JPS6258712B2

JPS6258712B2 -

Info

Publication number: JPS6258712B2
Application number: JP23600385A
Authority: JP
Inventors: Ryuichi Matsuno; Kazuhiro Nakanishi; Yukitaka Kimura
Original assignee: Daiwa Kasei KK
Current assignee: Daiwa Kasei KK
Priority date: 1985-10-21
Filing date: 1985-10-21
Publication date: 1987-12-07
Also published as: JPS6296096A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、特定の蛋白分解酵素を用いてＮ―置
換グリシル―グリシンとフエニルアラニル―ロイ
シルアルキルエステルとを縮合反応させてオリゴ
ペプチドを製造する方法に関する。

従来の技術オリゴペプチド、グリシル―グリシル―フエニ
ルアラニル―ロイシン、即ちGly―Gly―Phe―
Leuは、デス―Tyr¹―エンケフアリン（des―
Tyr¹―enkephalin）と呼ばれ、エンケフアリン
分解酵素（エンケフアリナーゼ）の阻害剤として
知られている。

しかして、エンケフアリン（enkephalin、Ｌ―
Tyr―Gly―Gly―Ｌ―Phe―Ｌ―Leu）は、ブタ
を初めとする数種の哺乳動物の脳から単離された
モルヒネ様鎮痛ペプチドであり、生体成分の鎮痛
剤として関心が持たれている。一方、生体内に投
与されたエンケフアリンは、極めて速やかに脳細
胞の酵素により分解されてその生理活性を失う。
従つてエンケフアリンを分解する酵素であるエン
ケフアリナーゼの活性を抑制すれば、生体内にお
けるエンケフアリンの相対的濃度上昇をもたら
し、鎮痛作用の増強及びその持続時間の延長が期
待できる。このエンケフアリナーゼ阻害活性を有
する物質としてデスーTyr¹―エンケフアリンが
知られているが、現在該化合物は、専ら化学的合
成法により製造されている。

近年、蛋白分解酵素の逆反応を利用して有用ペ
プチドを合成しようとする試みが活発になつてき
ており、かかる蛋白分解酵素を利用してペプチド
を合成する方法（酵素的合成法）は、化学的合成
法と比較して、アミノ酸の側鎖官能基を必ずしも
保護しておく必要がないこと、反応が立体選択的
に進行するので安価なラセミ体原料を使用できる
こと、反応中ラセミ化が起らないこと、常温常圧
で反応が進行すること等の非常に優れた特徴を有
している。

反面、酵素的合成法は酵素の基質特異性のため
に原料とするアミノ酸の種類に応じて利用できる
酵素が決定され、あるひとつの酵素が如何なるペ
プチド合成にも利用できるというものではなく、
目的とするペプチド合成反応を触媒することので
きる酵素を選択すること自体非常に困難であるこ
と、更に確立された酵素的ペプチド合成法といえ
ども、一般に反応の平衡は基質の方に大きく片寄
つており、収率、反応速度等がかなり低い等の問
題点がある。殊に、三つ以上の異なるアミノ酸が
結合したオリゴペプチドを酵素的に合成する場合
には、通常予め二つのアミノ酸を結合反応させた
後、これに更にアミノ酸を順次結合反応させてい
く所謂ステツプワイズ法が採用されるが、この方
法では第２段階以降の反応に原料基質としてジペ
プチド、トリペプチド等を用いる必要があり、こ
れら原料基質は、合成反応系内で用いられる酵素
により加水分解されて切断されたり、該切断によ
り生じるアミノ酸等が更に合成反応に関与したり
することが多い。之等副反応が生起する場合、目
的物が得られなかつたり、多量の副生物が生成し
て目的物の分離が困難となつたり、目的物純度を
大巾に低下させる。

発明が解決しようとする問題点本発明の目的は、酵素的合成法を駆使して、デ
ス―Tyr¹―エンケフアリンを製造する新しい方
法を提供することにある。特に本発明は、上記オ
リゴペプチドを、簡単な操作及び工程で、効率よ
くしかも高収率、高純度をもつて製造できる実用
的技術を提供することを目的とする。

問題点を解決するための手段本発明によれば、水―酢酸エチル二相系で、バ
チルス属金属プロテアーゼを用いてＮ―置換グリ
シル―グリシンとフエニルアラニル―ロイシルア
ルキルエステルとを縮合反応させることを特徴と
するオリゴペプチドの製造法が提供される。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基等の記載は、当該分野における慣用記号に従う
ものとする。

