JPH05111396A - クレアチンキナ−ゼの活性測定方法 およびそれに用いる試薬 - Google Patents
クレアチンキナ−ゼの活性測定方法 およびそれに用いる試薬Info
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- JPH05111396A JPH05111396A JP20108191A JP20108191A JPH05111396A JP H05111396 A JPH05111396 A JP H05111396A JP 20108191 A JP20108191 A JP 20108191A JP 20108191 A JP20108191 A JP 20108191A JP H05111396 A JPH05111396 A JP H05111396A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 クレアチンリン酸、ＡＤＰ、ヘキソキナーゼ
（グルコキナーゼ）、グルコース、グルコース−６−リ
ン酸脱水素酵素、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）を少なくとも含む
反応系と被検試料とを接触せしめて、クレアチンキナー
ゼの活性を測定する。 【効果】 微量のクレアチンキナーゼであっても正確且
つ効率的に測定することができる。
（グルコキナーゼ）、グルコース、グルコース−６−リ
ン酸脱水素酵素、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）を少なくとも含む
反応系と被検試料とを接触せしめて、クレアチンキナー
ゼの活性を測定する。 【効果】 微量のクレアチンキナーゼであっても正確且
つ効率的に測定することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、クレアチンキナーゼ
（以下ＣＫと称することもある）の高感度活性測定方
法、及びそれに使用する測定試薬に関する。
（以下ＣＫと称することもある）の高感度活性測定方
法、及びそれに使用する測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＣＫは、骨格筋、心筋、脳、および平滑
筋など生体内に広く分布し、２つのサブユニットからな
るダイマー蛋白質である。サブユニットには、Ｍ（ｍｕ
ｓｃｌｅ）とＢ（ｂｒａｉｎ）があり、その組み合わせ
によってＣＫ−ＢＢ（ＣＫ１）、ＣＫ−ＭＢ（ＣＫ
２）、ＣＫ−ＭＭ（ＣＫ３）の３つのアイソザイムが知
られている。ＣＫ−ＢＢは主に脳に、ＣＫ−ＭＭは主に
骨格筋に存在している。血中のＣＫ活性は進行性筋ジス
トロフィー症、多発性筋炎、急性心筋梗塞、甲状腺機能
低下症などの疾病で上昇するため、血中のＣＫ活性を測
定することは臨床学的に非常に有用である。また、ＣＫ
−ＭＢは心筋に高濃度に存在しているため血中のＣＫ−
ＭＢ活性を測定することは心筋障害の有無やその程度、
特に急性心筋梗塞の診断には欠くことのできない項目と
なっている。
筋など生体内に広く分布し、２つのサブユニットからな
るダイマー蛋白質である。サブユニットには、Ｍ（ｍｕ
ｓｃｌｅ）とＢ（ｂｒａｉｎ）があり、その組み合わせ
によってＣＫ−ＢＢ（ＣＫ１）、ＣＫ−ＭＢ（ＣＫ
２）、ＣＫ−ＭＭ（ＣＫ３）の３つのアイソザイムが知
られている。ＣＫ−ＢＢは主に脳に、ＣＫ−ＭＭは主に
骨格筋に存在している。血中のＣＫ活性は進行性筋ジス
トロフィー症、多発性筋炎、急性心筋梗塞、甲状腺機能
低下症などの疾病で上昇するため、血中のＣＫ活性を測
定することは臨床学的に非常に有用である。また、ＣＫ
−ＭＢは心筋に高濃度に存在しているため血中のＣＫ−
ＭＢ活性を測定することは心筋障害の有無やその程度、
特に急性心筋梗塞の診断には欠くことのできない項目と
なっている。
【０００３】従来、ＣＫ活性の測定方法としては種々の
方法が報告されているが、近年臨床検査には、ドイツ臨
床化学会、スカンジナビア臨床化学会、フランス臨床生
物学会や国際臨床化学連合などが定めている方法が多く
用いられている。その方法を概約すると、クレアチンリ
ン酸とＡＤＰを基質とし未知のＣＫ活性の血中を反応液
に添加する。するとクレアチンリン酸とＡＤＰが血中の
ＣＫ活性に依存しクレアチンとＡＴＰに変換される。Ａ
ＴＰはその後ヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１，以
下ＨＫということもある）あるいはグルコキナーゼ（Ｅ
Ｃ ２．７．１．２，以下ＧＫということもある）など
の酵素反応によってグルコース存在下グルコース−６−
リン酸へと導かれる。グルコース−６−リン酸は今度
