JPH051719B2

JPH051719B2 -

Info

Publication number: JPH051719B2
Application number: JP20978187A
Authority: JP
Inventors: Ryuichi Matsuno; Kazuhiro Nakanishi; Yukitaka Kimura
Original assignee: Daiwa Kasei KK
Current assignee: Daiwa Kasei KK
Priority date: 1987-08-24
Filing date: 1987-08-24
Publication date: 1993-01-08
Also published as: JPS6451096A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、特定の蛋白分解酵素を用いるペプチ
ド合成反応の組合せによつて、オリゴペプチド、
チロシル−グリシル−グリシル−フエニルアラニ
ル−ロイシン［Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu、
Leu−エンケフアリン（Leu−enkephalin）］を
製造する新しい方法に関する。

従来の技術オリゴペプチド、Leu−エンケフアリンは、
Met−エンケフアリンと共に、ブタを初めとする
数種の哺乳動物の脳から単離されたモルヒネ様鎮
痛ペプチドであり、その特有の生理活性より、副
作用が少ない非麻薬性の鎮痛剤として関心が持た
れている。

近年、蛋白分解酵素の逆反応を利用して有用ペ
プチドを合成しようとする試みが活発になつてき
ており、上記Leu−エンケフアリンについても、
その全工程を酵素的合成法により行なう報告がな
されている〔Kullman、W.、Biochem.Biophys.
Res.Commun.、91、693（1979）；J.Biol.Chem.、
255(17)、8235（1980）及び256(3)、1301（1981）〕。

上記報告によれば、キモトリプシンとパパイン
とを巧みに使い分けた多岐に亘る合成経路が示さ
れているが、そのいずれもが非常に複雑且つ多段
階の工程を要しており、しかも原料とする保護ア
ミノ酸乃至保護ペプチドの選択、調製や得られる
ペプチドからの脱保護反応等にも繁雑な操作が必
要である。また上記酵素、保護基等の選択のいか
んによつては目的とする合成反応は進行せず、む
しろ分解反応が惹起することを報告している。更
に上記報告の方法は、酵素反応のみの収率自体決
して満足できず、上記保護反応、脱保護反応等に
おける収率をも考慮した全工程を通じての総収率
は非常に低く、到底工業的実施には適さない。

しかして、一般に酵素を利用するペプチド合成
法（酵素的合成法）は、化学的合成法と比較し
て、原料アミノ酸等の側鎖官能基を必ずしも保護
する必要はなく、反応が立体選択的に進行するの
で安価なラセミ体原料を使用でき、反応中ラセミ
化が起らず、常温常圧下で反応が進行する等の優
れた特徴を有する反面、上記報告からも明らかな
通り、酵素の基質特異性のために原料アミノ酸等
の種類に応じて利用できる酵素が限定され、ある
ひとつの酵素が如何なるペプチド合成にも利用で
きるというものではなく、目的とするペプチド合
成反応を触媒することのできる酵素を選択するこ
と自体非常に困難である。更に確立された酵素的
ペプチド合成法といえども、一般に反応の平衡は
基質の方に大きく片寄つており、収率、反応速度
等がなりに低い欠点がある。殊に、Leu−エンケ
フアリン等の三つ以上の異なるアミノ酸が結合し
たオリゴペプチドを酵素的に合成する場合には、
予め二つのアミノ酸を結合反応させた後、これに
更にアミノ酸を結合反応させる必要があるが、こ
の第２段階以降の反応に原料基質として利用され
るジペプチド、トリペプチド等は、合成反応系内
で、酵素により加水分解されて切断されたり、該
切断により生じるアミノ酸等が更に合成反応に関
与したりすることが考えられる。事実前記報告で
もパパインを用いたＨ−Leu−N₂H₂Ph＋Boc−
Gly−Phe−OHの反応や、Ｈ−Phe−Leu−
N₂H₂Ph＋Boc−Tyr（Bzl）−Gly−Gly−OHの反
応では、期待したペプチドは合成されず、原料ペ
プチドの分解反応やペプチド結合の置換反応が起
こつている。かかる副反応が生起すれば、当然目
的物は得られないか、多量の副生物が混入して目
的物の分離を困難とし、目的物純度を大巾に低下
させる。

