JPH05130865A - ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスＳ
Ｆ−１２９３株のホスホエノールピルビン酸ホスホムタ
ーゼをコードする遺伝子を含むハイブリドプラスミドを
構築し、このハイブリドプラスミドを用いてストレプト
マイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・ハイグロ
スコピカス、ストレプトマイセス・ベデモレンシスを形
質転換した。これらの形質転換株はホスホエノールピル
ビン酸ホスホムターゼ活性を発現した。ホスホエノール
ピルビン酸ホスホムターゼをコードする遺伝子のＤＮＡ
の塩基配列を決定し、またホスホエノールピルビン酸ホ
スホムターゼのアミノ酸配列を決定した。 【効果】 本発明によれば、ホスホエノールピルビン酸
ホスホムターゼ活性の増強が可能となり、ビアラホスや
ホスホマイシン等のＣ−Ｐ結合を有する抗生物質または
その中間体の生産性向上に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の背景］

【０００２】

【産業上の利用分野】本発明はＣ−Ｐ結合を有する抗生
物質の生合成に関与するホスホエノールピルビン酸ホス
ホムターゼ及びそれをコードする遺伝子のＤＮＡに関
し、またそれらＤＮＡを組み込んだハイブリッドプラス
ミドで宿主菌を形質転換させて得られた新規な微生物に
関するものである。ホスホエノールピルビン酸ホスホム
ターゼはビアラホスやホスホマイシン等のＣ−Ｐ結合を
有する抗生物質の生合成経路の第一段階に関与する酵素
である (T.Hidaka et al.: J.Antibiotics, 42, 491(19
89)) 。基質となるホスホエノールピルビン酸は抗生物
質等の二次代謝物の生産とＴＣＡサイクル等の一次代謝
の分岐点に位置する物質である。ホスホエノールピルビ
ン酸からホスホノピルビン酸を生成する酵素であるホス
ホエノールピルビン酸ホスホムターゼの活性を微生物中
に増強することは、微生物によるビアラホスやホスホマ
イシン等のＣ−Ｐ結合を有する抗生物質またはその中間
体の生産性を向上させるに有用である。

【０００３】

【従来の技術】ビアラホスは放線菌ストレプトマイセス
・ハイグロスコピカス(Streptomyceshygroscopicus)が
生産する除草剤であり、天然物としては極めて稀な炭素
とリンが直接結合したＣ−Ｐ結合を有する構造をもつこ
とが特徴である。その構造が特異なことから、ビアラホ
スがどのように生産されるかという、いわゆる生合成研
究が本発明者らにより詳細に進められてきた。その研究
の過程でビアラホスの生合成の第一段階がホスホエノー
ルピルビン酸の分子内転位でホスホノピルビン酸が生じ
る反応であることが明らかとなった。しかも興味深いこ
とに、この反応に関与する酵素ホスホエノールピルビン
酸ホスホムターゼの活性がＣ−Ｐ結合を有する抗生物質
であるホスホマイシンを生産するストレプトマイセス・
ベデモレンシス(Streptomyces wedmorensis)や、シリア
チンを生産するテトラヒメナにも存在することが見いだ
された。すなわちホスホエノールピルビン酸ホスホムタ
ーゼはＣーＰ化合物を生産する生物に共通した酵素であ
り、Ｃ−Ｐ化合物の生合成に重要な意味を持つことが示
唆された。

【０００４】本酵素の性状については最近、テトラヒメ
ナ、放線菌等について解明がなされてきているが(H.M.S
eidel et al.: Nature, 335 , 457(1988), T.Hidaka et
al.: J.Antibiotics, 42, 491(1989)) 、この酵素タ
ンパク質のアミノ酸配列に関する報告はなされていな
い。また本酵素をコードする遺伝子は本発明者らにより
特開昭６１−５８５８９号公報に示されたビアラホス生
合成遺伝子群に含まれると推定されるが、本酵素をコー
ドする遺伝子のみを取出してクローン化し、形質転換法
によって本酵素を発現させる試みはなされていなかっ
た。

【０００５】［発明の概要］

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的の一つ
は、Ｃ−Ｐ化合物の生産に極めて有用な酵素であるホス
ホエノールピルビン酸ホスホムターゼを遺伝子工学的に
収得することであり、他の目的は該酵素をコードする遺
伝子ＤＮＡを収得し、そして該遺伝子をクローン化しそ
の発現を人為的に制御する技術を開発することである。

【０００７】

【問題点を解決するための手段】ビアラホス生合成遺伝
子群は既にクローン化されているが（特開昭６１ー５８
５８９号公報参照）、ホスホエノールピルビン酸ホスホ
ムターゼをコードする遺伝子の特定化を行うため本発明
者らは今回、研究を進めた。このためには、まずホスホ
エノールピルビン酸ホスホムターゼ欠損株を相補してビ
アラホスの生産を回復させるＤＮＡ断片を特定化して収
得した。さらにそのＤＮＡ断片を発現ベクターに組み込
んだプラスミドを構築し、そのプラスミドを用いて放線
菌ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces livi
dans) 、ストレプトマイセス．ハイグロスコピカスやス
トレプトマイセス．ベデモレンシスを形質転換し、組換
え形質転換体のホスホエノールピルビン酸ホスホムター
ゼ活性を測定した。その結果、後記の実施例に示すとお
り、既知のベクタープラスミドｐＩＪ６８０のアミノグ
リコシドホスホトランスフェラーゼ(aph) 遺伝子内のBa
mHI 部位中に、既知のハイブリッドプラスミドｐＭＳＢ
２−４（特開昭６１−５８５８９号）から得られる１．
３キロベース（Ｋｂ）のBclI断片を挿入して構築された
新規なハイブリッドプラスミドｐＭＳＢ３２を導入され
て保持する放射菌の組換え形質転換株にホスホエノール
ピルビン酸ホスホムターゼ活性が発現できたことが認め
られた。これらの知見に基づいて、本発明者らは、前記
の１．３ＫｂのBclI断片の塩基配列を決定し、その結果
から、ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ遺伝子
に相当するＤＮＡの塩基配列を決定した。このようにし
てホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼをコードす
る遺伝子を決定して収得し、更に該遺伝子のクローン化
と酵素活性の発現を行い、そしてホスホエノールピルビ
ン酸ホスホムターゼのアミノ配列も決定して本発明を完
成した。

