JPH0420598B2 - - Google Patents
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- JPH0420598B2 JPH0420598B2 JP56167615A JP16761581A JPH0420598B2 JP H0420598 B2 JPH0420598 B2 JP H0420598B2 JP 56167615 A JP56167615 A JP 56167615A JP 16761581 A JP16761581 A JP 16761581A JP H0420598 B2 JPH0420598 B2 JP H0420598B2
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
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Description
本発明は、酵母細胞の形質転換方法に関する。
従来、大腸菌に代表される原核細胞を宿主とす
る遺伝子操作技術について多くの研究がなされ、
ソマトスタチン、ヒト成長ホルモン、インシユリ
ン、インターフエロンなどが、いわゆる遺伝子組
換え技術によつて生産されていることが報告され
ている。 しかしながら、有核細胞における外来性遺伝子
の発現は、SV40によるウサギのβ−グロビン等
が報告されているが、上述の様な有用物質での成
功例の報告はない。 本発明者らは、目的とする物質は本来有核細胞
が産生していることから、遺伝子の構造ならびに
機能が共通する有核細胞を宿主とすることが大腸
菌に代表される原核細胞を宿主とするよりも有利
であるとの判断により研究を進めてきた。そして
有核細胞の実験モデルとして、培養条件が簡単
で、分裂速度が速く、取扱いが容易という理由か
ら酵母を選択した。そして酵母における外来性遺
伝子の発現につき鋭意研究の結果、その発現に成
功した。本発明は、この成功に基くものである。 有核生物において、一般にmRNAにはポリＡ
と呼ばれるポリアデニル酸が付加されている。こ
のポリＡはアミノ酸をコードせず、mRNA自身
の安定性及びアミノ酸への翻訳効率に寄与してい
ると考えられる。 一方、有核細胞DNAには、mRANの3′末非翻
訳部分に相当する領域が存在しているが、この領
域が、DNAからmRNAへの転写の制御に何らか
の関与があると考えられており、例えば、ポリＡ
の付加機能が示唆される。 本発明者らは、その3′末非翻訳部分に相当する
領域に関し、さらに研究を進めた結果、構造遺伝
子の3′末非翻訳部分に相当する領域を外来性遺伝
子の下流部分に付加することにより、有核細胞に
おいて収率の良い発現が得られることを発見し、
本発明を完成するに至つた。 本発明は、酵母由来のTPR1遺伝子の3′末非翻
訳部分を、外来遺伝子の終止コドンの下流に連結
したハイブリツド遺伝子を用いて酵母細胞を形質
転換することを特徴とする酵母細胞の形質転換方
法である。 プロモータ遺伝子としては、酵母細胞由来の遺
伝子を用いれば良く、たとえば、TRP1、CYC−
１、CYC−７、グリセルアルデヒド−３−ホス
フエイトデヒドロギナーゼ遺伝子等が揚げられ
る。 対象となる外来性目的遺伝子としては、化学合
成のDNAまたはmRNAから逆転写酵素によつて
得られるcDNAなどが使用できる。 たとえば、ソマトスタチン、アルフア・ネオ・
エンドルフイン、カルシトニン、インシユリンな
どは化学合成によるDNAとして、インターフエ
ロン、成長ホルモンなどは、mRNAを逆転写し
て得られるcDNAとして例示できる。 構造遺伝子の3′末非翻訳部分に相当する領域の
外来性遺伝子の下流への付加は公知の方法によつ
て行いうる。 以下、記述の簡略化のために、外来性目的遺伝
子が化学合成によるアルフア・ネオ・エンドルフ
イン（以下、α−N.E.と略する）遺伝子の例で
説明する。 α−N.E.は、1976年寒川・松尾らによりブタ
視床下部から発見された新しい脳内ホルモンであ
り、その構造は、H2N−Tyr−Gly−Gly−Phe−
Leu−Arg−Lys−Tyr−Pro−Lys−COOHであ
ることが報告されている。 本発明者らは、α−N.E.遺伝子を合成し、他
方シヤトルベクターを造成し、α−N.E.遺伝子
とシヤトルベクターとを連結した。この際シヤト
ルベクター造成中に欠落した3′末非翻訳部分に相
当する領域をα−N.E.遺伝子の下流部分に付加
した。同時に付加していないものを対照とした。 これらのα−N.E.遺伝子を含むプラスミドシ
ヤトルベクターを用いて酵母（サツカロマイセ
ス．セレビシエ）を形質転換し、次いでこの形質
転換した酵母を培養、培養物中に、α−N.E.を
含む雑種蛋白を生成させ、これを採取し、臭化シ
アンで分解し、α−N.E.を得た。そして産生量
をラジオイムノアツセイにより測定した結果、
3′末非翻訳部分に相当する領域を付加したプラス
ミドを有する酵母が、付加されていないプラスミ
ドを有する酵母に比して、略10倍量の発現がある
ことが判明した。 一方、先述のプラスミドで大腸菌K12を形質転
換したところ、3′末非翻訳部分に相当する領域の
付加のあるなしにかかわらず、同程度の発現であ
つた。 以上の結果から、有核細胞においては、構造遺
伝子の3′末非翻訳部分に相当する領域を外来性目
的遺伝子の下流部分に付加することが、外来性遺
伝子の発現、ひいては生産に有利であることが、
実証された。 以下実施例でさらに詳しく説明するが、本発明
はこの実施例に限定されるものではない。 実施例 １ １ α−N.E.遺伝子フラグメントの化学合成 第１図に示した、それぞれF1〜F8と名付け
た８個のオリゴデオキシリポヌクレオチドの化
学合成のための方法および原料については、以
下の述べる変更を除いては、基本的にはブロツ
カおよびクレア等により報告されている方法
〔Broka、C.、etal（1950）Nucl.Acids.Res.８
5461およびCrea、R.、et al（1978）Proc.
Natl.Acad.Sci.USA.75 5765〕を用いた。 完全に保護された２官能性トリマー（第２図
参照）は、以下に述べる改良法を用いて３〜５
ミリモルスケールで合成した。すなわち、完全
保護した２官能性ダイマー（１モル当量）を
ピリジン−トリエチルアミン−水（３：１：
1V／Ｖ）混合液によつて相当する3′−燐酸ジ
エステル成分（″）に変換し、これに5′−水
酸基成分、（1.5モル当量）を加え、縮合剤、
メシチレンスルホニルテトラゾリド（MsTe、
２〜３モル当量）を用いて縮合反応を行なつ
た。生成物はシリカゲルを用いたクロマトグラ
フイー及びC18を用いた逆相クロマトグラフイ
ーにより単離精製した。 この化合物群から出発して、一定の塩基配列
を持つた８個のオリゴデオキシリポヌクレオチ
ド、即ちF1〜F8をブロツク縮合法を用いて合
成した。 この様にして得た完全保護した８個のフラグ
メントは各々、濃NH4OHで55℃10時間、次い
で80％酢酸で室温10分処理することにより全て
の保護基を除去した。最終産物の精製は高速液
体クロマトグラフイー（HPLC）を用いて行な
つた。このHPLCは、ALTEX mod el110A液
体クロマトグラフを使用して行なつた。溶媒Ａ
（0.005M、KH2PO4、PH4.0）と、溶媒Ｂ
（0.05M、KH2PO4−1.0M Kcl；PH4.0）による
直線濃度勾配法を用い、パーマフエイズAAX
（ジユポン）カラム（0.21×50cm）で化合物を
分離、精製した。溶媒Ａから開始し、１分毎に
３％の溶媒Ｂを加えることにより、勾配をつけ
た。溶出は58℃で、１分当たり２mlの流速で行
なつた。目的とするピークのものを集め、透析
により脱塩し、凍結乾燥した。この様にして得
た８個の完全脱保護したオリゴデオキシリポヌ
クレオチドの均一性（homogeneity）は、前記
HPLCを用いた２種の、即ちイオン交換〔パー
マフエイズAAX（ジユポン）〕、及び逆相〔μ−
Bondapak C18（ウオーターズ）〕カラムクロマ
トグラフイーで各々単一ピークが得られること
より確認した（表１参照）。
る遺伝子操作技術について多くの研究がなされ、
ソマトスタチン、ヒト成長ホルモン、インシユリ
ン、インターフエロンなどが、いわゆる遺伝子組
換え技術によつて生産されていることが報告され
ている。 しかしながら、有核細胞における外来性遺伝子
の発現は、SV40によるウサギのβ−グロビン等
が報告されているが、上述の様な有用物質での成
功例の報告はない。 本発明者らは、目的とする物質は本来有核細胞
が産生していることから、遺伝子の構造ならびに