発明が解決しようとする問題点本発明の目的は、酵素的合成法を駆使して、
Leu−エンケフアリンを製造する新しい方法を提
供することにある。特に本発明は、上記オリゴペ
プチドを、簡単な操作及び工程で、効率よくしか
も高収率、高純度をもつて製造できる実用的技術
を提供することを目的とする。

問題点を解決するための手段上記目的は、α−キモトリプシンを用いてＮ−
置換チロシン（Tyr）とグリシル−グリシン
（Gly−Gly）−アルキルエステルとを縮合反応さ
せ、次いで上記で得られる保護トリペプチド（Ｎ
−置換Tyr−Gly−Gly−アルキルエステル）を
脱エステル化後、バチルス属金属プロテアーゼを
用いてフエニルアラニル−ロイシン（Phe−Leu）
−アルキルエステルと縮合反応させることを特徴
とするオリゴペプチドの製造法により達成され
る。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基等の記載は、IUPAC委員会提唱の略号乃至当
該分野における慣用記号に従うものとする。また
アミノ酸は特記しない限りＬ−体である。

本発明者らは、プロテアーゼによるペプチド類
の合成につき鋭意研究を重ねる過程において、先
にジペプチドPhe−Phe及びAsp−Phe−OMe前
駆体の酵素合成法〔特開昭60−45596号公報参照〕
及びエンケフアリナーゼの阻害剤であるデス−
Tyr¹−エンケフアリン（des−Tyr¹−
enkephalin、Gly−Gly−Phe−Leu）のバチルス
属金属プロテアーゼ（サーモライシン）による酵
素合成法〔特開昭62−96096号公報参照〕を確立
した。

本発明は、之等に引続く研究の結果完成された
ものである。

本発明方法においては、まずα−キモトリプシ
ンを用いてＮ−置換TyrとGly−Gly−アルキル
エステルとを縮合反応させる（第１工程）。ここ
で一方の基質とするＮ−置換TyrにおけるＮ−置
換基は、ペプチド合成反応に慣用されるアミノ基
保護基である。その代表例としてはベンジルオキ
シカルボニル基(Z)を例示でき、他に例えばｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル基（pMZ）、ｔ
−ブトキシカルボニル基（Boc）、２−クロルベ
ンジルオキシカルボニル基等も包含される。他方
の基質とするGly−Gly−アルキルエステルにお
けるアルキル基も亦慣用されるアミノ酸のカルボ
キシル保護基である。その具体例としては、例え
ばメチル（OMe）、エチル（OEt）、プロピル
（OPr）、ブチル（OBu）、tert−ブチル（OBu^t）
基等の炭素数１〜４のアルキル基、好ましくは
OBu^tを例示できる。

上記第１工程において原料基質の一方とする
Gly−Glyは、市販されており、またパパインを
用いた酵素的合成法により容易に製造でき、更に
Glyが光学異性体を有していないため、化学合成
法でも簡単に合成できる。上記パパインを用いた
酵素的合成法の一具体例を、後記実施例に詳述す
る。

上記Ｎ−置換TyrとGly−Gly−アルキルエス
テルとのα−キモトリプシンによる酵素反応は、
前者を酸成分、後者を塩基成分として、例えば好
ましくは水−酢酸エチル二相系で行なうことがで
きる。ここで水−酢酸エチル二相系とは、別個に
調製した水相と酢酸エチル相とを用いることを意
味し、実際の反応に当つては両相は攪拌等により
エマルジヨン状態で均一に混合される。

上記水相としては適当な緩衝液を用いるのがよ
く、例えば（２−ジアミノモルホリノ）エタンス
ルホン酸（MES）の水溶液やトリス塩酸緩衝液
等を好ましく利用できる。また該水相には、その
PHを約４〜５程度に調節するために例えば水酸化
ナトリウム等を加えることができ、更に用いる酵
素の安定化因子として知られている例えば塩化カ
ルシウム等を溶解させることもできる。

