JPH05105657A

JPH05105657A - 抗生物質ｗａｐ−５０４４ｃおよびｗａｐ−５０４４ａ、ｗａｐ−５０４４ｃをアルギナーゼで処理して得られる誘導体、それらの製造法ならびに用途

Info

Publication number: JPH05105657A
Application number: JP3293843A
Authority: JP
Inventors: Haruhisa Hirata; 晴久平田; Azusa Katou; あずさ加藤; Seigo Nakatani; 清吾中谷; Takeshi Aiba; 勇志相場; Yoshitami Ohashi; 良民大橋; Masayoshi Goto; 正義後藤
Original assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1991-10-15
Filing date: 1991-10-15
Publication date: 1993-04-27

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】カンジタ症及びアスペルギルス症などの真菌
感染症の治療に有用な新規抗生物質ならびに該抗生物質
を産生する微生物を提供することを目的とする。【構成】一般式〔Ｉ〕【化１】で示される新規抗生物質ＷＡＰ−５０４４ＡおよびＷＡ
Ｐ−５０４４Ｃ、ＷＡＰ−５０４４Ｃをアルギナーゼで
処理して得られる誘導体ならびに該抗生物質を産生する
ストレプトミセス属に属する微生物ならびに該物質を有
効成分とする抗真菌剤。【効果】カンジタ・アルビカンスおよびアスペルギル
ス・フミガタスに対して強い抗菌活性を示した。また、
カンジタ・アルビカンスによる全身カンジタ症感染モデ
ルに対し、優れた治療効果を示した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規抗生物質ＷＡＰ−
５０４４Ａ及びＷＡＰ−５０４４Ｃ並びにＷＡＰ−５０
４４Ｃをアルギナーゼで処理して得られる新規な誘導体
及びその製法並びに用途に関する。本発明の化合物は、
抗真菌活性を有し、真菌の感染症に対する化学療法剤と
して期待される。

【０００２】

【従来の技術】従来、真菌感染症の治療剤としてはアン
ホテリシンＢ，ナイスタチン，ミコナゾール，フルコナ
ゾール，ピロールニトリン等の化学療法剤が使用されて
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの化学
療法剤は毒性や効力などにおいて満足すべきものではな
く、また度重なる使用による耐性菌の出現が問題となっ
てきている。この問題を解決するため、より低毒性すな
わち選択毒性の優れた臨床上有用な新規抗生物質が必要
とされている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは新規な抗生
物質の探索を目的として主に土壌中から多数の微生物を
分離し、それらの産生する抗生物質を分離し、生物学的
性質を調べたところ、ストレプトミセス属に属する放線
菌の培養濾液中にカンジダ・アルビカンスをはじめその
他の病原性微生物に対し抗菌活性を示す文献末記載の二
種類の新規抗生物質が生産されることを見出した。この
抗生物質を該培養液から単離・精製し、その物理化学的
性質を調べた結果、後述のＩ式およびII式の構造を有す
る新規化合物であることを確認し、これらの抗生物質を
それぞれＷＡＰ−５０４４ＣおよびＷＡＰ−５０４４Ａ
と命名した。

【化３】

【０００５】一方、Ｉ式を有するＷＡＰ−５０４４Ｃを
牛肝臓由来のアルギナーゼ（シグマ社製）で処理すると
グアニジノ基が分解を受けた新規誘導体が得られ、本物
質はカンジダ・ケフィールを被検菌とした寒天平板上で
の抗真菌活性がＷＡＰ−５０４４Ｃとほぼ同程度であっ
た。

【０００６】本発明は抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ｃおよ
び／またはＷＡＰ−５０４４Ａを生産するストレプトミ
セス属に属する微生物を培養し、抗生物質ＷＡＰ−５０
４４Ｃおよび／またはＷＡＰ−５０４４Ａを生成蓄積せ
しめこの培養物中より得られるＷＡＰ−５０４４Ｃおよ
びＷＡＰ−５０４４Ａまたはそれらの塩と、ＷＡＰ−５
０４４Ｃをアルギナーゼで処理して得られる誘導体およ
びそれらの製造法、さらには、抗生物質ＷＡＰ−５０４
４Ｃおよび／またはＷＡＰ−５０４４Ａを産生する能力
のある微生物と医薬品として許容し得る量の抗真菌剤と
しての用途を提供するものである。

