JPH049517B2

JPH049517B2 -

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Publication number: JPH049517B2
Application number: JP58198437A
Authority: JP
Priority date: 1982-10-26
Filing date: 1983-10-25
Publication date: 1992-02-20
Also published as: JPS5995898A; DE3377505D1; EP0107594A1; EP0107594B1; US4525453A; CA1204046A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、グラム陽性菌とグラム陰性菌とを迅
速に識別する生化学的方法に関する。従来技術すべての微生物はそのグラム染色反応に基づ
き、グラム陽性菌（又は微生物）及びグラム陰性
菌（又は微生物）のいずれかに分類できる。従つ
て、グラム反応は微生物の同定におけるキー試験
である。さらに、グラム陽性菌とグラム陰性菌と
の一般構造の相違及び生化学的相違のため、これ
らの種類の一方によつて起される感染の治療に
は、他方によつて起される感染の治療に使用され
るのとは異なつた抗生物質のスペクトルが使用さ
れる。従つて、感染菌のグラム反応を知ること
は、適切な抗生物質を即座に選択する上で重要で
ある。一般に、グラム染色は熱固定された乾燥生物学
的材料を含むガラススライド上で実施される４段
階染色法である。今日一般に使用されている方法
は、1883年にハンス・クリスチヤン・グラム
（Hans Christian Gram）によつて開発された原
染色法のハツカー（Hucker）変法である。スライド上に存在する物質の種類及び量に応じ
て適当な脱色法を変化させることが重要であるこ
と、及び関与する段階の数、ならびに標本をスラ
イドに熱固定する必要性のために、実際の染色法
は完全に自動化するのが困難である。さらに、ス
ライドの調製、染色及び目視検査を含む全操作
は、サンプルの数が多い場合には特に、時間がか
かる。完全に自動化され得るグラム反応の１段階
測定があれば、それはこの操作を著しくはかどら
せるため、臨床微生物学において有用であろう。バートロミユー（Bartholomew）らの「グラ
ム染色（the Gram Stain）」（Bact.Rev.、16：
１〜29、1952）はこの操作及びその説明を述べた
包括的な総説である。この文献の10ページの表１
には、グラム染色細胞が一般にアニオン性洗剤に
よつて、特に高級アルカリ硫酸塩によつてより死
滅しやすいかまたは発育阻害を受けやすいことが
指摘されている。ベイカー（Baker）ら〔「合成洗剤の細菌代謝
への作用（Action of Synthetic Detergents on
the Metabolism of Bacteria）、J.Exp.Med.、
73、249〜271、1941〕は、合成洗剤の化学構造及
び特性を呼吸法によつて測定された細菌代謝に対
するそれらの作用と関連づけている。これらの作
用は細菌による酸素消費に基づいて評価された。
アニオン性洗剤、たとえば、タージトール−７
（Tergitol−７）は酸性のPH及び１：3000の濃
度においてグラム陽性菌の呼吸を最も強く抑制し
た。アニオン性洗剤はグラム陽性菌の代謝のみを
抑制したが、カチオン性洗剤はグラム陽性菌及び
グラム陰性菌の両方の代謝を同程度に抑制した。
タージトール−７は１つのグラム陰性菌、プロ
テウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）を抑制
した。ベイカーらはこの文献の261ページで、ア
ニオン性洗剤がグラム陽性菌とグラム陰性菌とを
はつきりと識別する能力を有することを認めてい
る。しかしながら、この所見は呼吸測定法にのみ
基づいており、グラム陽性菌の存在下における還
元性化合物の保護手段または実用的且つ迅速なグ
ラム分離法を当業者に何ら示唆するものではな
い。さらに、この方法は好気性条件下で起こる反
応に限定されることが予想されるであろう。ダーケイ（Dakay）ら〔種々の環境細菌のホ
ルマザン形成に対する合成洗剤の作用（The
Effect of Synthetic Detergents on Formazan
Formation of Various Environmental
Bacteria）、Zentralblatt Bakt.Hyg.I Abt.Orig.
B174、121〜124ページ（1981）〕は、環境汚染の
指標として、数種の細菌のデヒドロゲナーゼ活性
に対する５種の洗剤の作用を研究した。２種のグ
ラム陽性菌及び１種のグラム陰性菌の２菌株を用
いた。デヒドロゲナーゼ活性の指標として、塩化
トリフエニルテトラゾリウムを用いた。試験され
たカチオン界面活性剤はデヒドロゲナーゼ活性に
対して非常に抑制的であつた。試験された２種の
アニオン界面活性剤の抑制作用はストレプトコツ
カス・フエカーリス（Streptococcus faecalis）
（0.03〜0.08％）で最も顕著であり、ミクロコツ
カス（Micrococcus）Sp.（別のグラム陽性菌）は
それほど敏感でないことが判つた。大腸菌（E.
