JPH05176792A

JPH05176792A - Ｇｍ−ｃｓｆ阻害抗体

Info

Publication number: JPH05176792A
Application number: JP4065473A
Authority: JP
Inventors: Isia Bursuker; バースカーアイシア; Robert S Greenfield; エスグリーンフィールドロバート; Gary R Braslawsky; アールブラスロースキィゲリー
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1991-02-11
Filing date: 1992-02-06
Publication date: 1993-07-20
Also published as: CA2060741A1; EP0499161A3; EP0499161A2

Abstract

(57)【要約】【構成】ＧＭ−ＣＳＦから誘導される配列を有するオ
リゴペプチドにより、宿主動物を免疫化することによっ
て得られる、ＧＭ−ＣＳＦの生物活性を阻害するモノク
ロナール抗体及びそのフラグメント、ハイブリドーマ細
胞系、並びにその製法。【効果】ＧＭ−ＣＳＦ依存性腫瘍性疾患、炎症疾患、
自己免疫疾患等の治療剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【従来の技術】コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、造血前
駆体細胞の増殖及び分化を刺激する一群のポリペプチド
ホルモンである。４種のネズミＣＳＦが同定されてい
る。即ち、マルチ−ＣＳＦ（「ＩＬ−３」とも称され
る）、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦであ
る。各ＣＳＦは、造血細胞の異なった条列の形成を誘起
し、そして前駆細胞の特異レセプターに結合する。同様
に、４種のヒトＣＳＦが同定されている。

【０００２】ネズミＧＭ−ＣＳＦは、種々の細胞タイプ
により生産され、これらの細胞タイプにはＴ−リンパ
球、マクロフアージ、内皮細胞及び繊維芽細胞が包含さ
れる。ＣＭ−ＣＳＦは、顆粒球及びマクロフアージコロ
ニーの形成を誘起し、そして成熟好酸球、好中球及びマ
クロフアージを活性化する。この因子は、マウス肺細胞
から精製され、そして約２３キロダルトンの分子量を有
する糖タンパク質であることが判った。マウス（ネズ
ミ）ＧＭ−ＣＳＦをコードしている遺伝子は、観察され
たヌクレオチド配列から演繹された。例えば、Ｎ．Ｍ．
ゴウ（Ｇｏｕｇｈ）等、（１９８５年）、ＥＭＢＯ・ジ
ャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ）、４（３）、６４５頁を参
照。成熟ネズミタンパク質は、約１４，０００の計算分
子量を有する１２４個のアミノ酸からなっている。更
に、何人かの研究者は、生物活性にとって重要なタンパ
ク質領域を測定するために、種々の欠失分析を行ってい
る。特に、Ａ．Ｂ．シャナフルト（Ｓｈａｎａｆｅｌ
ｔ）等、（１９８９年）、プロク・ナツル・アカド・サ
イ・（Ｕ．Ｓ．Ａ）〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓａｉ（Ｕ．Ｓ．Ａ）〕、８２、４３６０頁には、ネズ
ミＧＭ−ＣＳＦの生物活性にとって、アミノ酸残基１８
−２２、３４−４１、５２−６１及び９４−１１５が臨
界的なものであることが指示されている。また、Ｎ．
Ｍ．ゴウ等、（１９８７年）、ヨール・Ｊ・ビオケム
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）、１６９、３５３頁に
は、官能性ネズミＧＭ−ＣＳＦ分子にとって、アミノ酸
残基１１−１５、２４−３７、４７−４９及び８１−８
９が必要であることが指摘されている。

【０００３】血液または骨髄源から得られる原発性ヒト
骨髄性白血病細胞の大部分は、試験管内で増殖及び生存
のためにコロニー刺激因子を必要とする。例えば、Ｊ．
Ｄ．グリフェン（Ｇｒｉｆｆｅｎ）等、（１９８６年）
ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、６７巻、１４４８頁は、１３
〜１５例の急性骨髄性白血病（「ＡＭＬ」）患者からの
芽球細胞は、ＧＭ−ＣＳＦで刺激すると半固体寒天でコ
ロニーとして、生育することを見い出した。更に、何人
かの研究者は、ＡＭＬ患者から得られた組織試料中に、
ＧＭ−ＣＳＦ依存性腫瘍細胞を見い出した。〔例えば、
「サイトカインズ・イン・キャンサー・テラピイ」（Ｃ
ｙｔｏｋｉｎｅｓｉｎＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐ
ｙ）、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏ
ｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ）（１
９８９年）、１１４−１４９頁、Ｆ．Ｒ．バルクウィル
（Ｂａｌｋｗｉｌｌ）での討論を参照〕。従って、ＧＭ
−ＣＳＦ依存性腫瘍の生育を阻止する能力が最も望まし
い。

【０００４】ＧＭ−ＣＳＦの活性を中和もしくは阻止す
る抗体を調製する試みは、一般に成功していなかった。
例えば、Ｊ．Ｆ．デラマルタ（Ｄｅｌａｍａｒｔｅｒ）
等は、（１９８５年）、ザ・ＥＭＢＯ・ジャーナル（Ｔ
ｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）、４巻、２５７５頁
でＧＭ−ＣＳＦ活性を約５０％のレベルで中和する、ネ
ズミＧＭ−ＣＳＦに対するポリクロナール抗血清を調製
していた。これらの著者は、結合抗体及びＧＭ−ＣＳＦ
活性阻止に臨界的であるエピトープを定めようとはして
いなかった。更に、Ｉ．クラーク−ルイス（Ｃｌａｒｋ
−Ｌｅｗｉｓ）等は、（１９８８年）Ｊ．イムノロジイ
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１４１巻、８８１頁で
ヒトＧＭ−ＣＳＦの１４−２４及び１４−１９残基に対
する抗体を調製した。著者等は、これらの領域がＧＭ−
ＣＳＦの生物活性に対して、臨界的であることを認め
た。それでも、これらの領域を表現している合成ペプチ
ドを産出させた抗体は、天然のヒトＧＭ−ＣＳＦの生物
活性と反応もしくは阻止することができなかった。

【０００５】

【発明の構成】これに対して、本発明によれば、ＧＭ−
ＣＳＦから誘導される配列のオリゴペプチドで宿主動物
を免疫化することによって生じる抗体が提供される。こ
れらの抗体は、ＧＭ−ＣＳＦの生物活性を阻止し得る。
特に、これらの抗体は、ＧＭ−ＣＳＦ依存性腫瘍性疾患
での生育を阻止するのに有用である。これらの抗体は、
また造血前駆細胞でのＧＭ−ＣＳＦの生物活性を阻止す
るのに有用であり、この活性の阻止が望ましいとされて
いる疾患、例えば炎症過程で有用でもある。

【０００６】知られている通り、顆粒球・マクロフアー
ジコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）の生物学的効
果を阻止し得る抗体を製造するのに有用であるオリゴペ
プチドが、開示されている。特に、これらのオリゴペプ
チドは、そのアミノ酸配列が哺乳動物ＧＭ−ＣＳＦ配列
から誘導され、ＧＭ−ＣＳＦの望ましくない生物活性を
阻害もしくは抑制し得る抗体を生産するのに有用であ
る。好ましい態様では、特定の哺乳動物宿主から誘導さ
れ、且つ第１図で示したネズミ由来の配列に相当するオ
リゴペプチド〔配列番号１（ＳＥＱＩＤＮＯ：
１）〕は、同族宿主に投与された時に、ＧＭ−ＣＳＦの
生物効果を阻害もしくは抑制し得る抗体を生産するのに
有用である。この目的のための好ましいオリゴペプチド
は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ配列から誘導され、得るものであ
る。

【０００７】本文全体にわたって使用される「哺乳動物
の」または「哺乳動物」は、いずれの温血動物をも称す
る。それで、本発明の抗体を生産するのに使用されるオ
リゴペプチドは、例えばマウス（ネズミ）、馬、羊、
牛、豚、犬、ネコまたは霊長類（ヒトを包含する）源か
ら誘導し得るものである。実験動物、例えばマウス、ラ
ット、モルモット及び兎のような実験動物のＧＭ−ＣＳ
Ｆ配列から誘導されるオリゴペプチドが関心をもたれて
いる。更に、家畜例えば牛、特に雌牛、羊及び豚のＧＭ
−ＣＳＦから誘導されるオリゴペプチドが、特に本発明
で有用である。ヒトＧＭ−ＣＳＦから誘導されるＧＭ−
ＣＳＦオリゴペプチドは、本発明の実施態様に特に有用
である。特に、ヒトＧＭ−ＣＳＦ誘導オリゴペプチド
〔配列番号２ＳＥＱＩＤＮＯ：２）〕は、本発明の
使用に、最も好ましいオリゴペプチドである。

【０００８】いずれの特定の哺乳動物ＧＭ−ＣＳＦは、
種特異性であるので、本発明のＧＭ−ＣＳＦ阻害抗体
は、「同族」種の一員に投与されることを意味してい
る。即ち、本発明の阻害抗体は、それが誘導される対応
するＧＭ−ＣＳＦオリゴペプチドと同一の哺乳動物種の
一員に投与されるべきものである。それで、使用したオ
リゴペプチドが、ヒトＧＭ−ＣＳＦ配列から誘導される
時は、得られた抗体は、ヒトに投与されるべきである。
同様に、ネズミＧＭ−ＣＳＦ配列から誘導されるオリゴ
ペプチドから生産される阻害抗体は、ネズミ宿主動物に
投与されるべきである。

【０００９】使用される「オリゴペプチド」とは、好ま
しくは約４〜５０のアミノ酸残基、最も好ましくは約４
〜１５のアミノ酸残基を含有する単鎖ペプチドを称す
る。好ましい態様では、オリゴペプチドは、所望のＧＭ
−ＣＳＦ宿主から誘導されるものであり、そして第１図
（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）で示したネズミ阻害配列に
相当する。

【００１０】第１図に示したネズミ阻害配列（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１）は、ゴウ等、ネイチュア（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、（１９８４年）、３０９巻７６３頁に定義された
配列のアミノ酸２１−３２に相当する。該文献で示され
た予想アミノ酸配列は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから調製
されたクローン化_ＣＤＮＡの分析から得られ、そして後
にゴウ等、ＥＭＢＯ・ジャーナル、（１９８５年）、４
（３）、６４５頁に示したものとは変わっている。第１
図のネズミ誘導された配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）
は、この後者の文献のアミノ酸残基５６〜５７に相当す
る。当業者は、後者の文献に示された配列は、ＢＡＬＢ
／Ｃマウスから調製される全身大の_ＣＤＮＡクローンか
ら予想され、そしておそらくはその前に示された配列の
アレリック変異を表していることを認めるであろう。

【００１１】それで、本発明で使用されるオリゴペプチ
ドの変異体または突然変異体と反応性を有する抗体は、
特定の種または亜種について天然または野生型にみられ
る配列と比較して、本発明の範囲内に包含されるべきも
のであることを当業者は、理解し得るであろう。以下、
詳述する如く、このような変異体または突然変異体は、
特に所望のオリゴペプチドが、組換えＤＮＡ技術により
製造される場合、天然、自発、ランダムまたは誘発変異
体または突然変異体の結果であり得る。同様に、このよ
うな変異または突然変異オリゴペプチドは、所望の変異
体が合成の時点で知られている限り、化学的に合成する
ことができる。更に、第１図に特に示したものよりも小
さいか、または大きい配列のものも所望のＧＭ−ＣＳＦ
阻害活性を有する抗体を生産するのに有用であり得る。

