリプシンが増加していることも
報告され、その成因、病体との関連についても注目され
ている（　Ｃｅｌ　１　５２巻４８７−５０１頁　１９
８８年、生化学第６１巻　第　５号　３８５頁　１９８
９年、日経メディカル１９９０年　３月１０日号　６６
−７４頁）。

ヒトα１−アンチキモトリプシンの測定方法としては、
ヒトα１−アンチキモトリプシンに対する抗血清あるい
はヒトα１−アンチキモトリプシンに対する抗血清から
精製された抗ヒトα１−アンチキモトリプシン・ポリク
ローナル抗体を用いた免疫学的測定法、抗ヒトα１−ア
ンチキモトリプシン・モノクローナル抗体を用いたサン
ドイッチＥＩＡ法が知られている。

（発明が解決しようとする課題） 上述の測定方法のうち前者のＭ］定方法では、渭ｊ定に
使用するヒトａ１−アンチキモトリプシンに対する抗体
として抗血清あるいは抗血清から精製されたポリクロー
ナル抗体を使用しているため、抗体を含む測定用試薬の
品質を一定に保つことか困難であり、試料中のヒトα、
−アンチキモトリプシンを正確にかつ再現性よく定量す
ることは難しい。これに対して、上述の測定方法のうち
後者の測定方法では、ポリクローナル抗体の代りにモノ
クローナル抗体を使用しているため抗体を含むδＶ］定
用試用試薬質を一定に保つことができる。しかしながら
、ヒトα、−アンチキモトリプシンは血清中に３００〜
６００μｇ／ｍ　ｌもの高濃度で存在しているため、後
者の測定方法で血清中ヒトα１−アンチキモトリプシン
を４１定するには、はとんどの場合血清を１０００倍以
上に希釈しなければならない。血清を１０００倍以上に
希釈して潰１定した場合には、測定誤差か大きくなる可
能性があり後者の測定方法も好ましくない。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上述の測定方法の問題点を解決するため
、ヒトα、−アンチキモトリプシンに特異的に結合する
モノクローナル抗体を用いたヒトα１−アンチキモトリ
プシンの４１１定方法を見比たした。

即ち本発明は、ヒトα、−アンチキモトリプシンに特異
的に結合するモノクローナル抗体を用いたヒトａ１−ア
ンチキモトリプシンの１ｌｊｌｌｌ定方法において、 ■ヒトα１−アンチキモトリプシンに特異的に結合する
固定化されたモノクローナル抗体、試料及び標識された
ヒトα１−アンチキモトリプシンを接触させる工程、 ■遊離の試料及び標志されたヒトα１−アンチキモトリ
プシンを除去する工程、 ■標識を直接又は間接的に検出して■て生じる免疫反応
生成物を定量する工程 からなることを特徴とするヒトα１−アンチキモトリプ
シンのハ１定方法である。

ヒトα　−アンチキモトリプシンに特異的に結合するモ
ノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、それ自
体公知である方法 （Ｇ、Ｋ　　ｈｌｅｒ＆ｃ、Ｍｉｌ、５ｔｅｉｎＮａｔ
ｕｒｅ　　２５６　４９５　　（１９７５））こ準して
製造することができ、例えば次の如くして製造すること
ができる。すなわち、 ■・抗原としてヒトα、−アンチキモトリプシンを用い
て免疫した動物から抗体産生細胞を調製し、■これとは
別に骨髄肝細胞を調製し、 ■これらの細胞を融合させ、 ■得られた融合細胞のうちハイブリドーマのみを選択的
に増殖させ、 ■得られたハイブリドーマからヒトα１−アンチキモト
リプシンに対する抗体を産生ずるノ１イブリドーマを検
索し、 ■ヒトミ１−アンチキモトリプシンに対する抗体を産生
ずるハイブリドーマをクローニング１することにより得
られる。