本発明の上記第１工程では、より詳しくはまず
上記水相に塩基成分を溶解し、酢酸エチル相に酸
成分を溶解し、両基質の溶液を調製する。上記各
基質溶液における基質濃度は、適宜に決定され、
反応速度の面からはできるだけ高濃度とするのが
好ましいが、通常酸成分約10〜200ｍＭ及び塩基
成分約10〜1200ｍＭ程度の範囲とするのがよく、
特に塩基成分に対する酸成分の濃度比を、約0.1
〜３、通常約0.4〜３の範囲とするのが好適であ
り、この範囲では酸成分濃度が低い程目的とする
オリゴペプチドの収率は向上する傾向にある。ま
た上記各基質溶液の使用割合（体積比）は、水相
に対して酢酸エチル相を少なくとも等量とするこ
とにより、目的とする合成反応が進行し、高収率
で目的物が収得される。通常上記体積比率は、水
相に対して酢酸エチル相を約１〜10倍量となる範
囲で選択するのがよく、この範囲で酢酸エチル相
を多量に用いる程目的物収率は向上する傾向にあ
る。

上記工程においては、またα−キモトリプシン
を、上記水相側基質溶液に添加して用いる。その
使用量は、用いる酵素の力価、反応条件等により
異なるが、通常用いる水相の全容積の約0.2w／
ｖ％以上、好ましくは約１〜2w／ｖ％程度とす
るのがよい。勿論この範囲以上の高濃度で用いる
こともできるが、高濃度で用いても目的物収率量
等が向上するわけではなく、むしろ経済的に好ま
しくない。

本発明の上記第１工程における縮合反応は、塩
基成分を含む酢酸エチル相と酸成分及び酵素を含
有させた水相とを添加混合するか、酢酸エチル相
と酵素とを同時に、酸成分を含む水相に添加混合
するか、または塩基成分と酸成分とを含む酢酸エ
チル相と酵素を含む水相とを混合して、所定温度
で攪拌することにより実施される。上記反応時の
温度は通常約20〜50℃とされるのがよく、該温度
が高い程反応時間は短縮されるが、通常約40℃付
近とするのが適当である。反応時の水相のPHは、
通常約５〜８、好ましくは約6.5〜7.0の範囲とす
るのがよい。反応の進行に伴つて変化するおそれ
のある該水相のPHを、上記範囲に維持するため
に、反応系内には塩酸等の酸や水酸化ナトリウム
等のアルカリ等を逐次添加することもできる。ま
た上記攪拌は反応系が均一状態を保持するよう
に、通常比較的ゆるやかな条件で行なうか又は振
盪しながら行なうことができる。更に上記攪拌は
反応中常に連続して行なう必要はなく、断続的に
行なうこともできる。

上記縮合反応によつて、目的とする保護トリペ
プチドが有機溶媒溶液として得られる。これは、
常法に従い有機相を分取し、濃縮晶析させるか又
は抽出等の操作を行なうことにより容易に分離す
ることができ、更に通常の単離精製手段により精
製することもできる。

かくして得られる保護トリペプチドは、そのま
まで、または常法に従い保護基の脱離を行なつて
後、本発明Leu−エンケフアリンの合成中間体と
して有用であり、また、Tyr−Gly−Glyを含む
他の各種のオピオイドペプチドホルモン、例えば
エンドルフイン、ダイノルフイン等〔科学と工
業、Vol.59、No.11、458〜468（1985）参照〕の合
成中間体として、更にアミノ酸輸液用のアミノ酸
製剤原料等として有用である。

本発明方法においては、次いで上記で得られる
保護トリペプチドのカルボキシル基保護基を脱離
後、これとPhe−Leu−アルキルエステルとを、
金属プロテアーゼを用いて縮合反応させる（第２
工程）。

上記カルボキシル基保護基の脱離反応は、常法
例えば蟻酸等を用いた加水分解反応に従い容易に
実施できる。

上記第２工程は、第１工程で得られ、脱エステ
ル化されたＮ−置換Tyr−Gly−Glyを酸成分と
し、Phe−Leu−アルキルエステルを塩基成分と
して、好ましくは固定化酵素を利用して、水溶液
中で又は例えば酢酸エチル等の有機溶媒中で、上
記両成分を縮合反応させことにより実施できる。
上記各成分中の基質濃度は、適宜に決定できる
が、通常酸成分約５〜20ｍＭ及び塩基成分約５〜
100ｍＭ程度の範囲とするのがよく、縮合反応の
際の温度条件、水相のPH条件、攪拌条件等は前記
第１工程におけるそれらと略同様のものとするこ
とができる。