【００１２】それで、提供されたネズミ配列をその他の
所望の阻害配列と比較するのに使用される用語「対応す
る」及び「に対応する」は、融通性があることを意味す
る。好ましい態様では、特別な宿主ＧＭ−ＣＳＦの所望
のオリゴペプチド領域は、第１図に示すネズミ由来ＧＭ
−ＣＳＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に対して、最大の
相同性と合致している場合、「対応している」と称す
る。それで、第１図では例えば、２種の金ＧＭ−ＣＳＦ
配列が第３図に示す如く最大の相同性と合致している場
合、「Ｐ４４−５５」と称するネズミ由来配列に対応す
るヒト領域を示している。オリゴペプチドが、所望のＧ
Ｍ−ＣＳＦ阻害効果を伴う抗体を提供する限り、配列が
何であれ、該抗体は本発明に包括されることを意味して
いる。

【００１３】本文で使用される、例えば「阻害効果」、
「阻害」、「阻害し得る」等々の用語は、源が何であ
れ、天然のＧＭ−ＣＳＦの観察される生物活性を約５〜
１００％低減させる抗体を称する。好ましくは、治療投
与のためには、ＧＭ−ＣＳＦの観察される生物活性の低
減は、約５０〜１００％の範囲にある。

【００１４】本発明で使用されるオリゴペプチドは、当
業者に周知の手段によって合成することができる。特
に、アミノ酸配列は当該分野で既知の方法で、例えば固
相合成により、合成的に製造することができる。例え
ば、メリフィールド（Ｍｅｒｉｆｉｅｌｄ）、Ｒ．Ｂ．
（１９６３年）、Ｊ．アム・ケム・ソク（Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ）、８５巻、２１４９頁；クラーク−ル
イス（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ）、Ｉ．等、（１９８６
年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３１巻、１３４
頁；ケント（Ｋｅｎｔ），Ｓ．等、（１９８５年）、”
シンセティック・ペプチド・イン・バイオロジィ・アン
ド・メディシン”（”ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄ
ｅｓｉｎＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｄｉｃｉｎ
ｅ”）〔Ｋ．アリタロ（Ａｌｉｔａ１ｏ）編〕、エルセ
ビア・プレス（ＥｌｓｅｖｉｅｒＰｒｅｓｓ）、アムス
テルダム、２９頁；クラーク−ルイス，Ｉ等（１９８７
年）、”レセプター・バイオケミストリー・アンド・メ
ソドロジィ”（”ＲｅｃｅｐｔｏｒＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙａｎｄＭｅｔｈｏｌｏｇｙ”）、アラン
（Ａｌａｎ）Ｒ．リス（Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク、ニ
ューヨーク；及びクラーク−ルイス、Ｉ等、（１９８９
年）、Ｊ．イムノロジィ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ）、１４１巻、８８１頁を参照。比較的小さいサイズ
のオリゴペプチドは、固相合成の使用を殊に望ましくす
る。

【００１５】一般に、固相ペプチド合成において、反応
は不溶性固体支持体、例えばアミノ防護（「保護」）Ｃ
−末端アミノ酸が結合しているポリスチレン樹脂で、通
常反応性リンカー部分を介して起こる。このような樹脂
は、例えばｔ−ブチルオキシ−カルボニルアミノアシル
−４−（オキシメチル）−フェニルアセトアミドメチル
ポリスチレン樹脂〔「パム」（Ｐａｍ）；アプライド・
バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）、フォスター・シティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔ
ｙ）、カルフォルニアから入手可能〕であってよい。
Ａ．Ｒ．ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）等、（１９７
８年）、Ｊ．ビオル・ケム（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ）、４３巻、２８４５頁を参照。次に、樹脂上の反応
性基が、アミノ基が先に保護されているＣ−末端アミノ
酸のカルボキシル基と反応する。それで、Ｃ−末端アミ
ノ酸が、固体支持体と共有結合する。Ｃ−末端アミノ酸
のＮ−脱保護すると、次の所望のＮ−保護アミノ酸もし
くは、オリゴペプチドまたはその活性化形態が、固定Ｃ
−末端アミノ酸またはペプチドのここで、遊離のアミノ
基とカップリングする。

【００１６】カップリングは、既知のカップリング試
薬、例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ
−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、カルボ
ニルジイミダゾール、Ｎ−エチル−Ｓ’−フェニルイソ
オキサゾリニウム−３’−スルホネートまたは、Ｎ−エ
トキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキ
ノリン（ＥＥＤＱ）で行うことができる。結合されるべ
きアミノ酸、またはオリゴペプチドの活性化形態とは、
アミノ酸またはオリゴペプチドのカルボキシル官能基を
先に、結合された残基の脱保護したアミノ基とのアミド
結合りカップリング及び形成に反応性となす誘導体を意
味する。適当な活性化誘導体、それらを製造する手段及
びそれらの使用は、当業者に認められている。しかし、
好ましい活性化誘導体は、所望のアミノ酸またはオリゴ
ペプチドのカルボキシル基の活性エステル、無水物また
はアシルハライドである。

【００１７】最初のカップリング反応の後、次の望まし
いＮ−保護アミノ酸またはオリゴペプチドあるいは、そ
の活性化誘導体は、不溶性樹脂にカップリングされてい
る既存のＮ−脱保護アミノ酸またはペプチドとカップリ
ングさせる。この方法を所望のオリゴペプチド全体が、
合成されるまで続ける。樹脂固定ペプチドから一度保護
基の全てを除去して、ペプチドを生成物のペプチジル結
合または存在する残基を破断しない手段で樹脂から開裂
する。

【００１８】あるいはまた、開裂工程は生成物に存在す
る保護基の除去をもたらすことがある。即ち、脱保護と
開裂とが単一工程として、起こり得る。更に、樹脂から
生成物を選択的に開裂し、次いで本発明のオリゴペプチ
ドの選択的脱保護をすることも可能である。

【００１９】固相合成は、本発明のオリゴペプチドを製
造するのに、殊に有用である。その理由は、これらの方
法は、通常最終生成物の高収率を生じるからである。更
に、中間体生成物の精製は、容易である。その理由は、
中間体が不溶性樹脂に共有結合されているからである。
それで、樹脂及び結合生成物の単純な濾過、次いで未反
応の中間体及び試薬の洗浄により、各工程での所望の中
間体を精製する必要が除かれる。

【００２０】開示した方法で用いられる固体支持体は、
用いられる条件下で、化学的に不活性である支持体であ
り得る。適当な支持体には、例えば樹脂、例えばスチレ
ン−ジビニルベンゼン共重合体またはポリスチレンを包
含する。次に、樹脂を変性して合成されるべきペプチド
の最初のＮ−保護Ｃ−末端アミノ酸とカップリングし得
る反応性基を包含させる。このような活性化支持体は、
例えば反応性基、例えばクロロメチル基を有するもの、
先に開示したパム樹脂、４−メチル−ベンズヒドリルア
ミンポリスチレン、あるいは反応性アミノメチル基を含
有する樹脂を包含する。その他の可能な「活性化」樹脂
は、当業者に明白である。

【００２１】固相合成で、使用するのに適したアミノ保
護（「防護」）（”ｂｌｏｃｋｉｎｇ”）基は、周知で
ある。例えば、「プロテクティブ・グループス・イン・
オーガニック・ケミストリー」（”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖ
ｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ”）、マクオミック（ＭｃＯｍｉｃ）編、プレナ
ム・プレス（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ）、Ｎ．Ｙ．
Ｎ．Ｙ．（１９７３年）及び「プロテクティブ・グルー
プス・イン・オーガニック・シンセシズ」（”Ｐｒｏｔ
ｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”）、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）
編、ジョン・ウイレイ・アンド・サンズ（ＪｈｏｎＷ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、ニューヨーク
（１９８１年）参照。このような基には、例えば「ｔ−
ＢＯＣ」（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、アセチル、
ベンゾイル、ベンジル、２，４−ジメトキシベンジル、
４，４’−ジメトキシ−ベンズヒドリル、フタリル、ト
リクロロアセチル、トリフルオロアセチル、トシル及び
トリチル保護基がとりわけ包含される。上述した方法に
適しているためには、使用される保護基は、適切な選択
脱保護条件が使用されるまで、保護されるべき部分に結
合されたままになっていなければならない。脱保護が所
望される場合、所望のアミノ保護基のみが除去されなけ
ればならない。更に、脱保護はすでに、形成されている
ペプチド結合の破断を避ける反応条件下で生じなければ
ならない。

【００２２】また、当業者が理解しているように、裸の
ヒドロキシ、カルボキシ、チオールまたはその他の側鎖
官能基は、本発明のペプチドの合成中、保護を必要とす
ることがある。これらの部分のための容易に開裂し得る
保護基は周知であり、更に解説を必要としない。「シン
セティック・ペプタイド」（”ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅ
ｐｔｉｄｅｓ”）、５巻、ジョージ・Ｒ・ペティット
（ＧｅｏｒｇｅＲ．Ｐｅｔｔｉｔ）編、エルセビア・
サイエンティフィック・パブリッシング・カンパニー）
（ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌ
ｉｓｈｉｎｇＣｏ．）、アムステルダム（１９８０年）
及びその中に引用されている文献を参照。更に、適当な
カルボキシ、ヒドロキシ、チオール及びアミノ保護基が
文献、例えば「プロテクティブ・グループス・イン・オ
ーガニック・ケミストリー」、マクオミック編、プレナ
ム・プレス、Ｎ．Ｙ．Ｎ．Ｙ．（１９７３年）及び「プ
ロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シン
セシズ」、グリーン編、ジョン・ウイレイ・アンド・サ
ンズ、ニューヨーク、ニューヨーク、（１９８１年）の
ような文献に示されている。アミノ保護基の場合の如
く、これらの側鎖保護基は、保護基を除去するために選
択的脱保護基条件が使用されるまで、保護される部分上
の適切なところに保持されていなければならない。更
に、基を除去するのに使用される条件は、形成されるペ
プチド結合の破断がないか、あるいは生成物の存在する
アミノ酸残基の変性がないようなものでなければならな
い。

【００２３】樹脂からの最終生成物の開裂（及び保護基
のいずれかの可能な除去）は、一般に加水分解条件下で
生じる。樹脂からの開裂に使用される試薬は、例えばフ
ツ化水素、トリフルオロ酢酸、塩化水素あるいは臭化水
素及びトリフルオロ酢酸が包含される。あるいはまた、
開裂は塩基性条件下にヒドラジノ分解法により、あるい
は場合により、水添分解法により実施することができ
る。

【００２４】最終オリゴペプチド生成物は、所望により
標準精製法により、精製することができる。このような
精製手段は、例えばゲル濾過、ＨＰＬＣ、イオン交換ク
ロマトグラフィー、透析あるいは当業者に既知の他の手
段を包含する。