【０００７】抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ｃおよび／また
はＷＡＰ−５０４４Ａ生産菌としては、抗生物質ＷＡＰ
−５０４４Ｃおよび／またはＷＡＰ−５０４４Ａを産生
する微生物であればどのような微生物でも良いが、抗生
物質ＷＡＰ−５０４４Ｃおよび／またはＷＡＰ−５０４
４Ａ生産菌の一例として、本発明者らが長野県長野市内
の土壌より分離したストレプトミセス属に属するＷＡＰ
−５０４４株が挙げられる。

【０００８】（生産菌の菌学的性質）ＷＡＰ−５０４４
株の菌学的性質を以下に示す。ＷＡＰ−５０４４株の形
態的特徴および分類培地上の培養所見は以下のとおりで
ある。ＷＡＰ−５０４４株は各種培地上で気菌糸を形成
し、それらは単純分枝を示す。胞子形成菌糸はらせん状
を呈し、胞子が１０個以上連鎖している。胞子は球形ま
たは楕円形で、大きさは０．７〜１．１×０．９〜１．
３μｍで、その表面はとげ状である。各種培地上で胞子
のう、鞭毛胞子、菌核などの形成は認められない。

【０００９】ＷＡＰ−５０４４株の分類培地上の生育状
態は表１のとおりである。観察は各種培地で２８℃、３
週間培養した後に行った。表１中（）内はＪＩＳ色名
帳（ＪＩＳ２８１０２準拠、日本規格協会、昭和６２
年６月１日初版、第２刷）によるものである。

【００１０】

【表１】

【００１１】ＷＡＰ−５０４４株の生理的性質はつぎの
とおりである。（１）生育温度範囲：２０〜４０℃ 最適生育温度：２５〜３０℃ （２）ゼラチンの液化：陽性（２８℃）、陰性（２０
℃）（３）スターチ加水分解：陽性（４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化：陽性（ペプトン
化）（５）メラニン様色素の生成：陰性（チロシン寒天培地
およびペプトン・イースト鉄寒天培地）（６）炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培
地）よく利用される炭素源Ｄ−グルコース、シュクロース、ラフィノース、イノシ
トール、Ｄ−マンニット中程度に利用される炭素源Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース利用されない炭素源Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノース

【００１２】一方、上述した形態的特徴、分類培地上の
生育状態および生理的性質に加え、ＷＡＰ−５０４４株
全菌体の塩酸加水分解物中よりＬＬ−ジアミノピメリン
酸が検出された。以上の性質からＷＡＰ−５０４４株は
ストレプトミセス属に属するものと判断される。

【００１３】ＷＡＰ−５０４４株の分類上の位置につい
て「インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマ
ティック・バクテリオロジー」第１８巻（１９６８
年）、第１９巻（１９６９年）、第２２巻（１９７２
年）、「バージェイズ・マニュアル・オブ・ディターミ
ネイティブ・バクテリオロジー」第８巻（１９７４年）
の菌種記載を参照し、比較したが、ＷＡＰ−５０４４株
に類似の既知菌種はみあたらなかった。従って、本発明
者らは、ＷＡＰ−５０４４株をストレプトミセス・エス
ピー・ＷＡＰ−５０４４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ，ＷＡＰ−５０４４）と称することにした。ストレ
プトミセス・エスピー・ＷＡＰ−５０４４は工業技術院
微生物工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１２５
５４として寄託されている。ストレプトミセス属を含む
放線菌の一般的性状としてその菌学的性質は極めて変異
しやすく、ＷＡＰ−５０４４株も例外ではない。従っ
て、ＷＡＰ−５０４４株が上述の性質を必ずしも示すと
はかぎらない。しかし、それらの変異株が自然的および
各種変異誘起剤による人工的なものであっても抗生物質
ＷＡＰ−５０４４Ｃおよび／またはＷＡＰ−５０４４Ａ
を生産する能力を有する微生物はすべて本発明方法にお
いて使用することができる。

【００１４】（培養と生産）本発明の抗生物質ＷＡＰ−
５０４４ＣおよびＷＡＰ−５０４４Ａは、上記生産菌を
栄養源含有培地に接種し、好気的に培養することによっ
て製造される。抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ｃおよび／ま
たはＷＡＰ−５０４４Ａの生産菌の培養に際しては、炭
素源として例えば、グルコース、フラクトース、デンプ
ン、デキストリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類、
有機酸類などの資化し得る有機炭素化合物が利用され、
一方、窒素源としては、例えば、大豆粉、綿実粉、コー
ンスチープリカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、
肉エキス、胚芽、尿素、アミノ酸類、アンモニウム塩な
どの有機窒素化合物や無機窒素化合物が利用できる。ま
た、塩類としては例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、
カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩
類が単独あるいは適宜組合わせて使用することができ
る。さらに必要に応じて、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバル
ト塩などの重金属や、微生物の生育に必要なビオチン、
ビタミンＢ₁などのビタミン類をはじめ、その他生産菌
の生育を促進し、ＷＡＰ−５０４４Ｃおよび／またはＷ
ＡＰ−５０４４Ａを著量生産することができる有機物や
無機物を適宜添加することが望ましい。また、シリコー
ンオイル、ポリアルキレングリコールエーテルなどの消
泡剤や界面活性剤を培地に加えても良い。