coli）（グラム陰性菌）はこれよりはるかに高い
濃度で抑制された。アニオン界面活性剤は抑制作
用を持たなかつた。しかしながら、後述の実施例５に示されるよう
に、発育阻害に有効な化合物は本明細書中に記載
した迅速なアツセイにおいて染料の還元を選択的
に抑制するのに必ずしも有効ではない。従つて、
いくつかの界面活性剤が発育阻害剤であることが
わかつたとしても、複雑なグラム染色法の簡易化
の問題を解決に導く染料還元の選択的抑制につい
ては何ら示唆されない。発明の目的本発明の目的はグラム染色法を簡易化及び改良
する方法を提供することにある。発明の構成本発明は、(a)生存グラム陽性菌及び生存グラム
陰性菌、(b)還元抑制剤の不在下においてグラム陽
性菌及びグラム陰性菌の両者によつて検出可能な
物質に還元され得る化合物、及び(c)グラム陽性菌
による該化合物の還元を選択的に抑制するのに充
分な量のアニオン界面活性剤を混合し、そして検
出可能な該物質の存在または不存在を測定するこ
とによつて該化合物が還元されたか否かを測定す
ることを含んでなる、生存グラム陽性菌と生存グ
ラム陰性菌との識別方法を提供する。発明の効果本発明は、グラム陽性菌による還元を抑制し且
つ生存微生物のグラム型を識別する迅速且つ簡易
でコスト効果的な（cost−effective）手段を提供
する。本発明の第一の利点は、グラム陰性菌のみが検
出可能な有色最終生成物を形成できるために脱色
工程（ハツカーの変法）を削除できることであ
る。第二の利点は、公知方法では生存細胞と非生存
細胞がともに染色されるのに対して生存細胞のみ
が判別できることである。第三の利点は、本発明の方法は容易に自動化で
き且つ湿式及び乾式のいずれの試験形式であつて
も微生物の同定系に取り入れることができること
である。さらに、本方法は、たとえば、混合サンプル中
のグラム陽性菌及びグラム陰性菌の相対量の測定
におけるように少なくとも判定量的であり得る。発明の作用本発明の方法に有用な界面活性剤は、１個もし
くはそれ以上のアルキル基もしくはアリール基ま
たはそれらの組み合わせを有する疎水基；親水性
アニオン基；及びイオン安定性塩基の完成に必要
な対イオンを含んでなる任意のアニオン界面活性
剤であることができる。アニオン界面活性剤の疎水基のアルキル基及
び／またはアリール基はヘテロ原子基、たとえ
ば、炭素原子の合計総数が６〜20個、好ましく
は、10〜17個のエステル基（すなわち
【式】及び／またはエーテル基で中断されていてもよい。これらのアルキル基及び／または
アリール基の炭素原子は場合によつては、置換
基、たとえば、アリール、アルキル及びハロゲン
を結合していてもよい。親水性アニオン基及び本発明の実施に使用する
アニオン界面活性剤の種類は決定的なものではな
く、この用途で知られる普通の基、たとえば、硫
酸塩、スルホン酸塩、燐酸塩、ホスホン酸塩及び
カルボン酸塩基を用いることができる。同様に、イオン安定性塩基を完成するのに使用
する対イオンは、この目的で通常使用され且つよ
く使われた任意のもの、たとえば、アルカリ金属
カチオンならびに有機アンモニウム及びアミン−
酸付加塩カチオンを含むアンモニウムカチオンで
あることができる。アリール基及びアリール置換基の例としては、
フエニル、ナフチル、ビフエニリル等が挙げられ
る。アルキル基及びアルキル置換基の例として
は、たとえば、メチル、エチル、プロピル、イソ
プロピル、ブチル、アミル、ヘキシル、オクチ
ル、ノニル、デシル、ドデシル等が挙げられる。
ハロゲン置換基が存在する場合には、フツ化物が
好ましいが、塩化物または臭化物のような他のハ
ロゲン化物も使用できる。本発明方法に有用な各アニオン界面活性剤につ
いて、グラム陽性菌の還元能を抑制し且つグラム
陽性菌とグラム陰性菌とを識別するための最適濃
度範囲及び最適環境条件があることは当業者によ
つて理解されるであろう。さらに、アニオン界面
活性剤の選択的抑制作用に例外もあり得る。このような例外の一つは、後述の実施例中に述
べたが、グラム陰性菌プロテウス・ブルガリス
（Proteus vulgaris）の３−（４，５−ジメチル−
２−チアゾリル）−２，５−ジフエニル−2H−テ
トラゾリウムブロミド（MTT）還元能をドデシ
ル硫酸ナトリウムが抑制できることである。別の
例として、アニオン界面活性剤トリトン
（Triton）Ｘ−200が試験濃度において大腸菌
（グラム陰性菌）及びS.アウレウス（グラム陽性
菌）に対して実質的に同一の小さい阻止作用を示
すことが判つた。しかしながら、これらのわずか
の例外にかかわらず、グラム陽性菌の還元能の抑
制ならびにグラム陽性菌とグラム陰性菌との識別
のための本明細書に開示した方法は、一般的に適
用できるものであり、本明細書の教示を特定の場
合に適用するのに当業者は苦労することはないで
あろう。特に、熟練した専門家ならば、この目的
で以前に試験されたことのないアニオン界面活性