【０００８】［発明の具体的説明］関連微生物の寄託 ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼをコードする
遺伝子を組み込んだ前記の新規なプラスミドｐＭＳＢ３
２は本発明者らが先に得たハイブリッドプラスミドｐＭ
ＳＢ２−４から容易に構築できる（その詳細は後記す
る）が、そのｐＭＳＢ２−４によって形質転換されたビ
アラホス生合成欠損株ストレプトマイセス・ハイグロス
コピカスＮＰ５０の形質転換株は、すでにＦＥＲＭ Ｐ
−７８０５として工業技術院微生物工業研究所に寄託さ
れている。また、ストレプトマイセス・ハイグロスコピ
カスＮＰ５０は、ホスホエノールピルビン酸ホスホムタ
ーゼの欠損株であり、この微生物自体はＦＥＲＭ Ｐ−
７８０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６８に移行）として工
業技術院微生物工業研究所に寄託されている（特開昭６
１−５８５８９号又は特公平３−３２３５８号公報参
照）。遺伝子の供給源であるストレプトマイセス（以
下、単にＳ．と略す）．ハイグロスコピカスＳＦ−１２
９３株はＦＥＲＭ ＢＰ−１３０として工業技術院微生
物工業研究所に寄託されている。また、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ２１７０５
として寄託されていて分譲可能な状態にある。宿主とし
て用いうるＳ．リビダンス６６の菌学的性質は、特開昭
５９ー１７５８８９号公報及びJ.Virology, 9 , 258(19
72) に開示されており、またこの微生物自体はＦＥＲＭ
ＢＰ−７３７として工業技術院微生物工業研究所に寄
託されている。Ｓ．ベデモレンシスはアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ２１２３９と
して寄託されていて分譲可能な状態にある。

【０００９】ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ 第１の本発明によるホスホエノールピルビン酸ホスホム
ターゼは、後記する配列表の配列番号２の配列で表され
るアミノ酸配列を有するタンパク質及びその同効物であ
る。ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼはホスホ
エノールピルビン酸の分子内転移により、ホスホノピル
ビン酸が生成する反応を触媒する。ここで「同効物」と
は、この同効物とされるタンパク質がホスホエノールピ
ルビン酸ホスホムターゼ活性を有する限りホスホエノー
ルピルビン酸ホスホムターゼそれ自体のアミノ酸のいく
つかについて欠失、置換、付加等がされているものをい
う。

【００１０】ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ遺伝子 第２の本発明によるＤＮＡは、後記する配列表の配列番
号２の配列で表されるアミノ酸配列をコードするホスホ
エノールピルビン酸ホスホムターゼ遺伝子またはその同
効物を含有してなるものであるか、あるいは該遺伝子を
構成するＤＮＡそのものである。

【００１１】ここで「ＤＮＡ」という用語は、非環状の
フラグメントとしての存在の他に、それを組み込んだ環
状体、すなわちプラスミドとしての存在を包含するもの
である。

【００１２】第２の本発明によるＤＮＡに包含される新
規ＤＮＡの典型的な塩基配列は、後記する配列表の配列
番号１の配列中の３７０−１３０８位の９３９塩基対か
らなるものであり、この９３９塩基対からなるＤＮＡが
ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ遺伝子をなす
ものである。

【００１３】タンパク質のアミノ酸配列が与えられれ
ば、それをコードするＤＮＡ塩基配列は、いわゆる遺伝
暗号表を参照して容易に定まり、前記したアミノ酸配列
をコードする種々のＤＮＡ塩基配列を適宜選択すること
ができる。従って、本発明による配列表の配列番号２の
配列で表されるアミノ酸配列をコードするホスホエノー
ルピルビン酸ホスホムターゼ遺伝子とは、そのＤＮＡ塩
基配列が前記した配列表の配列番号１の配列中の９３９
塩基対からなるＤＮＡ並びにその縮重異性体を包含す
る。ここで、「縮重異性体」とは、縮重関係にあるコド
ンが使用されている以外は塩基配列が同一で同一のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを意味するものとする。

【００１４】さらに本発明によるＤＮＡは、前記した９
３９塩基対の塩基配列をもつＤＮＡ及びその縮重異性体
の他に、その「同効物」を包含する。ここで「同効物」
とは、遺伝的に等価な改変体、すなわちいくつかの塩基
の欠失、置換、付加等がなされていても帯有遺伝情報に
実質的に差のないＤＮＡ、例えば前記したホスホエノー
ルピルビン酸ホスホムターゼの同効物をコードするＤＮ
Ａ塩基配列、を意味する。

【００１５】ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ遺伝子の取得 本発明によるＤＮＡは、その塩基配列が定まっているこ
とから、そのＤＮＡを取得するひとつの手段は、核酸合
成の方法に従って製造することである。