【００１５】培養法としては、一般に抗生物質の生産に
用いられている方法が採用されるが、液体培養法では、
特に好気性に保つために深部通気攪拌培養が好ましく、
実験室的にはフラスコによる通常の振盪培養が適してい
る。培養温度は通常２０〜４０℃で可能であるが、好ま
しくは２５〜３０℃に保つことが望ましい。培養のpHは
６〜８付近で可能であるが、好ましくは７付近に保つこ
とが望ましい。培養物中のＷＡＰ−５０４４Ｃおよび／
またはＷＡＰ−５０４４Ａの生産量は２〜６日間位で充
分達成される。

【００１６】（単離・精製）以上のごとく、培養物中に
蓄積されたＷＡＰ−５０４４ＣおよびＷＡＰ−５０４４
Ａを培養物中から採取するためには、後記する本抗生物
質の物理化学的性質を利用することによって有利に行い
得る。すなわち、ＷＡＰ−５０４４ＣおよびＷＡＰ−５
０４４Ａは培養濾液中に含有されているので、まず培養
物にセライトやラジオライトなどの濾過助剤を加えて減
圧濾過を行うか、遠心分離することによって菌体を除去
して培養濾液を得る。

【００１７】ＷＡＰ−５０４４ＣおよびＷＡＰ−５０４
４Ａ物質は後記する物理化学的性質からニンヒドリン陽
性の水溶性両性物質であることから、培養濾液中より本
物質を採取するにあたっては、通常用いられるイオン交
換クロマトグラフィーによる精製が効率的である。例え
ば、陽イオン交換体としてはアンバーライトＩＲ−１２
０Ｂ（ロームアンドハース社製）、ダウエックス５０Ｗ
（ダウケミカル社製）、ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（三菱化
成社製）の強酸性陽イオン交換樹脂や、アンバーライト
ＩＲＣ−５０（ロームアンドハース社製）、ダイヤイオ
ンＷＫ１０（三菱化成社製）の弱酸性陽イオン交換樹脂
や、ＣＭ−セファデックス、ＳＰ−セファデックス（フ
ァルマシア社製）などを用いることができる。また陰イ
オン交換体としては、例えば、アンバーライトＩＲＡ−
４０１、ＩＲＡ−６８（ロームアンドハース社製）、ダ
ウエックス１（ダウケミカル社製）、ダイヤイオンＳＡ
１０Ｂ、ＰＡ４０６、ＷＡ３０（三菱化成社製）、ＱＡ
Ｅ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セファデックス（ファ
ルマシア社製）などを用いることができる。これらのイ
オン交換樹脂に吸着せしめた抗生物質ＷＡＰ−５０４４
ＣおよびＷＡＰ−５０４４Ａは、各種の塩、アルカリ、
あるいは酸を含む水溶液あるいは緩衝液などで容易に溶
出することができる。

【００１８】後記するごとく、ストレプトミセス・エス
ピー・ＷＡＰ−５０４４株の産生する抗真菌活性物質は
３種類（ＷＡＰ−５０４４Ｃ，ＷＡＰ−５０４４Ａ，Ｗ
ＡＰ−５０４４Ｂ）存在し、これら活性物質の分離には
吸着樹脂、例えば、ダイヤイオンＨＰ２０、セパビーズ
ＳＰ２０７（三菱化成社製）、アンバーライトＸＡＤ−
２（ロームアンドハース社製）などが有利に使用できる
が、特に活性炭カラムクロマトグラフィーによる分離が
効率的である。すなわち、ＷＡＰ−５０４４Ｂ成分は活
性炭カラムクロマトグラフィーを水で溶出すると、通塔
液に溶出され、その後、ＷＡＰ−５０４４Ｃ成分は水で
溶出される。ＷＡＰ−５０４４Ａ成分は活性炭カラムに
吸着し、含水アセトンや含水メタノールで容易に回収す
ることができる。