得られた抗ヒトα１−アンチキモトリプシン・モノクロ
ーナル抗体産生／＼イブリドーマから、抗ヒトα１−ア
ンチキモトリプシンψモノクローナル抗体を得るには例
えば次の如くすればよい。すなわち、抗ヒトα１−アン
チキモトリプシン・モノクローナル抗体産生／＼イブリ
ドーマを適当な培地中で培養し、その培養上清を採取す
ることにより、抗ヒトα１−アンチキモトリプシン争モ
ノクローナル抗体を得ることができる。また、細胞融合
の際に用いた骨髄腫細胞の由来動物と同種の動物にブリ
スタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカ
ン）などの鉱物油を腹腔内に投与した後、抗ヒトα１−
アンチキモトリプシン・モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマを接種して腹腔内でハイブリドーマを増殖させ
、目的とするモノクローナル抗体を含有する腹水を作ら
せ、腹水を採取することによっても目的とするモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。モノクローナル抗体を
分離精製する方法としては、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィーなどによる方法がある。

抗ヒトα１−アンチキモトリプシン・モノクローナル抗
体を用いたヒトα１−アンチキモトリプシンの測定は例
えば次のような測定方法により行うことができる。即ち
、 ■固相に固定化された抗ヒトα、−アンチキモトリプシ
ン・モノクローナル抗体と試料及び標識されたヒトα、
−アンチキモトリプシンを接触させる工程、 ■遊離の試料及び標識されたヒトα１−アンチキモトリ
プシンを除去する工程、 ■標識を直接又は間接的に検出して［１］で生じる免疫
反応生成物を定量する工程 を紅て、；１１１１定を行うことかできる。

本発明方法に用いられる抗体を固相に固定化する方法は
、公知の方法を採用でき、例えば固相としては、ポリス
チレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネ
ート、セファロース粒子、ラテックス、アガロース、セ
ルロース、ポリメタアクリレートなどが使用される。

また、固相に固定化するモノクローナル抗体のＦｃ領域
を特異的に認識する抗体を化学的に固相に固定化し、そ
の後、該抗体を介してモノクローナル抗体を固定化して
も良い。また、抗ヒトα。

−アンチキモトリプシン・モノクローナル抗体を適当な
酵素を用いてＦ（ａｂ−）２断片にまで処理したのち固
定化しても良い。適当な酵素とはベブンン、パパイン、
ズブチリシン、サーモライシン、トリプシン、キモトリ
プシン、カテブシンＤＥ１プラスミン等のプロテアーゼ
が好ましい。

抗体の標識化の方法とその検出方法はなんら限定される
ものでなく、公知の方法により標識化および検出するこ
とかできる。標本として酵素を用いる場合、標識物質と
しては例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、アルカリホスファターセ、ウレアーゼ、カタラ
ーゼ、β−グルクロニダーゼなどの酵素が使われる。放
射性物質としては、３Ｈ”５１．または　１３１１等が
、蛍光物質を使用する方法としては、例えば、フルオレ
スカミン、フルオレラセンチオシアネート、テトラロー
ダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等が常法によ
りモノクローナル抗体、あるいはＦ（ａｂ−）２フラグ
メントに結合される。好ましくは、安全で高感度Ｊｌ定
が可能な前記した通常のエンザイムイムノアッセイで使
用される酵素等がより好ましい。標識の検出は、例えば
放射性物質または蛍光物質等の標識物質を用いた場合に
は、通常の方法により直接行えば良い。または酵素を標
識物質として使用した場合には、該酵素の作用により検
出可能な物質に変化する基質を添加した後、該検出可能
な物質を検圧し、その結果に基づいて間接的に検出すれ
ば良い。

測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、溶解剤、
緩衝剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が用いられ
る。

遊離（間接的に固相に固定化されていない）の試料と標
識されたヒトα１−アンチキモトリプシンの除去には、
例えば通常のイムノアッセイて使用されるＢ／Ｆ分離法
等の洗浄等を行えば良い。

用いられる試料はなんら限定されず、血清、血漿、尿な
どの生体試料でも精製したヒトα１−アンチキモトリプ
シンを含む溶液でも良い。

このようにして本発明方法を行えば、固定化された抗体
に対して試料中のヒトα−アンチキモトリプシンおよび
標識されたヒトα−アンチキモトリプシンが競合的に反
応し、生じた免疫反応生成物中の標識を検出することに
より、試料中のヒトα−アンチキモトリプシンを定量す
ることができる。