本発明者らの研究によれば、上記第２工程にお
いては、固定化酵素（固定化バチルス属金属プロ
テアーゼ）の利用が最も重要である。ここで用い
られるバチルス属金属プロテアーゼとしては、例
えば代表的にはサーモライシン（大和化成株式会
社製）が市販されているが、特にこの市販品であ
る必要はなく、別途にバチルス属細菌より調製さ
れる粗酵素液やその精製品等或いは他の同様の酵
素の性質を有するバチルス属金属プロテアーゼで
あつてもよい。また、その固定化は適当な支持体
を用いた通常の各種方法に従い実施することがで
きる（特公昭62−1719号公報参照）。特に好まし
い上記支持体としては、アンバーライトXAD7
（ロームアンドハース社製）を例示できる。
上記固定化酵素の使用量は、適宜選択できるが、
通常反応液中に約１〜25w／ｖ％存在する量とす
るのがよい。

尚、上記第２工程において、塩基成分として利
用されるPhe−Leu−アルキルエステルの代表例
としては、例えば本発明者らが先に確立したデス
−Tyr¹−エンケフアリンの製造（特開昭62−
96096号公報参照）に利用されるもの、即ちサー
モライシシンを用いた酵素的合成法により得られ
るものを例示できるが、勿論これに限定されるも
のではなく、公知の各種の酵素的乃至化学的合成
法により得られるものであつてもよい。また該塩
基成分を構成するLeuのカルボキシル保護基とし
ては、例えばOEt基を好ましく例示できる。

上記第２工程における縮合反応によつて、目的
とするオリゴペプチド（Leu−エンケフアリン前
駆体）が得られ、これは、通常の方法により分離
できる。例えば上記縮合反応を有機溶媒中で行な
つた場合には、常法に従い有機相を分取し、濃縮
晶析させるか又は抽出等の操作を行なうことによ
り容易に目的物を分離することができる。また、
上記縮合反応を水溶液中で行なつた場合には、目
的生成物は固定化酵素担体に吸着されており、こ
れを水溶性又は水難溶性の有機溶媒、例えばアセ
トニトリル、酢酸エチル等で抽出することによ
り、目的物を分離できる。更に、かくして分離さ
れた目的物は、通常の単離精製手段により精製す
ることもできる。

上記により得られるオリゴペプチドは、そのカ
ルボキシル基及びアミノ基保護基を、常法に従い
脱離することによつて、目的とするLeu−エンケ
フアリン（Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu）とする
ことができる。

実施例以下実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明す
る。

実施例１ (1) Gly−Gly−OBu^tの製造 0.1％２−メルカプトエタノールを含む
0.05M−MES（（２−ジアミノモホリノ）エタ
ンスルホン酸・モノ水和物、同仁化学研究所
製）溶液と、等容積の酢酸エチルとを分液漏斗
を用いて平衡化（40℃）させ、酢酸エチルで飽
和されたMES−NaOH緩衝液と、同MES−
NaOH溶液で飽和された酢酸エチル溶液とを
調製した。

上記で得たMES−NaOH溶液飽和の酢酸エ
チル溶液10mlに、Ｚ−Glyの84mg（40ｍＭ）を
溶かして有機相側基質溶液を調製した。

一方、上記で得た酢酸エチル飽和のMES−
NaOH緩衝液５mlにGly−OBu^t・HCl塩201mg
（終濃度240ｍＭ）を溶かしてPH6.5の水相側基
質溶液を調製した。

上記水相側基質溶液に、パパイン（シグマ社
製）50mg（1.0％）を加え、これを前記有機相
側基質溶液と混合し、40℃で攪拌しながら、
1N NaOHで水相のPHを6.0にコントロールし
て反応を行なわせて、目的とする保護ペプチド
を得た。

