JPH0517837B2 - - Google Patents
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- JPH0517837B2 JPH0517837B2 JP59246292A JP24629284A JPH0517837B2 JP H0517837 B2 JPH0517837 B2 JP H0517837B2 JP 59246292 A JP59246292 A JP 59246292A JP 24629284 A JP24629284 A JP 24629284A JP H0517837 B2 JPH0517837 B2 JP H0517837B2
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Description
産業上の利用分野
本発明は、臨床診断、生化学的研究等の分野に
おいてα−アミラーゼの活性を測定するために使
用する試薬に関するものである。 従来の技術 血液が尿などの体液中に含まれているα−アミ
ラーゼの活性測定は、臨床診断や生化学的研究に
おける重要な基礎データを提供するものであり、
広く実施されている。その場合に採用される酵素
活性測定法としては種々の方法があるが、近年開
発された方法の一つに、マルトオリゴ糖の還元性
分子末端にインジケーター化合物としてフエノー
ル類をグルコシド結合させてなる基質または無処
理マルトオリゴ糖からなる基質に、α−グルコシ
ダーゼ（またはα−グルコシダーゼおよびβ−グ
ルコシダーゼ）の存在下または不存在下に、検体
中のα−アミラーゼを作用させ、遊離するインジ
ケーター化合物またはグルコースを定量すること
によつてα−アミラーゼの活性を知る方法がある
（米国特許第3879263号、特公昭57−53079等）。こ
の場合に作用させるα−グルコシダーゼやβ−グ
ルコシダーゼは追随酵素と呼ばれ、これを用いる
と上記基質の加水分解が化学量論的に進行し、測
定精度が向上する。具体的には、たとえばα−ア
ミラーゼを含有する検体に基質としてｐ−ニトロ
フエニル−α−マルトペンタオサイドを、また追
随酵素としてα−グルコシダーゼを、それぞれ加
え、まずα−アミラーゼの作用によりｐ−ニトロ
フエニル−α−マルトペンタオサイドからｐ−ニ
トロフエニル−α−マルトサイドおよびマルトト
リオースを生成させ、これらに次いで追随酵素を
作用させてｐ−ニトロフエノールおよびグルコー
スを生成させ、インジケーター化合物である前者
の生成量の時間的変化を追跡することによりα−
アミラーゼの活性を知る。この場合、ｐ−ニトロ
フエノールは波長400nｍ付近に極大吸収を有し、
一方、これが結合した基質・ｐ−ニトロフエニル
−α−マルトペンタオサイドは波長300nｍ付近
に極大吸収を有するから、波長400nｍ付近の吸
光度を測定することにより、遊離したインジケー
ター化合物の定量を容易に行うことができる。 上記例のほかにも、芳香環に直結したニトロ基
または芳香環と共役する炭素−炭素間２重結合を
介して芳香環と結合したニトロ基を有する芳香族
フエノール類（以下、ニトロ基置換フエノール類
という）をインジケーター化合物として結合させ
た基質を用いてα−アミラーゼ活性を測定する方
法は幾つか提案されており、その一つとして、吸
光度測定による定量値がPH変動の影響を受け難い
点でより有利な、ｏ−ハロゲン置換ニトロフエノ
ールがインジケーター化合物として結合されたｏ
−ハロゲン置換ニトロフエニルマルトオリゴサイ
ドを基質として用いる方法（本発明者らによるも
ので、特願昭58−111296号として特許出願；未公
開）がある。 発明が解決しようとする問題点 追随酵素を用いるα−アミラーゼ活性測定法
は、特に基質としてニトロ基置換フエノール類が
結合されたものを用いる場合、測定が簡単で測定
精度もよく、すぐれたものであるが、検体がα−
アミラーゼを全く含有しないものの場合でも、追