【００２５】当業者は、上述の点は、ペプチドの化学合
成に使用される技術及び工程のすべてを余すところな
く、詳述していることを意味しないことを理解できよ
う。従って、本題を更に詳しく詳述する多くの文献、例
えば特記したものを参照すべきである。それで、当業者
は本発明に用いるペプチドの製造に同等に十分に役立つ
上述の方法の変法を承知している。同様に、これらの代
替法は本発明の範囲内に包含されることを意味してい
る。

【００２６】上述の点に鑑み、更に他の本発明の態様に
おいて、本発明の抗体の製造に有用なオリゴペプチドの
製法が提供され、この方法は、保護されたＧＭ−ＣＳＦ
阻害オリゴペプチドを脱保護基をし、そして所望によ
り、得られた生成物を精製することからなる。

【００２７】あるいはまた、オリゴペプチドは組換えＤ
ＮＡ技術により生産することができ、本発明のオリゴペ
プチドをコードしている組換えＤＮＡ発現ベクターで、
所望の宿主細胞を形質転換し、次いで所望のオリゴペプ
チドの発現に適した条件下に宿主細胞を培養、そして所
望により発現生産物を単離することにより、生産するこ
とができる。

【００２８】発現ベクターは、言うまでもなくＧＭ−Ｃ
ＳＦ阻害オリゴペプチドをコードしているＤＮＡ配列、
あるいは以下に記載の融合ペプチドが発現に適切に配置
され、且つ翻訳開始部位に関して適切な翻訳読み枠中に
あるように構築されていなければならない。更に、転写
または翻訳開始部位は挿入ＤＮＡ配列から誘導すること
ができ、または他の源から誘導することができる。これ
らの開始配列は、天然であれば、ベクター自体に対し
て、非相同性あるいは相同性であってよく、あるいは構
築に用いられるプロモーターに対して、相同性または非
相同性であり得る。選択の目的には、発現ベクターは選
択マーカーを包含することができ、そして形質転換は、
標識遺伝子が不存在の時は、選択に用いる毒性物質に対
して普通に感応性を有する宿主細胞中である。

【００２９】本発明に使用するオリゴペプチドをコード
しているＤＮＡ配列を包含するベクターは、適切に設計
された発現ベクターに挿入されると、原核もしくは真核
宿主細胞で発現することができる。例えば、Ｅ．コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及び
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）発現ベ
クターは、現今当該分野で周知である。これに関して、
所望のオリゴペプチドをコードしている配列は、普通に
使用されている組換えＤＮＡ技術を用いて、所望の種の
ＧＭ−ＣＳＦをコードしている_ＣＤＮＡから直接単離す
ることができる。このような技術には、例えば標準制限
酵素開裂、ゲル電気分解精製及び通常の連結反応が包含
される。これを実施するに当たり、当業者は、適切なリ
ンカー配列を使用して、_ＣＤＮＡでの開裂すべき適切な
位置に所望の開裂部位を置くようにすることを認識し得
る。このようなリンカーは、問題の配列に基づいて、所
望のオリゴペプチドコード遺伝子を含有する制限フラグ
メントに結合させることができる。あるいはまた、ＧＭ
−ＣＳＦ阻害オリゴペプチドコード遺伝子を含有する_Ｃ
ＤＮＡフラグメントの適切な位置で、所望の制限酵素リ
ンカーを挿入するのに部位特異的変異誘発を使用するこ
とができる。この挿入後、配列を適切な制限酵素で開裂
する。

【００３０】本発明のオリゴペプチドは、比較的小さい
サイズであるので、当業者は標準技術を用いて、所望の
オリゴペプチドコード遺伝子を合成することができる。
例えば、所望の一本鎖デオキシオリゴヌクレオチド配列
は、市販の装置、例えば３８０ＡＤＮＡシンセサイ
ザー（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）〔アプライド・バイオ
システムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
（８５０リンコルン・センター・ドライブ・フォスター
・シティ、カリフォルニア、９４４０４〕を用いて合成
することができ、このシンセサイザーは、標準ホスホル
アミダイト化学を使用している。あるいはまた、所望の
ＤＮＡコード配列は、一本鎖ＤＮＡの合成のための通常
のホスホトリエステル変法により、製造することができ
る。この変法は、板倉等、（１９７７年）、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８巻、１０５６頁及びクレア
（Ｃｒｅａ）等、（１９８７年）、プロク・ナツル・ア
カド・サイ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．））、７５巻５７６５
頁に開示されている。更に、ＤＮＡ合成法は、シウング
（Ｈｓｉｕｎｇ）等、（１９８３年）、ヌクレイック・
アシド・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ
ｅａｒｃｈ）、１１巻、３２２７頁及びナラング（Ｎａ
ｒａｕｇ）等、（１９８０年）、メソド・イン・エンチ
モロジィ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）、６８巻、９０頁に開示されている。

【００３１】所望のオリゴペプチドをコードする配列が
一旦上述の方法で製造されると、このものを所望の原核
または真核発現ベクターで、所定のプロモーターからの
転写及び発現のための適切な配向で、挿入することがで
きる。次に、発現ベクターをクローニングし、そして適
切に形質転換された宿主細胞の選択を可能とする条件下
に、所望の宿主細胞に形質転換させ、次に挿入配列の発
現に適した条件下で発現させ、次いで生成物を採取す
る。

【００３２】原核宿主細胞中、殊にＥ．コリ中での発現
は、特別なプロモーターの使用に限定されない。その理
由は、特定のプロモーターが、本発明の実施可能性にと
って決定的なものではないからである。使用し得るプロ
モーターには、例えばリポプロテイン（「ｌｐｐ」）プ
ロモーター、Ｅ．コリトリプトファン（「ｔｒｐ」）プ
ロモーター、バクテリオフアージ・ラムダ・プロモータ
ーあるいは、Ｅ．コリラクトース（「ｌａｃ」）プロモ
ーターが包含される。更に、プロモーターの１種または
それ以上を縦列に使用することができ、例えばｔｒｐ及
びｌａｃプロモーターを使用することができる。更に、
ハイブリッドプロモーター／翻訳活性化配列、例えばｔ
ａｃプロモーターをオリゴペプチドコード遺伝子の発現
を推進するために、製造することができる。これらのプ
ロモーターのいずれもが先に特徴付けられ、当該分野で
周知であり、そして合成上あるいは既知のプラスミドか
ら構築することができる。

【００３３】更に、熱誘起可能なランナウェイ・レプリ
コン、例えば英国特許公開第１，５５７，７７４号及び
ウリン（Ｕｈｌｉｎ）等、（１９７９年）、ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）、６巻、２１頁に開示されているものを使用す
るのが有利である。３０℃以下の温度、特に２５℃でレ
プリコンは、約１０〜１５コピー／細胞の比較的低いコ
ピー数を維持している。温度が３７℃以上に上昇する
と、コピー数コントロールが失われ、そしてレプリコン
を含有するプラミドが約１０００〜２０００コピー／細
胞に増巾する。

【００３４】以下に述べる如く、異種遺伝子、例えばオ
リゴペプチドをコードする遺伝子をランナウェイ・レプ
リコン（ｒｕｎａｗａｙｒｅｐｌｉｃｏｎ）を包含す
るベクターにクローニングすることは、コピー数コント
ロールの誘起及び喪失により、蛋白合成及び細胞内蛋白
質性顆粒（「封入体」）の付随形成の比の著しい増加を
結果として、生じることがある。顆粒は、その蛋白組成
が著しく相同性であり、所望の蛋白生成物が顆粒の乾燥
重量の８０％まで、往々にしてそれを超えて包含する。
これらの顆粒は、細胞リゼイトから容易に単離され、そ
して一般には尿素または洗剤の低濃度での洗浄に安定で
ある。洗浄により、顆粒に非特異的に結合している蛋白
質が除去される。

【００３５】しかし、本発明はクローニング及び原核細
胞での発現のための、ランナウェイ・レプリコン含有プ
ラスミドの使用を必要としない。多くのレプリコン、例
えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２８、ｐＡＣＹＣ１８４等
からのレプリコンが当該分野で知られており、所望のオ
リゴペプチドをコードする遺伝子の発現を推進するよう
設計された組換ＤＮＡベクターの構築に適している。

【００３６】当業者はまた、バチルスでの発現が所望さ
れる時は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）か
らのｖｅｇプロモーターに習熟している。更に、ベクタ
ー及びバチルスでのポリペプチドの発現のための方法に
ついて、欧州特許公開ＥＰＡ０１１６４１１（１９８４
年８月２２日公開）及び米国特許第４，５５９，３００
号を参照されたい。これらを参考として、本文に挿入す
る。

【００３７】更に、米国特許第４，５５９，３００号に
は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
に使用するための発現ベクターが開示されている。例え
ば、堀之内等、モル・ゲン・ゲネト（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．）、２１０巻、４６８頁（１９８７年）及
びビブ（Ｂｉｂｂ）、Ｍ等、エクペリメンタル・マニピ
ュレーション・オブ・ジーン・エクスプレション（Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆ
ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、４章、「ディベ
ロップメント・イン・ストレプトマイセス・クロニン
グ」（ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓｃｌｏｎｉｎｇ）、アカデミック・プレ
ス、（１９８３年）を参照されたい。

【００３８】更に、特別な選択性マーカーの使用は、本
発明の操作に決定的なものではない。広範囲の選択性マ
ーカーが、原核または真核宿主細胞の一方もしくは双方
での使用のために存在する。

【００３９】当業者は、宿主細胞特に原核細胞、例えば
Ｅ．コリ、バチルスまたはストレプトマイセスで発現さ
れる場合、本発明の小さいオリゴペプチドは、細胞から
の生体内制限及び（または）脱離を受けることがあるこ
とを認めている。制限のない宿主細胞を使用することが
できるが、当業者は所望のオリゴペプチドをコードする
遺伝子を製造し、それにより開裂可能なリンカーをコー
ドする配列に連結され、この配列を順次より大きい発現
可能な遺伝子に連結され、それにより所望のオリゴペプ
チドが直接の発現生産物よりもむしろ、融合生産物とし
て発現させるようにするのが、一層有利であることを知
り得る。例えば、所望のＧＭ−ＣＳＦ阻害オリゴペプチ
ドコード遺伝子は、その５’末端でプロテアーゼ、例え
ばトリプシン、キモトリプシン、テルモリシン、臭化シ
アン、カテプシンＣ等のＤＮＡ配列コード部位特異的認
識部位に結合させることができ、このものを順次その
５’末端でより大きいコード配列、例えばβ−ガラクト
シダーゼ、インシュリンまたは成長ホルモンコード配列
またはそのフラグメントに連結される。発現された生成
物は構造蛋白質−｛開裂可能部位｝−ＧＭ−ＣＳＦ阻害オリゴペ
プチドを有する融合生成物である。

【００４０】当業者は、所望の特定の切断部位は、融合
生成物のオリゴペプチドの領域に出現すべきでもないこ
とを理解している。指示した融合生成物の単離後、ポリ
ペプチドを挿入された特定のプロテアーゼ切断部位を認
識する、適切なプロテアーゼで処理する。これにより、
オリゴペプチドが遊離され、次にこれを常法で単離する
ことができる。本発明の発現オリゴペプチドの生体内分
解を回避するその他の手段は、当業者に明白であり、そ
して同じ結果を達成するこれらの他の方法の使用は、本
発明によって包含されていることを意味する。