機能が共通する有核細胞を宿主とすることが大腸
菌に代表される原核細胞を宿主とするよりも有利
であるとの判断により研究を進めてきた。そして
有核細胞の実験モデルとして、培養条件が簡単
で、分裂速度が速く、取扱いが容易という理由か
ら酵母を選択した。そして酵母における外来性遺
伝子の発現につき鋭意研究の結果、その発現に成
功した。本発明は、この成功に基くものである。 有核生物において、一般にmRNAにはポリＡ
と呼ばれるポリアデニル酸が付加されている。こ
のポリＡはアミノ酸をコードせず、mRNA自身
の安定性及びアミノ酸への翻訳効率に寄与してい
ると考えられる。 一方、有核細胞DNAには、mRANの3′末非翻
訳部分に相当する領域が存在しているが、この領
域が、DNAからmRNAへの転写の制御に何らか
の関与があると考えられており、例えば、ポリＡ
の付加機能が示唆される。 本発明者らは、その3′末非翻訳部分に相当する
領域に関し、さらに研究を進めた結果、構造遺伝
子の3′末非翻訳部分に相当する領域を外来性遺伝
子の下流部分に付加することにより、有核細胞に
おいて収率の良い発現が得られることを発見し、
本発明を完成するに至つた。 本発明は、酵母由来のTPR1遺伝子の3′末非翻
訳部分を、外来遺伝子の終止コドンの下流に連結
したハイブリツド遺伝子を用いて酵母細胞を形質
転換することを特徴とする酵母細胞の形質転換方
法である。 プロモータ遺伝子としては、酵母細胞由来の遺
伝子を用いれば良く、たとえば、TRP1、CYC−
１、CYC−７、グリセルアルデヒド−３−ホス
フエイトデヒドロギナーゼ遺伝子等が揚げられ
る。 対象となる外来性目的遺伝子としては、化学合
成のDNAまたはmRNAから逆転写酵素によつて
得られるcDNAなどが使用できる。 たとえば、ソマトスタチン、アルフア・ネオ・
エンドルフイン、カルシトニン、インシユリンな
どは化学合成によるDNAとして、インターフエ
ロン、成長ホルモンなどは、mRNAを逆転写し
て得られるcDNAとして例示できる。 構造遺伝子の3′末非翻訳部分に相当する領域の
外来性遺伝子の下流への付加は公知の方法によつ
て行いうる。 以下、記述の簡略化のために、外来性目的遺伝
子が化学合成によるアルフア・ネオ・エンドルフ
イン（以下、α−N.E.と略する）遺伝子の例で
説明する。 α−N.E.は、1976年寒川・松尾らによりブタ
視床下部から発見された新しい脳内ホルモンであ
り、その構造は、H2N−Tyr−Gly−Gly−Phe−
Leu−Arg−Lys−Tyr−Pro−Lys−COOHであ
ることが報告されている。 本発明者らは、α−N.E.遺伝子を合成し、他
方シヤトルベクターを造成し、α−N.E.遺伝子
とシヤトルベクターとを連結した。この際シヤト
ルベクター造成中に欠落した3′末非翻訳部分に相
当する領域をα−N.E.遺伝子の下流部分に付加
した。同時に付加していないものを対照とした。 これらのα−N.E.遺伝子を含むプラスミドシ
ヤトルベクターを用いて酵母（サツカロマイセ
ス．セレビシエ）を形質転換し、次いでこの形質
転換した酵母を培養、培養物中に、α−N.E.を
含む雑種蛋白を生成させ、これを採取し、臭化シ
アンで分解し、α−N.E.を得た。そして産生量
をラジオイムノアツセイにより測定した結果、
3′末非翻訳部分に相当する領域を付加したプラス
ミドを有する酵母が、付加されていないプラスミ
ドを有する酵母に比して、略10倍量の発現がある
ことが判明した。 一方、先述のプラスミドで大腸菌K12を形質転
換したところ、3′末非翻訳部分に相当する領域の
付加のあるなしにかかわらず、同程度の発現であ
つた。 以上の結果から、有核細胞においては、構造遺
伝子の3′末非翻訳部分に相当する領域を外来性目
的遺伝子の下流部分に付加することが、外来性遺
伝子の発現、ひいては生産に有利であることが、
実証された。 以下実施例でさらに詳しく説明するが、本発明
はこの実施例に限定されるものではない。 実施例 １ １ α−N.E.遺伝子フラグメントの化学合成 第１図に示した、それぞれF1〜F8と名付け
た８個のオリゴデオキシリポヌクレオチドの化
学合成のための方法および原料については、以
下の述べる変更を除いては、基本的にはブロツ
カおよびクレア等により報告されている方法
〔Broka、C.、etal（1950）Nucl.Acids.Res.８
5461およびCrea、R.、et al（1978）Proc.
Natl.Acad.Sci.USA.75 5765〕を用いた。 完全に保護された２官能性トリマー（第２図
参照）は、以下に述べる改良法を用いて３〜５
ミリモルスケールで合成した。すなわち、完全
保護した２官能性ダイマー（１モル当量）を
ピリジン−トリエチルアミン−水（３：１：
1V／Ｖ）混合液によつて相当する3′−燐酸ジ
エステル成分（″）に変換し、これに5′−水
酸基成分、（1.5モル当量）を加え、縮合剤、
メシチレンスルホニルテトラゾリド（MsTe、
２〜３モル当量）を用いて縮合反応を行なつ
た。生成物はシリカゲルを用いたクロマトグラ
フイー及びC18を用いた逆相クロマトグラフイ
ーにより単離精製した。 この化合物群から出発して、一定の塩基配列
を持つた８個のオリゴデオキシリポヌクレオチ
ド、即ちF1〜F8をブロツク縮合法を用いて合
成した。 この様にして得た完全保護した８個のフラグ
メントは各々、濃NH4OHで55℃10時間、次い
で80％酢酸で室温10分処理することにより全て
の保護基を除去した。最終産物の精製は高速液
体クロマトグラフイー（HPLC）を用いて行な
つた。このHPLCは、ALTEX mod el110A液
体クロマトグラフを使用して行なつた。溶媒Ａ
（0.005M、KH2PO4、PH4.0）と、溶媒Ｂ
（0.05M、KH2PO4−1.0M Kcl；PH4.0）による
直線濃度勾配法を用い、パーマフエイズAAX
（ジユポン）カラム（0.21×50cm）で化合物を
分離、精製した。溶媒Ａから開始し、１分毎に
３％の溶媒Ｂを加えることにより、勾配をつけ
た。溶出は58℃で、１分当たり２mlの流速で行
なつた。目的とするピークのものを集め、透析
により脱塩し、凍結乾燥した。この様にして得
た８個の完全脱保護したオリゴデオキシリポヌ
クレオチドの均一性（homogeneity）は、前記
HPLCを用いた２種の、即ちイオン交換〔パー
マフエイズAAX（ジユポン）〕、及び逆相〔μ−
Bondapak C18（ウオーターズ）〕カラムクロマ
トグラフイーで各々単一ピークが得られること
より確認した（表１参照）。
【表】
アセトニト
リル
リル
【表】
さらに８個のオリゴデオキシリポヌクレオチ
ドの塩基配列は、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼを用い、〔γ−32P〕ATPで5′−末端を標識
した後、ヌクレアーゼを用いて部分水解したも
のをセルローズアセテートを用いるPH3.5の電
気泳動と、DEAE−セルローズによりホモクロ
マトグラフイーを行つて得られる２次元マツピ
ング法で確認した〔Bambara、Ｊ、E.、et al
（1974）NuCl.Acids Res.１331〕。 ２ α−N.E.DNAの結合（ligation） 前記のようにして塩基配列を確認したF1〜
F8からなる８個のオリゴデオキシリポヌクレ
オチドをT4DNAリガーゼを用いて以下に述べ
る方法で結合させた。 F2、F3、F4、F6、F7、F8の各フラグメン
トについてその5′−OH末端を各々T4ポリヌク
レオチドキナーゼで別々にリン酸化した。〔γ
−32P〕ATP（7400Ci／ｍmol）200μCiをエツ
ペンドルフチユーブ中で蒸発乾固し、フラグメ
ント10μｇを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ10
単位と全量50μの50ｍＭトリス塩酸緩衝液
（PH8.0）、10ｍＭ Mg Cl2、10ｍＭジチオスレ
トール（DTT）中で20分間37℃で反応した。
次にすべての5′−OH末端をリン酸化するため
に前記反応液に10n molのATPおよび10単位
のT4ポリヌクレオチドキナーゼを添加し、37
℃で１時間さらに反応させ、次いで90℃で５分
間加熱することにより反応を停止させた。F1
とF5のフラグメントは次のライゲーシヨン反
応の過程で目的の遺伝子からの5′末端粘着部材
（HindおよびBamHI）で２個以上結合しな
いように5′−OH末端のリン酸化は行わなかつ
た。かくして得たリン酸化されたフイグラメン
トF2、F3、F4、F6、F7、F8とF1、F5を各々
25μｇづつ透析チユーブに入れ、１水に対し