（発明の効果） 本発明によれば、簡便な操作により高精度にかつ高濃度
域でヒトα−アンチキモトリプシンを測定することが可
能である。実施例１で説明されるようにして得られたヒ
トα１−アンチキモトリプシンに対するモノクローナル
抗体を用いた場合には、実施例２て示されるようにヒト
α１−アンチキモトリプシンは７．８〜１２５μｇ　／
　ｍ　ｌの濃度範囲内で測定することかできた。この測
定法を用いれば、血清を５〜１０倍程度に希釈すること
により、ヒト血清中のａ）−アンチキモトリプシンを測
定することか可能である。従って、δＰ］定誤差も最小
におさえることができる。

更に本発明では、モノクローナル抗体の同相への固定化
及び機工物質のヒトα、−アンチキモトリプシン標準試
料への結合を前もって行っておくことて、更に操作を簡
便にし、測定に要する時間を短縮することか可能である
。例えば、０．０２ｍ１以下の極微量の試料で測定可能
であり、このことは短時間に多数の検体（試料）を測定
するという臨床的な要望を解決するものであり、その応
用範囲は広い。

（実施例） 以下実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するか、
本発明は以下の実施例になんら限定されるものではない
。

［実施例１］ 抗ヒトα１−アンチキモトリプシン・モノクローナル抗
体産生ハイブリドーマの製造 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製造は、前記
したようにＧ、Ｋ　　ｈｌｅｒとＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
らの方法（Ｎａｔｕｒｅ。

２５６．４９５．　　（１９７５））に従った。

（Ａ）ヒトａ１−アンチキモトリプシン感作動物細胞の
調製 Ｂａ１ｂ／ｃマウス（♀）をヒトα　−アンチキモトリ
プシンで免疫した。免疫は、マウスの腹腔にフロイント
の完全アジュバントとヒトａ。

アンチキモトリプシンとを乳化させた試料（０，７ｍｇ
−α、−アンチキモトリプシン／　ｍ　１　）を１００
μｍ／匹ずっ投与した。それから−ケ月後に追加免疫と
してヒトα１−アンチキモトリプシンをフロイントの不
完全アジュバントと乳化させた試料（０，７ｌ１１ｇ・
α１−アンチキモトリプシン／ｍｌ）を１００μｍ／匹
ずつマウス腹腔に投与した。二週間後に最終免疫として
ヒトａ１−アンチキモトリプシンをリン酸緩衝化生理食
塩水（０，８５％ＮａＣ１を含む０．０１５’６リン酸
緩衝液（ｐＨ７，２）　、以下ＰＢＳと省略する）に溶
解したもの（０，７Ｂ−ａ　、−アンチキモトリプシン
／　ｍ　１　）を１００μｍ／匹ずつ腹腔内に投与し、
３日後この処置マウスの肺臓を無菌的に取出した。あら
かじめカルチャーデイツシュにナイロンメツシュとＥ−
ＲＤＦ培地を入れてナイロンメツシュをＥ−ＲＤＦ培地
中に浸しておき、このナイロンメツシュの上に取出した
肺臓をゆっくりと置き、肺臓を挟むようにナイロンメツ
シュを半分こ折り、肺臓をビンセットで押しつぶしては
ぐし肺臓細胞を培地中に懸濁させた。細胞懸濁液を遠心
管に入れ、１１０００ｒｐで１０分間遠心した後上澄を
捨て、さらに細胞ベレットをＥ−ＲＤＦ培地で２回同様
に遠心洗浄して肺臓細胞とした−（Ｂ）骨髄腫細胞の調
製 骨髄腫細胞としてはＢ　ａ　１　ｂ　／　Ｃマウス由来
の８−アザグアニン耐性株であるＳＰ２１０−Ａｇ１４
　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０、以下５Ｐ２１０と省略す
る）を使用した。細胞融合を行う１週間前まで２０μｇ
　／　ｍ　１の８−アザグアニン、１５％子牛脂児血清
（以下１５％ＦＣ８と省略する）を含むＥ−ＲＤＦ培地
で培養し、その後細胞融合日まで１５％ＦＣ５を含むＥ
−ＲＤＦ培地を使用した。細胞融合直前に、Ｓ　Ｐ　２
１０は無菌的にＥ−ＲＤＦ培地で１１０００ｒｐで１０
分間遠心洗浄を２回繰り返し調製した。

（Ｃ）細胞融合 実施例１の（Ａ）項で調製した肺臓細胞と実施例１の（
Ｂ）項で調製した骨髄腫細胞を５＝１の割合で混合遠心
（１０００ｒｐｍ、１０分）し細胞ベレットを集めた。