【００４１】原核生物、殊にＥ．コリでは生成物、殊に
上述したタイプの融合生成物は、「封入体」として、宿
主細胞内に沈着し得る。このような場合、生成物の精製
には宿主細胞膜の破断、生成物の変性及び所望により、
適切なプロテアーゼの使用による生成物の任意の所望部
分の開裂、もしくは切断を必要とすることがある。封入
体の精製、変性及び開裂は周知であり、更に解説を必要
としない。

【００４２】組換ＤＮＡ手段を用いてのクローニング及
び発現に好ましい宿主細胞は、原核細胞、好ましくは
Ｅ．コリである。しかし、当業者は真核宿主細胞中で、
オリゴペプチドコード遺伝子を発現させようとすること
もできる。適当な真核宿主細胞には、例えば哺乳動物細
胞あるいは、時には酵母細胞、例えばサッカロミヤス
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイフェロマイヤ
ス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはピキア（Ｐｉ
ｃｈｉａ）が包含される。この目的に有用な真核宿主細
胞には、例えば次のものが包含される。ヒト２９３（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ１５７３）；シリアン・ハムスターＡＶ
１２−６６４（ＡＴＣＣＣＲＬ９５９５）；チャイニ
ーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ−Ｋｌ…ＡＴＣＣＣ
ＣＬ６１）；３Ｔ３（マウス胚繊維芽細胞…ＡＴＣＣ
ＣＣＬ９２）；ＣＶ−１（アフリカン・グリーン・モン
キー腎臓…ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；ＬＬＣ−ＭＫ
_２（アカゲザル腎臓−ＡＴＣＣＣＣＬ７）；ＨｅｐＧ
−２（ヒト肝芽腫…ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）；ＢＨ
Ｋ−２１（シリアン・ハムスター腎臓…ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ１０）；ＣＯＳ−１（サル腎臓…ＳＶ４０形質転換…
ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、並びに例えばアメリカン
・タイプ・カルチュア・コレクション（「ＡＴＣ
Ｃ」）、ロックヴィレ、ＭＤのような源から公けに入手
可能な他の真核細胞系。このような真核宿主細胞の形質
転換のために、広汎なベクターが存在し、そして以下の
記載は、本発明の範囲内に包含される発現手段または生
成物に対する限定を全く意味していない。

【００４３】例えば、広汎なｐＳＶ２−タイプのベクタ
ーは、ＳＶ４０ゲノムのセグメントを包含し、そしてプ
ロモーター（例えば、「ＥＰ」、初期プロモーター）、
介在配列（「ＩＶＳ」）及びポリアデニル化（「Ｐ
Ａ」）部位を包含する、一定の真核転写単位を包含す
る。ＳＶ４０Ｔ抗原の不存在下、ｐＳＶ２−タイプベク
ターは、宿主細胞染色体ＤＮＡへの組込みにより、哺乳
動物及びその他の真核宿主細胞を形質転換させる。種々
のプラスミドｐＳＶ２−タイプベクター、例えばプラス
ミドｐＳＶ２−ｇｐｔ、ｐＳＶ２−ｎｅｏ、ｐＳＶ２−
ｄｈｆｒ、及びｐＳＶ２−β−グロビン等が構築されて
おり、ここではＳＶ４０プロモーターが挿入遺伝子の転
写を推進する〔グルズマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）編、オイ
カリオティック・バイラル・ベクターズ（Ｅｕｋａｒｙ
ｏｔｉｃＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ）、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ（ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）、Ｎ．Ｙ．１９８２年〕。これらのベクターの構築
及び使用は、現今当業者に周知である。このようなベク
ターは、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ
ン（「ＡＴＣＣ」）あるいは、ノーザン・レジオナル・
リサーチ・ラボラトリーズ（ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇ
ｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）（「ＮＲＲＬ」）、ペオリア、イリノイから入手
可能である。

【００４４】更にまた、本発明のオリゴペプチドを発現
するのに、有用なその他のプラスミドは、ＳＶ４０初期
プロモーター以外のプロモーターを使用し得る。本発明
は、いずれの特別なプロモーターの使用に限定されるも
のではない。他のプロモーター、例えばＳＶ４０後期プ
ロモーターあるいは他の真核遺伝子例えば、エストロゲ
ン−誘起性ニワトリオボアルブミン遺伝子、インターフ
ェロン遺伝子、グルココルチコイド誘起性チロシンアミ
ノトランスフェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝
子、及び主要初期及び後期アデノウィルス遺伝子からの
プロモーターを容易に単離することができ、そして本発
明のオリゴペプチドを生成するよう設計された、組換Ｄ
ＮＡ発現ベクターで使用するよう変性することができ
る。真核プロモーターを縦列に使用して、所望の最終生
成物の発現を推進することができる。必要なことの全て
は、挿入遺伝子配列と組み合された特別のプロモーター
が、ベクターが形質転換されている宿主細胞中で機能す
ることである。

【００４５】更に、広い範囲の宿主細胞に感染する多数
のレトロウィルスが知られている。レトロウィルスＤＮ
Ａ中の長鎖末端反覆体（「ＬＴＲ」）は、往々にしてプ
ロモーター活性をコードし、そして上述のＳＶ４０初期
プロモーターの代わりに用いて、オリゴペプチドコード
遺伝子の転写及び翻訳を推進することができる。例え
ば、プラスミドｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣから受理番号
ＡＴＣＣ３７１５２で入手可能）は、ラウス肉腫ウィル
ス（「ＲＳＶ」）（ニワトリまたは他の宿主細胞を感染
することが知られているウィルス）のＬＴＲの部分を包
含している。ＲＳＶＬＴＲ配列は、プラスミドｐＲＳ
Ｖｃａｔの０．７６ｋｂＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制
限フラグメントで単離することができる。このプロモー
ターは、単離し、そして適当なベクターに挿入すること
ができ、それによりこのものが正しく位置して、所望の
オリゴペプチドコード配列の転写及び発現を推進する。

【００４６】更にまた、その他の真核または哺乳動物発
現システムが知られている。例えば、欧州特許出願第８
７３０３０８３．７号〔ＥＰＡ０２４５９４９として公
開、１９８７年１１月１９日公開、及び米国特許出願第
０６／８４９９９９号（１９８６年４月９日出願）に対
応〕を参照のこと。このものを参考として本文に挿入す
る。特に有用な真核発現ベクターは、プラスミドｐｈｄ
である。プラスミドｐｈｄは、通常の真核発現ベクター
である。その理由は、このものはアデノウィルス−２後
期プロモーター（「ＡＶ２ＬＰ」）から、すぐ上流のＢ
Ｋウィルスエンハンサー配列（「ＢＫ」）を含有する
カセットベクターであるからである。更に、プラスミド
ｐｈｄは所望のＤＮＡ配列の挿入のために、配置された
単一ＢｃｌＩ制限酵素認識配列を含有し、それでこのも
のはＢＫエンハンサー−ＡＶ２ＬＰプロモーターシステ
ムから発現される。この構築により、高レベルの転写及
びその次の挿入遺伝子配列の発現を可能とする。プラス
ミドｐｈｄは、またヒグロマイシン耐性−付与配列、並
びにジヒドロフォレート・レダクターゼ（「ｄｈｆ
ｒ」）シストロンを含有し、これらの両者は、それぞれ
ヒグロマイシン感受性またはｄｈｆｒ陰性宿主細胞での
選択性マーカーとして使用し得る。プラスミドｐｈｄの
構築は、欧州特許出願ＥＰＡ０２４５９４９（出願番号
８７３０３０８３．７、１９８７年１１月１９日公開）
に詳述されている。プラスミドｐｈｄは、プラスミドの
好ましい源及び株貯蔵体であるＥ．コリＫｌ２ＧＭ４
８に形質転換されている。このプラスミドは、寄託ずみ
で、ＮＲＲＬ永久株培養物コレクションの一部となって
いる、この菌株から常法で単離することができる。この
菌株は、受理番号ＮＲＲＵＢ−１８５２５で入手可能
である。

【００４７】それで、プラスミドｐｈｄを単離し、Ｂｃ
ｌＩ制限酵素で切断することができる。同様に、オリゴ
ペプチドコード配列（あるいは好ましくは、融合ペプチ
ドコード領域：必要な翻訳開始部位を包含している）例
えば、先に記載したものを製造し、ＢｃｌＩリンカーが
連結され、そして得られたフラグメントをＢｃｌＩ制限
エンドヌクレアーゼで切断する。ｐｈｄフラグメント及
びオリゴペプチドコードフラグメントを結合させて、所
望のオリゴペプチド、あるいはオリゴペプチド融合生成
物を発現し得る有用な発現ベクターを得る。挿入遺伝子
配列の発現に適した条件下で、所望の真核宿主細胞の形
質転換及び培養で、当業者は、上述の如く、追加ＤＮＡ
コード配列が添加される時は融合蛋白質として、あるい
は直接発現生成物として、所望のオリゴペプチドを得る
ことができる。発現生成物の単離、精製及び切断は、上
述した通りであるが、または当業者にとって自明であ
る。

【００４８】あるいは、酵母細胞での発現が所望される
時は、酵母発現システムを調製するための手段は、現今
当該分野で十分に開示されている。かかる発現が所望の
時は、次の文献を参照されたい。米国特許第４，７７
５，６２２号（１９８８年１０月４日付与）；欧州特許
番号ＥＰＢ００７３６７３（１９８８年４月２０日付
与）；米国特許第４，６１５，９７４号（１９８６年１
０月７日付与）；及び欧州特許公開ＥＰＡ０１８３０７
０（１９８６年６月４日公開）。

【００４９】認められている如く、記載の真核発現ベク
ターあるいは構築されたいずれの他のベクターも、種々
の真核、殊に哺乳動物の宿主細胞に形質転換され、発現
させることができる。安定な形質転換体を単離、同定す
るための選択性マーカーを含有していないベクターは、
例えば米国特許第４，３９９，２１６号（１９８３年８
月２６日付与：これを参考として、本文に挿入する）に
開示されている操作の如く、移行検定のためにあるい
は、共形質転換のために有用である。使用されるベクタ
ーは、発現「シャトル」ベクターであってよく、Ｅ．コ
リでの効率のよい複製を可能とする配列を含有し得る。
このようなシャトルベクターは、他の宿主生物よりも
Ｅ．コリでプラスミドＤＮＡを製造するのに、通常はよ
り効率がよいので、有用である。それで所望により、ベ
クターを最終の所望宿主に形質転換させる。