随酵素が基質を加水分解させ（いわゆるブランク
反応）、偽似アミラーゼ活性測定値を与えるので、
それを補正することが必要であり、また、ブラン
ク反応が急速であるときは、基質を追随酵素とか
らなる酵素活性測定試薬が使われる前に有効基質
濃度の低下を招くし、ブランク値も大きくなつて
酵素活性測定精度が悪くなるという問題がある。 本発明の目的は、基質と追随酵素とを併用する
α−アミラーゼ活性測定法における上述のような
問題点を解決し、ブランク反応を起こし難く安定
性のよいα−アミラーゼ活性測定用試薬を提供す
ることにある。 問題点を解決するための手段 上記目的と達成することに成功した本発明は、
マルトオリゴ糖の還元性分子末端にフエノール類
を結合させてなるグルコシドまたはマルトオリゴ
糖をα−アミラーゼの基質として含有し、α−グ
ルコシダーゼを追随酵素として含有するα−アミ
ラーゼの活性測定用試薬に、非イオン界面活性剤
またはデキストラン硫酸エステルもしくはその塩
をブランク反応抑制のための助剤として含有させ
たことを特徴とするものである。 本発明によるα−アミラーゼ活性測定用試薬に
含有させる非イオン界面活性剤、デキストラン硫
酸エステルもしくはその塩の量は、全液量に対し
て0.01〜5w／ｖ％程度でよく、特にデキストラ
ン硫酸エステルとその塩の場合、有効量の下限は
約0.001％である。非イオン界面活性剤とデキス
トラン硫酸エステル（またはその塩）は併用して
もよく、その場合はそれらを単独で用いた場合よ
りも一層顕著な使用効果が得られる。 本発明によるα−アミラーゼ活性測定用試薬に
含有させる非イオン界面活性剤は、水溶性の点で
問題のないHLB値12以上のものであればなんで
もよいが、使用可能なものの具体例としては次の
ようなものがある。これらは２種以上を併用して
もよい。 (i) ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリ
オキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシ
エチレンステアリルエーテル等のポリオキシエ
チレン長鎖アルキルエーテル。 (ii) ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテ
ル、ポリオキシエチレンオクチルフエニルエー
テル等のポリオキシエチレンアルキルエーテ
ル。 (iii) ポリオキシエチレンモノラウレート、ポリオ
キシエチレンモノオレエート、ポリオキシエチ
レンモノステアレート等のポリオキシエチレン
脂肪酸エステル。 (iv) ポリオキシエチレンステアリルエーテルラウ
レート、ポリオキシエチレンノニルフエニルエ
ーテルラウレレート等の、ポリオキシエチレン
アルキルエーテルもしくはポリオキシエチレン
アルキルアリールエーテルの脂肪族エステル。 (v) ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレー
ト、ポリオキシエチレンソルビタントリラウレ
ート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステ
アレート、ポリオキシエチレンソルビタントリ
ステアレート、ポリオキシエチレンソルビタン
モノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタ
ントリオレエート、ポリオキシエチレンペンタ
エリスリトールモノラウレート等の、多価アル
コール脂肪族エステルのポリエチレンオキシド
付加物。 (vi) その他、ポリエチレングリコール類、ポリオ
キシエチレン−ポリオキシプロピレンブロツク
共重合体類、ポリプロピレングリコール類な
ど。 また、デキストラン硫酸エステルとしては分子
量が約５万〜100万のものが使われ、その塩とし
ては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金