は、補酵素ＮＡＤＰと共にグルコース−６−リン酸脱水
素酵素（ＥＣ １．１．１．４９，以下Ｇ６ＰＤＨとい
うこともある）によって６−フォスフォグルコン酸とＮ
ＡＤＰＨへと変化する。ここで産生するＮＡＤＰＨの増
加速度を分光学的に測定することによりこれに比例する
ＣＫ活性を求めるというものである。
方法が報告されているが、近年臨床検査には、ドイツ臨
床化学会、スカンジナビア臨床化学会、フランス臨床生
物学会や国際臨床化学連合などが定めている方法が多く
用いられている。その方法を概約すると、クレアチンリ
ン酸とＡＤＰを基質とし未知のＣＫ活性の血中を反応液
に添加する。するとクレアチンリン酸とＡＤＰが血中の
ＣＫ活性に依存しクレアチンとＡＴＰに変換される。Ａ
ＴＰはその後ヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１，以
下ＨＫということもある）あるいはグルコキナーゼ（Ｅ
Ｃ ２．７．１．２，以下ＧＫということもある）など
の酵素反応によってグルコース存在下グルコース−６−
リン酸へと導かれる。グルコース−６−リン酸は今度
は、補酵素ＮＡＤＰと共にグルコース−６−リン酸脱水
素酵素（ＥＣ １．１．１．４９，以下Ｇ６ＰＤＨとい
うこともある）によって６−フォスフォグルコン酸とＮ
ＡＤＰＨへと変化する。ここで産生するＮＡＤＰＨの増
加速度を分光学的に測定することによりこれに比例する
ＣＫ活性を求めるというものである。
【０００４】またＣＫ−ＭＢの測定としては電気泳動法
やカラムクロマトグラフィーを用いた方法があるが、分
析に長時間を要したり、操作が複雑である上に感度が低
いためあまり利用されていない。一般にはＣＫ−Ｍに対
する阻害抗体で血中の主なアイソザイムであるＣＫ−Ｍ
Ｍの活性を阻害し、阻害されないでいるＣＫ−ＭＢを上
記勧告法に基づく方法にて測定してきている。既知のよ
うにＮＡＤＰＨの分子吸光係数は３４０ｎｍにおいてミ
リモル／リッターあたり６．２〜６．３と低いため、検
体が健常人からのものだと１分間あたりの吸光度が０．
０１も変化しないため測定精度に問題が非常に多かっ
た。高感度化の方法としてホルマザンを用いる方法もあ
るが、ホルマザンは還元されると不溶性になるので自動
分析機やセルやチューブ類を汚すためあまり好まれては
利用されていない。
やカラムクロマトグラフィーを用いた方法があるが、分
析に長時間を要したり、操作が複雑である上に感度が低
いためあまり利用されていない。一般にはＣＫ−Ｍに対
する阻害抗体で血中の主なアイソザイムであるＣＫ−Ｍ
Ｍの活性を阻害し、阻害されないでいるＣＫ−ＭＢを上
記勧告法に基づく方法にて測定してきている。既知のよ
うにＮＡＤＰＨの分子吸光係数は３４０ｎｍにおいてミ
リモル／リッターあたり６．２〜６．３と低いため、検
体が健常人からのものだと１分間あたりの吸光度が０．
０１も変化しないため測定精度に問題が非常に多かっ
た。高感度化の方法としてホルマザンを用いる方法もあ
るが、ホルマザンは還元されると不溶性になるので自動
分析機やセルやチューブ類を汚すためあまり好まれては
利用されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した技
術の現状に鑑みてなされたものであって、非常に微量な
クレアチンキナーゼをも正確に且つ熟練を要することな
く簡便に測定することができ、自動化ないし多数のサン
プルの測定を可能とする、クレアチンキナーゼの高感度
分析システムを新規に開発することを、その目的とする
ものである。
術の現状に鑑みてなされたものであって、非常に微量な
クレアチンキナーゼをも正確に且つ熟練を要することな
く簡便に測定することができ、自動化ないし多数のサン
プルの測定を可能とする、クレアチンキナーゼの高感度
分析システムを新規に開発することを、その目的とする
ものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】かかる課題を解決するた
め本発明者らは鋭意研究を行った結果、Ｇ６ＰＤＨが、
ＮＡＤＰよりも分子吸光係数の大きなチオ−ＮＡＤある
いはチオ−ＮＡＤＰに反応するという性質に新たに着目
し、勧告法（従来法）におけるＮＡＤＰにかえてチオ−
ＮＡＤ（Ｐ）を用いたところ、産生されるチオ−ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈが容易に分光学的に測定できるのみでなく、チ
オ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加速度を分光学的に正確に追跡
できることをはじめて確認し、この新知見を基礎として
更に研究を行い、遂にクレアチンキナーゼ活性を測定す
る新しい高感度測定方法を開発するのに成功した。