20時間反応後の目的物収率（Ｚ−Gly基準）
は、75％であつた。

上記で得られた保護ペプチドを、メタノー
ル：水：酢酸（５：３：２）混合溶液に溶か
し、パラジウム−黒を触媒として水素ガスを用
いて接触還元してＺ基を脱離させて、Gly−
Gly−OBu^tを得た。

(2) Ｚ−Tyr−Gly−Glyの製造５ｍＭ CaCl₂を含む0.25Mトリス塩酸緩衝
液と、等容積の酢酸エチルとを分液漏斗を用い
て平衡化（40℃）させ、酢酸エチルで飽和され
たトリス塩酸緩衝液と、同トリス塩酸緩衝液で
飽和された酢酸エチル溶液とを調製した。

上記で得たトリス塩酸緩衝液飽和の酢酸エチ
ル溶液15mlに、Ｚ−Tyrの378mg（80ｍＭ）を
溶かして有機相側基質溶液を調製した。

一方、上記で得た酢酸エチル飽和のトリス塩
酸緩衝液３mlに上記(1)で調製したGly−Gly−
OBu^tを600ｍＭになるように溶解させた後、
6N HClによりPHを7.0に調整した。これを水
相側基質溶液とする。

上記水相側基質溶液に、α−キモトリプシン
（シグマ社製）36mg（終濃度1.2％）を加え、こ
れを前記有機相側基質溶液と混合し、40℃で攪
拌しながら、1N NaOHで水相のPHを7.0にコ
ントロールして反応を行なわせて、目的とする
保護トリペプチドを得た。

20時間反応後の目的物収率（Ｚ−Tyr基準）
は、95％であつた。

上記で得られた保護トリペプチドを、蟻酸に
溶かして、OBu^t基を脱離させて、Ｚ−Tyr−
Gly−Glyを得た。

(3) Phe−Leu−OEtの製造５ｍＭ CaCl₂を含む0.25Mトリス塩酸緩衝
液と、等容積の酢酸エチルとを分液漏斗を用い
て平衡化（40℃）させ、酢酸エチルで飽和され
たトリス塩酸緩衝液と、同トリス塩酸緩衝液で
飽和された酢酸エチル溶液とを調製した。

上記で得た酢酸エチル飽和のトリス塩酸緩衝
液10mlにLeu−OEt・HCl塩313mg（160ｍＭ）
を溶かして、PH＝7.5の水相側基質溶液を調製
した。

一方、上記トリス塩酸緩衝液で飽和した酢酸
エチル10mlに、Ｚ−Phe239.5mg（80ｍＭ）を溶
かして有機相側基質溶液を調製した。

上記水相側気質溶液にサーモライシン（大和
化成株式会社製、力価9470PU／mg）20mg（0.2
％）を加え、これを有機相側基質溶液と混合
し、40℃で攪拌しながら反応させて、Ｚ−Phe
−Leu−OEtを得た。

５時間反応後の収率（Ｚ−Phe基準）は、
93.2％であり、24時間反応後の収率は、99.5％
であつた。

上記で得られた保護ジペプチドより、酢酸と
25％HBr−酢酸溶液を用いて、Ｚ基を脱離反
応させてPhe−Leu−OEtを得た。

(4) 固定化サーモライシンの調製サーモライシン7.5ｇを、5M−NaBr及び
16.6ｍＭ CaCl₂を含む0.25Mトリス塩酸緩衝
液（PH7.5）120mlに氷冷下に溶解させ、この液
にアンバーライトXAD7（ロームアンドハ
ース社製）30ｇ（湿重量）を加え、４℃て17時
間静かに振盪し酵素を担体に吸着させた。上澄
液の残存酵素蛋白量をビユーレツト法で定量し
た結果、初発酵素量の約70％の酵素が吸着され
ていた。

上記上澄液75mlを除去した残りの固定化酵素
懸濁液に25％グルタールアルデヒド溶液75mlを
加え、４℃で約３時間振盪して架橋反応を行な
い、その後、冷却した５ｍＭ CaCl₂を含む
0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）約１及び
1M NaClを含む同緩衝液約１で交互に２回
洗浄して、固定化サーモライシンを得た。得ら
れた固定化酵素は４℃で保存した。