【００１９】このようにＷＡＰ−５０４４Ｂ、ＷＡＰ−
５０４４Ｃ、およびＷＡＰ−５０４４Ａ成分を粗分離で
きた分画をそれぞれさらに不純物を除去するためには、
シリカゲルなどの吸着クロマトグラフィーを用い、例え
ば、アセトニトリル−水系で展開溶出することによっ
て、それぞれの成分を単一に分離することができる。ま
たセファデックスＧ−１０をはじめセファデックスＧ−
１５、ＬＨ−２０（ファルマシア社製）などの分子ふる
い効果を用いて水または含水メタノールなどで展開、溶
出することによって、それぞれの成分を単一にすること
もできる。また高速液体クロマトグラフィーによる分
離、精製も有利に利用できる。用いられる担体として
は、シリカゲル、あるいはオクタデシル基、オクチル
基、アミノ基などが結合した化学結合型シリカゲル、ま
たはポリスチレン系のポーラスポリマーゲルなどがあげ
られる。移動相としては含水アセトニトリルや含水メタ
ノールおよび緩衝液などを用いることができる。

【００２０】（物理化学的性質）前記に示した各種クロ
マトグラフィーを組合わせて得られたＷＡＰ−５０４４
Ｂ、ＷＡＰ−５０４４Ｃ、およびＷＡＰ−５０４４Ａの
結晶もしくは粉末について、以下に物理化学的性質を示
すが、これらの成分のうちＷＡＰ−５０４４Ｂは物理化
学的性質がβ−シアノアラニンと酷似していたので、標
品と直接比較した。その結果、機器分析を含め全ての性
質が一致したので、ＷＡＰ−５０４４Ｂをβ−シアノア
ラニンと同定した。ＷＡＰ−５０４４ＣおよびＷＡＰ−
５０４４Ａの物理化学的性質は以下のとおりである。

【００２１】ＷＡＰ−５０４４Ｃ（１）外観：白色針状結晶（吸湿性強）（２）融点：１４０〜１５０℃（分解）（３）分子量：１７４〔ＦＡＢマスｍ／ｚ：１７５
（Ｍ＋Ｈ）⁺，ｍ／ｚ：３４９（２Ｍ＋Ｈ）⁺〕（４）分子式：Ｃ₅Ｈ₁₀Ｎ₄Ｏ₃ 高分解能ＦＡＢマス実測値：ｍ／ｚ３４９．１６２４（２Ｍ＋Ｈ）⁺ 理論値：ｍ／ｚ３４９．１５８４（Ｃ₁₀Ｈ₂₁Ｎ₈Ｏ₆）（５）比旋光度：〔α〕_D ²⁰＝＋８７．２°（ｃ＝０．
５０，Ｈ₂Ｏ）（６）溶解性：水に可溶，メタノール，エタノール，ア
セトンに難溶（７）紫外線吸収スペクトル：末端吸収（水中）（８）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ錠法で測定した赤
外吸収スペクトルを図１に示す。その吸収極大値（波数cm^-1）を以下に示す。３４８０，３３９０，３１７０，１５７０，１５２０，
１４６０，１３９０，１３２０，１３００，１２００，
１１５０，１０６０，９７０，８９０，８４０，７９
０，７００，５９０，５４０，４７０，４２０，４１０（９）¹ＨＮＭＲスペクトル重水中２７０ＭＨｚで測定した図２の¹ＨＮＭＲスペ
クトルの化学シフトを以下に示す。 δ（ppm)：４．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ）、
５．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１２．１Ｈ
ｚ）、６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ）（１０）¹³ＣＮＭＲスペクトル重水中６７．９４ＭＨｚで測定した図３の¹³ＣＮＭＲ
スペクトルの化学シフトを以下に示す。 δ（ppm)：５６．８９，９８．９７，１５５．８６，１
６２．５９，１７６．９９（１１）呈色反応陽性：ニンヒドリン，過マンガン酸カリウム，エールリ
ッヒ，ヨードベーパー，ペンタシアノアンモニオフェレ
ート試薬陰性：ドラーゲンドルフ，リンモリブデン酸，坂口反応
（淡黄色）（１２）物質区分：水溶性両性物質（１３）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）

