JPH082316B2 - アデノシンデアミナーゼ測定用試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は体液、例えば血清中のアデノシンデアミナー
ゼの活性を測定する試薬に関する。

（従来技術） アデノシンデアミナーゼは核酸代謝に関与し、アデノ
シンを脱アミノ化してイノシンとアンモニアを生成する
酵素である。この酵素は各種悪性腫瘍、肝疾患、炎症性
疾患、細胞性免疫疾患などに関与することから、体液中
のアデノシンデアミナーゼ活性を測定することは臨床的
意義があるといわれている。

従来から、アデノシンデアミナーゼ活性測定法として
は基質としてアデノシンを使用し、生成したアンモニア
をインドフェノール反応により定量する方法（インドフ
ェノール法）が公知である（検査と技術14巻135−140
頁、1986年）。この測定法は内因性アンモニアの影響を
受けるばかりでなく、アデノシンデアミナーゼによる酵
素反応とインドフェノール反応を分けて行う必要がある
ため、操作が煩雑で長時間を要する。また試料中にイン
ドフェノール反応を起こす成分、例えばフェノール誘導
体が存在するため、検体盲検が必要であるなどの欠点を
有する。

一方、アデノシンデアミナーゼによる酵素反応で生成
したアンモニアをグルタミン酸脱水素酵素を用いて測定
する方法が公知である（検査と技術14巻、135−140頁、
1986年）。この測定法はアンモニアにα−ケトグルタル
酸と還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（以下
NADPHと略する）の存在下でグルタミン酸脱水素酵素を
反応させ、NADPHの減少量を波長340nmで測定する方法で
ある。しかし、この方法はインドフェノール法と同様
に、体液中の内因性アンモニアの影響を大きく受けるた
めに、精度、正確性において問題があった。

またアンモニアを中間体としないアデノシンデアミナ
ーゼの測定法としては、アデノシンデアミナーゼによる
酵素反応にプリンヌクレオチドフォスフォリラーゼ（以
下PNPと略する）とキサンチンオキシダーゼ（以下XODと
略する）を作用させ、生成するスーパーオキサイドアニ
オン▲Ｏ⁻ _２▼に直接テトラゾリウム塩を作用させ、ホ
ルマザン色素を生成させる方法が公知である（臨床検査
29巻、705−708頁、1985年）。さらにアデノシンデアミ
ナーゼによる酵素反応にPNP,XODを共役させたとき生成
する過酸化水素をNADPHの存在下でテトラゾリウム塩を
用いてホルマザン色素を生成する方法も公知である（特
開昭62−40300号公報）。しかしながら、ホルマザン色
素を生成する方法は難溶性ホルマザン色素を使用するた
め、器具や測定ラインへの色素沈着の問題がある。特
に、前者（スーパーオキサイドアニオンを測定）は▲Ｏ
⁻ _２▼の発生率が低く、感度不足の欠点がある。また後
者（過酸化水素を測定）はNADPHの関与する内因性乳酸
脱水素酵素の影響を受け、正誤差を生じる問題を有す
る。

（発明の解決しようとする課題） 本発明の目的は、アデノシンデアミナーゼ活性を測定
する方法において従来から問題にされていた内因性アン
モニアの影響、検体盲検測定の必要性、測定感度の不
足、測定ライン等への色素沈着、乳酸脱水素酵素等の共
存物質による正誤差等の問題を解決した、新規でかつ精
度の高いアデノシンデアミナーゼ測定用試薬を提供する
ことにある。

（課題を解決するための手段） 本発明はアデノシン、プリンヌクレオチドホスホラリ
ーゼ（以下PNPと略する）、リン酸またはリン酸塩、キ
サンチンオキシダーゼ（以下XODと略する）、ペルオキ
シダーゼ、４−アミノアンチピリンまたは３−メチル−
２−ベンゾチアゾリン−ヒドラゾンおよびＮ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−ト
ルイジンを含むことを特徴とするアデノシンデアミナー
ゼ測定用試薬である。本発明に用いるPNPは微生物由来
のものなどがある。本発明の試薬中、PNPの量は反応液
中0.1−30u/mlとなる量が好ましい。

本発明に用いるXODはミルク由来のもの、微生物由来
のものなどがあり、たとえば牛ミルク由来のXODが挙げ
られる。本発明の試薬中、XODの量は反応液中0.01−1.0
u/mlとなる量が好ましい。