属塩が適当である。 α−アミラーゼの活性測定用試薬の基本的な成
分の一つである基質は、前述のような原理による
α−アミラーゼの活性測定を可能にするマルトオ
リゴ糖またはこれとフエノール類とから形成され
た各種グルコシドの中から任意に選ぶことができ
るが、特に適当な基質の具体例としては次のよう
なものがある。 (i) マルトオリゴ糖類 マルトテトラオース、マルトペンタオース、
マルトヘキサオース、マルトヘプタオース等。 (ii) ｐ−ニトロフエニルマルトオリゴサイド類 ｐ−ニトロフエニル−α−マルトペンタオサ
イド、ｐ−ニトロフエニル−β−マルトペンタ
オサイド、ｐ−ニトロフエニル−α−マルトヘ
キサオサイド、ｐ−ニトロフエニル−β−マル
トヘキサオサイド、ｐ−ニトロフエニル−α−
マルトヘプタオサイド、ｐ−ニトロフエニル−
β−マルトヘプタオサイド等。 (iii) ハロゲン置換ニトロフエニルマルトオリゴサ
イド類２−クロル−４−ニトロフエニル−α−
マルトペンタオサイド、２−クロル−４−ニト
ロフエニル−β−マルトペンタオサイド、２−
クロル−４−ニトロフエニル−β−マルトヘキ
サオサイド、２−クロル−４−ニトロフエニル
−β−マルトヘプタオサイド、２，６−ジクロ
ル−４−ニトロフエニル−α−マルトペンタオ
サイド、３，５−ジクロル−４−ニトロフエニ
ル−α−マルトペンタオサイド、２，６−ジク
ロル−４−ニトロフエニル−β−マルトペンタ
オサイド、２−ブロム−４−ニトロフエニル−
α−マルトペンタオサイド等。 また、いま一つの基本的な成分である追随酵素
すなわちα−グルコシダーゼおよびβ−グルコシ
ダーゼとしては、いかなる起源のものを用いても
よく、たとえばサツカロマイセス・カルロスベン
ゲンシス、酵母などから得られたα−グルコシダ
ーゼや、アーモンドから得られたβ−グルコシダ
ーゼを用いることができる。 本発明によるα−アミラーゼの活性測定用試薬
には、上記各成分のほかに、活性測定に必要な他
の酵素類、緩衝液（PH6.5〜7.5のものが好まし
い）、抗生物質、サルフア剤等の化学療法剤、キ
レート剤（エチレンジアミン四酢酸塩等）、安定
剤（カルシウム塩など）等を、用いる基質や検体
の種類に応じて適宜配合することができる。 本発明によるα−アミラーゼの活性測定用試薬
は、非イオン界面活性剤など、従来α−アミラー
ゼ活性測定には使われたことのない助剤を含有す
るが、この試薬を用いるα−アミラーゼの活性測
定に特殊な操作は不要であつて、マルトオリゴ糖
またはこれとフエノール類とから形成されたグル
コシドをα−アミラーゼの基質として含有し、α
−グルコシダーゼを追随酵素として含有する従来
のα−アミラーゼ活性測定用試薬を用いる場合と
全く同様にして測定を行うことができる。すなわ
ち、検体と基質との反応と同時に、あるいは反応
前または反応後に、α−グルコシダーゼおよびβ
−グルコシダーゼを非イオン界面活性剤またはデ
キストラン硫酸エステル（またはその塩）ととも
に添加して反応させる。そして基質から遊離した
グルコースまたはフエノール類を常法により定量
することにより、α−アミラーゼの活性を測定す
る。グルコースを定量する方法としては、たとえ
ばグルコースオキシダーゼを作用させ、生成する
過酸化水素をパーオキシダーゼおよび呈色試薬と
反応させ、生成物の吸光度を測定する方法、生成
する過酸化水素を直接、過酸化水素電極を用いる
電気的方法により定量する方法、グルコース−６
−リン酸脱水酵素、ヘキソキナーゼ、アデノシン
−３−リン酸およびニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドを作用させ、生成する還元性ニコチン
アミドアデニンヌクレオチドの340nｍの吸光度
変化を測定する方法などがある。フエノール類を
定量する方法としては、遊離したフエノール類が
たとえばｐ−ニトロフエノールやｏ−クロル−ｐ
−ニトロフエノールの場合は直接吸光度変化を測