剤の有効性が後述の実施例１に記載した手法を用
いて容易に試験できることがわかるであろう。さらに、第表に列挙した好ましいアニオン界
面活性剤は、これまでは試験された濃度でそれら
が存在する場合に還元力が抑制されることのない
グラム陰性菌は判明していなかつたので、一般的
に役立つようである。【表】ジオクチルエ
ステル
【表】本発明の実施に有用な他のアニオン界面活性剤
はよく知られたいくつかの文献のいずれか、たと
えば、エンサイクロペデイア・オブ・サーフアク
タンツ（Encyclopedia of Surfactants）、１〜３
巻、マイクル・アツシユ（Michael Ash）及び
アイリーン・アツシユ（Irene Ash）、ケミカ
ル・パブリシング・カンパニー（Chemical
Publishing Company）、ニユーヨーク、1980
年；マツカツチヨンズ・エマルジフアイアーズ・
アンド・デイタージエンツ（McCutcheon′s
Emulsifiers＆Detergents）、北アメリカ版、マツ
カツチヨン・デイビジヨン（McCutcheon
Division）、MCパブリシング・カンパニー（MC
Publishing Company）、ニユージヤージー州グ
レンロツク（Glen Rock）、1981年；及びエンサ
イクロペデイア・オブ・サーフエス−アクテイ
ブ・エージエンツ（Encyclopedia of Surface−
Active Agents）、J.P.シスリー（Sisley）、ケミ
カル・パブリシング・カンパニー、ニユーヨー
ク、1952年に記載されている。本発明の実施に使用される、検出可能な物質に
還元され得る化合物は、還元抑制剤の不在下にお
いてグラム陽性菌及にびラム陰性菌によつてその
酸化型が還元されて検出可能な生成物を生じる任
意の化合物であることができる。このような検出
は、たとえば、電位差測定手段によつて実施でき
る。好ましくは、この検出可能な物質は、放射線
測定手段によつて直接的に検出可能な物質であ
る。本明細書中で使用される「放射線測定手段」
なる用語は、分析結果を得るために放射線を用い
る種々の分析検出手段の全てを含むものと定義さ
れる。放射線測定手段によつて直接的に検出できる
種々の検出可能な物質を一部分挙げると次の通り
である：(a)従来の比色検出装置を用いてその存在
または濃度を測定するに使用できる吸光係数また
は吸収スペクトルを有する、比色分析法で検出可
能な物質、たとえば、着色剤（すなわち、染料ま
たは顔料）；及び(b)そこから放射される放射線を
検出できる装置によつて検出され得る、放射線放
射物質、たとえば、螢光物質、たとえば、螢光プ
ローブ。染料または好ましくは、染料前駆体の使用が好
ましい。染料の使用はいくつかの可能性を示す：
(1)酸化還元反応が染料を１つの色から別の色に変
化させる；(2)有色の染料が無色になる；または(3)
無色の物質、すなわち、染料前駆体が有色の染料
になる。色の発生は色の消色よりも概して容易に
検出できるので、前記(3)が本発明の実施に最も好
ましい。本発明の実施に使用できる染料の例は、メチレ
ンブルー、ジクロロインドフエノール、レザズリ
ン、ならびに還元時に有色のホルマザン染料にな
る種々のテトラゾリウム化合物、たとえば、３−
（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−
ジフエニル−2H−テトラゾリウムブロミド、２，
３，５−トリフエニル−2H−テトラゾリウムク
ロリド、テトラニトロブルー、テトラゾリウムク
ロリド及びニトロテトラゾリウムバイオレツトで
ある。テトラゾリウム塩は本発明に使用するのに
好ましい染料前駆体である。本発明に有用なテトラゾリウム塩は一般式
（）を有し、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の
両者によつて以下のように一般式（）のホルマ
ザン染料に還元され得るものである：前記式（）及び（）において、Ｙはアニ
オンを表わし；R₁、R₂及びR₃は各々、アリール
または複素環式置換基（好ましくは５〜６個の原
子を含み、好ましいヘテロ原子はＮ、Ｓ、Ｏ及び
Seである）、たとえば、フエニル、置換されたフ
エニル、ナフチル、置換されたナフチル、置換さ
れたもしくは未置換のチアゾリル、ベンゾチアゾ
リレ、オキサゾール、ベンゾキサゾール、セレナ
ゾール、またはベンゾセレナゾール基を表わし；
R₂はさらにアルキル基（たとえば、メチル、ブ
チル、ヘキシル、ドデシル等）または置換基（酸
置換基を含む）、たとえば、−Ｈ、−OH、−
COOH、−SO₃H、−SH、−NO₂等、もしくは
Chem.Rev.、55、355〜483（1955）においてホル
マザンもしくはテトラゾリウム塩のこの位置に存
在するとして言及されている他の任意の置換基を
表わすことができ；そして置換基R₁及びR₃は金