【００１６】本発明によるＤＮＡは、また、ホスホエノ
ールピルビン酸ホスホムターゼの生産能を持つ菌株（例
えばＳ・ハイグロスコピカスまたはその変異株）の遺伝
子から切り出す方法で得ることも可能であって、この方
法によるのが好ましい。この方法によるＤＮＡの取得
は、遺伝子工学の分野で慣用されている技術により行う
ことができる。ホスホエノールピルビン酸ホスホムター
ゼ遺伝子はビアラホス生合成遺伝子群のうちの一つであ
ると推定される。放線菌の抗生物質生合成遺伝子は群を
なしているのが一般的であるからである。従って、既に
クローン化されているビアラホス生合成遺伝子（特開昭
６１ー５８５８９号公報参照）の中からサブクローニン
グによって、ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ
遺伝子の選別を行うのが最も効率的である。その方法を
簡単に以下に説明するが、さらなる具体的方法について
は後記実施例を参照されたい。

【００１７】（１）ＤＮＡ供与体 本発明によるＤＮＡの供与体（採取源）の好ましい例と
しては、前記したＳ・ハイグロスコピカスＳＦ−１２９
３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３０）が挙げられる。このＳ
・ハイグロスコピカスの染色体ＤＮＡを制限酵素BclIで
消化して得られる１．３Ｋｂの断片は、図１に示される
制限酵素地図を与える。前記したＳ・ハイグロスコピカ
スの変異株例えばＳ．ハイグロスコピカスＮＰ５０の形
質転換株（ＦＥＲＭ Ｐ−７８０５）も、そのＤＮＡの
供与体として好ましい。この菌株から得られるＤＮＡ断
片も、図１に示された制限酵素地図を与えるＤＮＡを有
するものである。

【００１８】すなわち、上記のＦＥＲＭ Ｐ−７８０５
株中に挿入されたハイブリッドプラスミドｐＭＳＢ２−
４を分離し、これを制限酵素BclIで切断すると、図１の
制限酵素地図をもつ１．３ＫｂのBclI断片が生成され
る。

【００１９】（２）遺伝子のサブクローニング 一般的な遺伝子操作技術はホップウッドらの実験書(Gen
etic Manipulation ofStreptomyces, A laboratory man
ual (1985))を参照することができるが、その一例を挙
げれば、下記の通りである。

【００２０】ビアラホス生合成の第一ステップを欠損す
るビアラホス非生産株ＮＰ５０（ＦＥＲＭ Ｐ−７８０
４）のビアラホス生産性はビアラホス生合成遺伝子を含
む前記プラスミドｐＭＳＢ２−４（図２）の１．３Ｋｂ
のBclI断片で回復することが今回、見出された。このこ
とから、該１．３ＫｂのBclI断片にはホスホエノールピ
ルビン酸ホスホムターゼ遺伝子が含有されていることが
推定された。そこで、本発明で目的とする遺伝子のＤＮ
Ａを含むＤＮＡ断片を得るために、プラスミドｐＭＳＢ
２−４を収得して、それのＤＮＡをBclIで切断する。他
方、ベクタープラスミドは別にBclIと付着末端を同じく
するBamHI 、BglII 、BclI等の制限酵素で切断する。こ
れらプラスミドを夫々に切断して得られたＤＮＡ断片を
混合し、適当なリガーゼ例えばＴ４リガーゼでライゲー
ション処理することにより、目的のハイブリッドプラス
ミドを構築することができる。

【００２１】ここで使用し得るベクタープラスミドとし
ては、BamHI 、BglII 、BclI等のBclIと同じ付着末端を
有しているとともに、これらの制限酵素で切断されたと
きに増殖可能な断片を与えるベクタープラスミドが一般
に適当である。例えば、放線菌、大腸菌、枯草菌その他
の合目的的な微生物由来のものが好ましく、具体例とし
ては放線菌由来のプラスミドｐＩＪ７０２(John Innes
研究所より入手可能。文献： E.Katz et al.: J.Genera
l Microbiology, 129 , 2703(1983)) 及びｐＩＪ６８０
(John Innes 研究所より入手可能。文献： D.A.Hopwood
et al.: Genetic Manipulation of Streptomyces, A l
aboratory manual (1985))等が挙げられる。

【００２２】目的プラスミドを、それを既に含有する宿
主菌から取得するには、上記文献の記載の技術その他遺
伝子組換えに慣用されているところに従えばよい。

【００２３】次に、得られたプラスミドによって別の適
当な宿主菌を形質転換する。このための宿主菌は、用い
るベクターの種類に応じて、放線菌、大腸菌、枯草菌そ
の他の微生物の中から適宜選択されてよい。ベクターが
放線菌プラスミドである場合に、形質転換用の宿主菌と
しては放線菌が適当であるが、好ましい例としては前記
のＳ・リビダンス６６が挙げられる。

【００２４】プラスミドを宿主菌に形質転換のため導入
する方法としては、宿主菌やベクターの種類によって最
も効率のよい方法が選択される。放線菌のプラスミドベ
クターを使用する場合は、宿主菌のプロトプラストを形
質転換するのが最も一般的な方法である。形質転換によ
って得られた、組換え体の選別には、用いるベクターの
保有する遺伝的指標、例えば、抗生物質耐性、ポック形
成(M.J.Bibb et al.:Molec.Gen.Genet., 154 , 155(197
7), Nature 274 , 398(1978))等が利用できる。

【００２５】得られたハイブリッドプラスミドがホスホ
エノールピルビン酸ホスホムターゼをコードする遺伝子
を含むクローンであるかの確認は、このクローンを培養
し、ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ活性を示
すか否かを調べればよい。

【００２６】ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ
は反応の平衡がホスホエノールピルビン酸の生じる逆反
応の方向、すなわち、Ｃ−Ｐ結合の分解する方向に著し
く偏っている。従って、本酵素の活性は、逆反応により
生じるホスホエノールピルビン酸をラクテートデヒドロ
ゲナーゼとピルベートキナーゼのカップル法により定量
することができる。

