JPH0516832B2

JPH0516832B2 -

Info

Publication number: JPH0516832B2
Application number: JP59045292A
Authority: JP
Inventors: Akira Endo
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-03-09
Filing date: 1984-03-09
Publication date: 1993-03-05
Also published as: US4624924A; DE3584026D1; EP0159497A2; EP0159497A3; EP0159497B1; JPS60188066A; CA1236039A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は不溶性コラーゲン溶解活性を有する新
コラゲナーゼ「デイスコリシン」及びその製造法
に関する。不溶性コラーゲン分解活性を有するコラゲナー
ゼとしては従来クロストリジウム・ヒストリカム
の生産する酵素が最もよく知られている。本菌の
コラゲナーゼは種々の生化学的研究に研究試薬と
して幅広く使用されているだけでなく、最近では
椎間板コラーゲンを分解することによる腰痛、椎
間板ヘルニア等の疾患の治療にも利用できるよう
になつた。しかしながら、本菌はガス壊疽菌とし
て古くから知られている嫌気性の病原菌であり、
毒素を生産する。従つて、コラゲナーゼの大量生
産には嫌気性細菌であるため大量培養が困難であ
り、しかも危険な毒素を生産するという点で適さ
ない。そこで本発明者は優れた特性を有し、しか
も大量生産が容易で経済性のある微生物の生産す
るコラゲナーゼを広く探索し、ストレプトミセス
属の培養液から新規コラゲナーゼを発見し、本発
明を完成した。すなわち、本発明は生化学研究及び椎間板ヘル
ニアをはじめとするコラーゲンに原因のある多く
の疾患の治療に有用な微生物の生産する新規コラ
ゲナーゼを提供するものである。本酵素は未変性及び変性のコラーゲンを溶解す
ることが示された。以下本酵素をデイスコリシン
（discolysin）と称する。本発明は、また放線菌を培養して培養物からデ
イスコリシンを採取する方法、特にストレプトミ
セス属菌を培養して培養物からデイスコリシンを
採取する方法に関するものである。本発明に用いうる微生物は、ストレプトミセス
属に属するデイスコリシン生産菌であり、本発明
により特に有効であると認められた菌株は例えば
ストレプトミセス（Streptomycessp.）Ｃ−51株
である。本菌株は通産省工業技術院微生物工業技
術研究所に受託番号微工研条寄第710号（微工研
菌寄第7469号より移管）として寄託した。本菌株は本発明者により沼津市大平の土壌から
分離されたもので、その菌学的特徴は下記の通り
である。 (1) 形態栄養菌糸の球状あるいは桿状への分断はみら
れない。気菌糸及び胞子鎖は波状からゆるいラ
セン状をなし、20個以上の胞子を着生する。す
なわち、Retinaculum−Apertum（RA）タイ
プとSpiraタイプの中間の性質を有する。走査
型電子顕微鏡観察によると胞子は俵型で0.6〜
0.8×1.0〜1.2ｍμで、胞子表面はスムースタイ
プである。子のう、菌核及び遊走子等の器官は
みられない。 (2) 細胞壁の特徴細胞壁はLL型ジアミノピメリン酸（LL−
DAP）及びグリシンを含有し、菌体構成糖に
特徴はみられない。 (3) 生育状態各種寒天培地上における生育状態は表１の如
くであつた。