【００５０】本発明のオリゴペプチドを生産するのに、
組換技術を用いることを当業者が決定した時は、上記の
特定のベクターは、本発明のオリゴペプチドをコードす
るＤＮＡ配列をクローニングし、発現する唯一の方法と
みなすべきではないことが明白であろう。特に当業者
は、所望のオリゴヌクレオチドを製造するのに有用な真
核及び原核組換ＤＮＡベクター双方を製造するために、
いずれの所望の制限酵素認識配列を含有するベクターを
構築することができる。更に当業者は、遺伝暗号の縮退
に通じている。従って、当業者は本発明で使用されるＤ
ＮＡ配列を修飾して、第１図及び第４図で示した特定の
オリゴペプチドと比較して、本発明の所望の抗体を製造
するための改善された能力、あるいは同一もしくは改善
された生理学的特性を有する相同蛋白質を提供すること
ができる。また当業者は、ＤＮＡ配列を修飾して、より
高いレベルで発現されるが、本発明によるものと同一の
蛋白質を発現させることができる。

【００５１】更にまた、当業者は、本発明で有用なオリ
ゴペプチドを製造するために、組換ＤＮＡベクター、あ
るいはオリゴペプチドコード配列を製造するのに有用で
あるＤＮＡ配列を合成的に、部分的にまたは全体とし
て、製造する手段に通じている。更に、提供されたＤＮ
Ａ配列を修飾するための組換手段には、例えば部位特異
的変異誘発が包含される。これらの技術は、当業者に周
知であり、ここで更に解説を必要としない。従って、い
ずれの「構築された」ＤＮＡもしくはベクターは、合成
または半合成（天然及び合成源から）で製造される天然
源から単離されるか、あるいは組換ＤＮＡ法で修飾され
るＤＮＡをその範囲内に包含している。

【００５２】同様に、先に指示した如く、オリゴペプチ
ドは通常の固相合成により、全体としてもしくは、部分
的に製造することができる。最終の所望のオリゴペプチ
ドは、組換及び非組換技術の組合せを用いて、製造する
ことができる。それで、本発明は本発明のオリゴペプチ
ドを生産する、特定の手段に限定されるものと解すべき
ではない。

【００５３】更に指示の如く、オリゴペプチド、例えば
第１図に示すオリゴペプチドに到達するのに用いる配列
は、全長天然ＧＭ−ＣＳＦ蛋白質から直接誘導されるも
のである。しかし、当業者は本発明の抗体を製造するの
に、有用なその他のオリゴペプチドを製造するために、
これらの配列またはＤＮＡコード配列を修飾することが
できる。従って、本文で使用される「誘導可能」とは、
これらの修飾生成物を包含することを意味する。「誘導
可能」とはまた、最終オリゴペプチドのための特別のア
ミノ酸配列の元の源は、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド、そ
の一部、あるいは対応するＤＮＡコード領域であること
を指示する意味である。これは、意図的な設計ではない
が、当業者が元の問題の天然配列に対する修飾、欠失ま
たは付加をなしたとしても、その通りである。

【００５４】ＧＭ−ＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦレセプター
担有細胞の増殖を誘発し得るので、ＧＭ−ＣＳＦがその
レセプターに結合するのを阻害する抗体はまた、ＧＭ−
ＣＳＦにより仲介される疾患の治療にも有用である。例
えば、先に指示した如く、リンパ及び固形腫瘍から誘導
される悪性腫瘍細胞は、ＧＭ−ＣＳＦの投与により増殖
することがわかっている。それで、その細胞連合レセプ
ターとＧＭ−ＣＳＦとの相互作用を阻害し得る抗−ＧＭ
−ＣＳＦ抗体は、ＧＭ−ＣＳＦ依存性細胞、例えば先に
指示した腫瘍細胞の成長、もしくは増殖を阻害する手段
を提供するものである。以下に論述する如く、ＧＭ−Ｃ
ＳＦで仲介されるその他の疾患状態も同様に処置するこ
とができる。

【００５５】指示の如く、上で得られたオリゴペプチド
は、ＧＭ−ＣＳＦの生物活性を阻害し得るモノクロナー
ル抗体またはそのフラグメントを製造するのに使用し得
る。それで、本発明の最も好ましい態様では、ＧＭ−Ｃ
ＳＦの生物活性を阻害し得るモノクロナール抗体、また
はそのフラグメントが提供される。

【００５６】指示されたモノクロナール抗体は、Ｇ．コ
ーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）及びＣ．ミルスティン（Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ）、（１９７５年）、ネイチュア、２５６
巻、４９５頁に記載の現今周知の方法で、製造すること
ができる。当業者が承知している如く、この操作は、マ
ウスまたは他の適当な動物を免疫源として作用し得る物
質で免疫化することを包含する。所望の注射化合物が免
疫反応を誘発し得ないほどのサイズである時は、周知の
技術により、他のより大きい分子、例えば血清アルブミ
ン、例えばヒトまたはウシ血清アルブミン、あるいはキ
イホール・リムペット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ
ｌｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（「ＫＬ
Ｈ」）と接合させることができる。例えば、ミアレス
（Ｍｅａｒｅｓ）等、米国特許第４，７２２，８９２号
（１９８８年２月２日付与）、及びミアレス等、米国特
許第４，６２２，４２０号（１９８６年１１月１１日付
与）を参照。これらを参考として本文に挿入する。適当
な培養期間（例えば、２週間またはそれ以上）後、マウ
スを屠殺し、その脾臓からとった細胞を骨髄腫細胞と融
合させる。ハイブリドーマとして知られているハイブリ
ッド細胞は、試験管内で繁殖可能である。このようにし
て、生産されたハイブリドーマの集団をスクリーニング
して、その各々が免疫原として使用される抗原と反応性
を有する単一抗体種を分泌する個別のクローンを単離す
る。このようにして得られた個別の抗体種は、それぞれ
免疫動物からの単一Ｂ細胞の生成物であり、免疫原で認
識された特定の抗原部位に反応して、発生する。更に、
所望の抗体を生産するこれらのハイブリドーマ細胞系を
スクリーニングして、宿主動物を免疫化するのに用いる
免疫原について最高の親和性を有する抗体を生産するも
のを同定するのが、有用である。当業者が理解している
如く、本発明の目的のために用いられる免疫原は、上述
の如く、製造されたオリゴヌクレオチドまたは接合オリ
ゴヌクレオチドである。好ましい態様では、免疫原とし
て使用されるオリゴペプチドは、ジサルフアイド結合、
例えば２個のシステイン残基を介して、架橋されていな
いものである。即ち、免疫化に用いられるオリゴペプチ
ドは、残基間にジサルフアイド架橋を有していない直鎖
ペプチドである。

【００５７】それで、追加の態様では、本発明の抗体を
製造する方法が提供され、この方法は所望の抗体を生産
するハイプリドーマを培養し、そして生じた抗体を採集
することからなる。所望により、当業者はＧＭ−ＣＳＦ
阻害フラグメントをハイブリドーマ生成抗体から直接、
あるいは他の手段例えばＧＭ−ＣＳＦ阻害抗体フラグメ
ントコード遺伝子の組換発現で製造することができる。
この目的のための遺伝子は、上述の如く、製造されたハ
イブリドーマから誘導することができる。あるいは、ハ
イブリドーマ自体は組換ベクターで移入することがで
き、このベクターは、増殖及び発現に適した条件下で培
養する時は、ハイブリドーマ内に発現のために適当に配
置されているＧＭ−ＣＳＦ阻害抗体フラグメントコード
遺伝子を包含している。細胞系の増殖及び維持の目的
で、標準細胞系培地を用いて、ハイブリドーマを培養す
ることができる。あるいは、所望により、ハイブリドー
マは生宿主動物、例えばマウスに通常腹腔内に注射、も
しくは移殖することができ、この動物内で所望の抗体の
増殖、発現が可能である。この後者の場合、抗体は通常
注射／移殖部位に蓄積している腹水から採取される。

【００５８】当業者が認める如く、ＧＭ−ＣＳＦの生物
活性の阻害は、普通細胞連合ＧＭ−ＣＳＦレセプターに
より、認識されるＧＭ−ＣＳＦ分子上、もしくは分子内
の所望の部位を阻止することにより達成される。それ
で、所望のアミノ酸配列と反応性を有するいずれの抗
体、または抗体フラグメントが本発明に包含されている
ことを意味する。上記の方法で生産される抗体（もしく
は免疫グロブリン）またはフラグメントは、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ分子の所望のエピトープと反応性を有するものであ
る。

【００５９】本文で使用される「抗体」もしくは「免疫
グロブリン」とは、いずれの認められたクラスまたはサ
ブクラスの免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥを称するものである。免疫グ
ロブリンのＩｇＧクラスに入る免疫グロブリンが好まし
い。抗原反応性免疫グロブリンフラグメントもまたこの
用語に包含される。このような免疫グロブリンフラグメ
ントには、例えばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、もしくは
Ｆａｂフラグメントあるいは任意の他の抗原−反応性免
疫グロブリンフラグメントが包含される。このような免
疫グロブリンフラグメントは、例えば蛋白分解酵素消
化、例えばペプシンあるいはパパイン消化、還元アルキ
ル化、あるいは組換ＤＮＡ技術により製造される。この
ような免疫グロブリンフラグメントを製造するための材
料、方法は当業者に周知である。一般には、パルハム
（Ｐａｒｈａｍ）、（１９８３年）Ｊ．イムノロジイ、
１３１巻、２８９５頁；ラモイ（Ｌａｍｏｙｉ）等、
（１９８３年）、Ｊ．イムノロジカル・メソド（Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ）、５６
巻、２３５頁；パルハム、（１９８２年）、同誌、５３
巻、１３３頁；及びマチウ（Ｍａｔｔｈｅｗ）等、（１
９８２年）、同誌、５０巻、２３９頁を参照。

【００６０】免疫グロブリンまたはそのフラグメント
は、任意の哺乳動物種から誘導出来るが、最も好ましい
のはヒト由来、例えば上記のネズミハイブリドーマの製
造と類似した方法で製造される、ヒト／ヒトハイブリド
ーマの培養によって得られるものである。また、免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメントは、当該分野で認めら
れている用語「キメラ性」（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）であっ
てよい。特に、免疫グロブリンまたはそのフラグメント
は、可変領域（即ち、結合領域）及び異種から誘導され
る不変部領域の少なくとも１部分で構成されていてよ
い。このようなキメラ抗体は、通常組換ＤＮＡ技術によ
り製造される。ネズミ可変領域及びヒト不可変領域を包
含するキメラ抗体がある種の適用例、特にヒトの治療に
特に好ましい。その理由は、このような抗体は純粋なネ
ズミモノクロナール抗体よりも抗原性が低いことがある
からである。このようなネズミ／ヒトキメラ抗体は、ネ
ズミ免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメ
ント及びヒト免疫グロブリン不変部領域をコードするＤ
ＮＡセグメントを包含する免疫グロブリン遺伝子を発現
する生産物である。このようなキメラ抗体の生産方法
は、通常の組換ＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション
技術を包含し、これらの技術は当該分野で現今周知であ
る。例えば、Ｓ．Ｌ．モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）
等、（１９８４年）、プロク・ナツル・アカド・サイ
（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８１巻、６８５１頁参照。