【００２２】

【表２】

【００２３】ＷＡＰ−５０４４Ａ（１）外観：淡黄白色粉末（２）融点：明確な融点を示さず（３）分子量：１７２〔ＦＡＢマスｍ／ｚ：１７３
（Ｍ＋Ｈ）⁺，ｍ／ｚ：３４５（２Ｍ＋Ｈ）⁺〕（４）分子式：Ｃ₇Ｈ₁₂Ｎ₂Ｏ₃ 高分解能ＦＡＢマス実測値：ｍ／ｚ３４５．１７６０（２Ｍ＋Ｈ）⁺ 理論値：ｍ／ｚ３４５．１７７４（Ｃ₁₄Ｈ₂₅Ｎ₄Ｏ₆）（５）比旋光度：〔α〕_D ²⁰＝＋３９．１８°（ｃ＝
０．４９，Ｈ₂Ｏ）（６）溶解性：水，メタノールに可溶アセトン，酢酸エ
チルに難溶（７）紫外線吸収スペクトル：末端吸収（水中）（８）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ錠法で測定した赤
外吸収スペクトルを図４に示す。その吸収極大値（波数cm^-1）を以下に示す。３４６０，１６２４，１３９６，４１０（９）¹ＨＮＭＲスペクトル重水中２７０ＭＨｚで測定した図５の¹ＨＮＭＲスペ
クトルの化学シフトを以下に示す δ（ppm)：２．０３（３Ｈ，ｓ）、２．０５（３Ｈ，
ｓ）、４．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ）、５．
２５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１２．４Ｈ
ｚ）、７．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ）（１０）¹³ＣＮＭＲスペクトル重水中６７．９４ＭＨｚで測定した図６の¹³ＣＮＭＲ
スペクトルの化学シフトを以下に示す δ（ppm)：１８．６４，２３．４７，５６．７３，１０
０．４０，１５５．７０，１６７．４４，１７６．５５（１１）呈色反応陽性：ニンヒドリン，過マンガン酸カリウム，エールリ
ッヒ，ヨードベーパー陰性：ドラーゲンドルフ，リンモリブデン酸（１２）物質区分：水溶性両性物質（１３）薄層クロマトグラフィー

【００２４】

【表３】

【００２５】（ＷＡＰ−５０４４Ｃをアルギナーゼで処
理して得られる新規誘導体の性質）ＷＡＰ−５０４４Ｃ
物質のアルギナーゼ処理による新規誘導体の合成につい
ては、ＷＡＰ−５０４４Ｃの化学構造中に存在するグア
ニジノオキシ基を牛肝臓由来のアルギナーゼ（シグマ社
製）の作用によってアミノオキシ基に変換できることを
明らかにした。得られた２−アミノ−４−アミノオキシ
−３−トランス−ブテノイックアシッド

【化４】は不安定であり、分子内転位と分子内脱水を起こして容
易にβ−シアノアラニン

【化５】に変化していくことを確認した。本新規誘導体は展開溶
媒アセトニトリル：水（３：１）を用いたシリカゲルＴ
ＬＣで、ニンヒドリン赤紫色のスポットを示し、そのＲ
ｆ値は０．１９を与える。このニンヒドリン陽性スポッ
トは他にヨウ素蒸気による呈色、過マンガン酸カリウム
による脱色反応から分子内に二重結合を有すること、か
つ、アミノオキシ基の呈色反応であるジャフェ（Ｊａｆ
ｆｅ）試薬に陽性であることから

【化６】の構造を有するものと判断される。

【００２６】一方、本新規誘導体の生物活性に興味が持
たれるが、カンジダ・ケフィールを被検菌としたシリカ
ゲルＴＬＣ−オートバイオグラフィーを行うと本新規誘
導体はＷＡＰ−５０４４Ｃとほぼ同程度の抗真菌活性を
示した。（生物学的性質）ＷＡＰ−５０４４ＣおよびＷＡＰ−５
０４４Ａの抗菌活性試験結果を表２に示す。最少生育阻
止濃度（ＭＩＣ）の測定は、イースト・ニトロゲン・ベ
ース・ウイズアウト・アミノアシッズ培地（ディフコ社
製）に０．５％グルコースを加えた培地（Ａ）またはペ
ンアッセイブロス（ディフコ社製）（Ｂ）を用いて液体
培地希釈法により行った。表２に示すようにＷＡＰ−５
０４４ＣおよびＷＡＰ−５０４４Ａは真菌類に対して抗
菌活性を示す。

【００２７】

【表４】

【００２８】ＷＡＰ−５０４４Ｃはカンジダ・アルビカ
ンスおよびアスペルギルス・フミガタスに対して強い抗
菌活性を示したので、そのうちカンジダ・アルビカンス
をマウスの尾静脈内に接種して得られる全身カンジダ症
感染モデルに対する治療効果を調べた。カンジダ・アル
ビカンスＴＩＭＭ０２３９株をサブロ−デキストロース
液体培地にて３７℃、一夜培養後、集菌してpH７．２の
ＰＢＳ緩衝液（日水製薬社製）に浮遊させた。このカン
ジダ・アルビカンスＴＩＭＭ０２３９株１×１０⁶個を
ＩＣＲ−ＭＣＨ系マウス、４週令、雄（日本クレア社）
の尾静脈より接種し、その２時間後に１回、その後、１
日に１回、４日間、各濃度のＷＡＰ−５０４４Ｃ物質を
含有するpH７．２のＰＢＳ緩衝液を皮下投与して、１５
日間生死を観察し、治療効果を測定した。その結果を表
３に示した。