定する方法があり、フエノール類がフエノール、
２，６−ジクロロフエノール等の場合は、呈色試
薬たとえば４−アミノアンチピリンを添加して酸
化縮合させ、生成物の吸光度を測定する方法など
がある。 本発明の試薬は、従来のこの種の試薬と同様、
血清、尿、膵液、だ液などに含まれるα−アミラ
ーゼの活性測定に広く使用することができる。 発明の効果 本発明によるα−アミラーゼの活性測定用試薬
は、上述のように追随酵素によるブランク反応を
抑制する作用を有する非イオン界面活性剤または
デキストラン理酸エステルもしくはその塩を含有
させたものであるから、使用前の基質分解がほと
んどなく安定性にすぐれており、また、これを用
いてα−アミラーゼの活性測定用を行うときはブ
ランク値が小さく、かつ添加した助剤による妨害
もないから、従来よりも精度の高い測定を行うこ
とができる。 実施例 以下実施例および実験例を示して本発明を説明
する。 実施例 １ 50ｍＭ PIPES※ 緩衝液（PH7.0） ２−クロル−４−ニトロフエニル−β−マルトペ
ンタオサイド ５ｍＭ α−グルコシダーゼ 80U／ml β−グルコシダーゼ 10U／ml CaCl １ｍＭ NaCl １ｍＭ ※ ピペラジン−Ｎ，N′−ビス（２−エタン
スルホン酸） 上記の基本組成を有する試薬に第１表記載のと
おりの助剤を添加してα−アミラーゼの活性測定
用試薬Ａ〜Ｘを調製した。また対照例として、助
剤無添加のもの(a)を用意した。 上記試薬により、血清および尿を検体として、
下記の方法によりα−アミラーゼの活性測定を行
なつた。 37℃で５分間加温した試薬３mlを試料20μに
加えて反応させ、添加後４分から８分までの直線
部を400nｍで測定する。追随酵素によるフラン
ク反応を知るため、水を試料として同様の測定を
行う。 各測定例における１分間の吸光度変化を第１表
に示す（検体についての測定値は水を試料とした
ときの測定値をブランク値として除いてある。）。 同表から明らかなように、本発明の実施例品を
用いた場合は対照例に比べてブランク値が、少な
い場合でも24％、最高92％も低下した。また、助
剤による妨害も認められなかつた。 （なお第１表および後記第２表において、ポリオ
キシエチレンアルキルエーテルは日光ケミカルズ
社製・BL−8SY、ポリオキシエチレンアルキル
フエニルエーテルはシグマ社製・トリトンＸであ
り、いずれもアルキル基の炭素数は不明である。） 実験例 50ｍＭ PIPES緩衝液（PH7.0）マルトヘプタオ
ース 15ｍＭ グルコース−６−リン酸脱水素酵素 6U／ml α−グルコシダーゼ 80U／ml ヘキソキナーゼ 5U／ml CaCl １ｍＭ NaCl １ｍＭ アデノシン−３−リン酸 １ｍＭ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド 2.5ｍＭ 上記の基本組成を有する試薬に第２表記載のと
おりの助剤を添加してα−アミラーゼの活性測定
用試薬Ａ〜Ｘを調製した。また対照例として、助
剤無添加のもの(a)を用意した。 上記試薬について、調製直後および４℃で24時
間保存後に、340nｍの吸光度を測定した。その
結果を第２表に示す。 同表から、本発明の実施例品は対照例に比べて
保存による吸光度変化が少なく、安定性がすぐれ
ていることがわかる。
おいてα−アミラーゼの活性を測定するために使
用する試薬に関するものである。 従来の技術 血液が尿などの体液中に含まれているα−アミ
ラーゼの活性測定は、臨床診断や生化学的研究に
おける重要な基礎データを提供するものであり、
広く実施されている。その場合に採用される酵素
活性測定法としては種々の方法があるが、近年開
発された方法の一つに、マルトオリゴ糖の還元性
分子末端にインジケーター化合物としてフエノー
ル類をグルコシド結合させてなる基質または無処
理マルトオリゴ糖からなる基質に、α−グルコシ
ダーゼ（またはα−グルコシダーゼおよびβ−グ
ルコシダーゼ）の存在下または不存在下に、検体