属キレートまたは錯体を形成し得る電子共有基を
含むことができる。このようなキレート化基また
は錯体は、第一、第二及び第三アミノ、イミノ、
置換イミノ、オキシム、チオエーテル、ケト、チ
オケト、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシ
ル、スルホ及びホスホ、アルコキシ基または錯体
である。本発明に有用なテトラゾリウム塩としてはま
た、グラム陽性菌及びグラム陰性菌によつて還元
されて式（）のホルマザンを生成できる一般式
（）のビス−化合物が挙げられる：〔式中、Ｙはアニオンを表わし；Ｘはアルキ
レンまたはアリーレン基を表わし；そしてR₁、
R₂及びR₃は各々、前記式（）及び（）に関
して前述した置換基を表わす〕。本発明の実施に有用なテトラゾリウム塩の具体
例は次の通りである： (a) トリフエニルテトラゾリウムクロリド
（TTC）； (b) ２，2′−（ｐ−ジフエニレン）−ビス（３，５
−ジフエニル）テトラゾリウムクロリド（ネオ
テトラゾリウムクロリドまたはNTとしても知
られる）； (c) NTのメトキシ誘導体（BTブルーテトラゾ
リウムとしても知られる）； (d) ２−（ｐ−ヨードフエニル）−３−（ｐ−ニト
ロフエニル）−５−フエニルテトラリゾウムク
ロリド（INT）； (e) ２，２−ジ−ｐ−ニトロフエニル−５，5′−
ジフエニル−３，3′−（３，3′−ジメトキシ−
４，4′−ジフエニレン）テトラゾリウムクロリ
ド（ニトロ−BTとしても知られる）； (f) ２，2′，５，5′−テトラ−ｐ−ニトロフエニ
ル−３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビ
フエニレン）−ジテトラゾリウムクロリド（テ
トラ−ニトロBTまたはTNBTとしても知られ
る）； (g) ３−（４，５−ジメチル−チアゾリル−２）−
２，５−ジフエニルテトラゾリウムブロミド
（MTT）； (h) ２，2′−ジ（３−ニトロフエニル）−５，
5′−ジメチル−３，3′−（４，4′−ビフエニレ
ン）ジテトラゾリウムクロリド（イエローテト
ラゾリウムまたはYTとしても知られる）； (i) ２，３，５−トリ（ｐ−ニトロフエニル）−
テトラゾリウムブロミド（TNTTC）； (j) ２−フエニル−３−（３−メトキシ−４−フ
エニル）−５−（ｐ−ニトロフエニル）−テトラ
ゾリウムクロリド（半ニトロBTとしても知ら
れる）；及び (k) ２，５−ジ（ｐ−ニトロフエニル）−３−（３
−メトキシ−４−フエニル）−テトラゾリウム
クロリド（半TNBTとしても知られる）。これらの化合物についてのより詳細な情報は、
ヒストケミストリー、セオレテイカル・アンド・
アプライド（Histochemistry.Theoretical and
Applied）、A.G.E.パース（Pearse）、第２巻、第
３版、880〜883ページ、チヤーチル・リビングス
トン（Churchill Livingstone）、エジンバラ及び
ロンドン、1972年に見ることができる。グラム陽性菌とグラム陰性菌とを識別する方法
は、常用の実験用ガラス器具中で、たとえば、試
験管またはガラススライドを用いて都合よく実施
できる。あるいは、アニオン界面活性剤及び検出可能な
物質は含浸または他の方法で多孔質薄層、すなわ
ち、吸収材料のマトリツクス、たとえば、紙ス
トリツプ中に取り入れて、その上に付着させる試
料中に存在する微生物の識別に適当な試験組成物
を生成することができる。さらに、この方法は、米国特許第3992158号ま
たは米国特許第4258001号に記載された型の塗布
層である多孔質薄層を有する要素中で実施する場
合に特に有利に使用される。これらの特許に記載
されている通り、このような塗布層は自立性であ
るかまたは他の材料のストリツプまたはシート、
たとえば、ポリ（エチレンテレフタレート）フイ
ルムによつて支持されることができる。所望なら
ば、他の特殊な目的を満足させる他の層もまた存
在できる。２層またはそれ以上がこのような装置
中に存在する場合には、「下塗り（subbing）」層
を他の２層の間に用いてそれらの間の密着性を増
すと有利な場合が多い。このような要素の好ましい一般的形式は次のよ
うに表わすことができる：塗布／試薬層下塗層支持体もちろん、要素は、米国特許第3992158号に記
載されるように分離した塗布層及び試薬層を有す
ることもできる。このような場合には、アニオン
界面活性剤及び還元性物質が共に塗布層または試
薬層のいずれかの中に存在してもよいし、あるい
は一方が塗布層に存在し且つ他方が試薬層に存在
してもよいであろう。所定の例における選択の主
要な基準は、微生物、アニオン界面活性剤及び還
元性物質が分析時に接触できる必要があることで
ある。乾燥試験要素を前記形式で調製した。これらは
次の組成であつた：Ａ米国特許第4258001号に記載された粒状ポリ