て４℃で一夜透析することにより未反応ATP
を除いた。次に透析内液を最終濃度20ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（PH7.6）、10ｍＭ MgCl2となる
ように調製し、95℃で２分間加熱し、次いで80
℃で２分、37℃で10分、25℃で２分間放置後、
下記のライゲーシヨン反応を行つた。反応液を
全量80μの20ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH7.6）、
10ｍＭ MgCl2、10ｍＭ DTT、0.4ｍＭ
ATPに調製し、T4DNAリガーゼ25単位を用
いて11℃で行つた。サイズマーカーとしてはφ
×174RF DNAをHinfで分解し、バクテリ
アのアルカリフオスフアターゼにより脱リン酸
したものを〔γ−32P〕ATPとT4ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いてラベルしたDNAフラ
グメントを用いた。ライゲーシヨン反応開始か
ら24時間後、反応液を65℃で５分間加熱して反
応を停止させた。反応液を7Mの尿素を含む15
％ポリアクリルアミドゲルを用い、90ｍＭトリ
スホウ酸緩衝液（PH8.4）、40ｍＭ EDTAを用
いて電気泳動し、次いでオートラジオグラフで
検討した。目的とするα−N.E.DNA遺伝子
（40量体ヌクレオチド）と未反応フラグメント
とを分離した。45量体ヌクレオチドに相当する
部分をゲルより切り出し、下端を透析用チユー
ブに入れ、1/10濃度の前記電気泳動用緩衝液中
で電気泳動させてこのDNAを溶出させた。溶
出後、透析チユーブを水に対して透析し脱塩し
た。目的とするDNAはエタノール３倍容量を
加えて沈殿させ、遠心分離後、20μの蒸留水
に溶解した。収量は2.0μｇであつた。 (2) サツカロマイセス・セレビシエのTRP1遺伝
子を含むシヤトルベクターの作製 酵母（サツカロマイセス・セレビシエ）細胞
でのレプリコン及び選択マーカーは、PJDB219
（Beggs、J.D.Nature275（1978）104−108）の
Hind分解で得られる3300塩基対DNA断片を
用いた。この断片には酵母プラスミド2μｍ
DNAの一部と酵母のLEU2+遺伝子が含まれて
おり、T4DNAリガーゼを用いて環状とし、酵
母を形質転換した。形質転換酵母においてこの
環状DNAは保持されLEU+2遺伝子が発現し
た。従つて酵母細胞でのレプリコン及び選択マ
ーカー（LEU+2遺伝子）はこの3300塩基対
DNA断片が利用できる。この断片を大腸菌プ
ラスミドPBR322のHind切断点に組み込ん
だ。このプラスミドは大腸菌ではPBR322由来
のレプリコン及びApr遺伝子を選択マーカー、
酵母では2μｍDNAのレプリコン及びLEU2+遺
伝子を選択マーカーとして用いることが可能な
酵母・大腸菌シヤトルベクターである。このプ
ラスミドをPYE207とした。 YRP７のEcoR・Bgl分解により得られ
る850塩基対DNA断片にTPR1遺伝子が含ま
れ、その中にあるHind切断部位がα−N.E.
遺伝子の挿入部位として適当である。従つてプ
ラスミドにはHind切断部位がTRP1遺伝子
内のみ存在することが望まれる。 PYE207には、Hind切断部位が２ケ所存在
しており、そのうちの１つはYRP７のTRP1遺
伝子を含む850塩基対DNA断片を挿入する際に
除去されるので、他方（アンピシリン耐性遺伝
子に近い方）のHind切断部位が消去されたP
YE227を得た。 YRP７（Stinchcomb、D.T.他P.N.A.S.76、
1035−1039、1979）のEcoR、Bglの切断
によつて得られるTRP1遺伝子を含む850塩基
対DNA断片をPYE227の第３図に示したEcoR
、BamHI切断点に組み込みPYE1001を得る。
このPYE1001は前述の様にシヤトルベクターで
あり、酵母のTRP1遺伝子を含むものである。
以下に詳細を示す。（第３図、４図） 5μｇのPJDB219を10単位のHindを加え、
TA緩衝液（33ｍＭトリス酢酸、PH7.9 66ｍＭ
酢酸カリ、10ｍＭ酢酸マグネシウム、0.5ｍＭ
ジチオスレイトール（O′Farre、P.H.他、
MGG179、421−435、1980に示されているも
のから牛血清アルブミンを省略した）中で37
℃、１時間加温し、完全に分解後0.8％のアガ
ロース電気泳動により分離し、エチジウム・ブ
ロマイド染色後3300塩基対の相当する部分のゲ
ルを切り出し、ゲルより電気泳動法により、
DNA断片を溶出させた。溶出液をフエノール
でエチジウムブロマイドを抽出後、２容のエタ
ノールによりDNAを沈殿させた。一方1μｇのP
BR322を２単位のHindを用いてTA緩衝液中
で37℃１時間反応させることにより完全に分解
した。この分解物に２容のエタノールを加える
ことによりDNAを沈殿させた。この両沈殿物
を10μのリガーゼ緩衝液（20ｍＭトリス塩酸
PH7.5、５ｍＭ MgCl2、10ｍＭジチスレイト
ール、１ｍＭ ATP）で溶解し、両者を混合
した。T4DNAリガーゼ１単位を加え10℃18時
間反応させた。反応液に２容のエタノールを加
えDNAを沈澱させた。このDNAを供与プラス
ミツドとして大腸菌を形質転換した。この様に
してPBR322のHind部位に前述の3300塩基対
DNAの組み込まれたPYE207を持つ大腸菌を得
た。 大腸菌としてleuB変異株を用いれば、P
YE207のLEU2+gene大腸菌細胞中で発現し、
leu要求性は消失する。形質転換大腸菌を培養
し、菌体をリゾチームとトリトンX100を用い
て溶菌させた。18000rpm30分間の遠心分離に
よつて得られた溶菌液に塩化セシウム（密度
1.55ｇ／cm3）及びエチジウムブロミド（25μ
ｇ／ml）を加え、45000rpm48時間遠心分離し
プラスミツドDNAを得た。 10μｇのPYE207を１単位のHindを用いTA
緩衝液中15分間37℃で反応を行ないPYE207を
部分分解した。65℃10分間加熱することにより
反応を停止したのち、0.8％アガロースゲル電
気泳動で分離し、7600塩基体に相当する直鎖状
DNAをゲルより溶出させ、エタノール沈殿に
よりDNAを回収した。この直鎖状DNAの
Hind分解によつて生じる粘着末端
（cohesive end）をT4−DNAポリメラーゼ緩
衝液（67ｍＭトリス塩酸、PH8.8、6.7ｍＭ
MgCl2、10ｍＭメルカプトエタノール、16.6ｍ
Ｍ硫酸アンモニウム、167μｇ／ml牛血清アル
ブミン）注それぞれ0.33ｍＭのdCTP、dATP、
dTTP、dGTP及びT4DNAポリメラーゼ0.1単
位を加え、37℃で30分反応させることにより非
粘着末端とした。次に65℃10分間加熱すること
により反応を停止した。エタノール沈殿するこ
とによりDNAを回収し、20μのT4リガーゼ
緩衝液に溶解した。２単位のT4リガーゼを加
え10℃で18時間反応させ、非粘着末端を結合し
た。 PYE207のApr遺伝子に近い方のHind切断
部位の消失したPYE227を得た。（第３図） 20μｇのPYE227を２単位のEcoRを用い
TA緩衝液中で37℃15分間反応させ、部分分解
した。この部分分解物を0.8％アガロースゲル
電気泳動で分離し、１ケ所のみ切断された分子
（直鎖状7600塩基体DNA）を前述の方法により
得た。この7600塩基体DNA2μｇをBamHI5単
位を用いTA緩衝液中で37℃１時間反応させ完
全に分解した。分解物を0.8％アガロースゲル
電気泳動で分離後、7200塩基対に相当する
DNAを前述の方法で得た。一方2μｇのYRP７
を３単位のBgl、EcoRを用いTA緩衝液中
で37℃１時間反応させTRP1遺伝子を含む850
塩基対断片を前述の方法で得た。これら２種の
DNA断片を20μのT4DNAリガーゼ緩衝液に
溶解させ、１単位のT4DNAリガーゼを加え10
℃18時間反応させた。前述と同様に、PYE227に
YRP７のTRP1遺伝子が組み込まれたシヤトル
ベクターPYE1001を得た。このPYE1001で酵母
を形質転換したロイシンの非要求性クローンは
すべてトリプトンフアン非要求性となつており
YRP７由来の850塩基対DNA断片にはTRP1遺
伝子が完全な状態であることを示した。又P
YE1001は大腸菌細胞でも複製可能なシヤトル
ベクターであつた。 （第４図） (3) 化学合成αネオエンドルフイン遺伝子の組み
込み 酵母のTRP1遺伝子のHind切断部位に前
述のα−N.E.遺伝子を容易に導入でき、しか
も大腸菌で容易に選択できる様にするためにP