【表】

【表】 (4) 生理的性質生育温度は10〜40℃にあり、至適生育温度は
28℃付近にあつた。デンプン分解能、脱脂牛乳
のペプトン化能及び凝固能及びゼラチンの液化
能（グルコース・ペプトンゼラチン培地上）は
すべて陽性であつた。一方、メラニン様色素の
生成能、硝酸還元能、硫化水素生成能、セルロ
ース分解能は認められなかつた。 (5) 炭素源の同化性Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マ
ンニツト、Ｄ−フルクトースを極めて良く利用
した。Ｄ−キシロース、イノシトールも次いで
利用したが、Ｌ−ラムノース、ラフイノース、
シユークロース、セルロースは利用されない
か、又は利用性が極めて低かつた。以上の性状を要約すると本菌株はストレプトミ
セス属に属し、Gray seriesのRAまたはRASタ
イプ、胞子表面は平滑で、メラニン陰性（non−
chromogenic）タイプであると結論される。上記以外のストレプトミセス属でもデイスコリ
シン生産能を示すものであれば、その変種或いは
変異株を問わず使用し得ることはいうまでもな
い。デイスコリシンはデイスコリシンを生産する菌
株を放線菌の培養法として公知の培養法により好
気的に培養して培養物中に生産せしめられる。デ
イスコリシン生産菌は10〜40℃で生育するが、デ
イスコリシンの生産には通常25〜35℃が好まし
い。デイスコリシンを生産するストレプトミセス
属菌を培養するためには放線菌その他の微生物の
培養に公知の栄養源を利用することができる。例
えば、グルコース、デンプン、デキストリン、グ
リセリン、シユクロース等を炭素源として利用で
きる。これらの炭素源の中でグルコース及びシユ
ークロースはデイスコリシン生産に好ましい炭素
源である。デイスコリシンを生産するため、放線菌その他
の微生物の発育のため公知の窒素源はすべて利用
できる。例えば、ペプトン、肉エキス、酵母、酵
母エキス、大豆粉、落花生粉、コーン・ステイー
プ・リカー、米ぬか、ゼラチン、各種魚粉、無機
窒素等を利用できる。デイスコリシン生産菌の培養でデイスコリシン
を生産させる場合、必要とするときは、無機塩、
金属塩を加える。また必要とするときは、重金属
を微量加えることもできる。デイスコリシンはその生産菌を好気的に培養し
て得られるが、通常用いられる好気培養法、例え
ば、固体培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法
が用いられる。培養或いは培地滅菌中消泡を必要
とするときは、シリコンオイル、界面活性剤等の
消泡剤が使用できる。培養温度は25〜35℃が好ま
しい。デイスコリシンの活性はコラーゲンを溶解する
以下の方法で検定できる。即ち、0.067Mリン酸
バツフアー（PH7.4）（0.45％のNaClを含有）５
ml、デイスコリシン溶液１mlと仔牛アキレス腱コ
ラーゲン25mgを37℃で18時間反応させる（コント
ロールには酵素液を加えない）。反応後反応液を
ろ過してそのろ過の0.2mlをニンヒドリン試薬2.0
mlに加え、20分間沸とう水中で加熱する。その後
流水中で冷却し、液量を水で10mlに調整し、15分
後に波長600ｍμで吸光度を測定する。Ｌ−ロイ
シンを標準とする標準曲線から反応中遊離したア
ミノ酸量を求める。これによりデイスコリシンの
生理活性が求められる。培養はデイスコリシンが実質的に蓄積するまで
続け、本物質の培養物からの抽出分離は後記実施
例が示すごとく、本発明者によつて明らかにされ
た本物質の性状にもとづいて、種々の方法を適当
に組合わせることにより行いうる。すなわち、硫
安等による塩析法、アセトン、メタノール等有機
溶媒による沈澱法、各種イオン交換体によるクロ
マトグラフイー、種々の担体によるゲルろ過法、
種々の電気泳動法、限外ろ過法、凍結乾燥法、透
析法、クロマトフオーカシング等である。これら
の手段を組合わせ、また反復使用することにより
培養物からデイスコリシンは単離される。次にデイスコリシンの理化学的性状及び生物活
性を示す。 (1) 分子量60000〜70000（SDSポリアクリルアミ
ド電気泳動による） (2) デイスク電気泳動で活性のある２本のバンド
を与える。 (3) 等電点PH4.8及び4.9（焦点電気泳動法による） (4) 元素分析値：Ｃ：約43％、Ｈ約７％、Ｎ約13％。 (5) 紫外部吸収スペクトル第１図 (6) 赤外部吸収スペクトル第２図 (7) 硫安飽和45〜80％で沈澱する (8) イオン交換体DEAEセルロースに吸着される (9) 不溶性天然コラーゲン、変性コラーゲン、ゼ
ラチンを分解するがカゼインには極めて作用し