マー、たとえば、ポリ（ビニルトルエン−co
−ｐ−ｔ−ブチルスチレン−co−メタクリル
酸）（好適比、66：33：１）；結合剤、たとえば
ポリ（ｎ−ブチル−アクリレート−co−スチ
レン−co−２−アクリルアミド−２−メチル
プロパンスルホン酸）（好適比60：30：10）；界
面活性剤ゾニル（Zonyl）FNS ；ならびに、
さらに、(1)電子移動剤、たとえば、フエナジン
メトスルフエート、(2)色原体化合物、たとえ
ば、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）
−２，５−ジフエニル−2H−テトラゾリウム
ブロミド（MTT）及び(3)グラム陽性菌による
染料の還元を抑制し得る任意の適当なアニオン
界面活性剤、たとえば、タージトール
（Tergitol）７及びウルトラウエツト
（Ultrawet）60L を含んでなる塗布／試薬
層；Ｂ (1)結合剤、たとえば、ポリ（アクリルアミド
−co−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）（90：
10）；及び(2)界面活性剤、たとえば、ゾニル
FSN を含んでなる下塗層；ならびにＣポリ（エチレンテレフタレート）フイルム支
持体または米国特許第3992158号に記載された
他の適当な材料（Ａ及びＢは前述のような形式
でＣの上に塗布される）。本発明の方法を実施するに当り、次の手法を行
なつた：微生物をブレイン・ハート・インフユージヨン
ブロス（BHI）中に保持し、そして溶液の研究
に使用するためにBHI中で37℃において一夜、
定常期まで増殖させた。微生物による染料還元の定性分析−溶液研究 BHIにおける微生物の一夜培養物約40mlを遠
心分離し、デカントし、そしてPH7.0の0.05M燐
酸カリウム緩衝液（KPB）中に再懸濁させた。
ボウシユ・アンド・ロウム（Bausch and
Lomb）製のスペクトロニツク（Spectronic
）20分光光度計で測定した各細胞浮遊液の
620nｍにおける吸光度（OD）を、細胞浮遊液の
１：30希釈のOD読みが0.1となるように前記燐酸
カリウム緩衝液で調整した。細胞浮遊液2.5mlに、
PH7.0の0.05M KPB2.5ml、または種々の濃度の
抑制剤、エネルギー源としての10％グルコース
100μ及びフエナジンメトスルフエート（PMS）
100μ（１mg／mlメタノール）（または微生物か
ら還元性化合物に電子を移動できる任意の化合
物）を含む同一の緩衝液2.5mlを加えた。エネル
ギー源及び／または電子移動剤の使用は好ましい
が、必ずしも必要ではない。次いで、試験管内容
物をボルテツクスによつて混合した。混合後、特に断わりのない限り、各試験管に３
−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５
−ジフエニル−2H−テトラゾリウムブロミド
（MTT）（100mg／mlメタノール）（または微生物
による還元によつて検出可能な最終生成物を形成
する任意の化合物）100μを加えた。あるいは、
蒸留水中３mg／mlのPMS溶液及び蒸留水中５
mg／mlのMTT溶液を用いた。試験管内容物を混合し、そして混合直後に及び
37℃でインキユベーシヨンする間に種々の時間間
隔で目視検査した。赤紫色（purple）の形成は
MTTの還元を示した。還元の強さを次のように
等級付けした：０は染料還元が見られないことを
示し；±は微量の還元を示し；１＋は軽度の還元
を示し；２＋は中等度の還元を示し；３＋は強度
の還元を示し；４＋は極めて強度の還元を示す。使用した最終細胞濃度は、特に断わりのない限
り、試験微生物に応じて細胞６×10⁸〜１×10⁹
個／mlであつた。微生物による染料の還元の測定−乾燥要素様式吸光度を細胞浮遊液の１：20の希釈を用いて
0.1に調整した以外は、前述のようにして細胞を
保持し且つ調整した。PH7.0の0.05M KPB10μ
または0.2％グルコースを含む細胞浮遊液10μを
乾燥要素上にスポツトし、特に断わりのない限
り、湿つた室内で37℃で15分間インキユベートし
た。さらにインキユベーシヨンすることなく、各
スポツトの反射濃度（D_R）を反射濃度計で550n
ｍにおいて測定した。0.5M KPBブランクのD_R
を0.00に設定するか、または試験D_Rから差し引い
て、バツクグラウンドについて補正した試験D_R
を得た。材料大腸菌〔Escherichia coli（E.coli）〕
ATCC25922、クレブシエラ・ニユーモニエ
（Klebsiella pneumonia）ATCC13883、エンテ
ロバクター・クロアカエ（Enterobacter
cloacae）ATCC23355、プロテウス・ブルガリス
（Proteus vulgaris）ATCC13315、セレイシア・
マルセツセンス（Serratia marcescens）