遠心チューブを軽くたたいて細胞ベレットを壁面に薄く
広げ、その中に３７℃に加温しておいた５０％ＰＥＧ　
（ＭＥＲＫ社製ポリエチレングリコール４０００）を含
むＥ−ＲＤＦ培３１！！１ｒｎｌを、１分間に１ｍｌの
割合で遠心チューブを回しながら少しずつ滴下した。そ
の後、３７℃に加温しておいたＥ−ＲＤＦ培地１０ｍ１
を３０秒に１ｍｌの割合で遠心チューブを回転しながら
加えた。つぎにＦＣ８２ｍｌをゆっくりと入れ、１１０
００ｒｐで１０分間遠心した。細胞ベレットを１５％Ｆ
Ｃ３とＩ　Ｘ　１０−’Ｍヒボキサンチン、４　Ｘ　１
０−７Ｍアミノプテリン、１．６×１０−５Ｍチミジン
を含むＥ−ＲＤＦ培地（以下ＨＡＴ培地と省略する）で
２回遠心洗浄（１０００ｒｐｍ、１０分間）し、この培
養液を９６ｗｅｌｌ　　ｐｌａｔｅ　（Ｆａｌｃｏｎ＃
３０４２’）に１×１０５細胞個／ウェルになるように
２００μｍずつ分注した。５日月ごとにＨＡＴ培地を１
００μｍ／ウェル交換した。２週間後からは、１５％Ｆ
Ｃ５とＩ　Ｘ　１０−’Ｍヒボキサンチン、１．６Ｘ１
０〜５Ｍチミジンを含むＥ−ＲＤＦ培地（以下ＨＴ培地
と省略する）を培地交換に用いた。

（Ｄ）ハイブリドーマの選択 ９６ｗｅｌｌ　　ｐｌａｔｅに細胞コロニーが認められ
る１０日目前後からＥＬＩＳＡを行い、培養上清に抗ヒ
トα１−アンチキモトリプシン抗体か存在するかどうか
調へた。９６ｗｅｌｌ＋ｍｍｕｎｏｐ　ｌａ　ｔ　ｅ平
底（インターメッド社製）に、ヒトａ１−アンチキモト
リプシン２μｇ／ｍｌを５０μｍ／ウェル分注し、４℃
で一夜静置した。その後、ウェルの溶液を除去しウェル
を０．０４９６ツイーン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含むＰ
ＢＳ　（以下ＰＢＳ−Ｔ）て３回洗浄した後、０．５％
ウシ血清アルブミン（以下０．５％ＢＳＡと省略する）
を含むＰＢＳ２８０μｍを各ウェルニ加えて４℃で一夜
静置してＢＳＡで各ウェルをブロッキングしそのまま冷
蔵保存した。次に、ウェルの溶液を除去しウェルをＰＢ
Ｓ−Ｔで３回洗浄した後、各ウェルに上記培養上清を５
０μｍすつ分注し３７℃で１．５時間静置した。その後
、ウェルの溶液を除去しウェルをＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔテ３回
洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ラビット抗マウスエ
ｇＧ抗体（ジャクソン社製）を５０００倍に希釈した溶
液を５０μｍ／ウェルずっ分注し、３７℃で１．５時間
静置した。その後、ウェルの溶液を除去しＰＢＳ−Ｔて
３回洗浄したのち、基質溶液（１−２９’ｏ　　２　＋
　　２−アンノシー（３−エチルベンズチアゾリン硫酸
）−ジアンモニウム塩（以下ＡＢＴＳと省略する）及び
０．０１９６過酸化水素（Ｈ２０□）を含む０．１Ｍク
エン酸緩衝液（ｐＨ４，０））を各ウェルに１００μｌ
ずつ添加した。３０分間室温で放置した後、０．５Ｍシ
ュウ酸溶液を１００μｌ加えて酵素反応を停止させ、４
４１−５ｎでの吸光度を測定し、酵素活性が認められた
ウェルに抗ヒトα１−アンチキモトリプシン抗体を産生
ずるハイブリドーマが存在することから、そのウェルの
ハイブリドーマをスケールアップし増殖させた。以上の
ようにして、抗体価の強い抗体産生ハイブリドーマを取
得した。