め本発明者らは鋭意研究を行った結果、Ｇ６ＰＤＨが、
ＮＡＤＰよりも分子吸光係数の大きなチオ−ＮＡＤある
いはチオ−ＮＡＤＰに反応するという性質に新たに着目
し、勧告法（従来法）におけるＮＡＤＰにかえてチオ−
ＮＡＤ（Ｐ）を用いたところ、産生されるチオ−ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈが容易に分光学的に測定できるのみでなく、チ
オ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加速度を分光学的に正確に追跡
できることをはじめて確認し、この新知見を基礎として
更に研究を行い、遂にクレアチンキナーゼ活性を測定す
る新しい高感度測定方法を開発するのに成功した。
【０００７】すなわち、本発明は、生体試料中のクレア
チンキナーゼの測定方法であって、クレアチンリン酸、
ＡＤＰ、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、グルコ
ース、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及び、チオニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下チオ−ＮＡ
Ｄと称する）またはチオニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸（以下チオ−ＮＡＤＰと称する）をすく
なくとも含む反応系と、被検試料とを接触せしめ、検出
できる変化を検出することを基本的技術思想とするもの
である。
チンキナーゼの測定方法であって、クレアチンリン酸、
ＡＤＰ、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、グルコ
ース、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及び、チオニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下チオ−ＮＡ
Ｄと称する）またはチオニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸（以下チオ−ＮＡＤＰと称する）をすく
なくとも含む反応系と、被検試料とを接触せしめ、検出
できる変化を検出することを基本的技術思想とするもの
である。
【０００８】本発明に係るクレアチンキナーゼの測定方
法の基本原理を勧告法（従来法）と比較して示すと、下
記の表１のとおりである。
法の基本原理を勧告法（従来法）と比較して示すと、下
記の表１のとおりである。
【０００９】
【表１】
【００１０】本発明は、更に、その測定を効率的に行う
ことができるように、必要に応じてマグネシウム塩、還
元剤、クレアチンキナーゼのサブユニットＭを阻害する
抗体、及び／またはｐＨが６〜７の範囲に最適なバッフ
ァーを反応系に共存せしめる方法を包含するものであ
り、更に必要あればＥＤＴＡ、ＡＭＰ及び／又はＰ1，
Ｐ5−ジアデノシン−５’−ペンタリン酸を共存せしめ
る方法も包含するものである。
ことができるように、必要に応じてマグネシウム塩、還
元剤、クレアチンキナーゼのサブユニットＭを阻害する
抗体、及び／またはｐＨが６〜７の範囲に最適なバッフ
ァーを反応系に共存せしめる方法を包含するものであ
り、更に必要あればＥＤＴＡ、ＡＭＰ及び／又はＰ1，
Ｐ5−ジアデノシン−５’−ペンタリン酸を共存せしめ
る方法も包含するものである。
【００１１】更にまた本発明は、クレアチンキナーゼの
活性測定試薬にも関するものであって、マグネシウム
塩、還元剤、ＡＤＰ、グルコース、チオ−ＮＡＤあるい
はチオ−ＮＡＤＰ、ヘキソキナーゼあるいはグルコキナ
ーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、クレアチン
リン酸を基本的組成とし、必要に応じてクレアチンキナ
ーゼのサブユニットＭに対する阻害抗体を配合し、更に
必要あれば、ＥＤＴＡ、ＡＭＰ、Ｐ1，Ｐ5−ジアデノシ
ン−５’−ペンタリン酸、及び／又はｐＨが６〜７の範
囲に最適なバッファーを含有することを特徴とするもの
である。
活性測定試薬にも関するものであって、マグネシウム
塩、還元剤、ＡＤＰ、グルコース、チオ−ＮＡＤあるい
はチオ−ＮＡＤＰ、ヘキソキナーゼあるいはグルコキナ
ーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、クレアチン
リン酸を基本的組成とし、必要に応じてクレアチンキナ
ーゼのサブユニットＭに対する阻害抗体を配合し、更に
必要あれば、ＥＤＴＡ、ＡＭＰ、Ｐ1，Ｐ5−ジアデノシ