【００２７】得られたホスホエノールピルビン酸ホスホ
ムターゼをコードする遺伝子を含むクローンを培養し、
菌体より公知の方法(J. Bacteriol., 135 , 227 (197
8)) によってプラスミドを単離することができる。な
お、ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼをコード
する遺伝子を含むクローンであることの確認は、単離し
たプラスミドを再び宿主菌に導入して、ホスホエノール
ピルビン酸ホスホムターゼ活性を調べることによって行
えばよい。

【００２８】得られたハイブリッドプラスミドをBclI酵
素で切断し、そして得られたＤＮＡ断片を各種制限酵素
によってさらに切断し、アガロースゲル電気泳動を行っ
て各断片の大きさを分析することにより、制限酵素切断
地図を作成することができる。さらに各断片を適当なベ
クターに組み込んで、再クローニングを行うことによ
り、ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼをコード
する遺伝子の所在の確定と該遺伝子の構造解析を行い、
その特性を明らかにすることができる。

【００２９】第２の本発明によるホスホエノールピルビ
ン酸ホスホムターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ
は、それの制限酵素切断地図が図１に示された通りであ
ることが見出されている。

【００３０】

【実施例１】プラスミドｐＭＳＢ３２とｐＭＳＢ３３の構築 予め分離されたプラスミドｐＭＳＢ２−４（図２）のＤ
ＮＡ５μg を総量50μl のＨ−バッファー（50mM Tris-
HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10mM MgCl_２, 1mM ジチオスレ
イトール）中で制限酵素BclI10単位を加えて、37℃で２
時間反応させた。酵素消化物を0.8 ％アガロースゲル電
気泳動にかけ、泳動後、１．３ＫｂのBclI断片をゲルか
ら切り出した。ＤＮＡ回収用フィルター付き遠心チュー
ブ（宝酒造社製）を用いてBclI断片を精製し、30μl の
ＴＥＳＬバッファー（10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA,
2.5mM NaCl)に溶解した。

【００３１】別に、ベクタープラスミドｐＩＪ６８０の
ＤＮＡ１μg を、総量20μl のＨ−バッファー中で、制
限酵素BamHI １単位を加えて、37℃で２時間反応させ
た。これを70℃で１０分間加熱して酵素を失活させてか
ら、1/20量の１M Tris-HCl,pH9.0を添加し、さらにカー
フ・インテスチン・アルカライン・ホスファターゼを２
単位加えて、37℃で１時間反応させた。この反応液に、
ＴＥＳＨバッファー（ＴＥＳＬバッファーの２０倍濃
度）を飽和させたフェノール溶液を等量加えて１分間振
盪し、5000Xg／5 分間の遠心分離後、上層（水層）を取
り出した。

【００３２】ＤＮＡを含むこの水層部分をエチルエーテ
ル抽出に付し、フェノールを除去してから２倍量のエタ
ノール、1/10量の３M 酢酸ナトリウムを加え、−80℃で
２時間放置後、5000Xg/10 分間の遠心分離でＤＮＡを沈
澱させた。このようにして得たＤＮＡを500 μlのエタ
ノールで洗浄し、減圧下で乾燥してから、20μl のＴＥ
ＳＬバッファーに溶解した。

【００３３】前記のｐＭＳＢ２−４由来の１．３Ｋｂの
BclI断片とプラスミドｐＩＪ６８０由来の上記のプラス
ミドＤＮＡを合併し、70℃で１０分間加熱処理し、つい
で室温まで徐冷し、ライゲーションキット（宝酒造社
製）を用いて15℃で一晩ライゲション反応をさせて、組
換えＤＮＡの混合物を生成させた。

【００３４】これら組換えＤＮＡをＳ・リビダンス６６
(Lomovskaya et al.: Genetics, 68, 341(1971))の形質
転換のため導入する。この形質転換はチェイター等の公
知の方法 (Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96, 69
(1982)) に従って行った。

【００３５】すなわち、先づ50mlのＹＥＭＥ培地(34%
ショ糖、0.3% イーストエキストラクト、0.5% バクト
ペプトン、0.3% マルトエキストラクト、1% グルコー
ス、5mM MgCl_２、0.5% グリシン、pH7.0)にＳ．リビダ
ンス６６を接種して30℃で36時間振盪培養を行った。10
000Xg の遠心分離で菌糸を集めて、10.3% ショ糖溶液で
１回洗浄した後、10ml のＰ培地 (0.3M ショ糖、 1.4
mM K_２SO_４、10mM MgCl _２、0.4mM KH_２PO_４、25mM CaC
l _２、25mM ＴＥＳ緩衝液、pH7.2 、1/500 量微量元素
溶液) に懸濁させた（微量元素溶液の組成（１リットル
中： 40mg ZnCl_２、200mg FeCl_３・6H_２O 、 10mg CuCl
_２・2H_２O 、 10mg MnCl_２・4H_２O 、10mg Na_２B _４O
_７・ 10H_２O 、10mg (NH_４) _６Mo_７O _２４・4H_２O)) 。

【００３６】ついで、最終濃度1mg/mlになるように卵白
リゾチームを加え、30℃に30分間保温してプロトプラス
トを形成させ、プロトプラスト化しなかった菌糸は綿濾
過で除去した。800Xg/7 分間の遠心分離によってプロト
プラストを集め、Ｐ培地で１回洗浄してから20mlのＰ培
地に懸濁させた。プロトプラスト液100 μl 、3/2 濃度
に調製したＰ−マレイン酸緩衝液 (2.5%ショ糖、1.4mM
K _２SO_４、 1/500量微量元素溶液、100mM CaCl_２、50mM
Tris-マレイン酸、pH8.0）100 μl 、前記の調製した
組換え体ＤＮＡ50μl 及び375 μl のポリエチレングリ
コール溶液（ポリエチレングリコール＃1000 33%/ Ｐ−
マレイン酸緩衝液）を混合し、１分間室温に放置した。