本発明者らは、プロテアーゼによるペプチド類
の合成につき鋭意研究を重ねる過程において、先
にジペプチドPhe―Phe及びAsp―Pheの酵素的合
成法を確立した（特開昭60−45596号公報参照）。
引続く研究において本発明者らは、エンケフアリ
ンの合成を最終目標として、その第一段階として
エンケフアリナーゼの阻害剤であるデス―Tyr¹
―エンケフアリンの酵素による合成（縮合）反応
につき研究を重ねた。その結果、上記縮合反応が
サーモライシン即ちバチルス属金属プロテアーゼ
により触媒され、しかもこの反応が水―酢酸エチ
ル二相系で効率よく実施されるという新しい知見
を得た。本発明は、この知見に基づいて完成され
たものである。

本発明方法において一方の基質とするＮ―置換
Gly―Gly（以下「酸成分」という）におけるＮ
―置換基は、ペプチド合成反応に慣用されるアミ
ノ基保護基である。その代表例としてはベンジル
オキシカルボニル基（Ｚ）を例示でき、他に例え
ばｐ―メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｔ
―ブトキシカルボニル基（Boc）、２―クロルベ
ンジルオキシカルボニル基等も包含される。他方
の基質するPhe―Leu―アルキルエステル（以下
「塩基成分」という）におけるアルキル基も亦慣
用されるアミノ酸のカルボキシル保護基である。
その具体例としては炭素数１〜４のアルキル基、
例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル基を例
示でき、他にベンジル、ｐ―ニトロベンジル、ｐ
―クロロベンジル基等もよく知られている。之等
原料基質のうち酸成分とするGly―Glyは、Glyが
光学異性体を有していないため、化学合成法で簡
単に合成でき、また市販されてもいる。塩基成分
であるPhe―Leuの各アミノ酸としては、通常い
ずれもＬ―体を利用するのが普通であり、該塩基
成分の合成は化学合成法によつてもよいが、本発
明に従う酵素的合成法と同様にしてサーモライシ
ンにより合成するのが好ましい。

本発明では、酵素反応を水―酢酸エチル二相系
で行なうことが重要である。ここで水―酢酸エチ
ル二相系とは、別個に調製した水相と酢酸エチル
相とを用いることを意味し、実際の反応に当つて
は両相は攪拌等によりエマルジヨン状態で均一に
混合される。

上記水相としては適当な緩衝液を用いるのがよ
く、例えば（２―ジアミノモルホリノ）エタンス
ルホン酸（MES）の水溶液が好ましく用いられ
る。また該水相には、そのPHを約４〜５程度に調
節するために例えば水酸化ナトリウム等を加える
ことができ、更に用いる酵素の安定化因子として
知られている例えば塩化カルシウム等を溶解させ
ることもできる。

本発明方法では、まず上記水相に酸成分を溶解
し、酢酸エチル相に塩基成分を溶解して、両基質
の溶液を調製する。上記各基質溶液における基質
濃度は、適宜に決定され、反応速度の面からはで
きるだけ高濃度とするのが好ましいが、通常いず
れも約５〜60mM程度の範囲とするのがよく、特
に塩基成分に対する酸成分の濃度比を、約0.2〜
３の範囲、通常約0.4〜３とするのが好適であ
り、この範囲では酸成分濃度が低い程目的とする
オリゴペプチドの収率は向上する傾向にあり、逆
に酸成分濃度を高くすると目的物収率は若干低下
するが、副反応成物の生成が抑制される傾向があ
る。また上記各基質溶液の使用割合（体積化）
は、酢酸エチル相に対して水相を少なくとも等量
とすることにより、目的とする合成反応が進行
し、高収率で目的物が収得される。通常上記体積
比率は、水相に対して酢酸エチル相を約１〜10倍
量となる範囲で選択するのがよく、この範囲で酢
酸エチル相を多量に用いる程目的物純度及び収率
は向上する傾向にある。

本発明方法においては、バチルス属金属プロテ
アーゼを、上記水相側基質溶液に添加して用い
る。上記酵素剤としては例えば代表的にはサーモ
ライシン（大和化成株式会社製）が市販されてい
るが、本発明では特にこの市販品を用いる必要は
なく、別途にバチルス属細菌より調製される粗酵
素液やその精製品等を用いることもでき、また他
の同様の酵素の性質を有するバチルス属金属プロ
テアーゼを用いることもできる。その使用量は、
用いる酵素の力価、反応件等により異なるが、通
常サーモライシンの場合は本発明に用いる前記水
相の全容積の約．2W／Ｖ％以上、好ましくは約
１〜2W／Ｖ％程度とするのがよい。勿論この範
囲以上の高濃度で用いることもできるが、高濃度
で用いても目的物収量等が向上するわけではな
く、むしろ経済的に好ましくない。