（Ｅ）コンデショニンダメディウムの調整冷蔵しておい
た０、３４Ｍサッカロース溶液を２６ゲージの注射針を
つけた注射器に１０ｍ１吸い取り、を椎脱臼死させてお
いたＢ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃマウス（♂）の腹腔内に無
菌的に上記溶液を注入した。注入後５分以内に、水冷し
ておいた１８ゲージの注射針をつけた注射器で左側腹部
から腹腔内溶液を回収した。水冷しておいた遠心チュー
ブに上記回収液を流し込み、１１０００ｒｐで１０分間
遠心分離した。遠心後上清を廃棄し、細胞ベレットに１
５％ＦＣ８を含むＥ−ＲＤＦ培地を加え攪拌しプッシュ
に入れた。３７℃、５％炭酸ガス濃度、９５％湿度で一
晩培養し、培養上清を集め、０．２２μｍのメンブレン
フィルターで濾過し、これをコンデショニングメディウ
ムとした。

（Ｆ）クローニング 抗体産生を認めるハイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。実施例１の（Ｅ）項で作製
したコンデショニングメディウムを１ｍｌ含むＨＡＴ培
地２０ｍ１を用意し、クロニングしたいハイブリドーマ
細胞約８０個を上記培養液中に懸濁し、２００μｍ／ウ
ェルずつ９６ｗｅｌｌ　　ｐｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏｎ＃
３０４２）に分注した。培養１０日目前後から細胞コロ
ニーが認められるウェルについて、実施例１の（Ｄ）項
に記載したのと同様にして抗ヒトα１−アンチキモトリ
プシン抗体産生ハイブリドーマを選択し、さらに再度ク
ローニングを縁り返し単一ハイブリドーマを樹立した。

最終的に１４クローンのハイブリドーマを確立した。

［実施例２］ 抗ヒトα１−アンチキモトリプシン・モノクローナル抗
体の製造 Ｂａ１ｂ／ｃマウス（♂）６〜１０週令の腹腔にブリス
タン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン
）を０．５ｍｌ／匹投与し、２週間後実施例１の（Ｅ）
項で得られた抗ヒトａアンチキモトリプシン・モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマ株をマウス腹腔内に各ク
ローンについて２Ｘ１０６細胞個／匹移植した。マウス
腹腔内に腹水か溜まる１０日目前後に、１８ゲージの注
射針を腹部に差し込み、腹腔内に溜まった腹水を１／２
０量の０．２Ｍ−ＥＤＴＡをいれた遠心チューブに滴下
させた後、遠心チューブを３５００ｒｐｍで１０分間遠
心し上清を集めた。

採取した上清を５０％硫酸アンモニウム沈殿分画法にし
たかって粗精製し、ＰＢＳ溶液に透析後、ＴＳＫ−ゲル
　ＤＥＡＥ−５ＰＷイオン交換クロマトグラフイーをお
こない精製した。精製したモノクローナル抗体は、ゲル
濾過および、β−メルカプトエタノール還元下および非
還元下での１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動て見た限りでは単一標品となっていた。また、ＥＬ
ＩＳＡ法により、精製したモノクローナル抗体が抗体価
を有することを確認した。

［実施例３］ 抗ヒトα１−アンチキモトリプシン・モノクローナル抗
体を用いたヒトα１−アンチキモトリプシンの測定 （Ａ）抗ヒトα１−アンチキモトリプシン・モノクロー
ナル抗体の固相への固定化 未処理マイクロタイタープレート（９６ウエル・ヌンク
プレート、インターメッド社製）の各ウェルに、ＰＢＳ
に１０μｇ　／　ｍ　１の濃度になるように溶解した抗
ヒトα１−アンチキモトリプシン・モノクローナル抗体
ＡＣＴＹ（１４ｆ−Ｊ類の抗ヒトα１−アンチキモトリ
プシン・モノクローナル抗体のうちの一種の抗体名）の
溶液１００μｍを加え、４℃で一夜インキユベートした
。次に、各ウェルの溶液を除去しＰＢＳ−Ｔて３回洗浄
した後、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ２８０μｍを各ウ
ェルに加えて４℃で一夜ブロッキング処理しそのまま保
存した。