(5) Ｚ−Tyr−Gly−Gly−Leu−OEtの合成５ｍＭ CaCl₂を含む0.05M−MES溶液と、
等容積の酢酸エチルとを分液漏斗を用いて平衡
化（40℃）させ、酢酸エチルで飽和された
MES溶液と、同MES溶液で飽和された酢酸エ
チル溶液とを調製した。

上記で得たMES溶液飽和の酢酸エチル溶液
３mlに、Ｚ−Tyr−Gly−Glyの９mg（終濃度
7.5ｍＭ）及びPhe−Leu−OEt7mg（7.5ｍＭ）
を溶かして基質溶液を調製した。

一方、上記酢酸エチル飽和のMES溶液（PH
5.0）中に、固定化サーモライシン0.2ｇを加え
て30分間平衡化（40）あさせた後、これに前記
基質溶液を加えて、40℃で振盪させて反応を行
つた。

経時的に反応溶液の少量をサンプリングし、
下記に示す条件で高速液体クロマトグラフイー
を行ない、生成物量を定量した。

＜高速液体クロマトグラフイー＞装置：高速流体クロマトグラフ（島津製作所製
LC−Ａ型）カラム：内径4.6mm×長さ150mm Cosmosil 5C₁₈
−Ppacked colum 半井化学社製）溶媒：アセトニトリル−水（60：40、リン酸でPH
を2.5に調整）検出：紫外吸収（254nｍ）その結果、反応開始５時間後の目的生成物（Ｚ
−Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−OEt、Leu−エ
ンケフアリン前駆体）の出発基質に対する収率
は、約28％になつた。

上記目的物（Ｚ−Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu
−OEt）を、酢酸エチルで抽出し、エバポレータ
ーで乾固させ、その１ミリモル当りに、メタノー
ル５ml、水３ml及び酢酸２mlの混液を加え、更に
少量のパラジウム−黒を加え、水素ガスを用いて
接触還元して、Ｚ基を脱離除去した。

反応後、パラジウム−黒を去し、反応液をエ
バポレーターで乾固させ、得られた化合物に０〜
４℃で、等量の1M水酸化ナトリウム水溶液を加
えてエステル結合を切断し、更に酢酸で中和し、
ロータリーエバポレーターで約10倍に濃縮し、得
られる沈澱物を少量の蒸留水、次いでエーテルで
それぞれ洗浄し、乾燥して、目的とするTyr−
Gly−Gly−Phe−Leuを得た。

実施例２実施例１において、Ｚ−Tyr−Gly−Glyの濃
度を5.5ｍＭ、Phe−Leu−OEtの濃度を55ｍＭ、
固定化酵素の平衡化に用いるMES−NaOH緩衝
液のPHを4.5として、同様に振盪して反応を行な
つた。

その結果、約68％の収率で目的物が製造され
た。

実施例３実施例１と同一の固定化酵素を用いて、水溶液
中でＺ−Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−OEtの合
成反応を以下の通り実施した。

即ち、５ｍＭ CaCl₂を含む0.05M MES−
NaOH緩衝液６mlに、Ｚ−Tyr−Gly−Glyの26
mg（10ｍＭ）及びPhe−Leu−OEt・HBrの44mg
（20ｍＭ）を溶解させて、PH5.0の基質溶液を調整
した。

５個のバイアル瓶にそれぞれ固定化サーモライ
シン67mgを秤取し、この中に上記基質溶液各１ml
を加え、40℃で振盪して反応を行なわせた。

各反応時間毎に、バイアル瓶の一つに6N
HCl20μを加えて反応を停止させ、固定化酵素
中の反応物をアセトニトリル２mlで抽出し、これ
を実施例１と同条件で生成物量の定量に供した。

その結果、反応開始後３時間で、目的物収率は
約62％に達することが分かつた。

Claims

【特許請求の範囲】

１ α−キモトリプシンを用いてＮ−置換チロシ
ンとグリシル−グリシンアルキルエステルとを縮
合反応させ、次いで上記で得られる保護トリペプ
チドを脱エステル化後、バチルス属金属プロテア
ーゼを用いてフエニルアラニル−ロイシンアルキ
ルエステルと縮合反応させることを特徴とするオ
リゴペプチドの製造法。