にくい。 (10) 不溶性コラーゲン分解の至適PHが7.6〜8.0に
ある。 (11) EDTAで活性が阻害を受ける。 (12) 不溶性コラーゲンに対する分解活性はクロス
トリジウム・ヒストリカムの生産するコラゲナ
ーゼと同等もしくは若干高い。 (13) マウス経口による急性毒性（LD₅₀）は１
ｇ／Kg以上である。デイスコリシンはコラーゲンの分解を必要とす
る各種の生化学的、生理・薬理学的研究に広く利
用できる。さらにデイスコリシンはコラーゲンに
異常の原因がある各種疾患、例えば椎間板ヘルニ
ア、ペーロニ病（海綿体炎）、一部の肝疾患等の
予防と治療にも広く利用できる。例えば、麻酔下
にあるイヌを腹部切開し、触診により椎間板
（Intervertebral disc）を確認しながら、背部腹
膜を通して注射法により椎間板の中心部にある弾
力性半円板（nucleus pulposus）にデイスコリシ
ン溶液（0.05ml）を投与した。投与１週間後にイ
ヌを殺して椎間板を観察した結果、椎間板１個に
つきデイスコリシン100単位（ABC単位）以上投
与したものでは弾力性半円板が有意に溶解してい
た。なお、重篤な毒性、副作用は認められなかつ
た。以上の如く、デイスコリシンはコラーゲンに異
常のある疾患に効果のあることが認められ、医
薬、医薬部外品または食品添加物として使用する
ことができる。デイスコリシンは経口的または非経口的に例え
ばカプセル剤、錠剤、注射剤通の形で投与するこ
とができる。投与量は年令、症状、体重等により
異なるが、通常は成人に対して１日１〜100mgを
１〜３回に分けて投与される。しかし、必要に応
じてそれ以上の量またはそれ以上の回数投与する
ことができる。次に本発明の実施例を示すが、本発明により上
述の如き諸性質が明らかにされた以上、これらの
知見に基づき、培養物またはその関連物からのデ
イスコリシンの採取には諸種の修飾手段が可能で
ある。本発明は実施例に限定されるものでなく、
すでに記載された知見から容易に推定されるすべ
ての方法を含むものである。実施例１シユークロース１％、ペプトン１％、ゼラチン
0.3％、酵母エキス0.2％、Na₂HPO₄0.2％、
Na₂CO₃0.25％、MgSO₄・7H₂O0.04％からなる培
地15を30容量のジヤーにとり、滅菌後ストレ
プトミセスＣ−51株を接種して30℃で30時間好気
的に培養した。培養終了後ろ液（12）を得て、
これに硫安を加えて45〜80％飽和で沈澱となる画
分を集めた。これを溶解して10ｍＭトリス・塩酸
バツフアー（PH7.5）／４ｍＭ CaCl₂に対して透
析し、DEAEセルロースカラム（3.2×26cm）に
吸着せしめた。同バツフアー及び同バツフアーに
1M NaClを加えたもの各１からなるグラジエ
ント系により同カラムを展開してデイスコリシン
画分を採取した。本画分を10ｍＭクエン酸（Na）
バツフアー（PH7.0）／４ｍＭ CaCl₂に対して透
析し、同バツフアー条件下にあるDEAEセルロー
スカラム（2.0×26cm）に吸着せしめた。次いで、
同バツフアー及び10ｍＭクエン酸（Na）バツフ
アー（PH4.0）／４ｍＭ CaCl₂各１から成るグ
ラジエント法によりカラムを展開して主要活性画
分を採取した。本活性画分を0.2ｍＭ CaCl₂に対
して透析してから凍結乾燥し、糖製デイスコリシ
ン51mg（タンパクとして）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はデイスコリシンの紫外部吸収スペクト
ル、第２図は同物質の赤外部吸収スペクトルであ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の理化学的性質を有する新コラゲナー
ゼ、デイスコリシン。 (1) 分子量60000〜70000。 (2) デイスク電気泳動でコラゲナーゼ活性のある
２本のバンドを与える。 (3) 等電点PH4.8及び4.9（焦点電気泳動法による） (4) 元素分析値Ｃ約43％、Ｈ約７％、Ｎ約13
％。 (5) 紫外部吸収スペクトル第１図 (6) 赤外部吸収スペクトル第２図 (7) 硫安飽和45〜81％で沈澱する。 (8) イオン交換体DEAEセルロースに吸着され
る。 (9) 不溶性コラーゲン、変性コラーゲンに分解す
るがカゼインには極めて作用しにくい。 (10) 不溶性コラーゲン分解の至適PHが7.6〜8.0に
ある。 (11) EDTAで活性が阻害を受ける。２ストレプトミセス属に属するデイスコリシン
生産菌を培養し、培養液からデイスコリシンを採
取することを特徴とする新コラゲナーゼ、デイス
コリシンの製造法。３デイスコリシン生産菌がストレプトミセスＣ
−51株である特許請求の範囲第２項記載の製造
法。