BR322プラスミドのTCr遺伝子をTRP1遺伝子
のHind切断部位の下流に導入したPYE1010
を作成した。（第５図） 10μｇのPYE1001をHind、Salをそれぞ
れ10単位を用い、TA緩衝液中で37℃１時間反
応させ完全に分解した。前述と同様の方法でア
ガロース電気泳動により分解物を分離した後
7500塩基対に相当する断片を得た。10μｇのP
BR322を10単位のHind、Salを用いTA緩
衝液中で完全に分解後650塩基対に相当する断
片を得た。この両者混合し、前述と同様の方法
でライゲーシヨンしてPYE1010を得た。P
YE1010は大腸菌でテトラサイクリン耐性（5μ
ｇ／ml）を示し、Hind、BamHIでそれぞれ
１ケ所の切断点を有していた。酵母中では
TRP1遺伝子のHindより下流の部分が消失
しているのでTRP1の活性は認められなかつ
た。 このPYE1010にHind、BamHIの粘着部位
を持つ45量体α−N.E.遺伝子を導入した。（第
６図） 前記方法により得たα−N.E.DNA1.0μｇを
20ｍＭトリス塩酸緩衝液PH7.6、10ｍＭ
MgCl2溶液23μ中で95℃、２分間加熱し、氷
水中で冷却後、ATP1.2nmol、T4ポリヌクレ
オチドキナーゼ6.5単位、DTT10ｍＭを加え、
37℃で20分間反応させてDNAの5′−OH末端を
リン酸化した。すべての5′−OH末端をリン酸
化するために、反応液を95℃で２分間再度加熱
し、氷水中で冷却後、反応液量の１／10容量の100 ｍMDTTおよび6.5単位のT4ポリヌクレオチド
キナーゼを加え、37℃で20分間さらに反応させ
た。次いで95℃２分間加熱した後ゆつくりと室
温にもどした。 次にプラスミドPYE1010DNA5μｇを制限酵
素HindとBamHI各々５単位を用いて完全消
化したものを0.8アガロースゲル電気泳動で分
離し、大きいDAN断片を電気泳動法により回
収した。この様にして得たPYE1010のHind、
BamHIの断片DNA1μｇと先に得た5′−OH末
端をリン酸化したα−N.E.遺伝子DNA0.1μｇ
のリガーゼ緩衝液30μに溶解し、T4DNAリ
ガーゼ１単位を用いて、10℃18時間反応させ
た。反応液に２倍容量のエタノールを加え
DNAを沈殿として得た。このDNA沈殿を100
ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH7.6）、６ｍ
MMgCl2、66ｍＭ NaClよりなる溶液100μ
に溶解し、E.coli菌株JA221へ形質転換した。
形質転換株はアンピシリン40μｇ／mlを含む栄
養寒天培地に37℃で一夜培養したコロニーを
5μｇ／mlのテトラサイクリンを含む栄養寒天
培地にレプリカして、テトラサイクリン感受性
コロニーとして選択した。６コノリーをアンピ
シリン非感受性、テトラサイクリン感受性株と
して得た。 これらの独立に単離した６菌株をJA221／P
YαNE2、JA221／PYαNE3、JA221／P
YαNE4、JA221／PYαNE5、JA221／PYαNE6
と命名した。これらの菌株より得られたプラス
ミツドDNAを制限酵素Hind及びBamHIで
消化したところ、これらの組換え型プラスミド
は２個の断片が得られ、小さな断片は６例すべ
て、試験管内で製造したα−N.E.DNAと同じ
大きさであつた。 (4) 酵母TRP1遺伝子3′末端非翻訳部分の結合 有核細胞では3′末端非翻訳部分にポリアデニ
ル酸（PolyA）の付加等の重要な機能に関する
部分がある。酵母も有核細胞であるので3′末端
非翻訳部分の重要性が考えられ、この領域の遺
伝子の付加が発現に影響があると思われるので
ＰYαNE2のα−N.E.遺伝子の直後にPYE1010を
作製したときに除いたTRP1の3′末端後半の
DNAを結合したプラスミツドを作製した。（第
６図） 10μｇのPYαNE2を20単位のBamHIを用いた
TA緩衝液中で37℃１時間反応させ完全に分解
し65℃、５分間加熱することにより反応を止め
た。２容量のエタノールによりDNAを沈殿さ
せた。 次にBamHI化により生じた粘着末端をDNA
ポリメラーゼを用いて非粘着末端にした。 BamHI DNAをT4DNAポリメラーゼ緩衝
液中に溶解し、それぞれ0.33ｍＭのdCTP、
dATP、dTTP、dGTP及びT4DNAポリメラ
ーゼ0.1単位を加え37℃で30分反応させた。次
いで65℃10分加熱することにより反応を停止し
た。 一方10μｇのPYE1001を20単位のHindを用
いてTA緩衝液中で37℃１時間反応することに
より完全に消化後、前述のPYαNE2と同様に
DNAポリメラーゼを用いてHindで生じた粘
着末端を非粘着末端とした。BamHI消化後非
粘着末端とした直鎖状PYαNE25μｇを10単位の
Avaを用いTA緩衝液中で１時間反応するこ
とにより完全に消化したものを0.8％アガロー
スゲル電気泳動により分離し、4200塩基対、
2400塩基体の断片を前述の方法で得た。Hind
消化後非粘着末端とした直鎖状PYE1001 5μ
ｇを10単位のAvaを用い37℃で１時間反応す
ることにより完全に消化したものを0.8％アガ
ロースゲル電気泳動により分離し、1300塩基対
の断片を前記の方法で得た。この３種のDNA
断片を混合し、１単位のT4DNAリガーゼを用
い、前記T4DNAリガーゼ緩衝液中で10℃、18
時間反応させた。反応液に２倍容量のエタノー
ルを加えDNAを沈殿とした。このDNAを前記
の方法でE.coli菌株に形質転換し、アンピシリ
ン非感受性コロニーを得た。このコロニーのプ
ラスミドDNAを分離し、制限酵素による解析
を行ない、PYαNE2のBamHI切断部位の後部に
TRP1遺伝子の3′末端後半部分（250塩基対）
に挿入されたPYαNE101、PYαNE102、P
YαNE103、PYαNE104を得た。 (5) 酵母の形質転換 前記の方法で得られたPYαNE2、PYαNE3、P
YαNE101、PYαNE104のプラスミドDNAを供
与DNAとして酵母の形質転換をした。 形質転換菌はロイシン非要求菌として選択し
た。 XS16−5C（ａleu2trp1his3）を200mlの１％
酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコー
スを含むYPD培地で２×107細胞／mlになるま
で30℃で振とう培養した。 5000rpm5分の遠心分離により集菌し、20ml
1.2Mソルビトール溶液で１回洗浄した。次に
20mlの10ｍＭ EDTA、25ｍＭ DTT1.2Mソ
ルビトール（PH8.0）にけんだくし30℃10分間
加温した。20mlの1.2Mソルビトールで１回洗
浄後、20mlの0.1mg／mlザイモリアーデ60k、20
ｍＭクエン酸緩衝液PH6.0、1.2Mソルビトール
を含む溶液にけんだくし、30℃で30分間反応さ
せることによりプロトプラストとした。得られ
たプロトプラストを20mlの1.2Mソルビトール
で２回洗浄した。次に20mlの10ｍMCaCl2を含
む1.2Mソルビトールで１回洗浄後、同溶液に
109細胞／mlとなる様に懸だくした。2μｇの供
与DNAを0.2mlのプロトプラスト懸だく液と混
合し、室温に15分間放置後、２mlの10ｍ
MCaCl2、10ｍＭトリス緩衝液を含む30％ポリ
エチレングリコール4000を加え室温に20分間放
置した。3000rpm5分間の遠心分離によりプロ
トプラストを回収し、２mlの10％ポリエチレン
グリコール4000を含む1.2Mソルビトール溶液
に懸だくした。この懸だく液の適当量（0.2〜
0.02）をml0.67％イーストナイトロジエンベー
ス（Difco社製）、２％グルコース、２％寒天
及び160μｇ／mlトリプトフアン、100μｇ／ml
ヒスチジンを含む平板培地上にのせその上に再
生培地（0.67％イーストナイトロジエンベー
ス、２％グルコース、２％YPD3％寒天、
1.2Mソルビトール）を45℃に保つたものを重
層した。30℃５日間培養後生じたコロニーを取
り、各々10コロニーすべて供与プラスミド
DNAの存在を確認した。〔Nuclec
AcidsResearch４、1429（1977）〕 プラスミドPYαNE104により形質転換された
酵母（XS16−5C）株を
Sacchromycescerevisiae SBM304と命名し、
工業技術院微生物工業研究所に寄託した（寄託
番号FERMP−6033）。 (6) 放射免疫分析法を用いるα−N.E.の同定 α−N.E.の標準的放射免疫分析法（RIA）
についてはN.Minamino、et al〔Biochem.