ン−５’−ペンタリン酸、及び／又はｐＨが６〜７の範
囲に最適なバッファーを含有することを特徴とするもの
である。
【００１２】本発明に係る測定試薬において、好適な実
施態様の１例としては次の組成が挙げられる：
施態様の１例としては次の組成が挙げられる：
【００１３】最終濃度として、約０〜２０ｍＭのＥＤＴ
Ａ、約１〜１００ｍＭのマグネシウム塩、約１〜１００
ｍＭの還元剤、約０．１〜２０ｍＭのＡＤＰ、約０〜５
０ｍＭのＡＭＰ、約０〜１００μＭのＰ1，Ｐ5−ジアデ
ノシン−５’−ペンタリン酸、約２〜２００ｍＭのグル
コース、約０．０５〜５ｍＭのチオ−ＮＡＤあるいはチ
オ−ＮＡＤＰ、約０．３〜３０ユニット／ｍｌのヘキソ
キナーゼあるいはグルコキナーゼ、約０．１〜２０ユニ
ット／ｍｌのグルコース−６−リン酸脱水素酵素、約１
〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、約０．０１〜５ユニ
ット／ｍｌのクレアチンキナーゼのサブユニットＭを阻
害する抗体量、及びｐＨが６〜７の範囲に最適なバッフ
ァー。
Ａ、約１〜１００ｍＭのマグネシウム塩、約１〜１００
ｍＭの還元剤、約０．１〜２０ｍＭのＡＤＰ、約０〜５
０ｍＭのＡＭＰ、約０〜１００μＭのＰ1，Ｐ5−ジアデ
ノシン−５’−ペンタリン酸、約２〜２００ｍＭのグル
コース、約０．０５〜５ｍＭのチオ−ＮＡＤあるいはチ
オ−ＮＡＤＰ、約０．３〜３０ユニット／ｍｌのヘキソ
キナーゼあるいはグルコキナーゼ、約０．１〜２０ユニ
ット／ｍｌのグルコース−６−リン酸脱水素酵素、約１
〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、約０．０１〜５ユニ
ット／ｍｌのクレアチンキナーゼのサブユニットＭを阻
害する抗体量、及びｐＨが６〜７の範囲に最適なバッフ
ァー。
【００１４】本発明においては、既述のようにチオ−Ｎ
ＡＤ（Ｐ）を使用する点が重要の特徴のひとつとするも
のであるが、チオ−ＮＡＤあるいはチオ−ＮＡＤＰは報
告にあるように〔バイオケミストリー、２、１０１５〜
１０１７（１９６３）〕、還元されるとそれぞれ波長３
９８ｎｍ、３９９ｎｍに吸収ピークが出現してくる。そ
れゆえ還元が進むにつれて微黄色から黄色〜橙色への変
化が観測できる。分子吸光係数はミリモル／リッターあ
たりそれぞれ１１．９、１１．７と大きく、ＮＡＤＰの
それの６．２〜６．３と比較するとおよそ１．９倍であ
る。チオ−ＮＡＤ、チオ−ＮＡＤＰ、またはそれぞれの
還元型であるチオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨいずれ
も水溶性であるために、自動分析機のセルやチューブ類
を汚す心配は必要ない。
ＡＤ（Ｐ）を使用する点が重要の特徴のひとつとするも
のであるが、チオ−ＮＡＤあるいはチオ−ＮＡＤＰは報
告にあるように〔バイオケミストリー、２、１０１５〜
１０１７（１９６３）〕、還元されるとそれぞれ波長３
９８ｎｍ、３９９ｎｍに吸収ピークが出現してくる。そ
れゆえ還元が進むにつれて微黄色から黄色〜橙色への変
化が観測できる。分子吸光係数はミリモル／リッターあ
たりそれぞれ１１．９、１１．７と大きく、ＮＡＤＰの
それの６．２〜６．３と比較するとおよそ１．９倍であ
る。チオ−ＮＡＤ、チオ−ＮＡＤＰ、またはそれぞれの
還元型であるチオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨいずれ
も水溶性であるために、自動分析機のセルやチューブ類
を汚す心配は必要ない。
【００１５】本発明に使用できるチオ−ＮＡＤおよびチ
オ−ＮＡＤＰは遊離酸型またはアルカリ金属やアンモニ
ウムなどの塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよ
く、純度が高いものほど望まれるが、ＮＡＤやＮＡＤ
Ｐ、チオ−ＮＡＤＨやチオ−ＮＡＤＰＨ、波長３９０〜
４１０ｎｍに吸収のある不純物や本発明の反応系に干渉
を及ぼす物質、例えば、ＡＴＰ、グルコース−６−リン
酸、クレアチン、クレアチンキナーゼ、リン酸、上記共
役酵素のインヒビター、グルコース脱水素酵素、フォス
ファターゼ、アデニレートキナーゼ、ＮＡＤアーゼなど
の混在が、無いか、あるいは微量であれば純度について
特に規定されない。
オ−ＮＡＤＰは遊離酸型またはアルカリ金属やアンモニ
ウムなどの塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよ
く、純度が高いものほど望まれるが、ＮＡＤやＮＡＤ
Ｐ、チオ−ＮＡＤＨやチオ−ＮＡＤＰＨ、波長３９０〜
４１０ｎｍに吸収のある不純物や本発明の反応系に干渉
を及ぼす物質、例えば、ＡＴＰ、グルコース−６−リン