【００３７】このプロトプラスト液をＲ２ＹＥ寒天培地
(0.3M ショ糖、1.4mM K _２SO_４、50mM MgCl _２、1%
グルコース、0.01% カザミノ酸、1/500量 微量元素溶
液、0.4mM KH_２PO_４、 20mM CaCl_２、0.3% プロリン、
25mM ＴＥＳ緩衝液、pH7.2、5mM NaOH、0.5% イース
トエキストラクト、2.2% 寒天) にそれぞれ塗布して、
30℃で１日培養した後、チオストレプトン200 μg/mlを
含む滅菌水1ml を重層し、さらに４日間培養した。

【００３８】上記のＲ２ＹＥ寒天培地上に生育したチオ
ストレプトン耐性の形質転換コロニーをネオマイシン50
μg/mlを含んだＮＡ培地(Difco Nutrient Agar 2.3%)に
楊枝で移した。ベクタープラスミドｐＩＪ６８０のBamH
I 部位にＤＮＡ断片が挿入されるとネオマイシンに感受
性となるので、ネオマイシン感受性株を目的物として選
択した。

【００３９】得られたネオマイシン感受性株を80mlのＹ
ＥＭＥ培地に接種し、28℃で２日間振盪培養した菌体か
ら、ハンセン等による公知の方法(J. Bacteriol., 135
, 227 (1978)) に従ってプラスミドを抽出した。得ら
れたプラスミドを制限酵素で切断して調べたところ、目
的の１．３Ｋｂの断片が両向きにｐＩＪ６８０に組み込
まれている２種のハイブリッドプラスミドが得られてい
た。これらのハイブリッドプラスミドをそれぞれｐＭＳ
Ｂ３２（図３）とｐＭＳＢ３３（図４）と命名した。

【００４０】

【実施例２】ストレプトマイセス・リビダンスの形質転
換株の酵素活性 Ｓ．リビダンス６６は本来はホスホエノールピルビン酸
ホスホムターゼ活性を示さない。実施例１で構築したｐ
ＭＳＢ３２とｐＭＳＢ３３を夫々に導入されて持つＳ．
リビダンス６６の形質転換株２種のホスホエノールピル
ビン酸ホスホムターゼ活性を測定した。これらの菌株を
５μg/mlのチオストレプトンを含む10mlのＳ１培地（2%
ソルブルスターチ、1% ポリペプトン、0.3% 肉エキ
ス、0.05% K _２HPO _４、pH7.0 ）に接種し、30℃で２日
間振盪培養した。

【００４１】ついで、60mlの7% グルコース（別殺
菌）、3.9% 小麦胚芽、2.5% サングレイン、 0.3% KH
_２PO_４、0.0001% CoCl_２・6H_２O 、pH6.8 組成の培地に
植え継ぎ27℃で５日間振盪培養した。これを10000Xg/10
分間の遠心分離によって集菌した後、リン酸バッファー
(50mM KH_２PO_４/Na _２HPO _４、pH6.5)で２回洗浄した。
同バッファーで全量が30mlになるように懸濁し10分間の
ソニックにより菌体を破壊した。さらに15000Xg/20分間
の遠心分離を行い粗酵素液を調製した。

【００４２】酵素活性は50mM Tris ・HCl 、0.27mM ホ
スホノピルビン酸、0.15mM NADH 、5mM MgSO_４、0.72mM
ADP、10μg ラクテートデヒドロゲナーゼ(LDH) 、10μ
g ピルベートキナーゼ(PK)に粗酵素液を加え全量を１ml
にし30℃で340nm の減少を測定した。ブランクは反応液
からホスホノピルビン酸を除いた。

【００４３】ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ
活性は下記の表１に示したようにｐＭＳＢ３２を持つ
Ｓ．リビダンス形質転換株に酵素活性が認められたが、
ｐＭＳＢ３３を持つＳ．リビダンス形質転換株には酵素
活性が認められなかった。これはベクターのｐＩＪ６８
０のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子
(aph) のプロモーターを利用して酵素活性が発現してい
るからである。従って、ｐＭＳＢ３２の１．３ＫｂのBc
lI断片はaphに対し正向きに組み込まれ、ｐＭＳＢ３３
では逆向きに組み込まれていることが判明した。

【００４４】 表１ ストレプトマイセス・リビダンスの形質転換株のホスホエノールピルビン 酸ホスホムターゼ活性 菌株 △A340/min/mg protein S.lividans 66(pMSB32) 1.56 S.lividans 66(pMSB33) 0 S.lividans 66 0

【００４５】

【実施例３】ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
の形質転換株の酵素活性 実施例１で得られたプラスミドｐＭＳＢ３２を、ホスホ
エノールピルビン酸ホスホムターゼ活性を欠損したビア
ラホス生合成欠損株のＳ・ハイグロスコピカスＮＰ５０
（ＦＥＲＭ Ｐ−７８０４）に導入した。80mlのＳ培地
(1%グルコース、0.4% ペプトン、0.4% イーストエキ
ストラクト、0.05% MgSO_４・7H_２0 、0.2% KH _２PO_４、
0.4% K_２HPO _４、5% グリシン) にＳ・ハイグロスコピ
カスＮＰ５０を接種して、28℃で18時間振盪培養を行っ
た。

【００４６】10000Xg の遠心分離で菌糸を集めて、0.5M
ショ糖溶液で１回洗浄した後、10mlのPs培地(70mM NaC
l、0.5M ショ糖、5mM MgCl_２、5mM CaCl_２、25mM Ｔ
ＥＳ緩衝液、pH7.2)に懸濁させた。ついで、最終濃度1m
g/mlになるように卵白リゾチームと0.5mg/mlになるよう
にアクロモペプチダーゼを加え、37℃に60分間保温して
プロトプラストを形成させ、プロトプラスト化しなかっ
た菌糸は綿濾過で除去した。800Xg/10分間の遠心分離に
よってプロトプラストを集め、Ps培地で１回洗浄してか
ら2ml のPs培地に懸濁させた。