【００６１】「キメラ抗体またはフラグメント」なる用
語には、「ヒューマナイズド」（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）
もしくは「ＣＤＲ−移殖」免疫グロブリンまたはフラグ
メントの思想が包含されている。これらの抗体は、フレ
ームワークもしくは「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）
が変性されて、親免疫グロブリンと比較して異なった特
異性の免疫グロブリンのＣＤＲを包含する抗体である。
この抗体の好ましい形態では、ネズミＣＤＲがヒト免疫
グロブリンのフレームワーク領域に移殖されている。特
に、本発明の目的のためのＣＤＲは、ＧＭ−ＣＳＦ分子
と反応性を有する。ＣＤＲ変性抗体の教示については、
ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）等、欧州特許公開出願ＥＰ
Ａ０２３９４００（１９８７年９月３０日公開）を参照
されたい。

【００６２】実施例で更に詳述する如く、本発明のＧＭ
−ＣＳＦ阻害免疫グロブリンは、連続した増殖及び進行
がＧＭ−ＣＳＦにより、介在される（即ち、いくつかの
段階で生化学経路に包括されるかまたはＧＭ−ＣＳＦを
必要とする）疾患状態の処置に有用である。特に、当業
者は、造血始原細胞、例えば骨髄始原細胞、例えばマク
ロフアージまたは顆粒球前駆体に対するＧＭ−ＣＳＦコ
ロニー刺激因子により存在する、望ましくない疾患状態
を阻害または防止することが可能なことを理解し得る。
このような状態には、例えばマクロフアージ及び（また
は）顆粒球の過剰生産を包含する疾患状態、例えば炎症
性疾患及び種々の自己免疫疾患が包含される。かかる炎
症性過程を包含する疾患状態には、例えば側頭動脈炎、
結節性多発動脈炎、全身性エリテマートデス、リウマチ
性多発性筋痛、種々の形態の腎炎、及びおそらくはアテ
ローム性動脈硬化が包含される。

【００６３】更に、先に解説した如く、本発明の免疫グ
ロブリンはＧＭ−ＣＳＦ依存性腫瘍疾患の増殖を阻害ま
たは除去するのに有用であり得る。本発明の好ましい特
徴では、ＧＭ−ＣＳＦ阻害オリゴペプチドは、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ依存性リンパ腫または白血病の増殖を阻害または除
去し得る。

【００６４】それで、本発明によれば、ＧＭ−ＣＳＦの
望ましくない効果を必要とする温血哺乳動物において、
軽減する方法が提供され、この方法は前記哺乳動物に本
発明の免疫グロブリンまたはそのフラグメントを投与す
ることからなる。

【００６５】また、本発明の免疫グロブリンを投与する
のに有用な処方物が提供される。特に、本発明によれ
ば、製薬上許容し得る担体、希釈剤または医薬添加物と
組み合された免疫グロブリンまたはそのフラグメントを
包含し、そしてＧＭ−ＣＳＦの生物活性を阻害し得る製
薬処方物が提供される。好ましくは、本発明の免疫グロ
ブリンは非経口投与に適した処方物、例えば注射剤もし
くは静脈内投与に適した処方物、あるいは有効形態で血
流への送達を確実にするようなその他の方法による非経
口投与に適した処方物として調製される。このような処
方物は、好ましくは単位投与量形態であり、各投与量は
例えば所望の免疫グロブリン約０．００１〜１０００ｍ
ｇを含有している。好ましくは、処方物は免疫グロブリ
ンまたは免疫グロブリンフラグメント約０．０１〜２０
０ｍｇを含有している。

【００６６】本発明の免疫グロブリンを処方する手段
は、当業者に周知である。特に、本発明の免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントは、製薬上許容し得る担体、
希釈剤またはキャリヤーと温和して組合せることができ
る。適当な担体、希釈剤あるいは医薬添加物及び他のヒ
ト蛋白質、例えばヒト血清アルブミンを包含する処方物
は、例えばレミントン・ファーマシューティカル・サイ
エンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）、１６版、１９８０
年、マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ
ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．）、オソール（Ｏｓｏ
ｌ）等編に記載され、これを参考として本文に挿入す
る。典型的な製薬上許容し得る医薬添加物、希釈剤及び
担体、殊に好ましい投与経路である非経口投与のための
これらのものには、例えば、等張性食塩水、希デキスト
ロース水溶液（例．５％），多価脂肪族アルコールもし
くはその混合物、例えばグリセリン、プロピレングリコ
ール、ポリエチレングリコール等が包含される。非経口
溶液はまた防腐剤、例えばフェネチルアルコール、メチ
ルもしくはプロピルパラベン、チメロサール等を含有し
得る。必要に応じて、約０．０５〜０．２０重量％の抗
酸化剤、例えばメタ重亜硫酸ナトリウムまたは重亜流酸
ナトリウムもまた使用し得る。「製薬上許容し得る」と
は、温血哺乳動物の治療もしくは診断に有用な医薬添加
物、希釈剤または抗体を称する。

【００６７】本発明の免疫グロブリンは要因、例えば処
置されている疾患状態、投与方式、患者の年令、症状並
びに投与する医師が普通に決定、考慮するその他の要因
に基づいて、広い投与量範囲にわたって有効であること
を当業者は理解できる。

【００６８】

【実施例】以下に限定を企図しない実施例をあげて、本
発明を更に具体的に説明する。本発明は、実施例のいず
れに開示された記載の故に範囲を限定するものと解すべ
きではない。試薬の出所は便宜上のものであり、本発明
を限定することを意味しない。製造例１オリゴペプチドの合成オリゴペプチドＰ４４−５５（ＳＥＱＩＤＮＯ：
１）、Ｐ２４−３４（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、Ｐ６
４−７５（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、Ｐ９６−１０９
（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）及びＰ１３１−１４２（Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：６）は、本文に先に開示した如く、
固相合成により合成される。生成物は記載の条件下、Ｈ
ＰＬＣで分析すると次の保持時間を有している。

【表１】

【００６９】実施例１オリゴペプチドによる骨髄前駆体でのＧＭ−ＣＳＦ活性
の阻害骨髄前駆体に対するＧＭ−ＣＳＦ活性の生物効果を阻害
する所望のオリゴペプチドの効果を測定するために、次
の検定法を用いた。言うまでもなく、ネズミ以外の種か
ら誘導し得るオリゴペプチドを用いる時は、該種からの
細胞を検定操作に置換することが必要であろう。ＧＭ−
ＣＳＦの生物活性はネズミ骨髄細胞の液体培養系で測定
した〔例えば、Ｉ．ブルスカー（Ｂｕｒｓｋｅｒ）等、
Ｊ．レチクロエンドセリアル・ソク（Ｊ．Ｒｅｔｉｃｕ
ｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＳｏｃ．）、２５巻、５
３３頁、（１９７９年）参照〕。骨髄細胞は、１０〜１
２週令ＣＢ６Ｆｌ（Ｃ５７ＢＬ×Ｂａｌｂ／ｃ）雄マウ
ス〔ハーラン−スプラグエ・ドウレイ，インコ（Ｈａｒ
ｌａｎ−ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．）、
インディアナポリス、インディアナ〕の大腿骨及び脛骨
からりん酸緩衝食塩水〔「ＰＢＳ」、ＧＩＢＣＯ、グラ
ンド・アイランド、ニューヨーク〕で切開した清浄な骨
を洗うことにより採集した。生存可能な細胞カウントを
トリパンブルーにより測定した。次に、細胞を２４−ウ
エル組織培養プレート〔コスタタ（Ｃｏｓｔａｒ）、ケ
ンブリッジ、ＭＡ〕中で塗布した（１ｍｌ／ウエル；２
×１０^５細胞／ｍｌ）。顆粒球−マクロフアージコロニ
ー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」、２ｎｇ／ｍｌ；ペプロ
テク・インコーポレーテッド（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉ
ｎｃ．）、ロッキィヒル、ＮＪから組換え技術で生産、
入手可能）及び所望のオリゴペプチドをウエルに所望の
濃度で加えた。骨髄細胞をＣＯ_２培養器中３７℃で６日
間培養した。培養期間の終りにプレートをＰＢＳで洗
い、これでウエル中に成熟した固有の顆粒球及びマクロ
フアージのみが残存した。次に、細胞を４℃で２０分間
５％ホルムアルデヒドで固定し、０．１Ｍホウ酸塩緩衝
剤（ｐＨ８．５）で洗い、そして室温で１０分間同一緩
衝剤中１％メチレンブルーで染色した。ホウ酸緩衝剤中
で十分に洗った後、染料を４２℃で３０分間０．１ＮＨ
Ｃｌで細胞から溶離した。染料吸光度をＭＣＣ／３４０
タイターテク・マルチスキャン（Ｔｉｔｅｒｔｅｃｈ
Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ）プレートリーダー〔エフラブ（Ｅ
ｆｌａｂ）、ヘルシンキ、フィンランド〕中６２０ｎｍ
で測定した。染料吸光度示度は、培養物中の細胞の数に
比例する。ネズミＧＭ−ＣＳＦ分子の種々の領域に及ぶ
５種の異なったオリゴペプチドを用いた、この検定の結
果を表２に示す。

【表２】表１の結果から、オリゴペプチドＰ４４−５５（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１）は、１０μｇ／ｍｌの濃度でＧＭ−
ＣＳＦの生物活性を完全に阻害することがわかる。更に
分析すると、ＧＭ−ＣＳＦ−誘起顆粒球マクロフアージ
形成に対するオリゴペプチドＰ４４−５５の阻害効果は
約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲内の用量依存
性であることがわかる。別のオリゴペプチド、Ｐ９６−
１０９は試験濃度のいずれでも、ＧＭ−ＣＳＦの生物活
性に影響を及ぼさなかった。これらの結果を第２図に示
す。

【００７０】実施例２ＧＭ−ＣＳＦ依存形質転換細胞系の増殖阻害本発明のオリゴペプチドのＧＭ−ＣＳＦ依存形質転換細
胞の成長、増殖の阻害能力を測定するために、次のスク
リーンを開発した。前述の如く、ネズミ以外の種から誘
導され得るオリゴペプチドを用いる時は、該種力の細胞
をスクリーニング操作に置換するのが望ましい。

【００７１】Ａ．ＧＭ−ＣＳＦ依存形質転換細胞系の培
養及び維持ネズミＧＭ−ＣＳＦ形質転換細胞系、ＨＴ−２〔Ｊ．ワ
トソン（Ｗａｔｓｏｎ）、Ｊ．エクスプ、メド（Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．）、１５０巻、１５１０頁、（１９７９
年）を参照〕をヤコブ・ロン（ＹａｃｏｖＲｏｎ）博
士〔ニュージャージィ医科歯科大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＤｅｎｔｉｓｔ
ｒｙｏｆＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）、ピスカタウェ
イ、ＮＪ〕から入手した。その他のＧＭ−ＣＳＦ依存形
質転換細胞系と置換することもできる。例えば、ヒト形
態のＧＭ−ＣＳＦを阻害するオリゴペプチドのスクリー
ニングのためには、本例のスクリーンで次のＧＭ−ＣＳ
Ｆ依存ヒト細胞系と置換することができる：ＴＡＬＬ−
１０１、ＡＭＬ−１９３、ＭＶ４−１１。これらの細胞
系は、Ｄ．サントリ（Ｓａｎｔｏｌｉ）等、Ｊ．イムノ
ル（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１３９巻、３３４８−３
３５４頁、（１９８７年）に記載されている。ＨＴ−２
細胞は、１０％ウシ胎児血清〔ハイクローン（Ｈｙｃｌ
ｏｎｅ）、ローガン（Ｌｏｇａｎ）、ＶＴ〕、抗生物質
（ペニシリン（１００単位／ｍｌ）及びストレプトマイ
シン（１００μｇ／ｍｌ））及び組換え技術で生産され
たネズミＧＭ−ＣＳＦ（ペプトテク・インコ・ロッキィ
・ヒル、ＮＪ）１０ｎｇ／ｍｌを補填したＲＰＭＩ１６
４０培地〔ＧＩＢＣＯ、グランド・アイランド（Ｇｒａ
ｎｄＩｓｌａｎｄ）、ＮＹ〕で生育させた。