Biophys.Res.Commun、in press〕の方法を用
いた。 酵母菌体ではTrp1産物の雑種蛋白としてα
−N.E.が産生されるが、α−N.E.遺伝子のＮ
末端にMetが挿入されているので、CNBrで分
解することにより10個のペプチドよりなるα−
N.E.を得ることができる。 前記方法で得PYαNE2、PYαNE3、PYα101、P
YαNE104で形質転換した酵母をYPD中で18時
間培養したもの（５×107細胞／ml）を１mlと
り遠心分離により菌体を回収し、0.5mlの0.5
mg／mlのザイモリアーゼ60k、10ｍMβ−メル
カプトエタノールと1.0Mソルビトールを含む
50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）中で30℃15分間
反応させることによりプロトプラスト化した菌
体を得た。 プロトプラストを遠心分離により回収し、こ
れに0.5mlの５mg／mlの臭化シアンを含む70％
ギ酸を24時間反応させた。反応物を減圧下で濃
縮乾涸し、残渣を1M酢酸100μに溶解し、次
にPH8.4の1.3Mトリス塩酸緩衝液100μを加え
て中和した。この溶液にRIA標準緩衝液（PH
7.4リン酸緩衝液50ｍＭ、0.25％牛血清アルブ
ミン、NaCl80ｍＭ、EDTA25ｍＭ）800μを
加え全量を１mlとした。次にその一部100μ
をとり、α−N.E.の抗体を用い標準的放射免
疫分析法に準じて活性を測定した。大腸菌形質
転換菌はＬ−ブロス（0.5％酵母エキス、１％
ポリペプトン、0.5％NaCl、PH7.5）中で18時間
培養したものを遠心分離により回収し、菌体に
直接５mg／mlの臭化シアンを含む70％ギ酸を作
用させてメチオニンを分解した。以下酵母の場
合と同様に活性を測定した。 表２に酵母及び大腸菌形質転換菌体でのα−
N.B.の産生量を示した。酵母のTRP1遺伝子は
大腸菌においても発現するが、TRP1遺伝子に
結合したα−N.E.遺伝子も、大腸菌体中で発
現した。大腸菌の場合はTRP1遺伝子の3′末端
後半部分を付加したプラスミド（PYαNE101、P
YαNE104）の形質転換体も付加しないプラミ
ド（PYαNE2、PYαNE3）の形質転換体も同様
に発現した。一方酵母菌体では、3′末端後半部
分を付加したプラスミドの形質転換体の方が付
加しない場合と比べ約10倍の活性が認められ
た。産生量はmg全菌体蛋白あたり1nｇのα−
N.E.であり、これは酵母１細胞当り2500分子
に相当する。
ドの塩基配列は、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼを用い、〔γ−32P〕ATPで5′−末端を標識
した後、ヌクレアーゼを用いて部分水解したも
のをセルローズアセテートを用いるPH3.5の電
気泳動と、DEAE−セルローズによりホモクロ
マトグラフイーを行つて得られる２次元マツピ
ング法で確認した〔Bambara、Ｊ、E.、et al
（1974）NuCl.Acids Res.１331〕。 ２ α−N.E.DNAの結合（ligation） 前記のようにして塩基配列を確認したF1〜
F8からなる８個のオリゴデオキシリポヌクレ
オチドをT4DNAリガーゼを用いて以下に述べ
る方法で結合させた。 F2、F3、F4、F6、F7、F8の各フラグメン
トについてその5′−OH末端を各々T4ポリヌク
レオチドキナーゼで別々にリン酸化した。〔γ
−32P〕ATP（7400Ci／ｍmol）200μCiをエツ
ペンドルフチユーブ中で蒸発乾固し、フラグメ
ント10μｇを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ10
単位と全量50μの50ｍＭトリス塩酸緩衝液
（PH8.0）、10ｍＭ Mg Cl2、10ｍＭジチオスレ
トール（DTT）中で20分間37℃で反応した。
次にすべての5′−OH末端をリン酸化するため
に前記反応液に10n molのATPおよび10単位
のT4ポリヌクレオチドキナーゼを添加し、37
℃で１時間さらに反応させ、次いで90℃で５分
間加熱することにより反応を停止させた。F1
とF5のフラグメントは次のライゲーシヨン反
応の過程で目的の遺伝子からの5′末端粘着部材
（HindおよびBamHI）で２個以上結合しな
いように5′−OH末端のリン酸化は行わなかつ
た。かくして得たリン酸化されたフイグラメン
トF2、F3、F4、F6、F7、F8とF1、F5を各々
25μｇづつ透析チユーブに入れ、１水に対し
て４℃で一夜透析することにより未反応ATP
を除いた。次に透析内液を最終濃度20ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（PH7.6）、10ｍＭ MgCl2となる
ように調製し、95℃で２分間加熱し、次いで80
℃で２分、37℃で10分、25℃で２分間放置後、
下記のライゲーシヨン反応を行つた。反応液を
全量80μの20ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH7.6）、
10ｍＭ MgCl2、10ｍＭ DTT、0.4ｍＭ
ATPに調製し、T4DNAリガーゼ25単位を用
いて11℃で行つた。サイズマーカーとしてはφ
×174RF DNAをHinfで分解し、バクテリ
アのアルカリフオスフアターゼにより脱リン酸
したものを〔γ−32P〕ATPとT4ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いてラベルしたDNAフラ
グメントを用いた。ライゲーシヨン反応開始か
ら24時間後、反応液を65℃で５分間加熱して反
応を停止させた。反応液を7Mの尿素を含む15
％ポリアクリルアミドゲルを用い、90ｍＭトリ
スホウ酸緩衝液（PH8.4）、40ｍＭ EDTAを用
いて電気泳動し、次いでオートラジオグラフで
検討した。目的とするα−N.E.DNA遺伝子
（40量体ヌクレオチド）と未反応フラグメント
とを分離した。45量体ヌクレオチドに相当する
部分をゲルより切り出し、下端を透析用チユー
ブに入れ、1/10濃度の前記電気泳動用緩衝液中
で電気泳動させてこのDNAを溶出させた。溶
出後、透析チユーブを水に対して透析し脱塩し
た。目的とするDNAはエタノール３倍容量を
加えて沈殿させ、遠心分離後、20μの蒸留水
に溶解した。収量は2.0μｇであつた。 (2) サツカロマイセス・セレビシエのTRP1遺伝
子を含むシヤトルベクターの作製 酵母（サツカロマイセス・セレビシエ）細胞
でのレプリコン及び選択マーカーは、PJDB219
（Beggs、J.D.Nature275（1978）104−108）の
Hind分解で得られる3300塩基対DNA断片を
用いた。この断片には酵母プラスミド2μｍ
DNAの一部と酵母のLEU2+遺伝子が含まれて
おり、T4DNAリガーゼを用いて環状とし、酵
母を形質転換した。形質転換酵母においてこの
環状DNAは保持されLEU+2遺伝子が発現し
た。従つて酵母細胞でのレプリコン及び選択マ
ーカー（LEU+2遺伝子）はこの3300塩基対
DNA断片が利用できる。この断片を大腸菌プ
ラスミドPBR322のHind切断点に組み込ん
だ。このプラスミドは大腸菌ではPBR322由来
のレプリコン及びApr遺伝子を選択マーカー、
酵母では2μｍDNAのレプリコン及びLEU2+遺
伝子を選択マーカーとして用いることが可能な
酵母・大腸菌シヤトルベクターである。このプ
ラスミドをPYE207とした。 YRP７のEcoR・Bgl分解により得られ
る850塩基対DNA断片にTPR1遺伝子が含ま
れ、その中にあるHind切断部位がα−N.E.