本発明の縮合反応は、上記塩基成分を含む酢酸
エチル相と酸成分及び酵素を含有させた水相とを
添加混合するか、上記酢酸エチル相と酵素とを同
時に、酸成分を含む水相に添加混合するか、又は
塩基成分と酸成分とを含む酢酸エチル相と酵素を
含む水相とを混合して、混合物（エマルジヨン）
を所定温度で攪拌することにより実施される。上
記反応時の温度は通常約20〜50℃とされるのがよ
く、該温度が高い程反応時間は短縮されるが、通
常約40℃付近とするのが適当である。反応時の水
相のPHは、通常約4.5〜6.5の範囲とするのが好ま
しく、反応の進行に伴つて変化するおそれのある
該水相のPHを、上記範囲に維持するために、反応
系内には塩酸等の酸を逐次添加することもでき
る。また上記攪拌は反応系が均一状態を保持する
ように、通常比較的ゆるやかな条件で行なうか又
は振盪しながら行なうことができる。更に上記攪
拌は反中常に連続して行なう必要はなく、断続的
に行なうこともできる。

上記縮合反応によつて、目的とするオリゴペプ
チドが有機溶媒溶液として得られる。これは、常
法に従い有機相を分取し、濃縮晶析させるか又は
抽出等の操作を行なうことにより容易に分離する
ことができ、更に通常の単離精製手段により精製
することもできる。

かくして得られるオリゴペプチドは、そのカル
ボキシル基及びアミノ基保護基を、常法に従い脱
離することによつて、デス―Tyr¹―エンケフア
リン（GIy―Gly―Ｌ―Per―Ｌ―Leu）とするこ
とができる。これはエンケフアリナーゼ阻害剤と
して有用であり、また更にエンケフアリンの合成
中間体としても有用である。

実施例以下本発明を更に詳しく説明するため実施例を
挙げる。

実施例１ (1) Ｌ―Phe―LeuOEtの調製0.25Mトリス塩酸緩
衝液（5mMCaCl₂を含む）と、等容積の酢酸エ
チルとを分液漏斗を用いて平衡化（40℃）さ
せ、酢酸エチルで飽和されたトリス塩酸緩衝液
と、同トリス塩酸緩衝液で飽和された酢酸エチ
ル溶液とを調製した。

上記で得た酢酸エチル飽和のトリス塩酸緩衝
液10mlにＬ―LeuOEt・HCl塩313mg
（160mM）を溶かして、PH＝7.5の水相側基質
溶液を調製した。

一方、上記トリス塩酸緩衝液で飽和した酢酸
エチル10mlに、Ｚ―Phe239.5mg（80mM）を溶
かして有機相側基質溶液を調製した。

上記水相側基質溶液にサーモライシン20mg
（0.2％）を加え、これを有機相側基質溶液と混
合し、40℃で攪拌しながら反応させて、Ｚ―Ｌ
―Phe―Ｌ―LeuOEtを得た。

収率（Ｚ―Phe基準）５時間反応後 93.2％ 24時間反応後 99.5％上記で得られた保護ジペプチドより、酢酸と
25％HBr―酢酸溶液を用いてＺ基を脱離反応さ
せてＬ―Phe―Ｌ―LeuOEtを得た。

(2) Ｚ―Gly―Gly―Ｌ―Phe―Ｌ―LeuOEtの製
造先ずサーモライシンの安定化因子である5mM
―CaCl₂を含む0.05M―MES（（２―ジアミノモル
ホリノ）エタンスルホン酸・モノ水和物、同仁化
学研究所製）溶液と、等容積の酢酸エチルとを分
液漏斗を用いて平衡化（40℃）させ、酢酸エチル
で飽和されたMES溶液と、同MES溶液で飽和さ
れた酢酸エチル溶液とを調製した。

上記で得たMES溶液飽和の酢酸エチル溶液10
mlに、Ｌ―Phe―Ｌ―LeuOEt61.4mgを溶解（終
濃度20mM）して有機相側基質溶液を調製した。

一方、上記で得た酢酸エチル飽和のMES溶液
10mlに他方の基質であるＺ―Gly―Gly（シグマ
社製）53.3mgを溶解（終濃度20mM）し、4N水酸
化ナトリウム水溶液でPHを4.5に調節して水相側
基質溶液を調製した。

上記水相側基質溶液に、サーモライシン（大和
化成株式会社製、バチルス属金属プロテアーゼ、
力価9470PU／mg）40mgを溶解させ、これに前記
有機相側基質溶液を加えて40℃で攪拌して、エマ
ルジヨン状態で反応を行なわせた。尚、反応中
1N塩酸を溶液に添加して水相側を４，５に維持
した。経時的に有機相の少量をサンプリングし、
下記に示す条件で高速液体クロマトグラフイーを
行ない、生成物量を定量した。水相中の生成物量
は、有機相中のそれと比較して無視できるもので
あつた。