酸、クレアチン、クレアチンキナーゼ、リン酸、上記共
役酵素のインヒビター、グルコース脱水素酵素、フォス
ファターゼ、アデニレートキナーゼ、ＮＡＤアーゼなど
の混在が、無いか、あるいは微量であれば純度について
特に規定されない。
【００１６】また、本発明に使用できるグルコース−６
−リン酸脱水素酵素としては、チオ−ＮＡＤをもちいる
場合にはチオ−ＮＡＤに反応性のある酵素であれば良
く、チオ−ＮＡＤＰをもちいる場合にはチオ−ＮＡＤＰ
に反応性のある酵素であれば良い。ＮＡＤに反応する酵
素はチオ−ＮＡＤに反応し、ＮＡＤＰに反応する酵素は
チオ−ＮＡＤＰに反応するので、チオ−ＮＡＤをもちい
る場合には、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ，Ｚｙｍｏｍｏｎ
ａｓ，Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ，動物赤血球などの由来のＧ６ＰＤＨが使用できる
し、チオ−ＮＡＤＰをもちいる場合には、Ｌｅｕｃｏｎ
ｏｓｔｏｃ，Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ，Ａｚｏｔｏｂａｃｔ
ｅｒ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，動物赤血球、動物肝
臓、酵母、Ｃａｎｄｉｄａなどの由来のＧ６ＰＤＨが使
用できる。酵素形態も問わず、硫安サスペンション、凍
結乾燥物、結晶物、いずれの形態の酵素も使用可能であ
るが、本発明の支障となる混合物質は上記チオ−ＮＡＤ
およびチオ−ＮＡＤＰのそれと同様で本反応系に干渉を
及ぼす物質や安定性を著しく低下させる物質の混在はな
るべくさける。
−リン酸脱水素酵素としては、チオ−ＮＡＤをもちいる
場合にはチオ−ＮＡＤに反応性のある酵素であれば良
く、チオ−ＮＡＤＰをもちいる場合にはチオ−ＮＡＤＰ
に反応性のある酵素であれば良い。ＮＡＤに反応する酵
素はチオ−ＮＡＤに反応し、ＮＡＤＰに反応する酵素は
チオ−ＮＡＤＰに反応するので、チオ−ＮＡＤをもちい
る場合には、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ，Ｚｙｍｏｍｏｎ
ａｓ，Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ，動物赤血球などの由来のＧ６ＰＤＨが使用できる
し、チオ−ＮＡＤＰをもちいる場合には、Ｌｅｕｃｏｎ
ｏｓｔｏｃ，Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ，Ａｚｏｔｏｂａｃｔ
ｅｒ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，動物赤血球、動物肝
臓、酵母、Ｃａｎｄｉｄａなどの由来のＧ６ＰＤＨが使
用できる。酵素形態も問わず、硫安サスペンション、凍
結乾燥物、結晶物、いずれの形態の酵素も使用可能であ
るが、本発明の支障となる混合物質は上記チオ−ＮＡＤ
およびチオ−ＮＡＤＰのそれと同様で本反応系に干渉を
及ぼす物質や安定性を著しく低下させる物質の混在はな
るべくさける。
【００１７】本発明においてマグネシウム塩としては、
酢酸マグネシウム、塩化マグネシウムその他の塩類が単
用ないし２種以上使用可能である。また還元剤として
は、本反応系を阻害しないものであればすべての還元剤
が適宜単用ないし２種以上併用可能であって、その例と
しては次のものが挙げられる：Ｎ−アセチルシステイ
ン、システイン、２−メルカプトエタノール、還元型グ
ルタチオン、ジチオトレイトール、ジチオエリトリオー
ル、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム及びチオ
グリセロール。
酢酸マグネシウム、塩化マグネシウムその他の塩類が単
用ないし２種以上使用可能である。また還元剤として
は、本反応系を阻害しないものであればすべての還元剤
が適宜単用ないし２種以上併用可能であって、その例と
しては次のものが挙げられる：Ｎ−アセチルシステイ
ン、システイン、２−メルカプトエタノール、還元型グ
ルタチオン、ジチオトレイトール、ジチオエリトリオー
ル、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム及びチオ
グリセロール。
【００１８】本発明に係る測定方法を実施するには、被
検試料と上記した測定試薬とを接触せしめて表１に示し
た測定原理にしたがって反応させ、検出できる変化を測
定すればよい。検出できる変化としては、例えばグルコ
ース−６−リン酸の変化、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）の変化等