遺伝子の挿入部位として適当である。従つてプ
ラスミドにはHind切断部位がTRP1遺伝子
内のみ存在することが望まれる。 PYE207には、Hind切断部位が２ケ所存在
しており、そのうちの１つはYRP７のTRP1遺
伝子を含む850塩基対DNA断片を挿入する際に
除去されるので、他方（アンピシリン耐性遺伝
子に近い方）のHind切断部位が消去されたP
YE227を得た。 YRP７（Stinchcomb、D.T.他P.N.A.S.76、
1035−1039、1979）のEcoR、Bglの切断
によつて得られるTRP1遺伝子を含む850塩基
対DNA断片をPYE227の第３図に示したEcoR
、BamHI切断点に組み込みPYE1001を得る。
このPYE1001は前述の様にシヤトルベクターで
あり、酵母のTRP1遺伝子を含むものである。
以下に詳細を示す。（第３図、４図） 5μｇのPJDB219を10単位のHindを加え、
TA緩衝液（33ｍＭトリス酢酸、PH7.9 66ｍＭ
酢酸カリ、10ｍＭ酢酸マグネシウム、0.5ｍＭ
ジチオスレイトール（O′Farre、P.H.他、
MGG179、421−435、1980に示されているも
のから牛血清アルブミンを省略した）中で37
℃、１時間加温し、完全に分解後0.8％のアガ
ロース電気泳動により分離し、エチジウム・ブ
ロマイド染色後3300塩基対の相当する部分のゲ
ルを切り出し、ゲルより電気泳動法により、
DNA断片を溶出させた。溶出液をフエノール
でエチジウムブロマイドを抽出後、２容のエタ
ノールによりDNAを沈殿させた。一方1μｇのP
BR322を２単位のHindを用いてTA緩衝液中
で37℃１時間反応させることにより完全に分解
した。この分解物に２容のエタノールを加える
ことによりDNAを沈殿させた。この両沈殿物
を10μのリガーゼ緩衝液（20ｍＭトリス塩酸
PH7.5、５ｍＭ MgCl2、10ｍＭジチスレイト
ール、１ｍＭ ATP）で溶解し、両者を混合
した。T4DNAリガーゼ１単位を加え10℃18時
間反応させた。反応液に２容のエタノールを加
えDNAを沈澱させた。このDNAを供与プラス
ミツドとして大腸菌を形質転換した。この様に
してPBR322のHind部位に前述の3300塩基対
DNAの組み込まれたPYE207を持つ大腸菌を得
た。 大腸菌としてleuB変異株を用いれば、P
YE207のLEU2+gene大腸菌細胞中で発現し、
leu要求性は消失する。形質転換大腸菌を培養
し、菌体をリゾチームとトリトンX100を用い
て溶菌させた。18000rpm30分間の遠心分離に
よつて得られた溶菌液に塩化セシウム（密度
1.55ｇ／cm3）及びエチジウムブロミド（25μ
ｇ／ml）を加え、45000rpm48時間遠心分離し
プラスミツドDNAを得た。 10μｇのPYE207を１単位のHindを用いTA
緩衝液中15分間37℃で反応を行ないPYE207を
部分分解した。65℃10分間加熱することにより
反応を停止したのち、0.8％アガロースゲル電
気泳動で分離し、7600塩基体に相当する直鎖状
DNAをゲルより溶出させ、エタノール沈殿に
よりDNAを回収した。この直鎖状DNAの
Hind分解によつて生じる粘着末端
（cohesive end）をT4−DNAポリメラーゼ緩
衝液（67ｍＭトリス塩酸、PH8.8、6.7ｍＭ
MgCl2、10ｍＭメルカプトエタノール、16.6ｍ
Ｍ硫酸アンモニウム、167μｇ／ml牛血清アル
ブミン）注それぞれ0.33ｍＭのdCTP、dATP、
dTTP、dGTP及びT4DNAポリメラーゼ0.1単
位を加え、37℃で30分反応させることにより非
粘着末端とした。次に65℃10分間加熱すること
により反応を停止した。エタノール沈殿するこ
とによりDNAを回収し、20μのT4リガーゼ
緩衝液に溶解した。２単位のT4リガーゼを加
え10℃で18時間反応させ、非粘着末端を結合し
た。 PYE207のApr遺伝子に近い方のHind切断
部位の消失したPYE227を得た。（第３図） 20μｇのPYE227を２単位のEcoRを用い
TA緩衝液中で37℃15分間反応させ、部分分解
した。この部分分解物を0.8％アガロースゲル
電気泳動で分離し、１ケ所のみ切断された分子
（直鎖状7600塩基体DNA）を前述の方法により
得た。この7600塩基体DNA2μｇをBamHI5単
位を用いTA緩衝液中で37℃１時間反応させ完
全に分解した。分解物を0.8％アガロースゲル
電気泳動で分離後、7200塩基対に相当する
DNAを前述の方法で得た。一方2μｇのYRP７
を３単位のBgl、EcoRを用いTA緩衝液中
で37℃１時間反応させTRP1遺伝子を含む850
塩基対断片を前述の方法で得た。これら２種の
DNA断片を20μのT4DNAリガーゼ緩衝液に
溶解させ、１単位のT4DNAリガーゼを加え10
℃18時間反応させた。前述と同様に、PYE227に
YRP７のTRP1遺伝子が組み込まれたシヤトル
ベクターPYE1001を得た。このPYE1001で酵母
を形質転換したロイシンの非要求性クローンは
すべてトリプトンフアン非要求性となつており
YRP７由来の850塩基対DNA断片にはTRP1遺
伝子が完全な状態であることを示した。又P
YE1001は大腸菌細胞でも複製可能なシヤトル
ベクターであつた。 （第４図） (3) 化学合成αネオエンドルフイン遺伝子の組み
込み 酵母のTRP1遺伝子のHind切断部位に前
述のα−N.E.遺伝子を容易に導入でき、しか
も大腸菌で容易に選択できる様にするためにP
BR322プラスミドのTCr遺伝子をTRP1遺伝子
のHind切断部位の下流に導入したPYE1010
を作成した。（第５図） 10μｇのPYE1001をHind、Salをそれぞ
れ10単位を用い、TA緩衝液中で37℃１時間反
応させ完全に分解した。前述と同様の方法でア
ガロース電気泳動により分解物を分離した後
7500塩基対に相当する断片を得た。10μｇのP
BR322を10単位のHind、Salを用いTA緩
衝液中で完全に分解後650塩基対に相当する断
片を得た。この両者混合し、前述と同様の方法
でライゲーシヨンしてPYE1010を得た。P
YE1010は大腸菌でテトラサイクリン耐性（5μ
ｇ／ml）を示し、Hind、BamHIでそれぞれ
１ケ所の切断点を有していた。酵母中では
TRP1遺伝子のHindより下流の部分が消失
しているのでTRP1の活性は認められなかつ
た。 このPYE1010にHind、BamHIの粘着部位
を持つ45量体α−N.E.遺伝子を導入した。（第
６図） 前記方法により得たα−N.E.DNA1.0μｇを
20ｍＭトリス塩酸緩衝液PH7.6、10ｍＭ
MgCl2溶液23μ中で95℃、２分間加熱し、氷
水中で冷却後、ATP1.2nmol、T4ポリヌクレ
オチドキナーゼ6.5単位、DTT10ｍＭを加え、
37℃で20分間反応させてDNAの5′−OH末端を
リン酸化した。すべての5′−OH末端をリン酸
化するために、反応液を95℃で２分間再度加熱
し、氷水中で冷却後、反応液量の１／10容量の100 ｍMDTTおよび6.5単位のT4ポリヌクレオチド