ATCC8100及びシユードモナス・アエルギノーザ
（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853を含む
グラム陰性菌、ならびにスタフイロコツカス・ア
ウレウス〔Staphylococcus aureus（S.aureus）〕
ATCC25923、スタフイロコツカス・エピデルミ
デイス（Staphylococcus epidermidis）
ATCC12228、ストレプトコツカス・フエカーリ
ス（Streptococcus faecalis）ATCC19433及び
ストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes）ATCC19615を含む
グラム陰性菌は全て、メリーランド州ロツクビル
（Rock ville）のアメリカン・タイプカルチヤ
ー・コレクシヨン（American Type Culture
Collection）から入手した。ブレイン・ハート・
インフユージヨンブロスはメシガン州デトロイト
（Detroit）のデイフコ・ラブス社（Difco Labs、
Inc.）から購入した。フエナジン・メトスルフエ
ート、胆汁酸塩、タージトール（Tergitol）７
、ウルトラウエツト（Ultrawet）60L 、ポリ
ミキシンＢ及びテトラサイクリンはミズーリ州セ
ントルイス（St.Louis）のシグマケミカル社
（Sigma Chemical Co.）から購入した。セチル
硫酸ナトリウム、セチルスルホン酸ナトリウム、
オクタデシル硫酸ナトリウム及びエイコシル硫酸
ナトリウムはニユージヤージー州ベイヨン
（Bayonne）のリサーチ・プラス・ラブス社
（Research Plus Labs、Inc.）から購入した。１
−ドデカンスルホン酸ナトリウムはイリノイ州モ
ートン・グローブ（Morton Grove）のレジス・
ケミカル社（Regis Chemical Co.）から入手し
た。ホスタパー（Hostapur）SAS はサマービ
ル（Somerville）、NJのアメリカン・ヘキスト社
（American Hoechst Corp.）から購入し、そし
てFC143 はミネソタ州セントポール（St.Paul）
の3M社（3M Co.）から入手した。ゾニル
（Zonyl）FSN 及びアルカノール（Alkanol）
XC はデラウエア州ウイルミントン
（Wilmington）のE.I.デユポン社（E.I.Dupont
Co.）から購入し、そしてウイトコネート
（Witconate）P10−59 はニユーヨーク州ニユー
ヨーク（New York）のウイトコ・ケミカル社
（Witco Chemical Corp.）から入手した。サイ
ポネート（Siponate）DS−10 はメリーランド
州ボルチモア（Baltimore）のアルコラツク社
（Alcolac Inc.）からもらい、そしてエーロゾル
（Aerosol）OT 及びAY−100 はニユージヤー
ジー州ウエイン（Wayne）のアメリカン・シア
ナミド社（American Cyanamid Co.）から入手
した。ガフアツク（Gafac）RS−610 及びアリ
パール（Alipal）CO−436 はニユーヨーク州ニ
ユーヨークのガフ社（GAF Corp.）から購入し、
そしてサブチリンはニユーヨーク州プラニンビユ
ー（Planinview）のＫ／Ｋラボラトリーズ社
（Ｋ／Ｋ Laboratories、Inc.）から入手した。
ニトロテトラゾリウムバイオレツト及びテトラニ
トロブルーテトラゾリウムクロリドはウエーリン
トン（Warrington）、PAのポリサイエンス社
（Polysciences Inc.）から購入した。他の全ての化学薬品は試薬用であつて、ニユー
ヨーク州ロチエスター（Rochester）のイースト
マン・コダツク・カンパニー（Eastman
Kodack Company）から入手した。実施例実施例１アニオン界面活性剤による細菌性還元の選択的
抑制−溶液様式後記第表に挙げた種々の塩及びアニオン界面
活性剤を、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾ
リル）２，５−ジフエニル−2H−テトラゾリウ
ムブロミド（MTT）の細菌による還元の抑制剤
として試験した。溶液アツセイは、スタフイロコ
ツカス・アウレウス（S.aureus、グラム陽性菌）
及び大腸菌（E.coli、グラム陰性菌）を細胞約
10⁹個／mlの濃度で用いて前述のようにして実施
した。溶液を前述のようにして混合し、そして37
℃で30分間インキユベートした。【表】【表】 ○Ｒ
トP10〓59
第表に示されるように、グラム陽性菌である
大腸菌は、種々のアニオン界面活性剤の存在下で
MTTの強度の還元（３＋または４＋の反応）を
一貫して示した。これに対して、グラム陽性菌S.