本発明に使用するペルオキシダーゼは植物由来のも
の、微生物由来のものなどがあり、たとえば西洋ワサビ
由来のものを挙げることができる。本発明の試薬中、ペ
ルオキシダーゼの量は反応液中0.01−50u/mlとなる量が
好ましい。

本発明の試薬中、４−アミノアンチピリンまたは３−
メチル−２−ベンゾチアゾリン−ヒドラゾン（以下、水
素供与体とも呼ぶ）の量は反応液中0.1〜10mMとなる量
であれば良い。

本発明に使用するアニリン誘導体とは、Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−ト
ルイジンである。

本発明の試薬中、アニリン誘導体の量は反応液中0.1
−50mMとなる量が好ましい。

本発明の試薬は通常、pH6−８の緩衝液とともに使用
する。

本発明の試薬の液性の調整に用いる緩衝液はアデノシ
ンデアミナーゼの活性測定域で緩衝能を示すものであれ
ば特に制限されない。たとえばリン酸緩衝液、グッド緩
衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。

本発明の試薬には必要により、スーパーオキサイドジ
スムターゼ（以下SODと略する）、アスコルビン酸オキ
シダーゼ（以下ASOと略する）またはカタラーゼ、フェ
リシアン化カリウムを添加しても良い。

本発明の試薬には酵素反応または呈色反応を円滑に行
わせるために、他の化合物を添加しても良い。このよう
な化合物として、たとえば安定化剤、界面活性剤、賦活
剤等が挙げられる。

本発明の試薬は以下の測定反応を利用する。

本発明は上記式から明らかなように、アデノシンから
アデノシンデアミナーゼにより生成したイノシンに、PN
P,リン酸またはリン酸塩を作用させ、生成するヒポキサ
ンチンにXODを作用させて過酸化水素とキサンチンを生
成させる。生じたキサンチンにさらにXODを作用させて
過酸化水素と尿酸に分解させ、ヒポキサンチンにより生
じた過酸化水素との総量をペルオキシダーゼ、４−アミ
ノアンチピリンまたは３−メチル−２−ベンゾチアゾリ
ン−ヒドラゾンおよびアニリン誘導体を用いてキノン色
素を測定する。キノン色素の測定は通常、540〜650nmの
波長の吸光度測定を行う。

本発明の試薬は、試料に全測定試薬を１度に加えて反
応させる１ステップ法、試料に試薬を２回に分けて加え
て反応を行う２ステップ法に使用する。特にPNP,XOD,ペ
ルオキシダーゼおよび必要によりSODを含む試薬を第１
試薬とし、アデノシン、４−アミノアンチピリンまたは
３−メチル−２−ベンゾチアゾリン−ヒドラゾン、アニ
リン誘導体を含む試薬を第２試薬とする２ステップ法が
好ましい。

２ステップ法では、第１ステップにおいて試料中に存
在する若干量のキサンチン、ヒポキサンチンおよびアス
コルビン酸等をPNP,XODまたカタラーゼ、ASOでもって前
処理をおこない、試料中のキサンチン、ヒポキサンチ
ン、アスコルビン酸の影響を回避することが出来る。第
２ステップでは基質のアデノシンを含む試薬が用いられ
て、アデノシンデアミナーゼの酵素反応と呈色反応が同
時に行われる。レート法ではこの呈色反応の単位時間当
りの呈色の増加を測定する。また、測定感度の向上のた
めSODを添加することが好ましい。

本発明に必要により使用するSODは動物由来のもの、
微生物由来のものがあり、たとえば牛血清由来のものを
挙げることができる。本発明の試薬中、SODの量は反応
液中２−1000μ/mlとなる量であれば良い。本発明に必
要により使用するASOは植物由来のものなどがあり、例
えばキュウリ由来のものを挙げることができる。

（発明の効果） 本発明ではPNPおよびXODにより生じた過酸化水素をペ
ルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンまたは３−メ
チル−２−ベンゾチアゾリン−ヒドラゾン、アニリン誘
導体により測定する方法であるから、乳酸脱水素酵素等
の共存物質の影響を受けることが少ない測定法である。
本発明の試薬はアニリン誘導体を使用するが、フェノー
ル誘導体を使用すると感度がアニリン誘導体に比べて低
くなる。

（実施例） 以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例 1. 下記組成ＡおよびＢを有する試液を調製し、血清２検
体に該試薬を添加して下記測定法を実施した。

組成Ａ 第１試液:0.25Mリン酸緩衝液（pH7.0）に、PNPを６μ
/ml、XODを0.15μ/ml、ペルオキシダーゼを20μ/mlおよ
びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）−ｍ−トルイジンを2mMの濃度になるように溶解
した。