中のα−アミラーゼを作用させ、遊離するインジ
ケーター化合物またはグルコースを定量すること
によつてα−アミラーゼの活性を知る方法がある
（米国特許第3879263号、特公昭57−53079等）。こ
の場合に作用させるα−グルコシダーゼやβ−グ
ルコシダーゼは追随酵素と呼ばれ、これを用いる
と上記基質の加水分解が化学量論的に進行し、測
定精度が向上する。具体的には、たとえばα−ア
ミラーゼを含有する検体に基質としてｐ−ニトロ
フエニル−α−マルトペンタオサイドを、また追
随酵素としてα−グルコシダーゼを、それぞれ加
え、まずα−アミラーゼの作用によりｐ−ニトロ
フエニル−α−マルトペンタオサイドからｐ−ニ
トロフエニル−α−マルトサイドおよびマルトト
リオースを生成させ、これらに次いで追随酵素を
作用させてｐ−ニトロフエノールおよびグルコー
スを生成させ、インジケーター化合物である前者
の生成量の時間的変化を追跡することによりα−
アミラーゼの活性を知る。この場合、ｐ−ニトロ
フエノールは波長400nｍ付近に極大吸収を有し、
一方、これが結合した基質・ｐ−ニトロフエニル
−α−マルトペンタオサイドは波長300nｍ付近
に極大吸収を有するから、波長400nｍ付近の吸
光度を測定することにより、遊離したインジケー
ター化合物の定量を容易に行うことができる。 上記例のほかにも、芳香環に直結したニトロ基
または芳香環と共役する炭素−炭素間２重結合を
介して芳香環と結合したニトロ基を有する芳香族
フエノール類（以下、ニトロ基置換フエノール類
という）をインジケーター化合物として結合させ
た基質を用いてα−アミラーゼ活性を測定する方
法は幾つか提案されており、その一つとして、吸
光度測定による定量値がPH変動の影響を受け難い
点でより有利な、ｏ−ハロゲン置換ニトロフエノ
ールがインジケーター化合物として結合されたｏ
−ハロゲン置換ニトロフエニルマルトオリゴサイ
ドを基質として用いる方法（本発明者らによるも
ので、特願昭58−111296号として特許出願；未公
開）がある。 発明が解決しようとする問題点 追随酵素を用いるα−アミラーゼ活性測定法
は、特に基質としてニトロ基置換フエノール類が
結合されたものを用いる場合、測定が簡単で測定
精度もよく、すぐれたものであるが、検体がα−
アミラーゼを全く含有しないものの場合でも、追
随酵素が基質を加水分解させ（いわゆるブランク
反応）、偽似アミラーゼ活性測定値を与えるので、
それを補正することが必要であり、また、ブラン
ク反応が急速であるときは、基質を追随酵素とか
らなる酵素活性測定試薬が使われる前に有効基質
濃度の低下を招くし、ブランク値も大きくなつて
酵素活性測定精度が悪くなるという問題がある。 本発明の目的は、基質と追随酵素とを併用する
α−アミラーゼ活性測定法における上述のような
問題点を解決し、ブランク反応を起こし難く安定
性のよいα−アミラーゼ活性測定用試薬を提供す
ることにある。 問題点を解決するための手段 上記目的と達成することに成功した本発明は、
マルトオリゴ糖の還元性分子末端にフエノール類
を結合させてなるグルコシドまたはマルトオリゴ
糖をα−アミラーゼの基質として含有し、α−グ
ルコシダーゼを追随酵素として含有するα−アミ
ラーゼの活性測定用試薬に、非イオン界面活性剤
またはデキストラン硫酸エステルもしくはその塩
をブランク反応抑制のための助剤として含有させ
たことを特徴とするものである。 本発明によるα−アミラーゼ活性測定用試薬に
含有させる非イオン界面活性剤、デキストラン硫
酸エステルもしくはその塩の量は、全液量に対し
て0.01〜5w／ｖ％程度でよく、特にデキストラ
ン硫酸エステルとその塩の場合、有効量の下限は
約0.001％である。非イオン界面活性剤とデキス
トラン硫酸エステル（またはその塩）は併用して
もよく、その場合はそれらを単独で用いた場合よ
りも一層顕著な使用効果が得られる。 本発明によるα−アミラーゼ活性測定用試薬に