アウレウスによるMTTによるMTTの還元は、
アニオン界面活性剤の存在下で強く抑制された
（０〜１＋の反応）。実施例２嫌気性条件下におけるグラム陽性菌による
MTT還元の選択的抑制−溶液様式細菌による染料還元の抑制が酸素利用（好気性
呼吸）に依存しないことを示すために、タージト
ール７によるグラム陽性菌のMTT還元の選択
的抑制を嫌気性条件下で説明した。細胞５×10⁷個／ml、0.05M KPB（PH7.5）、0.2
％グルコース及び0.20ｍＭ PMSを含む大腸菌
またはS.アウレウスの細胞浮遊液１mlを２個の
1.5mlキユベツトの各々に入れた。キユベツトを
ゴム栓で密封し、そして５分間、窒素をパージし
て酸素を排除した。各微生物を含むキユベツトの
一方にタージトール７（最終濃度0.1％）を加
え、他方を対照とした。全キユベツトに最終濃度
が0.24ｍＭとなるようにMTTを加えた。好気的
サンプル及び細胞を含まない対照も含めた。
540nｍにおける吸光度を、パーキン・エルマ
ー・モデル（Perkin Elmer Model）572分光光
度計で10分間、全キユベツトについて測定した
（サンプル室37℃）。 10分後の吸光度の変化を計算し、細胞を含まな
い適当な対照の10分後のΔO.D.値を差し引いてバ
ツクグラウンドについて補正した。結果を第表
に示す。得られた結果は、好気性及び嫌気性環境
の両方においてタージトール７を用いた、グラ
ム陽性菌S.アウレウスによるMTT還元の選択的
抑制を証明している。このことは抑制過程が細菌
細胞による酸素利用に依存しないことを示してい
る。【表】実施例３ MTT還元の抑制に対する界面活性剤の電荷の
作用−溶液様式グラム陽性菌による染料還元の抑制に対する界
面活性剤の電荷の作用を測定するために、下記第
表に挙げた種々の界面活性剤を実施例１の界面
活性剤の代わりに用いて、溶液アツセイを実施例
１に記載した方法に従つて実施した。第表に示
した結果は、アニオン界面活性剤がグラム陽性菌
の染料還元の選択的抑制剤として作用しその結
果、グラム陽性菌とグラム陰性菌とをはつきりと
識別することを証明している。これに対して、試
験したカチオン界面活性剤及びノニオン界面活性
剤は、グラム陽性菌とグラム陰性菌とを識別しな
かつた。【表】ルアンモニウムブロミド
実施例４種々の化合物による選択的還元抑制−溶液様式 MTTの代わりに下記第表に挙げた種々の化
合物を用いて、以外のことを除いて実施例１と同
様にしてアツセイを実施した：抑制剤タージトー
ル７（T7）は、各細菌に関する１組の溶液
（対照溶液）中では除き、他の点では同一の別の
組の溶液中には0.1％の濃度で加えた。また、溶
液は37℃で60分間、インキユベートした。第表に示した結果は、MTTの代わりに種々
の化合物を反応に使用できることを証明してい
る。【表】レザズリン２３２０
実施例５公知の細菌発育阻害剤の存在下における微生物
による還元抑制の欠除細菌の発育を選択的に阻害することが知られて
いる化合物、たとえば、抗生物質等が細菌による
染料の還元を抑制するか否かを分析するために、
アニオン界面活性剤の代わりにこれらの化合物を
用いて実施例１と同様にして溶液アツセイを実施
した。試験した発育阻害剤のうち３種は抗生物質で、
それらはグラム陽性菌に対して有効なサブチリ
ン、グラム陰性菌に対して有効なポリミキシン−
Ｂ、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の両者に対し
て有効なテトラサイクリンであつた。これらの抗
生物質は通常は１〜10μｇ／mlの濃度範囲で有効
である。使用した抗生物質の濃度は、細菌の発育
を阻害するのに必要な濃度より20〜1000倍高かつ
た。さらに、グラム陽性菌を阻害するブリリアン
トグリーン及びウシオクスガル（bovine
oxgall）、グラム陰性菌の発育を阻害するフエネ
チルアルコール、ならびにグラム陽性菌及びグラ
ム陰性菌の両者のいくつかの属を阻害する亜テル
ルカリウムについて研究した。得られた結果を第表に示す。【表】第表に示した結果は、グラム陽性菌またはグ
ラミ陰性菌のいくつかの公知の発育阻害剤が急速
染料還元の原理体系に基づいて、試験したグラム
陽性菌（S.アウレウス）とグラム陰性菌（大腸
菌）とを識別しないことを示している。これらの
発見は、発育阻害に有効な化合物が染料還元の選
択的抑制には必ずしも有効でないことを確認して
いる。実施例６尿路感染において見い出される他の細菌の選択
的抑制−溶液様式尿路感染を引き起こす可能性のある他の属の細
菌の選択的抑制を証明するために、実施例１と同
様にして溶液アツセイを行なつた。試験した細菌