【００７２】Ｂ． ^３Ｈ−チミジン取込検定ＨＴ−２細胞（１−２×１０^４／０．１ｍｌ）を１０％
ウシ胎児血清を伴うＲＰＭＩ培地中９６−ウエルマイク
ロタイタープレートに塗布した。ＧＭ−ＣＳＦ及び所望
のオリゴペプチドをウエルに加えて、最終容量０．２ｍ
ｌとした。次に、細胞をＣＯ_２培養器中３７℃で４時間
培養し、そして１μＣｉ／ウエルの^３Ｈ−メチル〕−チ
ミジン〔ニュー・イングランド・ヌクレア（ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ、ボストン、ＭＡ〕を２
５μｌ容量で加えることにより、４時間パルスラベルし
た。プレートをトムテック・ハーベスター（Ｔｏｍｔｅ
ｃｈＨａｒｖｅｓｔｅｒ）９６（オレンジ、ＣＴ）装
置を用いて収集し、そして得られたフィルターをＬＫＢ
−Ｂプレートリーダーで計測した。オリゴペプチドＰ４
４−５５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）の存在下でＨＴ−
２細胞を培養した結果を表３に示す。

【表３】表３に示した結果から、オリゴペプチドＰ４４−５５
（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）は、用量依存方式でネズミ
細胞系のＧＭ−ＣＳＦ誘起増殖を阻害することがわか
る。

【００７３】実施例３ＧＭ−ＣＳＦ阻害モノクロナール抗体の製造Ｉ．接合体の製造上記のオリゴペプチドを次の方法に従って接合した後、
免疫化のための免疫源として使用した。

【００７４】Ａ．ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）へ
の接合−グルタールアルデヒド法ＢＳＡ（１０ｍｇ）をＰＢＳの１ｍｌに溶解した。オリ
ゴペプチドＰ２４−３４（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、
Ｐ６４−７５（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、Ｐ９６−１
０９（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）及びＰ１３１−１４２
（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）のそれぞれを２ｍｇ／ｍｌの
濃度でＰＢＳに溶解した。オリゴペプチドＰ４４−５５
（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）をＰＢＳ／ジメチルホルム
アミド（「ＤＭＦ」）（５０：５０）の混合物に溶解し
た。各オリゴペプチド溶液をＢＳＡ溶液に加えた。グル
タールアルデヒド（７０％、２８．５μｌ）を１０ｍｌ
ＰＢＳで希釈した。希釈グルタールアルデヒド溶液１ｍ
ｌを攪拌しながら、各オリゴペプチド／ＢＳＡ混合物に
滴加し、そして混合物を約１〜２．５時間周囲の温度で
培養した。次に、得られたオリゴペプチド−ＢＳＡ接合
体をＰＢＳに対して透析した。

【００７５】Ｂ．チオエーテル連鎖を介したＢＳＡへの
接合オリゴペプチドＰ２４−３４（ＳＥＱＩＤＮＯ：
３）及びＰ４４−５５（ＳＳＱＩＤＮＯ：１）をＤ
ＭＦの１ｍｌに溶解した。Ｐ４４−５５の場合、オリゴ
ペプチド溶液８０μｌをｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」、３ｍｇ
／ｍｌ、ＤＭＦで希釈）３０μｍｌに加えた。Ｐ２４−
３４の場合、オリゴペプチド１５０μｌを用いた。チオ
ール基は、次の如くしてＢＳＡに導入した：即ち、ＢＳ
Ａ（ＰＢＳ１ｍｌ中１１ｍｇ）を周囲の温度で１５０
分間、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）−プロピオネート（「ＳＰＤＰ」）（ＤＭＦ３０
０μｌ中１ｍｇ）と反応させた。反応化合物を次にＰＤ
−１０〔ファルマシア・ファイン・ケミカルズ・インコ
ーポレーテッド（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈ
ｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．ピスカタウェイ、Ｎ．Ｊ．〕
カラムを通し、そしてＳＰＤＰ−ＢＳＡをボイドボリュ
ームで採集した。ピリジル保護基を除去するために、生
成物をＰＢＳの０．１ｍｌ中ジチオスレイトール１ｍｌ
と反応させた。反応混合物をＰＤ−１０カラムを通し、
そしてチオール化−ＢＳＡをボイドボリュームで採集し
た。チオール化−ＢＳＡのｐＨを１Ｍクエン酸ナトリウ
ム緩衝剤（ｐＨ６．０）０．７ｍｌを加えることによ
り、６．０〜６．５に調節した。次に、ＭＢＳ−オリゴ
ペプチドを３０分間チオール化−ＢＳＡと反応させ、そ
して反応混合物をＰＤ−１０カラムを通した。採集生成
物をボイドボリュームで採集した。Ｐ６４−７５、Ｐ９
６−１０９及びＰ１３１−１４２の接合体を製造するの
に、次の操作を用いた：指示されたオリゴペプチドはシ
ステイン残基を含有し、それ故スルフヒドリル基は、オ
リゴペプチドＰ２４−３４及びＰ４４−５５について上
述したように、導入する必要がない。代わって、ＭＢＳ
（ＤＭＦ０．５ｍｌ中４ｍｇ）をＢＳＡ（３ｍｌ中３
０ｍｇ）に滴加し、そして反応を周囲の温度で４５分間
攪拌した。反応混合物をＰＤ−１０カラムを通し、そし
てＭＢＳ−ＢＳＡをボイドボリュームで採集した。指示
されたオリゴペプチド各２ｍｇをＭＢＳ−ＢＳＡ（１０
ｍｇ）に加え、混合物を周囲の温度で３時間培養した。
次に、反応混合物をＰＢＳに対して透析した。

【００７６】Ｃ．代替法−Ｐ４４−５５の接合体Ｐ４４−５５（６ｍｇ）をＮａＯＨでｐＨ８．３に調節
した１０ＸＰＢＳ１．５ｍｌに溶解した。水０．５ｍ
ｌ中の１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチ
ル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート
（１８．５ｍｇ）をＰ４４−５５溶液に加えた。２分
後、１０ＸＰＢＳ（ｐＨ８．０）中の０．５ｍｌ（１
０ｍｇ／ｍｌ）を加え、周囲の温度で一夜培養した。得
られた接合体をＰＢＳに対して透析した。

【００７７】ＩＩ．免疫化雌Ｂａｌｂ／ｃマウス〔チャールズ・リバー・ラボラト
リーズ（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）、ボストン、マサチューセッツ〕に皮下及び
腹腔内双方に各接種のための所望のオリゴペプチド２５
μｇを投与した。接種は、１、７及び１４日に行った。
接合体を一次免疫化のために、完全フロインドアジュバ
ントと１：１（ｖ／ｖ）、そして二次及び三次免疫化の
ために不完全フロインドアジュバントと混和した。ラッ
ト〔ハーラン−スプラグエドウレイ、インディアナポ
リス、インディアナ〕をマウスと同じ方法で免疫化し
た。但し、ラットには接合体５０μｇを皮下及び腹腔内
双方で投与した。マウスをまた完全フロインドアジュバ
ントと混和した未接合オリゴペプチド（１ｍｇ／用量）
で弱免疫化した。動物からの血清を以下に記載のＥＬＩ
ＳＡ検定を用いて、抗−オリゴペプチド抗体の存在につ
いてスクリーニングした。

【００７８】ＩＩＩ．細胞融合免疫化けっ菌類から供与ひ臓細胞をフアゼカス・デ・ス
ト・グロス（ＦａｚｅｋａｓＤｅＳｔ．Ｇｒｏｔ
ｈ）及びシュナイデッガー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｇｇｅ
ｒ）の方法、（１９８年）、Ｊ．イムノル・メソド
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）、３５巻、１
頁に従って、ポリエチレングリコールを使用して、ＮＳ
／１またはＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞系〔シュルマン
（Ｓｃｈｕｌｍａｎ）等、（１９７８年）、ネイチュア
（ロンドン）（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ））、２６
７巻、２６９頁参照〕と融合させた。いずれの骨髄腫細
胞系は、グルタミン２μＭ、ストレプトマイシン（１０
０μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００μ／ｍｌ）及び２
０％ウシ胎児血清（ハイクローン、ローガン、ＵＴ）を
補填したダルベッコ変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｓ’ Ｍｅｄｉｕ
ｍ）（ＧＩＢＣＯ、グランド・アイランド、ニューヨー
ク）を培養した。融合生成物をＨＡＴ選択培地〔Ｊ．
Ｗ．リトルフィールド（Ｊ．Ｗ．Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌ
ｄ）、（１９６４年）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、４５巻、７０９頁を参照〕で母細胞集団から選択
した。この培地は、骨髄腫母細胞の増殖に用いられる増
殖培地からなり、１．３６μｇ／ｍｌヒポキサンチン
〔シグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅ
ｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）、セントルイス、ＭＯ〕、
０．３８μｇ／ｍｌチミジン（シグマ・ケミカル・カン
パニー）及び１７．６μｇ／ｍｌアミノプテリン〔レデ
レ（Ｌｅｄｅｒｌｅ）、ニューヨーク〕を補填してい
た。抗体分泌ハイブリドーマ細胞系をストレプトマイシ
ン（１００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００μ／ｍ
ｌ）及び１０％ウシ胎児血清を補填したＲＰＭＩ１６４
０培地で増殖させた。ハイブリドーマを以下に記載のＥ
ＬＩＳＡ検定法を用いて、抗−オリゴペプチド抗体の生
産についてスクリーニングした。