含有させる非イオン界面活性剤は、水溶性の点で
問題のないHLB値12以上のものであればなんで
もよいが、使用可能なものの具体例としては次の
ようなものがある。これらは２種以上を併用して
もよい。 (i) ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリ
オキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシ
エチレンステアリルエーテル等のポリオキシエ
チレン長鎖アルキルエーテル。 (ii) ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテ
ル、ポリオキシエチレンオクチルフエニルエー
テル等のポリオキシエチレンアルキルエーテ
ル。 (iii) ポリオキシエチレンモノラウレート、ポリオ
キシエチレンモノオレエート、ポリオキシエチ
レンモノステアレート等のポリオキシエチレン
脂肪酸エステル。 (iv) ポリオキシエチレンステアリルエーテルラウ
レート、ポリオキシエチレンノニルフエニルエ
ーテルラウレレート等の、ポリオキシエチレン
アルキルエーテルもしくはポリオキシエチレン
アルキルアリールエーテルの脂肪族エステル。 (v) ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレー
ト、ポリオキシエチレンソルビタントリラウレ
ート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステ
アレート、ポリオキシエチレンソルビタントリ
ステアレート、ポリオキシエチレンソルビタン
モノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタ
ントリオレエート、ポリオキシエチレンペンタ
エリスリトールモノラウレート等の、多価アル
コール脂肪族エステルのポリエチレンオキシド
付加物。 (vi) その他、ポリエチレングリコール類、ポリオ
キシエチレン−ポリオキシプロピレンブロツク
共重合体類、ポリプロピレングリコール類な
ど。 また、デキストラン硫酸エステルとしては分子
量が約５万〜100万のものが使われ、その塩とし
ては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金
属塩が適当である。 α−アミラーゼの活性測定用試薬の基本的な成
分の一つである基質は、前述のような原理による
α−アミラーゼの活性測定を可能にするマルトオ
リゴ糖またはこれとフエノール類とから形成され
た各種グルコシドの中から任意に選ぶことができ
るが、特に適当な基質の具体例としては次のよう
なものがある。 (i) マルトオリゴ糖類 マルトテトラオース、マルトペンタオース、
マルトヘキサオース、マルトヘプタオース等。 (ii) ｐ−ニトロフエニルマルトオリゴサイド類 ｐ−ニトロフエニル−α−マルトペンタオサ
イド、ｐ−ニトロフエニル−β−マルトペンタ
オサイド、ｐ−ニトロフエニル−α−マルトヘ
キサオサイド、ｐ−ニトロフエニル−β−マル
トヘキサオサイド、ｐ−ニトロフエニル−α−
マルトヘプタオサイド、ｐ−ニトロフエニル−
β−マルトヘプタオサイド等。 (iii) ハロゲン置換ニトロフエニルマルトオリゴサ
イド類２−クロル−４−ニトロフエニル−α−
マルトペンタオサイド、２−クロル−４−ニト
ロフエニル−β−マルトペンタオサイド、２−
クロル−４−ニトロフエニル−β−マルトヘキ
サオサイド、２−クロル−４−ニトロフエニル
−β−マルトヘプタオサイド、２，６−ジクロ
ル−４−ニトロフエニル−α−マルトペンタオ
サイド、３，５−ジクロル−４−ニトロフエニ
ル−α−マルトペンタオサイド、２，６−ジク
ロル−４−ニトロフエニル−β−マルトペンタ
オサイド、２−ブロム−４−ニトロフエニル−
α−マルトペンタオサイド等。 また、いま一つの基本的な成分である追随酵素