を、化学的、生物学的ないし分光学的に測定すればよ
く、特に工業的見地、多数の検出測定等の見地からする
と、３９０〜４１０ｎｍの吸光度を測定する方法といっ
た比色法による測定が有効である。
検試料と上記した測定試薬とを接触せしめて表１に示し
た測定原理にしたがって反応させ、検出できる変化を測
定すればよい。検出できる変化としては、例えばグルコ
ース−６−リン酸の変化、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）の変化等
を、化学的、生物学的ないし分光学的に測定すればよ
く、特に工業的見地、多数の検出測定等の見地からする
と、３９０〜４１０ｎｍの吸光度を測定する方法といっ
た比色法による測定が有効である。
【００１９】次いで本発明を説明するため実施例をあげ
て具体的に述べるが、本発明はこれによって何等限定さ
れるものではない。
て具体的に述べるが、本発明はこれによって何等限定さ
れるものではない。
【００２０】
【実施例１】
【００２１】〈試薬〉下記表２及び表３に示す組成にし
たがって、試薬Ｒ−１〜Ｒ−３（対照１〜３）、試薬Ｓ
−１〜Ｓ−３（本試験１〜３）、及び試薬−２をそれぞ
れ調製した。
たがって、試薬Ｒ−１〜Ｒ−３（対照１〜３）、試薬Ｓ
−１〜Ｓ−３（本試験１〜３）、及び試薬−２をそれぞ
れ調製した。
【００２２】
【表−２】
【００２３】
【表−３】
【００２４】〈測定方法〉
【００２５】検体としては、コントロール血清（モニト
ロールＩＩ、デード社製）を３２倍希釈したものを用い
た。なお、モニトロールＩＩ中のＣＫ活性は、２７４Ｕ
／Ｌ（国際臨床化学連合の勧告法にて測定）であった。
ロールＩＩ、デード社製）を３２倍希釈したものを用い
た。なお、モニトロールＩＩ中のＣＫ活性は、２７４Ｕ
／Ｌ（国際臨床化学連合の勧告法にて測定）であった。
【００２６】上記検体（１０μｌ）、及び、試薬Ｒ−１
〜Ｒ−３又は試薬Ｓ−１〜Ｓ−３（２００μｌ）を攪拌
し、３０℃にて５分間加熱した後、試薬−２（２０μ
ｌ）を加え攪拌、３０℃にて２分間放置後２分間の吸光
度を測定する。対照では３４０ｎｍを、本試験では４０
５ｎｍを日立製７１５０自動分析機を使用して測定し
た。ｎ数はすべて１２。その結果を下記表４で表わされ
る第１表に示す。第１表を見れば分かるように本発明の
方法をもちいると、平均吸光度変化量が大きくなりそれ
に伴いＣＶ値が小さくなり測定の正確さの向上が認めら
れる。
〜Ｒ−３又は試薬Ｓ−１〜Ｓ−３（２００μｌ）を攪拌
し、３０℃にて５分間加熱した後、試薬−２（２０μ
ｌ）を加え攪拌、３０℃にて２分間放置後２分間の吸光
度を測定する。対照では３４０ｎｍを、本試験では４０
５ｎｍを日立製７１５０自動分析機を使用して測定し
た。ｎ数はすべて１２。その結果を下記表４で表わされ
る第１表に示す。第１表を見れば分かるように本発明の
方法をもちいると、平均吸光度変化量が大きくなりそれ
に伴いＣＶ値が小さくなり測定の正確さの向上が認めら
れる。
【００２７】
【表４】
【００２８】
【実施例２】実施例１で作製した試薬Ｒ−２（対照）と
試薬Ｓ−２（Ｇ６ＰＤＨ濃度は１．７Ｕ／ｍｌ）を用
い、検体としてモニトロールＩＩの１倍、２倍、４倍、
８倍、１６倍、３２倍希釈液を調整し使用、操作は実施
例１と同様におこなった。ｎ数はすべて１０。ＣＫ活性
のスタンダードカーブを図１に、平均変化量及びＣＶを
下記表５で示される第２表にまとめた。対照も本発明も
２７４Ｕ／ＬまでのＣＫ活性では直線性があるが、本発
明の吸光度変化量は対照のそれの約１．６倍の傾きが得
られた。ＣＶは対照より下がり本発明の効果が認められ
る。
試薬Ｓ−２（Ｇ６ＰＤＨ濃度は１．７Ｕ／ｍｌ）を用
い、検体としてモニトロールＩＩの１倍、２倍、４倍、
８倍、１６倍、３２倍希釈液を調整し使用、操作は実施
例１と同様におこなった。ｎ数はすべて１０。ＣＫ活性
のスタンダードカーブを図１に、平均変化量及びＣＶを
下記表５で示される第２表にまとめた。対照も本発明も
２７４Ｕ／ＬまでのＣＫ活性では直線性があるが、本発
明の吸光度変化量は対照のそれの約１．６倍の傾きが得
られた。ＣＶは対照より下がり本発明の効果が認められ
る。
【００２９】
【表５】
【００３０】
【実施例３】実施例１で作製した試薬Ｒ−２（対照）と
試薬Ｓ−２（Ｇ６ＰＤＨ濃度は１．７Ｕ／ｍｌ）に検体
中のＣＫ−ＭＭが２，０００Ｕ／Ｌまで阻害するＣＫ−
Ｍ抗体を添加した試薬を用い、実施例１と同様の操作に
て、検体中のＣＫ−ＭＢ活性を測定した。ｎ数はすべて
２０。その結果を、下記表６で表わされる第３表に示し
た。本発明の方法を用いると対照と良く相関する上に吸
光度変化量の増加に伴うＣＶ値の改良が認められた。
試薬Ｓ−２（Ｇ６ＰＤＨ濃度は１．７Ｕ／ｍｌ）に検体