キナーゼを加え、37℃で20分間さらに反応させ
た。次いで95℃２分間加熱した後ゆつくりと室
温にもどした。 次にプラスミドPYE1010DNA5μｇを制限酵
素HindとBamHI各々５単位を用いて完全消
化したものを0.8アガロースゲル電気泳動で分
離し、大きいDAN断片を電気泳動法により回
収した。この様にして得たPYE1010のHind、
BamHIの断片DNA1μｇと先に得た5′−OH末
端をリン酸化したα−N.E.遺伝子DNA0.1μｇ
のリガーゼ緩衝液30μに溶解し、T4DNAリ
ガーゼ１単位を用いて、10℃18時間反応させ
た。反応液に２倍容量のエタノールを加え
DNAを沈殿として得た。このDNA沈殿を100
ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH7.6）、６ｍ
MMgCl2、66ｍＭ NaClよりなる溶液100μ
に溶解し、E.coli菌株JA221へ形質転換した。
形質転換株はアンピシリン40μｇ／mlを含む栄
養寒天培地に37℃で一夜培養したコロニーを
5μｇ／mlのテトラサイクリンを含む栄養寒天
培地にレプリカして、テトラサイクリン感受性
コロニーとして選択した。６コノリーをアンピ
シリン非感受性、テトラサイクリン感受性株と
して得た。 これらの独立に単離した６菌株をJA221／P
YαNE2、JA221／PYαNE3、JA221／P
YαNE4、JA221／PYαNE5、JA221／PYαNE6
と命名した。これらの菌株より得られたプラス
ミツドDNAを制限酵素Hind及びBamHIで
消化したところ、これらの組換え型プラスミド
は２個の断片が得られ、小さな断片は６例すべ
て、試験管内で製造したα−N.E.DNAと同じ
大きさであつた。 (4) 酵母TRP1遺伝子3′末端非翻訳部分の結合 有核細胞では3′末端非翻訳部分にポリアデニ
ル酸（PolyA）の付加等の重要な機能に関する
部分がある。酵母も有核細胞であるので3′末端
非翻訳部分の重要性が考えられ、この領域の遺
伝子の付加が発現に影響があると思われるので
ＰYαNE2のα−N.E.遺伝子の直後にPYE1010を
作製したときに除いたTRP1の3′末端後半の
DNAを結合したプラスミツドを作製した。（第
６図） 10μｇのPYαNE2を20単位のBamHIを用いた
TA緩衝液中で37℃１時間反応させ完全に分解
し65℃、５分間加熱することにより反応を止め
た。２容量のエタノールによりDNAを沈殿さ
せた。 次にBamHI化により生じた粘着末端をDNA
ポリメラーゼを用いて非粘着末端にした。 BamHI DNAをT4DNAポリメラーゼ緩衝
液中に溶解し、それぞれ0.33ｍＭのdCTP、
dATP、dTTP、dGTP及びT4DNAポリメラ
ーゼ0.1単位を加え37℃で30分反応させた。次
いで65℃10分加熱することにより反応を停止し
た。 一方10μｇのPYE1001を20単位のHindを用
いてTA緩衝液中で37℃１時間反応することに
より完全に消化後、前述のPYαNE2と同様に
DNAポリメラーゼを用いてHindで生じた粘
着末端を非粘着末端とした。BamHI消化後非
粘着末端とした直鎖状PYαNE25μｇを10単位の
Avaを用いTA緩衝液中で１時間反応するこ
とにより完全に消化したものを0.8％アガロー
スゲル電気泳動により分離し、4200塩基対、
2400塩基体の断片を前述の方法で得た。Hind
消化後非粘着末端とした直鎖状PYE1001 5μ
ｇを10単位のAvaを用い37℃で１時間反応す
ることにより完全に消化したものを0.8％アガ
ロースゲル電気泳動により分離し、1300塩基対
の断片を前記の方法で得た。この３種のDNA
断片を混合し、１単位のT4DNAリガーゼを用
い、前記T4DNAリガーゼ緩衝液中で10℃、18
時間反応させた。反応液に２倍容量のエタノー
ルを加えDNAを沈殿とした。このDNAを前記
の方法でE.coli菌株に形質転換し、アンピシリ
ン非感受性コロニーを得た。このコロニーのプ
ラスミドDNAを分離し、制限酵素による解析
を行ない、PYαNE2のBamHI切断部位の後部に
TRP1遺伝子の3′末端後半部分（250塩基対）
に挿入されたPYαNE101、PYαNE102、P
YαNE103、PYαNE104を得た。 (5) 酵母の形質転換 前記の方法で得られたPYαNE2、PYαNE3、P
YαNE101、PYαNE104のプラスミドDNAを供
与DNAとして酵母の形質転換をした。 形質転換菌はロイシン非要求菌として選択し
た。 XS16−5C（ａleu2trp1his3）を200mlの１％
酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコー
スを含むYPD培地で２×107細胞／mlになるま
で30℃で振とう培養した。 5000rpm5分の遠心分離により集菌し、20ml
1.2Mソルビトール溶液で１回洗浄した。次に
20mlの10ｍＭ EDTA、25ｍＭ DTT1.2Mソ
ルビトール（PH8.0）にけんだくし30℃10分間
加温した。20mlの1.2Mソルビトールで１回洗
浄後、20mlの0.1mg／mlザイモリアーデ60k、20
ｍＭクエン酸緩衝液PH6.0、1.2Mソルビトール
を含む溶液にけんだくし、30℃で30分間反応さ
せることによりプロトプラストとした。得られ
たプロトプラストを20mlの1.2Mソルビトール
で２回洗浄した。次に20mlの10ｍMCaCl2を含
む1.2Mソルビトールで１回洗浄後、同溶液に
109細胞／mlとなる様に懸だくした。2μｇの供
与DNAを0.2mlのプロトプラスト懸だく液と混
合し、室温に15分間放置後、２mlの10ｍ
MCaCl2、10ｍＭトリス緩衝液を含む30％ポリ
エチレングリコール4000を加え室温に20分間放
置した。3000rpm5分間の遠心分離によりプロ
トプラストを回収し、２mlの10％ポリエチレン
グリコール4000を含む1.2Mソルビトール溶液
に懸だくした。この懸だく液の適当量（0.2〜
0.02）をml0.67％イーストナイトロジエンベー
ス（Difco社製）、２％グルコース、２％寒天
及び160μｇ／mlトリプトフアン、100μｇ／ml
ヒスチジンを含む平板培地上にのせその上に再
生培地（0.67％イーストナイトロジエンベー
ス、２％グルコース、２％YPD3％寒天、
1.2Mソルビトール）を45℃に保つたものを重
層した。30℃５日間培養後生じたコロニーを取
り、各々10コロニーすべて供与プラスミド
DNAの存在を確認した。〔Nuclec
AcidsResearch４、1429（1977）〕 プラスミドPYαNE104により形質転換された
酵母（XS16−5C）株を
Sacchromycescerevisiae SBM304と命名し、
工業技術院微生物工業研究所に寄託した（寄託
番号FERMP−6033）。 (6) 放射免疫分析法を用いるα−N.E.の同定 α−N.E.の標準的放射免疫分析法（RIA）
についてはN.Minamino、et al〔Biochem.