【００４７】プロトプラスト液100 μl 、3/2 濃度に調
製したＰ−マレイン酸緩衝液100 μl 、組換え体ＤＮＡ
50μl 及び375 μl のポリエチレングリコール溶液（ポ
リエチレングリコール＃1000 33%/ Ｐ−マレイン酸緩衝
液）を混合し、１分間室温に放置した。さらにPs培地５
mlで希釈し、800Xg/10分間の遠心分離でプロトプラスト
を集め、２mlのPs培地に懸濁させた。

【００４８】このプロトプラスト液をＲＭＥ寒天培地(
無菌濾過したＲＭＥベース(34.8%ショ糖、3% KCl、2%
グルコース、 0.05% K_２SO_４、0.4% プロリン、0.4%
カザミノ酸、0.4% イーストエキストラクト、0.2% lab
lemco powder 、0.01% デキストランサルフェイト、pH
7.0)500ml に別殺菌した0 .5% KH_２PO_４10ml、5M CaCl
_２10ml、12% コーンスチープリィカー 、pH7.0 25m
l、10% アスパラギン酸ナトリウム 10ml を加え、さら
に別殺菌した2%寒天450ml を加える) にそれぞれ塗布し
た後、ＲＭＥ寒天培地の寒天濃度が0.5%のものをその上
層に2ml 重層した。28℃で１日培養した後、チオストレ
プトン20μg/mlを含むＮＥ培地（1% グルコース、0.2%
イーストエキストラクト、0.2% カザミノ酸、0.1% l
ab lemcopowder 、1.5%寒天、pH7.0)を重層しさらに７
日間培養し、形質転換株を得た。

【００４９】Ｓ．ハイグロスコピカスの粗酵素液の調製
とホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ活性の測定
は実施例２と同じ方法で実施した。その結果を下記の表
２に示したが、Ｓ．ハイグロスコピカスＮＰ５０にプラ
スミドｐＭＳＢ３２を導入したところ活性が認められ、
Ｓ．ハイグロスコピカスＳＦ−１２９３株に比較して約
２倍の酵素活性が得られた。また、Ｓ．ハイグロスコピ
カスＮＰ５０（ｐＭＳＢ３２）はビアラホスの生産性を
回復した。

【００５０】 表２ ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスの形質転換株のホスホエノール ピルビン酸ホスホムターゼ活性 菌株 △A340/min/mg protein S.hygroscopicus NP50(pMSB32) 1.35 S.hygroscopicus NP50 0 S.hygroscopicus SF-1293 0.666

【００５１】

【実施例４】ストレプトマイセス・ベデモレンシスの形
質転換株の酵素活性 実施例１で得られたプラスミドｐＭＳＢ３２をホスホマ
イシン生合成欠損株Ｓ・ベデモレンシスＮＰ７（Imai e
t al.: Agric.Biol.Chem., 49, 873(1985))に導入し
た。形質転換は実施例２と同じ方法で行った。

【００５２】この形質転換株を５μg/mlのチオストレプ
トンを含む10mlのＳ１培地に接種し、30℃で２日間振盪
培養した。ついで、60mlの4% スターチ、 1.5% サラダ
油、5% サングレイン、2% 小麦胚芽、 0.1% KH_２P
O_４、0.0001% CoCl_２・6H_２O 、pH8.0 組成の培地に植
え継ぎ27℃で３日間振盪培養した。実施例２と同様に粗
酵素液を調製し、酵素活性を測定した。

【００５３】後記の表３に示したように、ｐＭＳＢ３２
を持つＳ・ベデモレンシスＮＰ７の形質転換株のホスホ
エノールピルビン酸ホスホムターゼ活性はｐＭＳＢ３２
を持たない菌株のそれに比較して、約２．４倍に上昇し
ていた。

【００５４】 表３ ストレプトマイセス・ベデモレンシスの形質転換株のホスホエノールピル ビン酸ホスホムターゼ活性 菌株 △A340/min/mg protein S.wedmorensis NP7(pMSB32) 0.442 S.wedmorensis NP7 0.186

【００５５】

【実施例５】実施例１〜４の実験から、実施例１でｐＭ
ＳＢ２−４から収得された１．３ＫｂのBclI−ＤＮＡ断
片はホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼをコード
する遺伝子を含有すると認められるので、該ＤＮＡ断片
の塩基配列を決定した。

【００５６】配列の決定 実施例１と同様にプラスミドｐＭＳＢ２−４のＤＮＡか
ら１．３ＫｂのBclI断片を切り出した。この断片をｐＵ
Ｃ１９ベクター（宝酒造社製）のBamHI 部位に両向きに
組み込んだ。これらのプラスミドから制限酵素部位を利
用した欠失プラスミド及びkilo-Sequence 用Deletion K
it（宝酒造社製）を用いた欠失プラスミドを調製した。
これら欠失プラスミド16μl （約2 μg ）に1N NaOHを
４μl 添加し37℃で５分間反応させＤＮＡを変性させ
た。さらに4M酢酸アンモニウム 10μl とエタノール100
μl を加えドライアイス中５分間冷却し5000Xg/10 分
間遠心分離をした。沈澱物として得たＤＮＡを70% エタ
ノールで洗浄し乾燥後、そのＤＮＡを９μl の滅菌水に
溶解し塩基配列決定に用いた。

【００５７】塩基配列の決定はM13 DEAZA シークエンス
キットを用いて行った。その結果、１３１４ベースの塩
基配列が決定された。その塩基配列は後記する配列表の
配列番号１の配列に示される通りである。