中のＣＫ−ＭＭが２，０００Ｕ／Ｌまで阻害するＣＫ−
Ｍ抗体を添加した試薬を用い、実施例１と同様の操作に
て、検体中のＣＫ−ＭＢ活性を測定した。ｎ数はすべて
２０。その結果を、下記表６で表わされる第３表に示し
た。本発明の方法を用いると対照と良く相関する上に吸
光度変化量の増加に伴うＣＶ値の改良が認められた。
【００３１】
【表６】
【００３２】
【発明の効果】本発明によれば、非常に微量なクレアチ
ンキナーゼをも正確に且つ熟練を要することなく簡便に
測定することができ、自動化ないし多数のサンプルの測
定が可能となり、本発明は臨床診断において多大の貢献
をなすものである。
ンキナーゼをも正確に且つ熟練を要することなく簡便に
測定することができ、自動化ないし多数のサンプルの測
定が可能となり、本発明は臨床診断において多大の貢献
をなすものである。
【図１】クレアチンキナーゼ活性のスタンダードカーブ
である。
である。
【表２】
【表３】
フロントページの続き (72)発明者 北 原 哲 夫 大阪府守口市大庭町 １−105 (72)発明者 古 堅 千 鶴 大阪府泉佐野市長滝 1137−２
Claims (10)
- 【請求項１】 クレアチンリン酸、ＡＤＰ、ヘキソキナ
ーゼまたはグルコキナーゼ、グルコース、グルコース−
６−リン酸脱水素酵素及び、チオニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（以下チオ−ＮＡＤと称する）または
チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以
下チオ−ＮＡＤＰと称する）をすくなくとも含む反応系
と、被検試料とを接触せしめ、検出できる変化を検出す
ることを特徴とするクレアチンキナーゼの活性測定方
法。 - 【請求項２】 上記反応系に、更にクレアチンキナーゼ
のサブユニットＭに対する阻害抗体を共存させること、
を特徴とする請求項１の測定方法。 - 【請求項３】 検出できる変化が補酵素の吸光度の変化
であることを特徴とする請求項１または請求項２の測定
方法。 - 【請求項４】 マグネシウム塩、還元剤、ＡＤＰ、グル
コース、チオ−ＮＡＤあるいはチオ−ＮＡＤＰ、ヘキソ
キナーゼあるいはグルコキナーゼ、グルコース−６−リ
ン酸脱水素酵素、クレアチンリン酸を少なくとも含有す
ることを特徴とするクレアチンキナーゼの活性測定試
薬。 - 【請求項５】 最終濃度として、約１〜１００ｍＭのマ
グネシウム塩、約１〜１００ｍＭの還元剤、約０．１〜
２０ｍＭのＡＤＰ、約２〜２００ｍＭのグルコース、約
０．０５〜５ｍＭのチオ−ＮＡＤあるいはチオ−ＮＡＤ
Ｐ、約０．３〜３０ユニット／ｍｌのヘキソキナーゼあ
るいはグルコキナーゼ、約０．１〜２０ユニット／ｍｌ
のグルコース−６−リン酸脱水素酵素、約１〜１００ｍ
Ｍのクレアチンリン酸よりなる組成のクレアチンキナー
ゼの活性測定試薬。 - 【請求項６】 更に、クレアチンキナーゼのサブユニッ
トＭに対する阻害抗体を含有することを特徴とする請求
項４の測定試薬。 - 【請求項７】 更に、ＥＤＴＡ、ＡＭＰ、Ｐ1，Ｐ5−ジ
アデノシン−５’−ペンタリン酸、及び／又はｐＨが６
〜７の範囲に最適なバッファーを含有することを特徴と
する請求項４あるいは請求項６の測定試薬。 - 【請求項８】 マグネシウム塩が酢酸マグネシウム及び
／又は塩化マグネシウムであり、還元剤が、Ｎ−アセチ
ルシステイン、システイン、２−メルカプトエタノー
ル、還元型グルタチオン、ジチオトレイトール、ジチオ
エリトリオール、臭化２−アミノエチルイソチオウロニ
ウム及びチオグリセロールからなる群から選ばれたもの
であること、を特徴とする請求項４〜請求項７のいずれ
か１項の測定試薬。 - 【請求項９】 最終濃度として、約０〜２０ｍＭのＥＤ
ＴＡ、約１〜１００ｍＭの酢酸マグネシウム、あるいは
塩化マグネシウム、約１〜１００ｍＭのＮ−アセチルシ
ステイン、あるいはシステイン、２−メルカプトエタノ
ール、還元型グルタチオン、ジチオトレイトール、ジチ
オエリトリオール、臭化２−アミノエチルイソチオウロ
ニウム、チオグリセロールなどの還元剤、約０．１〜２
０ｍＭのＡＤＰ、約０〜５０ｍＭのＡＭＰ、約０〜１０
０μＭのＰ1，Ｐ5−ジアデノシン−５’−ペンタリン
酸、約２〜２００ｍＭのグルコース、約０．０５〜５ｍ
Ｍのチオ−ＮＡＤあるいはチオ−ＮＡＤＰ、約０．３〜
３０ユニット／ｍｌのヘキソキナーゼまたはグルコキナ
ーゼ、約０．１〜２０ユニット／ｍｌのグルコース−６
−リン酸脱水素酵素、約１〜１００ｍＭのクレアチンリ
ン酸、および、ｐＨが６〜７の範囲に最適なバッファー
よりなる組成のクレアチンキナーゼの活性測定試薬。 - 【請求項１０】 更に、約０．０１〜５ユニット／ｍｌ
のクレアチンキナーゼのサブユニットＭを阻害する抗体