〈高速液体クロマトグラフイー〉装置：高速流体クロマトグラフ（島律製作所製
LC―3A型）カラム：内径10mm×長さ300mm 充填剤：TSK―GEL LS―410K（ODS―シリカ
東洋曹達社製）溶媒：アセトニトリル―水（55：45、リン酸でPH
を2.5に調整）検出：紫外吸収（25nm）結果を第１図にす示す。第１図において横軸は
反応時間（時間）を、縦軸は生成物収率（％）を
示し、曲線１は、目的生成物であるＺ―Gly―
Gly―Ｌ―Phe―Ｌ―LeuOEtを、曲線２は、副生
成物とするＺ―Gly―Gly―Ｌ―Phe―Ｌ―Phe―
Ｌ―LeuOEtをそれぞれ示す。

第１図より、目的生成物（デス―Tyr¹―ロイ
シンエンケフアリンの前駆体、曲線１で示され
る）の出発基質に対する収率は、約60％におよ
び、一方副生成物としては、上記曲線２で示され
るペンタペプチドのみが僅か６％程度生成するに
過ぎないことが判る。

上記目的物（Ｚ―Gly―Gly―Ｌ―Phe―Ｌ―
LeuOEt）を、酢酸エチルで抽出し、エバポレー
ターで乾固させ、その４ミリモル当りに、酢酸５
mlと25％HBr―酢酸溶液10mlとの混液を加え、室
温で１時間反応させてＺ基を脱離除去した。

反応後、系内にジエチルエーテルを添加して
HBr―Gly―Gly―Ｌ―Phe―Ｌ―LeuOEtを沈澱
として析出させた。これを等量の炭酸ナトリウム
と共に蒸留水に溶かし、分液漏斗でクロロホルム
と振盪してGly―Gly―Ｌ―Phe―Ｌ―LeuOEtを
抽出し、クロロホルム相を無水硫酸マグネシウム
にて脱水しロータリーエバポレーターで乾固させ
た。

得られた化合物に０〜４℃で等量の1N水酸化
ナトリウム水溶液を添加してエステル結合を切断
し、更に酢酸で中和し、ロータリーエバポレータ
ーで約10倍に濃縮し、得られる沈澱物を少量の蒸
留水、次いでエーテルで各々洗浄し、乾燥して
Gly―Gly―Ｌ―Phe―Ｌ―Leuを得た。

比較例１上記実施例１に示した水―酢酸エチル二相系で
の本発明方法に見られる効果を明らかにするた
め、以下の水相系での比較方法を実施した。

即ち酢酸エチル飽和の１／20M・MES―NaOH
緩衝液（PH）5.4）に、それぞれ終濃度が20mM
となるように各基質（Ｚ―Gly―Gly及びＬ―Leu
―Ｌ―PheOEt）を添加溶解し、更にこの水溶液
に実施例１で用いたと同一の酵素（0.1％）を加
え、同一条件下に水溶液中で酵素反応を行なわせ
た。

反応液を経時的にサンプリングし、実施例１と
同一条件で高速液体クロマトグラフイーを行な
い、生成物量を定量した結果を、第２図に示す。

第２図より明らかな通り、水溶液中での反応で
は、目的物の収率は僅か7.5％（曲線１）参照）
に過ぎず、一方副生成物としては、ペンタペプチ
ドＺ―Gly―Gly―Ｌ―Phe―Ｌ―Phe―Ｌ―
LeuOEtが約15％（図中曲線２として示す）及び
更に高分子のペプチドであるＺ―Gly―Gly―Ｌ
―Phe―Ｌ―Phe―Ｌ―Phe―Ｌ―LeuOEtが約10
％（図中曲線(3)として示す）も生成することが確
認された。

実施例２実施例１において、Ｚ―Gly―Glyの終濃度を
15mM、Ｌ―Phe―Ｌ―LeuOEtの終濃度を
5mM、有機相容積／水相容積比を10／１、水相
酵素濃度を２％、水相PHを4.5として、同様にエ
マルジヨン状態で反応を行なつた。

その結果、約82％の高収率で目的物が製造され
た。

このように本発明の水―酢酸エチル二相系での
酵素反応によれば、目的物の収率向上が可能であ
ることが判る。また反応条件の選択によれば、約
90％前後の高収率で目的物の合成が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１に示す方法における反応時間
と収率の関係を示すグラフであり、第２図は比較
例１に示す方法における同グラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

１水―酢酸エチル二相系で、バチルス属金属プ
ロテアーゼを用いてＮ―置換グリシル―グリシン
とフエニルアラニル―ロイシルアルキルエステル
とを縮合反応させることを特徴とするオリゴペプ
チドの製造法。