【００５８】決定された塩基配列に基づいてオープンリ
ーデイングフレーム（ＯＲＦ）を調べた。Ｂｉｂｂらの
報告 (Gene, 30, 157(1984))に従って検討した結果、配
列表の配列番号１の配列に示したＯＲＦを見い出した。
ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼをコードする
遺伝子のＤＮＡは配列表の３７０番目のＡＴＧから始ま
り１３０９番目のＴＧＡで終わると認められる。その塩
基配列に相当するアミノ酸配列も決定された。その配列
は配列表の配列番号１の配列中の３７０−１３０８位の
塩基配列に対応するアミノ酸配列として示されており、
また、それと同一のアミノ酸配列は配列番号２の配列と
して示されている。この配列番号２のアミノ酸配列がホ
スホエノールピルビン酸ホスホムターゼを構成している
と認められる。

【００５９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1314 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス(Str
eptomyces hygroscopicus) 株名：SF-1293 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：370..1308 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TGATCAGCGG ATCGATCCTG GAACAGGCAA AGCCGGGCGC CTTCCTCGTC AACACCGCCC 60 GTGGCGCCCT CGTCGACCCG GGGTGCGTGC TGCGGGCCCT GGAGAGCGAA CAGCTCGGCG 120 GCTTCGCCTC GGACGTCTTC TCCCCCGAGG ACCCCAACCA GTCGCCGGTG GCCCGCAAGC 180 TCCTGGAACG CGACGACGTC GTTGTCAGCT CCCACCGCGC GTTCCTTTCC GCCGAGTCGG 240 AGGAGAGCCT GCGCCGCCGT GTGGCCGAGG GGGTTCGCTC GGTGCTCCGG GACGGTAACC 300 CGCCCGCCGA GGGCCGCGTG GCATGACCCC AACCAACACA GCACCGCACG TCCCCCATTG 360 GAGGCACTC ATG AAC GCG ACG GAG CAG GCA GCG AAC GGC GAC CGG GGC ACC 411 Met Asn Ala Thr Glu Gln Ala Ala Asn Gly Asp Arg Gly Thr 1 5 10 ACA CGA TCG GCC GGC GGC CGG CTC AGG TAC CTG CTG CAC GCC CCA GGC 459 Thr Arg Ser Ala Gly Gly Arg Leu Arg Tyr Leu Leu His Ala Pro Gly 15 20 25 30 GCC TGT CAG CTG ATG GGT GTG CAC GAC GGA CTG AGC GCG CGG ATT GCC 507 Ala Cys Gln Leu Met Gly Val His Asp Gly Leu Ser Ala Arg Ile Ala 35 40 45 GTC GCC GAG GGG TTC GAG GCG CTG TGG GCG TCC GGC CTG TGC ATG TCC 555 Val Ala Glu Gly Phe Glu Ala Leu Trp Ala Ser Gly Leu Cys Met Ser 50 55 60 ACG GCG CGT GGC GTC CGG GAC AGC GAT GAA GCG TCC TGG ACG GAA CTG 603 Thr Ala Arg Gly Val Arg Asp Ser Asp Glu Ala Ser Trp Thr Glu Leu 65 70 75 CTC ACG CTG GTC GGC ACC ATG ACC GAC GCC GTC CCC GGC GTG CCC GTC 651 Leu Thr Leu Val Gly Thr Met Thr Asp Ala Val Pro Gly Val Pro Val 80 85 90 CTC GTC GAC GGT GAC ACC GGA TAC GGC AAC TTC AAC ACC GCC CGC CGG 699 Leu Val Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Gly Asn Phe Asn Thr Ala Arg Arg 95 100 105 110 TTC GCC GGC CGC GCG GAG CGG GTC GGC GCG GCC GGG GTG TGC TTC GAG 747 Phe Ala Gly Arg Ala Glu Arg Val Gly Ala Ala Gly Val Cys Phe Glu 115 120 125 GAC AAG GTC TTC CCG AAG ATG AAC TCC TTC TTC GGC GAC GGC CAC CAG 795 Asp Lys Val Phe Pro Lys Met Asn Ser Phe Phe Gly Asp Gly His Gln 130 135 140 CTG GCC CCG GTC GCC GAG TTC TGC GGA AAG ATC CGG GCC TGC AAG GAC 843 Leu Ala Pro Val Ala Glu Phe Cys Gly Lys Ile Arg Ala Cys Lys Asp 145 150 155 GCC CAG CGT GAC CCG GAC TTC GTC GTG GTG GCG CGG ACC GAG GCA CTG 891 Ala Gln Arg Asp Pro Asp Phe Val Val Val Ala Arg Thr Glu Ala Leu 160 165 170 ATC TCC AAA CTG CCG ATG GAA GAG GCG CTG GAC CGG GCC GCG GCC TAC 939 Ile Ser Lys Leu Pro Met Glu Glu Ala Leu Asp Arg Ala Ala Ala Tyr 175 180 185 190 GCC GAG GCC GGC GCC GAC GCC CTG TTC ATC CAC TCC CGG ATG AAC ACC 987 Ala Glu Ala Gly Ala Asp Ala Leu Phe Ile His Ser Arg Met Asn Thr 195 200 205 CCG CAG CAG ATC GCC ACC TTC ATG GAG CGC TGG GAG GGC AGT ACT CCC 1035 Pro Gln Gln Ile Ala Thr Phe Met Glu Arg Trp Glu Gly Ser Thr Pro 210 215 220 GTC CTG ATC GCG CCC ACC ACC TAC CAC ACG CCG TCC GTC GAC GAC TTC 1083 Val Leu Ile Ala Pro Thr Thr Tyr His Thr Pro Ser Val Asp Asp Phe 225 230 235 GCC GCG CTC GGC ATC GCC GGC TGC ATC TGG GCC AAC CAC AGC ATG CGG 1131 Ala Ala Leu Gly Ile Ala Gly Cys Ile Trp Ala Asn His Ser Met Arg 240 245 250 GCC GCG TTC GCC GCG ATG CGT GAC GTC TGC CAG CGG ATC CGC ACC GAC 1179 Ala Ala Phe Ala Ala Met Arg Asp Val Cys Gln Arg Ile Arg Thr Asp 255 260 265 270 CGC GGC ATC TAC GGC ATC GAG GAT CAG GTG GCG CCC CTG AAG GAG ATC 1227 Arg Gly Ile Tyr Gly Ile Glu Asp Gln Val Ala Pro Leu Lys Glu Ile 275 280 285 TTC GGC CTC TTC GAC TAC GAG GGC CTG GAG AAG GAC GAG AAC TGC TAC 1275 Phe Gly Leu Phe Asp Tyr Glu Gly Leu Glu Lys Asp Glu Asn Cys Tyr 290 295 300 ACA CAG GCC CCC GAC CTG GCC GCG GTG CAG GGA TGATCA 1314 Thr Gln Ala Pro Asp Leu Ala Ala Val Gln Gly 305 310

