JPH0517499A

JPH0517499A - 新規ヘプタペプチド及びその不溶化方法

Info

Publication number: JPH0517499A
Application number: JP3168208A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Yamamoto; 浩之山本
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1991-07-09
Filing date: 1991-07-09
Publication date: 1993-01-26

Abstract

(57)【要約】【目的】チリ産い貝の接着タンパク質に類似する新規ヘ
プタペプチドを高分子合成化学により製造する。【構成】アミノ酸配列が、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｌｙｓ（ＸはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅ
ｕ、Ｉｌｅ又はＰｈｅ）である新規ヘプタペプチド及び
そのヘプタペプチドが繰り返されたポリペプチド。【効果】生体適合性のある新素材つまりバイオ接着剤と
して使用され、具体的な用途には（内科、外科、眼
科）、薬学、歯学、獣医学上での生体関連複合接着剤、
水中での汚染防止のための表面被覆材料、あるいは導電
性電子材料などがある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規ヘプタペプチド及
びその不溶化方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】海洋中で岩などに付着・接着し生態を維
持しているふじつぼ、い貝、かきなどの無脊椎動物の分
泌するタンパク質は海洋接着タンパクと総称されてい
る。この海洋無脊椎動物の接着作用には長期にわたる観
察・研究史があるが、近年の接着物質の精製法およびア
ミノ酸配列の確立とあいまって、生体適合性のある新素
材つまりバイオ接着剤として期待されている。その具体
的な用途には医学（内科、外科、眼科）、薬学、歯学、
獣医学上での生体関連複合接着剤、水中での汚染防止の
ための表面被覆材料、あるいは導電性電子材料などが挙
げられている。

【０００３】海洋接着タンパク質のうち生化学の立場か
らの分析が最も進んでいるのはむらさきい貝を中心とす
る貝類であり、これら接着タンパク質の製法は始め天然
物抽出・精製から出発したが、次いで高分子合成化学と
遺伝子工学が追随した。初めての高分子合成は本願の発
明者のグループによるむらさきい貝の繰り返しポリペプ
チド（Ａｌａ−Ｌｙａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−４−
Ｈｙｐ−４−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ−Ｄｏｐａ−Ｌｙｓ）であ
るが(H.Yamamoto,J.Chem.Soc.,Perkin Trans,I,1987,61
3)、このポリペプチドの９−位のＤｏｐａはペプチド合
成化学の見地からは扱い易いとは言い難いアミノ酸であ
る。

【０００４】最近チリ産い貝の接着タンパク質の精製法
が報告された。この繰り返しヘプタペプチドを主とする
接着タンパク質はむらさきい貝の繰り返しデカペプチド
を主とするタンパク質より短いペプチド鎖の繰り返しで
あるため、むらききい貝よりはるかに安価なバイオ接着
剤として有望視されているが、専ら天然物の精製による
試料が供給されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、チリ産い貝
の接着タンパク質に類似する、高分子合成化学により製
造された新規ヘプタペプチド及びその不溶化方法を提供
するものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、アミノ酸配列
が、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｌ
ｙｓ（ＸはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＰｈ
ｅ）である新規ヘプタペプチド及びそのヘプタペプチド
が繰り返されたポリペプチドに関する。

【０００７】図１は、（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｌｙｓ）n（Ｘ＝Ａｌａ、Ｉｌｅ）の
合成ル−トを示すものである。Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｚ
ｌ）−ＯＨおよびＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ²Ｃｌ）・ｔ−ブ
チルアミンはペプチド研究所より購入した。Ｂｏｃ−Ａ
ｌａおよびＢｏｃ−Ｇｌｙは（Ｂｏｃ）₂Ｏを用いて作
った。アミノ酸誘導体およびペプチド誘導体の必要な脱
水縮合にはＤＣＣＩ法を用い、重縮合には活性エステル
法を用いた。すべての反応は薄層クロマト（ＴＬＣ、メ
ルク社シリカゲル６０ＧＦ₂₅₄）で追跡し、その展開溶
媒はクロロホルム−メタルノール−酢酸（９５：５：
３、Ｖ／Ｖ）などを用いた。中間体はＴＬＣで単−スポ
ットを与えるまで精製し、ＣＨＮ元素分析および旋光度
測定により純度を確認した。