量を含有する組成からなることを特徴とする請求項９の
測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20108191A JPH05111396A (ja) | 1991-07-17 | 1991-07-17 | クレアチンキナ−ゼの活性測定方法 およびそれに用いる試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20108191A JPH05111396A (ja) | 1991-07-17 | 1991-07-17 | クレアチンキナ−ゼの活性測定方法 およびそれに用いる試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05111396A true JPH05111396A (ja) | 1993-05-07 |
Family
ID=16435080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20108191A Pending JPH05111396A (ja) | 1991-07-17 | 1991-07-17 | クレアチンキナ−ゼの活性測定方法 およびそれに用いる試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05111396A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995030769A1 (en) * | 1994-05-06 | 1995-11-16 | Beckman Instruments, Inc. | Liquid stable thiol activator |
| EP0721986A3 (en) * | 1995-01-13 | 1996-09-11 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Reagent for creatine kinase |
| EP0790302A1 (en) * | 1996-02-16 | 1997-08-20 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Novel hexokinase |
| CN110554179A (zh) * | 2019-09-10 | 2019-12-10 | 四川新健康成生物股份有限公司 | 一种抗肝素干扰的ckmb测定试剂盒 |
| CN114150040A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-03-08 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒及其制备方法 |
-
1991
- 1991-07-17 JP JP20108191A patent/JPH05111396A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995030769A1 (en) * | 1994-05-06 | 1995-11-16 | Beckman Instruments, Inc. | Liquid stable thiol activator |
| EP0721986A3 (en) * | 1995-01-13 | 1996-09-11 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Reagent for creatine kinase |
| EP0790302A1 (en) * | 1996-02-16 | 1997-08-20 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Novel hexokinase |
| CN110554179A (zh) * | 2019-09-10 | 2019-12-10 | 四川新健康成生物股份有限公司 | 一种抗肝素干扰的ckmb测定试剂盒 |
| CN110554179B (zh) * | 2019-09-10 | 2022-06-28 | 四川新健康成生物股份有限公司 | 一种抗肝素干扰的ckmb测定试剂盒 |
| CN114150040A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-03-08 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒及其制备方法 |
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