Biophys.Res.Commun、in press〕の方法を用
いた。 酵母菌体ではTrp1産物の雑種蛋白としてα
−N.E.が産生されるが、α−N.E.遺伝子のＮ
末端にMetが挿入されているので、CNBrで分
解することにより10個のペプチドよりなるα−
N.E.を得ることができる。 前記方法で得PYαNE2、PYαNE3、PYα101、P
YαNE104で形質転換した酵母をYPD中で18時
間培養したもの（５×107細胞／ml）を１mlと
り遠心分離により菌体を回収し、0.5mlの0.5
mg／mlのザイモリアーゼ60k、10ｍMβ−メル
カプトエタノールと1.0Mソルビトールを含む
50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）中で30℃15分間
反応させることによりプロトプラスト化した菌
体を得た。 プロトプラストを遠心分離により回収し、こ
れに0.5mlの５mg／mlの臭化シアンを含む70％
ギ酸を24時間反応させた。反応物を減圧下で濃
縮乾涸し、残渣を1M酢酸100μに溶解し、次
にPH8.4の1.3Mトリス塩酸緩衝液100μを加え
て中和した。この溶液にRIA標準緩衝液（PH
7.4リン酸緩衝液50ｍＭ、0.25％牛血清アルブ
ミン、NaCl80ｍＭ、EDTA25ｍＭ）800μを
加え全量を１mlとした。次にその一部100μ
をとり、α−N.E.の抗体を用い標準的放射免
疫分析法に準じて活性を測定した。大腸菌形質
転換菌はＬ−ブロス（0.5％酵母エキス、１％
ポリペプトン、0.5％NaCl、PH7.5）中で18時間
培養したものを遠心分離により回収し、菌体に
直接５mg／mlの臭化シアンを含む70％ギ酸を作
用させてメチオニンを分解した。以下酵母の場
合と同様に活性を測定した。 表２に酵母及び大腸菌形質転換菌体でのα−
N.B.の産生量を示した。酵母のTRP1遺伝子は
大腸菌においても発現するが、TRP1遺伝子に
結合したα−N.E.遺伝子も、大腸菌体中で発
現した。大腸菌の場合はTRP1遺伝子の3′末端
後半部分を付加したプラスミド（PYαNE101、P
YαNE104）の形質転換体も付加しないプラミ
ド（PYαNE2、PYαNE3）の形質転換体も同様
に発現した。一方酵母菌体では、3′末端後半部
分を付加したプラスミドの形質転換体の方が付
加しない場合と比べ約10倍の活性が認められ
た。産生量はmg全菌体蛋白あたり1nｇのα−
N.E.であり、これは酵母１細胞当り2500分子
に相当する。
【表】
又、PYαNE101、PYαNE104によつて形質転換
した酵母には、宿主のtrp1変異を弱く回復させ
ることも認めたが、PYαNE2、PYαNE3には認め
られなかつた。 このことをトリプトフアンの入つていない培
他での増殖速度で検討した結果、PYαNE101、P
YαNE104によつて形質転換された酵母はP
YE1001（完全なTRP1遺伝子を含んでいる）と
比べ約1/5の速度で増殖した。 これらのプラスミドにあるTRP1−α−N.E.
雑種蛋白質は共にα−N.E.の末端に２つの終
止コドンが含まれているので生しる雑種蛋白質
は同一のものと考えることが出来る。従つて
TRP13′末端後部を付加することにより蛋白質
への翻訳するmRNAが効率よく生産されるか、
もしくはより安全性が高いmRNAが生じてい
ると考えることが出来る。この傾向はXS16−
5C以外の酵母（XP3−5A）を用いても同様で
あつた。これらのプラスミドの酵母菌体中での
安定性を10世代非選択培地（ロイシン、80μ
ｇ／mlを含んだ最小培地又はYPD）で培養し
た後のロイシン要求性株（プラスミドが脱落し
たものと考えられる）の出現頻度で検討した。
その結果PYαNE104で形質転換した菌株では95
％以上の安定性を認めた。PYαNE2の場合も同
様であつた。
した酵母には、宿主のtrp1変異を弱く回復させ
ることも認めたが、PYαNE2、PYαNE3には認め
られなかつた。 このことをトリプトフアンの入つていない培
他での増殖速度で検討した結果、PYαNE101、P
YαNE104によつて形質転換された酵母はP
YE1001（完全なTRP1遺伝子を含んでいる）と
比べ約1/5の速度で増殖した。 これらのプラスミドにあるTRP1−α−N.E.
雑種蛋白質は共にα−N.E.の末端に２つの終
止コドンが含まれているので生しる雑種蛋白質
は同一のものと考えることが出来る。従つて
TRP13′末端後部を付加することにより蛋白質
への翻訳するmRNAが効率よく生産されるか、
もしくはより安全性が高いmRNAが生じてい
ると考えることが出来る。この傾向はXS16−
5C以外の酵母（XP3−5A）を用いても同様で
あつた。これらのプラスミドの酵母菌体中での
安定性を10世代非選択培地（ロイシン、80μ
ｇ／mlを含んだ最小培地又はYPD）で培養し
た後のロイシン要求性株（プラスミドが脱落し
たものと考えられる）の出現頻度で検討した。
その結果PYαNE104で形質転換した菌株では95
％以上の安定性を認めた。PYαNE2の場合も同
様であつた。
第１図は本発明において用いられるα−N.E.
遺伝子を含む二重鎖ポリデオキシヌクレオチドの
一態様とその合成に用いられるオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド（F1〜F8）を、第２図は完全に
保護された２官能性トリマーデオキシリボヌクレ
オチドの合成反応式を、第３図〜第６図はα−
N.E.遺伝子を含む組み換えプラスミドの構成法
を示す。
遺伝子を含む二重鎖ポリデオキシヌクレオチドの
一態様とその合成に用いられるオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド（F1〜F8）を、第２図は完全に
保護された２官能性トリマーデオキシリボヌクレ
オチドの合成反応式を、第３図〜第６図はα−
N.E.遺伝子を含む組み換えプラスミドの構成法
を示す。
Claims (1)
- １ 酵母由来のTRP1遺伝子の3′末非翻訳部分
を、外来遺伝子の終止コドンの下流に連結したハ
イブリツド遺伝子を用いて酵母細胞を形質転換す
ることを特徴とする酵母細胞の形質転換方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56167615A JPS58146281A (ja) | 1981-10-19 | 1981-10-19 | 酵母細胞の形質転換法 |
| EP82305563A EP0077689A3 (en) | 1981-10-19 | 1982-10-19 | Method of gene manipulation using an eukaryotic cell as the host |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56167615A JPS58146281A (ja) | 1981-10-19 | 1981-10-19 | 酵母細胞の形質転換法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58146281A JPS58146281A (ja) | 1983-08-31 |
| JPH0420598B2 true JPH0420598B2 (ja) | 1992-04-03 |
Family
ID=15853062
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56167615A Granted JPS58146281A (ja) | 1981-10-19 | 1981-10-19 | 酵母細胞の形質転換法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0077689A3 (ja) |
| JP (1) | JPS58146281A (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0716432B2 (ja) * | 1982-10-20 | 1995-03-01 | サントリー株式会社 | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 |
| CA1341302C (en) * | 1983-02-22 | 2001-10-09 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis of foreign protein |
| EP0129268B1 (en) * | 1983-05-19 | 1989-10-04 | Unilever N.V. | Improvements in the expression of newly introduced genes in yeast cells |
| US4663281A (en) * | 1984-03-22 | 1987-05-05 | Mass Institute Of Technology | Enhanced production of proteinaceous materials in eucaryotic cells |
| DE3585578D1 (de) * | 1984-06-18 | 1992-04-16 | Chiron Corp | Hepatitisoberflaechenantigenpartikelvakzin. |
| JPS6152299A (ja) * | 1984-08-21 | 1986-03-14 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 酵母によるグルタチオンの製造方法 |
| US4879231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
| AU582288B2 (en) * | 1986-03-07 | 1989-03-16 | Damon Biotech Inc. | Vector and method for achieving high level expression in eukaryotic cells |
| CA1297435C (en) * | 1986-09-12 | 1992-03-17 | Stephen D. Gillies | Messenger rna stabilization in animal cells |
| US5149635A (en) * | 1986-09-12 | 1992-09-22 | Abbott Biotech, Inc. | Messenger RNA stabilization in animal cells |
| US6265186B1 (en) | 1997-04-11 | 2001-07-24 | Dsm N.V. | Yeast cells comprising at least two copies of a desired gene integrated into the chromosomal genome at more than one non-ribosomal RNA encoding domain, particularly with Kluyveromyces |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
| GR76274B (ja) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
| DK368882A (da) * | 1981-08-25 | 1983-02-26 | Alan John Kingsman | Expessions vektorer |
| NZ201705A (en) * | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
| AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
| IE54592B1 (en) * | 1982-03-08 | 1989-12-06 | Genentech Inc | Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby |
| US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
| US4446235A (en) * | 1982-03-22 | 1984-05-01 | Genentech, Inc. | Method for cloning human growth hormone varient genes |
| EP0096910B1 (en) * | 1982-05-19 | 1989-04-19 | Unilever N.V. | Yeast of the genus kluyveromyces modified for the expression of preprothaumatin or its various allelic and modified forms or their maturation forms |
-
1981
- 1981-10-19 JP JP56167615A patent/JPS58146281A/ja active Granted
-
1982
- 1982-10-19 EP EP82305563A patent/EP0077689A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0077689A2 (en) | 1983-04-27 |
| JPS58146281A (ja) | 1983-08-31 |
| EP0077689A3 (en) | 1984-09-12 |
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