【００７９】Ｗ．ＥＬＩＳＡ検定イムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ）ＩＩ〔ダイナテク・サイエ
ンティフィック・インコーポレーテッド（Ｄｙｎａｔｅ
ｃｈＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．）、ケンブリッ
ジ、マサチューセッツ〕マイクロタイタープレートのウ
エルをオリゴペプチド（２５０ｎｇ／２５μｌ、０．５
Ｍ炭酸塩緩衝剤、ｐＨ９．６）で被覆し、次いで４℃で
一夜培養した。ウエルをＰＢＳで洗い、そしてＰＢＳ中
１％オボアルブミン（「緩衝剤Ｂ」、２００μｌ／ウエ
ル）で阻止した。プレートをＰＢＳで４回洗い、血清ま
たは培養物上澄液５０μｌを加えた。周囲の温度で１時
間培養した後、ウエルを０．０５％オボアルブミンを含
有するＰＢＳ（「緩衝剤Ａ」）で４回洗った。結合マウ
ス抗体をストレプタビジン・ＨｙＢＲＬスクリーン・キ
ット（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＨｙＢＲＬＳｃｒ
ｅｅｎＫｉｔ）〔ベテスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）、ベテスダ、メリーランド〕を用いて検
知した。ビオチン化山羊抗−マウス免疫グロブリンを
１：１０００希釈度（５０μｌ緩衝剤Ｂ／ウエル）で用
いた。周囲の温度で１時間培養した後、ウエルを緩衝剤
Ａで４回洗い、そしてストレプタビジンセイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ接合体（５０μｌ／ウエル、緩衝剤
Ｂ中１：１０００）を加えた。周囲の温度で３０分間培
養した後、ウエルを緩衝剤Ａで６回洗った。ウエルを
０．０１２％過酸化水素を伴うｐＨ４．５の０．１Ｍク
エン酸緩衝剤中の０−フェニレンジアミン１００μｌを
加えることにより、展開した。プレートを１５〜３０分
間培養し、そして９６−ウエル・プレート・リーダーで
４１２ｎｍでの吸光度を読み取った。表４に上述した方
法で製造し、スクリーニングしたハイブリドーマ及び得
られた抗体を列記する。

【表４】

【００８０】実施例４ＧＭ−ＣＳＦ依存性細胞の抗体による阻害Ａ．ＨＴ−２細胞の増殖及び維持上記実施例２に記載のＨＴ−２細胞をＲＰＭＩ１６４
０メディウム（ＧＩＢＣＯ、グランド・アイランド、
Ｎ．Ｙ．）で増殖させた。この培地には、１０％ウシ胎
児血清（ハイクローン、ローガン、ＵＴ）及び５ｎｇ／
ｍｌの精製組換えネズミＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテク・イ
ンコーポレーテッド、ピスカタウェイ、Ｎ．Ｊ．）を補
填した。

【００８１】Ｂ． ^３Ｈ−チミジン取込検定特定量のハイブリドーマ上澄液及び０．５ｎｇ／ｍｌネ
ズミ組換えＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテク・インコーポレー
テッド、ピスカタウェイ、Ｎ．Ｊ．）を総量１７５μｌ
で９６−ウエルマイクロタイタープレート中３７℃で１
時間培養した。ＨＴ−２細胞（１−２×１０^４細胞／２
５μｌ）をウエルに加え、ＣＯ_２培養器中３７℃で４８
時間培養し、そして２５μｌ量中、１μＣｉ／ウエルの
^３Ｈ−メチル−チミジン（ニューイングランド・ヌクレ
ア・ボストン、ＭＡ）を加えることにより、４時間パル
スラベルした。トムテック・ハーベスター９６（オレン
ジ、ＣＴ）装置を用いて、プレートを収集し、そしてＬ
ＫＢ−Ｂプレートリーダーでフィルターを計測した。こ
の方法を用いて、ＧＭ−ＣＳＦ依存細胞系の増殖を阻害
する抗体能力を測定した。これらの実験の結果を表５及
び６に示す。

【表５】

【表６】表５及び６のデータから、本発明のモノクロナール抗体
は、ＧＭ−ＣＳＦ依存細胞系ＨＴ−２の増殖を阻害する
ことがわかる。オリゴペプチドＰ４４−５５に対する抗
体は、ＧＭ−ＣＳＦの生物効果を阻害するのに特に有効
である。かかる抗体は、ＨＴ−２細胞系の増殖の用量依
存阻害を示し、検定で供試した最高濃度でこれらの細胞
の増殖を完全に阻害する。本発明のモノクロナール抗体
のネズミ骨髄細胞のＧＭ−ＣＳＦ誘起顆粒球−マクロフ
アージ形成能力を阻害する能力を表７に示す。免疫消去
法を用いて、指定のモノクロナール抗体及び山羊抗−マ
ウスセフアロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズを伴う
培養に従う溶液から、ＧＭ−ＣＳＦ活性を除去した。抗
体はまた、中和検定で指示される如く、未変性ＧＭ−Ｃ
ＳＦに結合させることにより、顆粒球及びマクロフアー
ジ骨髄始原細胞の増殖及び分化を阻害することが見出さ
れた。これらの結果を表７に示す。これらの結果から、
未変性ＧＭ−ＣＳＦ分子での配列と相同のオリゴペプチ
ドと反応性を有するモノクロナール抗体は未変性分子を
結合、阻害可能であり、それで生物活性を阻害すること
がわかる。

【表７】

【表８】

【００８２】ハイブリドーマの寄託以下に示す細胞系は、本発明の抗体を製造するのに有用
なものの例示である。これらの細胞系は、ブタペスト条
約の条件下にアメリカン・タイプ・カルチュア・コレク
ション’ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（「ＡＴＣＣ」）、１２３０
１パークローン・ドライブ、ロックヴィレ、メリーラン
ド２０８５２に寄託されている。

【表９】

【００８３】本発明は、寄託された細胞系により、その
範囲が制約されるべきものではない。その理由は、寄託
されたハイブリドーマは、本発明の個々の特徴を単に例
示することのみを企図しているものであり、本文に記載
の抗体またはハイブリドーマと同等、もしくは対応する
いずれの細胞系または抗体も本発明の範囲内に包含され
ていることを意味するからである。

【表１０】

【００８４】本発明を特定の態様について特記したが、
変化、変形をなし得るものであり、これらは本発明の範
囲及び精神の範囲内にあるものである。

【００８５】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の特定の抗体を製造するのに使用される
ネズミオリゴペプチドと相当するヒトＧＭ−ＣＳＦオリ
ゴペプチドとの比較を示す。第１図では、これらのペプ
チドをコードする野生型ヌクレオチド配列も示す。オリ
ゴペプチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩ
ＤＮＯ：２）は、ネズミ及びヒトＧＭ−ＣＳＦの対応
領域から、あるいは組換ＤＮＡ法を用いることにより、
相当するＤＮＡコード領域から誘導される。ここで、提
示されたネズミ領域を「Ｐ４４−５５」と称した。

【００８６】

【図２】本発明で使用されるオリゴペプチドの用量依存
性阻害効果を示す。

【００８７】

【図３】ヒト及びネズミＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列の
比較を示す。第３図において、下線のひいたアミノ酸
は、ヒト及びネズミ形態双方で同一である。ネズミ形態
で異なっている配列は、ヒト配列の下方に示している
（最上の線）。これらの配列は、２種の形態の間の相同
性を最大のものとするよう、一列に並べたものである。
ヒト形態の５７−５８及び６５の位置にみられる垂直線
は、配列がネズミ配列中下に示す指示されたアミノ酸に
対応するアミノ酸を有していないことを指示することを
意味している。更に、星印（＊）のついたアミノ酸は、
ヒト配列にのみ存在する。この比較により、アミノ酸レ
ベルで、ネズミ及びヒト配列は相互に高度の相同性（−
５４％）を具有していることが理解される。

【００８８】本発明の抗体を製造するのに有用な数種の
誘導可能なオリゴペプチドの配列を示す。ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：２と指示された配列は、Ｐ４４−５５と指定さ
れたネズミ配列に「相当する」ヒト配列を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年１２月１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の特定の抗体を製造するのに使用される
ネズミオリゴペプチドと相当するヒトＧＭ−ＣＳＦオリ
ゴペプチドとの比較を示す。第１図では、これらのペプ
チドをコードする野性型ヌクレオチド配列も示す。オリ
ゴペプチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩ
ＤＮＯ：２）は、ネズミ及びヒトＧＭ−ＣＳＦの対応
領域から、あるいは組換ＤＮＡ法を用いることにより、
相当するＤＮＡコード領域から誘導される。ここで、提
示されたネズミ領域を「Ｐ４４−５５」と称した。

【図４】本発明の抗体を製造するのに有用な数種の誘導
可能なオリゴペプチドの配列を示す。ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：２と指示された配列は、Ｐ４４−５５と指定された
ネズミ配列に「相当する」ヒト配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＵＮ 8413−4ＣＣ１２Ｎ 5/20 5/28 // Ｃ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡＺ 8318−4Ｈ 7/08 8318−4ＨＣ１２Ｎ 15/06 15/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者ロバートエスグリーンフィールドアメリカ合衆国コネチカット州 06492 ウォーリングフォードシーターヒルロード 10 (72)発明者ゲリーアールブラスロースキィアメリカ合衆国コネチカット州 06033 グラストンバリーヘリテージドライブ 124

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＧＭ−ＣＳＦの生物活性を阻害し得るモ
ノクロナール抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】造血前駆細胞でのＧＭ−ＣＳＦの効果を
阻害し得る請求項１のモノクロナール抗体またはそのフ
ラグメント。
【請求項３】顆粒球の骨髄前駆体でのＧＭ−ＣＳＦ効
果を阻害し得る請求項１または２のモノクロナール抗体
またはそのフラグメント。
【請求項４】マクロフアージの骨髄前駆体でのＧＭ−
ＣＳＦ効果を阻害し得る請求項１または２のモノクロナ
ール抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】ＧＭ−ＣＳＦ依存腫瘍疾患の生育を阻害
し得る請求項１または２のモノクロナール抗体またはそ
のフラグメント。
【請求項６】マクロフアージまたは顆粒球の過剰生産
を包括する疾患の望ましくない効果を阻害または阻害し
得る請求項１のモノクロナール抗体またはそのフラグメ
ント。
【請求項７】ヒトＧＭ−ＣＳＦの生物活性を阻害し得
る請求項１〜６のいずれか１項記載のモノクロナール抗
体またはそのフラグメント。
【請求項８】配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）の
部分：ＡｓｎＬｅｕＳｅｒＡｒｇＡｓｐＴｈ
ｒＡｌａＡｌａＧｌｕＭｅｔＡｓｎＧｌｕ．
と反応性を有する請求項７のＧＭ−ＣＳＦ阻害抗体また
はそのフラグメント。
【請求項９】配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）の
部分：ＡｓｎＬｅｕＳｅｒＡｒｇＡｓｐＴｈ
ｒＡｌａＡｌａＧｌｕＭｅｔＡｓｎＧｌｕ．
と反応性を有する請求項８のＧＭ−ＣＳＦ阻害抗体また
はそのフラグメント。
【請求項１０】製薬上、許容し得る担体、希釈剤または
医薬品添加物と組み合わされた請求項１〜９のいずれか
１項記載のモノクロナール抗体、またはそのフラグメン
トを活性成分として、包含する製薬処方物。
【請求項１１】ＧＭ−ＣＳＦの生物効果を阻害するのに
使用される請求項１〜９のいずれか１項記載のモノクロ
ナール抗体。
【請求項１２】請求項１〜９のいずれか１項記載のモノ
クロナール抗体を生産し得るハイブリドーマ細胞系。
【請求項１３】請求項１〜９のいずれか１項記載のモノ
クロナール抗体を発現する細胞系を培養し、任意に生産
された抗体のフラグメントを調製し、そして所望によ
り、得られた生成物を精製することからなるモノクロナ
ール抗体またはそのフラグメントの製造方法。