（Ｂ）ヒトα１−アンチキモトリプシンの標識標識物質
としては西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社
製、以下ＨＲＰと省略する）を用いた。純水に溶解し３
　ｍ　ｇ　／　ｍ　］に調製したＨＲＰｉ＠液１ｍｌに
、０．１５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムＱ　　２．ｍｌを添
加し室温で３０分間反応させた後、１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ４，０）に対して４℃で一夜透析した。これとは
別に、ヒトａ１−アンチキモトリプシンを０．．１５Ｍ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）に対して４℃で一
夜透析した。その後、上述のごとく調製したＨＲＰ溶液
に０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）を少し
ずつ添加し、溶液のｐＨを９から９．５の範囲内に調製
し、これに透析しておいたヒトα１−アンチキモトリプ
シン溶液を加え、室温で２〜３時間静置し反応させた。

シップ塩基を還元し標識ヒトα１−アンチキモトリプシ
ンを安定化するため、４ｍｇ／ｒｎｌ水素化ホウ素ナト
リウム溶液０．１ｍｌを添加して４℃で２時間静置した
。その後、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除去し、
かつ標識ヒトα１−アンチキモトリプシンと未標識ヒト
α１−アンチキモトリプシンおよび遊離のＨＲＰを分離
するため、ＴＳＫ−ゲル　Ｇ３０００ＳＷｘ＋、（東ソ
ー株式会社製、商品名）カラムを用いた高速液体クロマ
トグラフィーによりゲル濾過し、精製ＨＲＰ標識標識ヒ
トαツーアンチキモトリプシンた。ＨＲＰ標識ヒトα１
−アンチキモトリプシンの定量はＨＲＰ標識ヒトα１−
アンチキモトリプシンの４０３ｎｍと２８０ｎｍの吸光
度から計算して求めることかできる。

（Ｃ）試料中のヒトα１−アンチキモトリプシンの定量 実施例３の（Ａ）項で記載した方法で作製したマイクロ
タイタープレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＰＢ
Ｓで希釈して調整したヒトαアンチキモトリプシンの標
準溶液（７，８゜ユ　　５．　　　６．　　　３１．　
　　３．　　　６２．　　　５．　　　１２５　　μ　
　２７ｍ１）を各ウェルにそれぞれ２０μｍずつ入れる
と同時にそれらの各ウェルにＰＢＳ−Ｔに溶解した既知
量のＨＲＰ標識標識ヒト−アンチキモトリプシン溶液を
それぞれ１００μｍずつ入れた。

室温で３時間インキュベートした後、溶液を除去しＰＢ
Ｓ−Ｔ溶液で３回洗浄した。その後、各ウェルに０．０
３ｍｇ／ｍ１ＡＢＴｓおよび０．０１％過酸化水素（Ｈ
２０□）を含有する０、ＩＭクエン酸緩衝′ＰＩＬ（ｐ
Ｈ４，０）から成る基質溶液を１００μｌずつ添加し室
温で２０分間酵素反応させた後、０．５Ｍシュウ酸溶液
を各ウェルに１００μｍずつ加えて酵素反応を停止させ
た。上記マイクロタイタープレートを各ウェルについて
、波長４１５ｎｍの吸光度を自動マイクロタイタープレ
ートリーダー（東ソー株式会社製、ＭＰ　Ｒ−Ａ　４、
商品名）でｆｌｌｌ＋定した。結果を第１図に示す。図
からも明らかなように、ヒトα。

アンチキモトリプシンは７，８〜１２５μｇ／ｍｌの濃
度範囲内で定量できることか確認された。

第１図

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３において抗体値を反映した呈色反応
の４１５ｎｍにおける吸光度を縦軸に、ヒトα１−アン
チキモトリプシンの濃度（μｇ／ｍｌ）を横軸にその関
係を示した図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトα＿１−アンチキモトリプシンに特異的に結
   合するモノクローナル抗体を用いたヒトα＿１−アンチ
   キモトリプシンの測定方法において、［１］ヒトα＿１
   −アンチキモトリプシンに特異的に結合する固定化され
   たモノクローナル抗体、試料及び標識されたヒトα＿１
   −アンチキモトリプシンを接触させる工程、 ［２］遊離の試料及び標識されたヒトα＿１−アンチキ
   モトリプシンを除去する工程、 ［３］標識を直接又は間接的に検出して［１］で生じる
   免疫反応生成物を定量する工程 からなることを特徴とするヒトα＿１−アンチキモトリ
   プシンの測定方法。