【００２９】

【表５】

【００３０】Ｔ／Ｃは無処置対照群の平均生存日数に対
する投与群の平均生存日数を％で表した値である。ＷＡ
Ｐ−５０４４Ｃは優れた治療効果を示すことが判明し
た。

【００３１】（用途）以上のような生物学的性質からＷ
ＡＰ−５０４４株の産生する新規抗生物質および新規誘
導体はカンジダ症をはじめアスペルギルス症などの各種
真菌感染症の治療剤として有用である。

【００３２】本発明の化合物を医薬として投与する場
合、本発明化合物はそのまま、または医薬上許容される
無毒性かつ不活性の担体中に例えば、０．１％〜９９．
５％、好ましくは０．５％〜９０％含有する医薬組成物
として人を含む動物に投与される。担体としては、固
形、半固形、または液状の希釈剤、充填剤、およびその
他の処方用の助剤の一種以上が用いられる。医薬組成物
としては、投与単位形態で投与することが望ましい。本
発明の医薬組成物は経口投与、組織内投与、局所投与
（経皮投与など）または経直腸に投与することができ
る。したがって、これらの投与方法に適した剤形に公知
の製剤化技術で製剤化投与することが好ましい。

【００３３】抗真菌剤としての用量は、年令、体重等の
患者の状態、投与経路、病気の性質と罹患程度等を考慮
した上で調整するのが望ましいが、通常は成人に対して
本発明の有効成分量として、１日当り１０〜２０００mg
の範囲が一般的である。場合によっては、これ以下で足
り得るし、また逆にこれ以上の用量を必要とする場合も
ある。（必要に応じて）多量に投与するときには、１日
数回に分割して投与することが望ましい。

【００３４】

【実施例】次に実施例をもって詳細に本発明を説明する
が、これによって本発明が限定されるものではない。実施例１５００ml容の三角フラスコにグルコース２．５％脱脂大
豆粉２．０％，大豆油０．４％，塩化ナトリウム０．２
５％，炭酸カルシウム０．５％からなる培地（pH７．
２）１００mlを注入後滅菌した培地を２本用意し、これ
にストレプトミセス・エスピーＷＡＰ−５０４４株の斜
面寒天培地から１白金耳づつ接種したのち、ロータリー
シェーカーで１８０往復／分，３０℃，２日間培養を行
った。上述の培地を１００ml注入後滅菌した５００ml容
三角フラスコ８０本を用意し、先に培養した三角フラス
コの培養液をそれぞれに２mlづつ接種して、ロータリー
シェーカーで１８０往復／分，３０℃，４日間培養を行
った。なお、抗真菌活性をカンジダ・ケフィールの寒天
平板法で測定した。

【００３５】実施例２実施例１で得られた培養液を５，０００回転、１５分間
遠心し、約６リットルの培養上清を得た。上清液をダイ
ヤイオンＨＰ−２０（１．５リットル）に通過させ、水
洗（４リットル）した。通過液と水洗液を合せ、アンバ
ーライトＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ⁺型，１リットル）のカラ
ムクロマトグラフィーに付し、０．５Ｎのアンモニア水
８リットルで溶出した。溶出液を濃縮後、活性炭カラム
クロマトグラフィー（３００ml）に付し、４．５リット
ルの水で展開後、３０mlの８０％アセトン水で溶出し
た。活性物質は通過液、水洗液、８０％アセトン溶出液
のいずれにも存在していたが、アセトニトリル＝水
（３：１）で展開したシリカゲルＴＬＣで異なるＲｆ値
（ＷＡＰ−５０４４Ａ：Ｒｆ０．４０，ＷＡＰ−５０４
４Ｂ：Ｒｆ０．２７，ＷＡＰ−５０４４Ｃ：Ｒｆ０．１
２）にそれぞれ活性を有することから、いずれも異なる
活性物質であることが判明した。以上の粗精製過程で得
られた活性物質は３種類存在することから、便宜上，８
０％アセトン溶出区を５０４４Ａ，通過画分を５０４４
Ｂ，水展開画分を５０４４Ｃと仮称した。