【００６０】 配列番号：２ 配列の長さ：313 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：タンパク質 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Met Asn Ala Thr Glu Gln Ala Ala Asn Gly Asp Arg Gly Thr Thr Arg 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gly Arg Leu Arg Tyr Leu Leu His Ala Pro Gly Ala Cys 20 25 30 Gln Leu Met Gly Val His Asp Gly Leu Ser Ala Arg Ile Ala Val Ala 35 40 45 Glu Gly Phe Glu Ala Leu Trp Ala Ser Gly Leu Cys Met Ser Thr Ala 50 55 60 Arg Gly Val Arg Asp Ser Asp Glu Ala Ser Trp Thr Glu Leu Leu Thr 65 70 75 80 Leu Val Gly Thr Met Thr Asp Ala Val Pro Gly Val Pro Val Leu Val 85 90 95 Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Gly Asn Phe Asn Thr Ala Arg Arg Phe Ala 100 105 110 Gly Arg Ala Glu Arg Val Gly Ala Ala Gly Val Cys Phe Glu Asp Lys 115 120 125 Val Phe Pro Lys Met Asn Ser Phe Phe Gly Asp Gly His Gln Leu Ala 130 135 140 Pro Val Ala Glu Phe Cys Gly Lys Ile Arg Ala Cys Lys Asp Ala Gln 145 150 155 160 Arg Asp Pro Asp Phe Val Val Val Ala Arg Thr Glu Ala Leu Ile Ser 165 170 175 Lys Leu Pro Met Glu Glu Ala Leu Asp Arg Ala Ala Ala Tyr Ala Glu 180 185 190 Ala Gly Ala Asp Ala Leu Phe Ile His Ser Arg Met Asn Thr Pro Gln 195 200 205 Gln Ile Ala Thr Phe Met Glu Arg Trp Glu Gly Ser Thr Pro Val Leu 210 215 220 Ile Ala Pro Thr Thr Tyr His Thr Pro Ser Val Asp Asp Phe Ala Ala 225 230 235 240 Leu Gly Ile Ala Gly Cys Ile Trp Ala Asn His Ser Met Arg Ala Ala 245 250 255 Phe Ala Ala Met Arg Asp Val Cys Gln Arg Ile Arg Thr Asp Arg Gly 260 265 270 Ile Tyr Gly Ile Glu Asp Gln Val Ala Pro Leu Lys Glu Ile Phe Gly 275 280 285 Leu Phe Asp Tyr Glu Gly Leu Glu Lys Asp Glu Asn Cys Tyr Thr Gln 290 295 300 Ala Pro Asp Leu Ala Ala Val Gln Gly 305 310 313

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるホスホエノールピルビン酸ホスホ
ムターゼ遺伝子を含む１．３ＫｂのＤＮＡ断片の制限酵
素地図

【図２】プラスミドｐＭＳＢ２−４の制限酵素地図

【図３】プラスミドｐＭＳＢ３２の制限酵素地図

【図４】プラスミドｐＭＳＢ３３の制限酵素地図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 今井 敏 神奈川県横浜市港北区師岡町760 明治製 菓株式会社薬品総合研究所内 (72)発明者 村上 健 神奈川県小田原市栢山788 明治製菓株式 会社フアーマテクノロジー研究所内 (72)発明者 長岡 行蔵 神奈川県横浜市港北区師岡町760 明治製 菓株式会社薬品総合研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表の配列番号２の配列で示されるアミ
   ノ酸配列を有する、ホスホエノールピルビン酸ホスホム
   ターゼ及びその同効物。
2. 【請求項２】配列表の配列番号２の配列で示されるアミ
   ノ酸配列をコードするホスホエノールピルビン酸ホスホ
   ムターゼ遺伝子またはその同効物を含有してなる、ＤＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ
   遺伝子をなすＤＮＡであって、配列表の配列番号１の配
   列中の３７０−１３０８位の塩基配列で表される、ＤＮ
   Ａ。
4. 【請求項４】請求項２または３記載のＤＮＡを含んでな
   る、ベクター。
5. 【請求項５】請求項４記載のベクターで宿主菌を形質転
   換されてなる、形質転換体。
6. 【請求項６】宿主がストレプトマイセス・リビダンスで
   ある、請求項５記載の形質転換体。
7. 【請求項７】宿主がストレプトマイセス・ハイグロスコ
   ピカスである、請求項５記載の形質転換体。
8. 【請求項８】宿主がストレプトマイセス・ベデモレンシ
   スである、請求項５記載の形質転換体。