【０００８】Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ²Ｃｌ）−ＯＮｐ
（１）はＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ²Ｃｌ）・ｔ−ブチルアミ
ンとｐ−ニトロフェノールから調製し（収率は９３
％）、４ＭのＨＣｌ／ジオキサン溶液を加えＨＣｌ・Ｌ
ｙｓ（Ｚ²Ｃｌ）−ＯＮｐ（２、収率は８４％）に変え
た。Ｂｏｃ−Ｘ（Ｘ、ＡｌａおよびＩｌｅ）（３）とＤ
ＣＣＩ法でカップリングしＢｏｃ−Ｘ−Ｌｙｓ（Ｚ²Ｃ
ｌ）−ＯＮｐ（５、収率はＡｌａで６３％、Ｉｌｅで６
１％）を合成し、４ＭのＨＣｌ／ジオキサンによりＨＣ
ｌ・Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｚ²Ｃｌ）−ＯＮｐ（６、収率は
Ａｌａで７６％、Ｉｌｅで８２％）に変えた。次いで、
同様な反応でＢｏｃ−Ｇｌｙとカップリングし、Ｂｏｃ
−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｌｙｓ（Ｚ²Ｃｌ）−ＯＮｐ（７、収率
はＡｌａで６９％、Ｉｌｅで７３％）を経てＣ−端側ト
リペプチドＨＣｌ・Ｇｌｙ−Ｘ−Ｌｙｓ（Ｚ²Ｃｌ）−
ＯＮｐ（８、収率はＡｌａで６８％、Ｉｌｅで７４％）
を得た。

【０００９】通常の塩酸ガス法で作ったＨＣｌ・Ｈ−Ｇ
ｌｙ−ＯＭｅ（４）とＢｏｃ−ＡｌａをＤＣＣＩ法でカ
ップリングしＢｏｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ（９、収
率は７８％）を得、１ＭのＮａＯＨを用いてけん化しＢ
ｏｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（１０、収率は７８％）を得た。
Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ−ＯＭｅ（１１）は
Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）と化合物４をＤＣＣＩ法によ
りカップリングし（収率は８１％）、ついでＨＣｌ・Ｔ
ｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ−ＯＭｅ（１２、収率は９１
％）に変えた。化合物と１０と１２をクロロホルム−酢
酸エチル中でカップリングしＢｏｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ−ＯＭｅ（１３、収率は６７
％）を得た。けん化によりＢｏｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ（１４、収率は９０％）に変え
た。

【００１０】Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（Ｂｚ
ｌ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｌｙｓ（Ｚ²Ｃｌ）−ＯＮ
ｐ（１５）はクロロホルム中で化合物１４と化合物８を
カップリングして得（収率はＡｌａで６８％、Ｉｌｅで
５９％）、次いでＨＣｌ・Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（Ｂ
ｚｌ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｚ²Ｃｌ）
−ＯＮｐ（１６）に変えた（収率はＡｌａで６７％、Ｉ
ｌｅで６７％）。

【００１１】重縮合はヘプタペプチド活性エステル塩酸
塩（１６）を精製ジメチルホルムアミドに溶かし、１．
１等量のトリエチルアミンを加え１０日間放置した。洗
浄および精製後、ポリ〔Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（Ｂｚ
ｌ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｚ²Ｃｌ）〕
（１７−Ａｌａ、収率は８５％、ＣＨＮ：分析値・Ｃ５
８．１％、Ｈ６．０％、Ｎ１２．７％、理論値（Ｃ₄₂Ｈ
₅₁Ｎ₈Ｏ₁₀Ｃｌ）・Ｃ５８．４％、Ｈ６．０％、Ｎ１
３．０％）およびポリ〔Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（Ｂｚ
ｌ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（Ｚ²Ｃｌ）〕
（１７−Ｉｌａ、収率は７８％、ＣＨＮ：分析値・Ｃ５
９．４％、Ｈ６．７％、Ｎ１２．６％、理論値（Ｃ₄₅Ｈ
₅₇Ｎ₈Ｏ₁₀Ｃｌ）・Ｃ５９．７％、Ｈ６．４％、Ｎ１
２．４％）が得られた。保護ポリヘプタペプチド（１
７）をトリフロロ酢酸に溶かし、３．１ＭのＨＢｒ／Ａ
ｃＯＨとチオアニソールを加え、５０℃で１０時間、次
いで室温にて５日間撹拌し側鎖保護基を完全に除去し、
ポリ〔Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌ
ａ−Ｌｙｓ（ＨＢｒ）〕・８Ｈ₂Ｏ（１８−Ａｌａ、収
量０．５５ｇ、収率９５％）およびポリ〔Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（ＨＢ
ｒ）〕・１０Ｈ₂Ｏ（１８−Ｉｌｅ、収量０．５３ｇ、
収率８８％）を得た。

【００１２】図２は、（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｌｙｓ）n （Ｘ＝Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖ
ａｌ）の合成ル−トを示すものである。この場合、Ｎ末
端保護差としてＢｏｃ基よりも酸に敏感で、２Ｍ塩化水
素処理においてＢｏｃ基よりも７０倍も切断の容易なＯ
−ニトロフェニルスルフェニルを使用した。これ以外は
図１の合成ル−トと同様にして（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｌｙｓ）n （Ｘ＝Ｐｈｅ、Ｌ
ｅｕ、Ｖａｌ）を合成した。