【００３６】実施例３実施例２で得られた粗製物５０４４Ａ，Ｂ，Ｃは以下に
示す方法により単離精製した。５０４４ＡＷＡＰ−５０４４Ａを含む活性炭カラムクロマトグラフ
ィーの８０％アセトン溶出液は濃縮し、その濃縮物
（１．３ｇ）をシリカゲル（エーメルク社製，５０ｇ）
のカラムクロマトグラフィーに付し、アセトニトリル：
水（８：１）の溶媒系で溶出・分画した。活性画分（１
０００ml）を集め、濃縮後、濃縮物（３８．６４mg）を
セファデックスＧ−１０カラムクロマトグラフィー（フ
ァルマシア社製）に付し水で溶出，分画した。シリカゲ
ルＴＬＣ（アセトニトリル：水＝３：１）上ニンヒドリ
ン発色（黄色）で単一スポットを示す画分を集め濃縮し
ＷＡＰ−５０４４Ａ淡黄白色粉末９．５mgを得た。

【００３７】５０４４ＢＷＡＰ−５０４４Ｂを含む活性炭カラム通過液画分は濃
縮後、濃縮物（３．３ｇ）をシリカゲル（エーメルク社
製１２０ｇ）のカラムクロマトグラフィーに付し、アセ
トニトリル：水（８：１）の溶媒系で溶出・分画した。
活性画分（２００ml）を集め、濃縮後、濃縮物（２０
２．６mg）をセパビーズＳＰ−２０７（三菱化成社製）
に付し水で溶出・分画した。活性物質を含む画分（３０
ml）を集め濃縮し、さらにダウエックス５０Ｗ×８Ｈ⁺
型（ダウケミカル社製）に付し、水洗後、０．５Ｎアン
モニア水で溶出した。溶出液を濃縮後、水−メタノール
より結晶化を行い、ＷＡＰ−５０４４Ｂ白色針状結晶７
３．９mgを得た。本物質は各種機器分析および標品との
比較から、β−シアノアラニンと一致した。

【００３８】５０４４ＣＷＡＰ−５０４４Ｃを含む活性炭カラムクロマトグラフ
ィーの水展開溶出画分を濃縮後、濃縮物（１．５６ｇ）
をシリカゲル（エーメルク社製，６０ｇ）のカラムクロ
マトグラフィーに付し、アセトニトリル：水（５：１）
の溶媒系で溶出・分画した。活性画分（３リットル）を
集め、濃縮後、濃縮物をセファデックスＧ−１０カラム
クロマトグラフィー（ファルマシア社製）に付し、水で
溶出分画した。シリカゲルＴＬＣ（アセトニトリル：水
＝３：１）上ニンヒドリンで単一スポット（黄色）を示
す画分を集め濃縮し、ＷＡＰ−５０４４Ｃ白色粉末２５
０mgを得た。さらに、これを水−メタノールより結晶化
を行い、ＷＡＰ−５０４４Ｃ白色針状結晶８５mgを得
た。

【００３９】実施例４ＷＡＰ−５０４４Ｃの還元成績体ＷＡＰ−５０４４Ｃ５．２mgを５０％メタノール水に溶
解し、１滴の酢酸を添加し、１０％パラジウム−炭素５
mgを加え常圧下、水素で一夜接触還元を行った。反応終
了後、触媒を回収し、濾液を濃縮し、白色結晶５．３mg
を得た。本還元成績体を確認するため展開溶媒ｎ−ブタ
ノール：ピリジン：酢酸：水（１５：１０：３：１２）
を用いたセルロースＴＬＣ（アビセル）を行うと標品の
ＤＬ−ホモセリンと同一のＲｆ（０．１５）値を有する
ニンヒドリンスポット（赤紫色）を与えた。本還元成績
体の絶対立体配置を決定するため、クラウンパックＣＲ
（＋）（φ４×１５０mm，ダイセル化学工業）を用い、
過塩素酸水溶液（pH１．５）、流速０．４ml／min ，検
出波長２００nmで展開溶出した高速液体クロマトグラフ
ィーによる分析を行った。その結果、本還元成績体は、
保持時間４．４分を有するＬ−ホモセリンと一致し、Ｄ
−ホモセリンの保持時間３．２分とは異なることが明ら
かとなった。したがって、本還元成績体はＬ−ホモセリ
ンであり、ＷＡＰ−５０４４Ｃのα−炭素の絶対立体配
置はＬである。