及び抑制剤を結果と共に第表及び第表に挙げ
た。結果は、本発明の方法においては実施例１に記
載したアニオン界面活性剤はグラム陽性菌による
還元に対しては選択的抑制剤であるが、グラム陰
性菌による還元に対しては選択的抑制剤でないこ
とを示している。１つの例外として、グラム陰性
菌プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）
によるMTTの還元がドデシル硫酸ナトリウムに
よつて抑制された。【表】＊細胞溶解が明白
【表】 ○Ｒ
XC
ウイトコネー (5) 4＋ 1＋

○Ｒ
トP10−59
【表】 ○Ｒ
DS−10
エーロゾル (1.0) 4＋ ±
○Ｒ
AY−100
＊細胞溶解が明白
実施例７好ましい抑制剤の濃度効果−溶液様式下記第表に列挙した微生物による細菌性染料
還元に対する、２種の好ましい抑制剤、タージト
ール７（０、0.1及び1.0％）及びウルトラウエ
ツト60L （0.1及び1.0％）の濃度効果を測定し
た。実施例１と同様にして溶液アツセイを実施し、
溶液は37℃で30分間インキユベートした。第表に示した結果は、界面活性剤の不在下で
は試験したグラム陽性菌及びグラム陰性菌が
MTTを同程度に還元したことを示している。し
かしながら、界面活性剤タージトール７及びウ
ルトラウエツト60L を0.1または1.0％（ｖ／ｖ）
で加えた場合には、MTTの還元は試験したグラ
ム陽性菌では抑制されたが、試験したグラム陰性
菌では抑制されなかつた。【表】実施例８タージトール７によるMTT還元の選択的抑
制−乾燥要素様式タージトール７による選択的抑制を乾燥要素
様式において証明した。対照要素（抑制剤な
し）を試験要素（抑制剤としてタージトール７
を添加）と比較した。対照要素を前記一般形式に従つて調製した：
ポリエチレンテレフタレートフイルム支持体に、
ポリ（アクリルアミド−co−Ｎ−ビニル−２−
ピロリドン）（90：10）及びゾニル（Zonyl）
FNS を含んでなる下塗層ならびにポリ（ビニ
ルトルエン−co−ｐ−ｔ−ブチルスチレン−co
−メタクリル酸）（66：33：１）のビーズ、ポリ
（ｎ−ブチルアクリレート−co−スチレン−co−
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホ
ン酸）（60：30：10）、フエナジンメトスルフエー
ト（0.011ｇ／m²）、３−（４，５−ジメチル−２
−チアゾリル）−２，５−ジフエニル−2H−テト
ラゾリウムブロミド（0.11ｇ／m²）及びゾニル
FNS を含んでなる塗布−試薬層を塗布した。試験要素についても同様にして塗布を行なつ
た。試験要素は、タージトール７（1.1ｇ／
m²）を塗布／試薬層の組成に加える以外は対照要
素と同様な材料を含んでいた。乾燥要素アツセイを前述のようにして実施し
た。アツセイに使用した微生物を第表に列挙す
る。これらの研究の結果は、試験要素が試験し
たグラム陽性菌とグラム陰性菌とを識別するのに
有効であることを確証した。【表】【表】タージトール７を含む、塗布された要素を用
いて、シユードモナス・アエルギノーザによる
MTT還元の中等度の抑制が見られた。塗布され
た要素におけるこの例外についての理由は不明で
ある。実施例９プロテウス・ブルガリスに対するタージトール
７の作用の比較−MTT還元（本発明）対呼
吸タージトール７は１：3000の希釈で、グラム
陰性菌プロテウス・ブルガリスの呼吸を54〜97％
抑制した〔ベーカー（Bakerら）、J.Exp.Med.、
73：249−271、1941参照〕。前述の実施例中に示
されたデータ：第表−溶液様式（実施例７）及
び第表−乾燥要素様式（実施例８）は、比較的
高いタージトール７濃度、すなわち、１：1000
（0.1％）及び１：100（1.0％）においても、プロ
テウス・ブルガリスがMTTを還元する能力が抑
制されないことを証明する。本実施例は、タージトール７がプロテウス・
ブルガリスの好気性呼吸を抑制する能力（ベーカ
ーら、上記）とタージトール７がプロテウス・
ブルガリスの還元能を抑制しないことの相違を指
摘している。

Claims

【特許請求の範囲】１生存グラム陽性菌と生存グラム陰性菌とを識
別する方法であつて、 (a)該グラム陽性菌及び該グラム陰性菌、(b)還元
抑制剤の不在下においてグラム陽性菌及びグラム
陰性菌の両者によつて検出可能な物質に還元され
得る化合物、及び(c)グラム陽性菌による該化合物
の還元を選択的に抑制するのに充分な量のアニオ
ン界面活性剤を混合し、そして検出可能な該物質の存在または不存在を測定す
ることによつて該化合物が還元されたか否かを測
定することを含んでなる方法。