【００１３】合成した側鎖保護ポリペプチド（１７、３
５）の平均重合度をその固有粘度から求めた。このとき
用いた粘度式は以下の三式である２５℃、溶媒ＤＡＣ

【数１】

【数２】ｌｏｇＤＰ＝１．４７×ｌｏｇ〔η〕＋２．９９平均重合度、平均アミノ酸重合度、繰り返し数は次の通
りである。Ｘ平均重合度平均アミノ酸重合度繰り返し数 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ Ａｌａ約２０８００１６８２４Ｉｌｅ約１５４００１１９１７Ｐｈｅ約１１６００１１９１７Ｌｅｕ約１４９００１６１２３Ｖａｌ約１６５００１８２２６

【００１４】化合物１８、化合物３６のアミノ酸分析結
果は次の通りである。Ｘ＝Ａｌａ：Ａｌａ_2.10、Ｇｌｙ_2.81、Ｔｙｒ_1.00、Ｌｙｓ_1.11 Ｘ＝Ｉｌｅ：Ａｌａ_0.96、Ｇｌｙ_2.99、Ｔｙｒ_1.00、Ｉｌｅ_1.15、Ｌｙｓ_1.14 Ｘ＝Ｐｈｅ：Ａｌａ_1.13、Ｇｌｙ_2.91、Ｔｙｒ_1.00、Ｐｈｅ_1.00、Ｌｙｓ_1.02 Ｘ＝Ｌｅｕ：Ａｌａ_1.15、Ｇｌｙ_3.04、Ｔｙｒ_1.00、Ｌｅｕ_1.04、Ｌｙｓ_1.05 Ｘ＝Ｖａｌ：Ａｌａ_1.10、Ｇｌｙ_3.09、Ｔｙｒ_1.00、Ｖａｌ_0.94、Ｌｙｓ_0.95

【００１５】ＸがＩｌｅの化合物１８（１．７ｍｇ）を
人工海水に溶かし（ｐＨ７）、酸化酵素チロシナーゼ４
２ｕｎｉｔを加え２５℃における吸収スペクトルの変化
を測定した。４〜５分後にＴｙｒからＤｏｐａへの転換
が起こり始め一夜経つとＴｙｒの吸収極大は消失し、Ｄ
ｏｐａおよびＤｏｐａキノンの吸収極大が観察され、そ
の後も時間と共に光学濃度は増し続けＤｏｐａキノンを
経ての不溶化の傾向が認められる。図３は、酵素により
Ｔｙｒ→Ｄｏｐａ→Ｄｏｐａキノンと変化したときのポ
リペプチドのスペクトル変化を示すものであり、図３に
示すように、ＴｙｒからＤｏｐａの変換はＤｏｐａの吸
収極大波長２８３ｍと連続酸化で生成するＤｏｐａキノ
ンの吸収極大波長３４０−３５０ｍの出現で確認され
る。図３でＡは酸化酵素チロシナ−ゼを加えない場合、
Ｂは酸化酵素チロシナ−ゼを加えた場合のグラフであ
る。

【００１６】本発明のペプチドを不溶化させるには、酸
化酵素の他に、グルタルアルデヒド、グリオキザ−ル、
ｏ−フタルアルデヒド、ｍ−フタルアルデヒド、ｐ−フ
タルアルデヒド等の架橋剤が使用される。

【００１７】

【発明の効果】チリ産い貝の接着タンパク質のアミノ酸
シークエンスは（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｐａ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｘ−Ｌｙｓ）n であり６−位のＸは疏水性アミ
ノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ）であ
る。一般にＤｏｐａを組み込んだペプチド合成は相当困
難であり、ＤｏｐａをＴｙｒに読み替えられるならその
難度は軽減する。本発明のペプチドは、水系で迅速、簡
便に不溶化、接着性をもたせることが可能で、例えば生
体適合性のある接着剤として使用される。具体的な用途
としては医学（内科、外科、眼科）、薬学、歯学、獣医
学上での生体関連複合接着剤などがある。

【図面の簡単な説明】

【図１】合成ル−トを示すフロ−チャ−ト。

【図２】合成ル−トを示すフロ−チャ−ト。

【図３】ポリペプチドのスペクトル変化を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０９Ｄ 5/14 ＰＱＪ 6904−4ＪＰＱＬ 6904−4ＪＣ０９Ｊ 189/00 ＪＡＪ 6770−4ＪＣ０７Ｋ 99:00

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列が、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｌｙｓ（ＸはＡｌａ、Ｖａｌ、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＰｈｅ）である新規ヘプタペプチ
ド。
【請求項２】請求項１のヘプタペプチドが繰り返された
ポリペプチド。
【請求項３】請求項１又は２のペプチドに酸化酵素及び
／又は架橋剤を添加することを特徴とするペプチドの不
溶化方法。
【請求項４】請求項３により不溶化されたペプチドを含
む接着剤。