【００４０】実施例５ＷＡＰ−５０４４Ｃのアルギナーゼ処理実施例３で得たＷＡＰ−５０４４Ｃ５０mgを２mlの蒸留
水に溶解し、１０mMＭｎＣｌ₂を０．２ml加え、１Ｎ
ＮａＯＨでpH９．４に調整した。これに牛肝臓アルギナ
ーゼ（シグマ社製）を１０mM ＭｎＣｌ₂で溶解した液
（３１２５単位／ml）を０．１６ml加え、３７℃で３．
５時間反応を行った。反応液の一部をシリカゲルＴＬＣ
（アセトニトリル：Ｈ₂Ｏ＝３：１）に付した。ニンヒ
ドリン発色の結果、図７に示したように、未反応の原料
ＷＡＰ−５０４４Ｃ（Ｒｆ値０．１２，黄色）の他に２
種類のニンヒドリン陽性物質（Ｒｆ値０．１９，赤紫
色、Ｒｆ値０．２７，緑色）が認められた。Ｒｆ値０．
２７の物質は標品との比較によりβ−シアノアラニンと
一致した。Ｒｆ値０．１９の物質はニンヒドリン、ヨウ
素蒸気、過マンガン酸カリウム、ジャフェ試薬反応陽性
であった。これらの呈色反応結果とＷＡＰ−５０４４Ｃ
の構造ならびにアルギナーゼの反応特異性を考えあわせ
ると、本物質はＷＡＰ−５０４４Ｃのグアニジノ基が加
水分解された下記式の構造を有すると判断される。

【００４１】

【化７】

【００４２】なお、アルギナーゼ処理によって得られた
新規誘導体が不安定なため、分子内転位と分子内脱水を
起こしてβ−シアノアラニンが生成したものと解釈され
る。このように不安定なため、反応液の一部を上述のシ
リカゲルＴＬＣに付した後、カンジダ・ケフィールを被
検菌としたオートバイオグラフィーを行った結果、本新
規誘導体はＷＡＰ−５０４４Ｃとほぼ同程度の抗菌活性
を有することが判明した。

【００４３】

【発明の効果】上述のとおり本発明により新規抗生物質
ＷＡＰ−５０４４ＣおよびＷＡＰ−５０４４ＡとＷＡＰ
−５０４４Ｃをアルギナーゼで処理して得られる新規誘
導体ならびにそれらの製造法が提供される。本抗生物質
ＷＡＰ−５０４４ＣおよびＷＡＰ−５０４４ＡとＷＡＰ
−５０４４Ｃをアルギナーゼで処理して得られる新規誘
導体は真菌に抗菌活性を示すことから、真菌感染症の治
療に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ｃの赤外線吸収スペ
クトル（ＫＢｒ法）図。

【図２】抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ｃの¹ＨＮＭＲス
ペクトル（２７０ＭＨｚ，重水中）図。

【図３】抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ｃの¹³ＣＮＭＲス
ペクトル（６７．９ＭＨｚ，重水中）図。

【図４】抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ａの赤外線吸収スペ
クトル（ＫＢｒ法）図。

【図５】抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ａの¹ＨＮＭＲス
ペクトル（２７０ＭＨｚ，重水中）図。

【図６】抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ａの¹³ＣＮＭＲス
ペクトル（６７．９ＭＨｚ，重水中）図。

【図７】抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ｃをアルギナーゼで
処理した反応液のシリカゲル薄層クロマトグラム。展開
溶媒アセトニトリル：水＝３：１。発色剤ニンヒドリ
ン。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 13/04 6977−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/00 8413−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者後藤正義神奈川県伊勢原市東成瀬４−２−５−408

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式【化１】で示される抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ａ及びＷＡＰ−５
０４４Ｃまたはその塩。
【請求項２】抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ｃをアルギナ
ーゼで処理して得られる下記式で示される誘導体または
その塩。【化２】
【請求項３】ストレプトミセス属に属し、抗生物質Ｗ
ＡＰ−５０４４Ａおよび／またはＷＡＰ−５０４４Ｃを
生産する能力を有する微生物を培地中で培養し、培養物
中に抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ａおよび／またはＷＡＰ
−５０４４Ｃを生産蓄積せしめ、次いでこれを採取する
ことを特徴とする抗生物質ＷＡＰ−５０４４Ａおよび／
またはＷＡＰ−５０４４Ｃの製造法。
【請求項４】ストレプトミセス属に属する抗生物質Ｗ
ＡＰ−５０４４Ａおよび／またはＷＡＰ−５０４４Ｃの
生産菌。
【請求項５】請求項１および２記載の抗生物質または
誘導体から選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分
とする抗真菌剤。