第２試液:0.25Mリン酸緩衝液（pH7.0）に、アデノシ
ンを20mM、４−アミノアンチピリンを1mMの濃度になる
ように溶解した。

組成Ｂ 第１試液：組成Ａの第１試液に、SODを200μ/mlの濃
度になるように添加した。

第２試液：組成Ａの第２試液と同じ組成である。

測定法 試料50μｌに、上記第１試液1.5mlおよび第２試液1.5
mlを添加し、第２試液分注後、３−５分後の吸光度変化
を、試薬ブランクを対照として、37℃、波長550nmで測
定した。測定結果を第１表に示す。

比較例 1. 下記組成Ｃを有する試液を調製し、血清２検体に該試
薬を添加して下記測定法を実施した。

組成Ｃ 試液:0.05Mトリス緩衝液（pH8.0）に、アデノシンを2
0mM,α−ゲトグルタル酸を5mM、NADPHを0.16mM、および
グルタミン酸脱水素酵素10u/mlの濃度になるように溶解
した。

測定法 試料20μｌ、試液3mlを加え、試液分注後、３−５分
後の吸光度変化を、試薬ブランクを対照として、37℃、
波長340nmで測定した。測定結果を第１表に示す。

比較例 2. 下記組成Ｄを有する試液を調製し、血清２検体に該試
薬を添加して下記測定法を実施した。

組成Ｄ 第１試液:0.05Mリン酸緩衝液（pH7.15）に、XODを80
μ/l、ウリカーゼを100u/l、ペルオキシダーゼを3000μ
/l、フェノールを0.01％、ニトロテトラゾリウムブルー
を0.04％の濃度となるように溶解した。

第２試液:0.05Mリン酸緩衝液（pH7.15）に、アデノシ
ンを0.5mM、PNPを50μ/l、NADPHを1.25Mおよびトリトン
Ｘ−100を0.1％の濃度になるように溶解した。

測定法 試料20μｌ、第１試液:1.0ml、第２試液1.0mlを加
え、37℃、10分間、加温後、反応停止液1.0mlを加え、
試薬ブランクを対照として波長580nmで吸光度変化を測
定した。その結果を第１表に示す。

第１表から明らかなように、本発明の試薬ＡおよびＢ
は従来の試薬ＣおよびＤに比べて感度が高い。

実施例 2. 下記組成ＥおよびＦを有する試薬を調製し、血清２検
体に実施例１と同じ方法を実施した。

組成Ｅ 第１試液:0.25Mリン酸緩衝液（pH7.0）に、PNPを６μ
/ml、XODを0.15μ/ml、ペルオキシダーゼを20μ/mlおよ
びＮ−エチル−Ｎ−（スルホプロピル−ｍ−アニシジン
を2mMの濃度になるように溶解した。

第２試液:0.25Mリン酸緩衝液（pH7.0）に、アデノシ
ンを20mM、３−メチル−２−ベンゾチアゾリン−ヒドラ
ゾンを1mMの濃度になるように溶解した。

組成Ｆ 第１試液：組成Ｅの第１試液にフェロシアン化カリウ
ムを0.001mg/mlの濃度になるように溶解した。

第２試液：組成Ｅの第２試液と同じである。

測定結果を第２表に示す。

比較例 3. 下記組成Ｇを有する試液を調製し、血清２検体に実施
例１と同じ方法を実施した。

組成Ｇ 第１試液:0.25Mリン酸緩衝液（pH7.0）に、PNPを６μ
/ml、XODを0.15μ/ml、ペルオキシダーゼを20μ/mlおよ
びフェノール2mMの濃度になるように溶解した。

第２試液：組成Ａの第２試液と同じである。

測定結果を第２表に示す。

第２表から明らかなように、本発明の試薬ＥおよびＦ
ではフェノール系化合物を使用する試薬Ｇに比べて感度
が高い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−40300（ＪＰ，Ａ) 日本農芸化学会編「ＡＢＣシリーズ」 酵素 −バイオテクノロジーへの指針 ▲Ｉ▼」朝倉書店（1985−３−20）Ｐ. 99〜100

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アデノシン、プリンヌクレオチドホスホリ
   ラーゼ、リン酸またはリン酸塩、キサンチンオキシダー
   ゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンまたは
   ３−メチル−２−ベンゾチアゾリン−ヒドラゾンおよび
   Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
   ル）−ｍ−トルイジンを含むことを特徴とするアデノシ
   ンデアミナーゼ測定用試薬。