すなわちα−グルコシダーゼおよびβ−グルコシ
ダーゼとしては、いかなる起源のものを用いても
よく、たとえばサツカロマイセス・カルロスベン
ゲンシス、酵母などから得られたα−グルコシダ
ーゼや、アーモンドから得られたβ−グルコシダ
ーゼを用いることができる。 本発明によるα−アミラーゼの活性測定用試薬
には、上記各成分のほかに、活性測定に必要な他
の酵素類、緩衝液（PH6.5〜7.5のものが好まし
い）、抗生物質、サルフア剤等の化学療法剤、キ
レート剤（エチレンジアミン四酢酸塩等）、安定
剤（カルシウム塩など）等を、用いる基質や検体
の種類に応じて適宜配合することができる。 本発明によるα−アミラーゼの活性測定用試薬
は、非イオン界面活性剤など、従来α−アミラー
ゼ活性測定には使われたことのない助剤を含有す
るが、この試薬を用いるα−アミラーゼの活性測
定に特殊な操作は不要であつて、マルトオリゴ糖
またはこれとフエノール類とから形成されたグル
コシドをα−アミラーゼの基質として含有し、α
−グルコシダーゼを追随酵素として含有する従来
のα−アミラーゼ活性測定用試薬を用いる場合と
全く同様にして測定を行うことができる。すなわ
ち、検体と基質との反応と同時に、あるいは反応
前または反応後に、α−グルコシダーゼおよびβ
−グルコシダーゼを非イオン界面活性剤またはデ
キストラン硫酸エステル（またはその塩）ととも
に添加して反応させる。そして基質から遊離した
グルコースまたはフエノール類を常法により定量
することにより、α−アミラーゼの活性を測定す
る。グルコースを定量する方法としては、たとえ
ばグルコースオキシダーゼを作用させ、生成する
過酸化水素をパーオキシダーゼおよび呈色試薬と
反応させ、生成物の吸光度を測定する方法、生成
する過酸化水素を直接、過酸化水素電極を用いる
電気的方法により定量する方法、グルコース−６
−リン酸脱水酵素、ヘキソキナーゼ、アデノシン
−３−リン酸およびニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドを作用させ、生成する還元性ニコチン
アミドアデニンヌクレオチドの340nｍの吸光度
変化を測定する方法などがある。フエノール類を
定量する方法としては、遊離したフエノール類が
たとえばｐ−ニトロフエノールやｏ−クロル−ｐ
−ニトロフエノールの場合は直接吸光度変化を測
定する方法があり、フエノール類がフエノール、
２，６−ジクロロフエノール等の場合は、呈色試
薬たとえば４−アミノアンチピリンを添加して酸
化縮合させ、生成物の吸光度を測定する方法など
がある。 本発明の試薬は、従来のこの種の試薬と同様、
血清、尿、膵液、だ液などに含まれるα−アミラ
ーゼの活性測定に広く使用することができる。 発明の効果 本発明によるα−アミラーゼの活性測定用試薬
は、上述のように追随酵素によるブランク反応を
抑制する作用を有する非イオン界面活性剤または
デキストラン理酸エステルもしくはその塩を含有
させたものであるから、使用前の基質分解がほと
んどなく安定性にすぐれており、また、これを用
いてα−アミラーゼの活性測定用を行うときはブ
ランク値が小さく、かつ添加した助剤による妨害
もないから、従来よりも精度の高い測定を行うこ
とができる。 実施例 以下実施例および実験例を示して本発明を説明
する。 実施例 １ 50ｍＭ PIPES※ 緩衝液（PH7.0） ２−クロル−４−ニトロフエニル−β−マルトペ
ンタオサイド ５ｍＭ α−グルコシダーゼ 80U／ml β−グルコシダーゼ 10U／ml CaCl １ｍＭ NaCl １ｍＭ ※ ピペラジン−Ｎ，N′−ビス（２−エタン
スルホン酸） 上記の基本組成を有する試薬に第１表記載のと
おりの助剤を添加してα−アミラーゼの活性測定
用試薬Ａ〜Ｘを調製した。また対照例として、助
剤無添加のもの(a)を用意した。 上記試薬により、血清および尿を検体として、
下記の方法によりα−アミラーゼの活性測定を行
なつた。 37℃で５分間加温した試薬３mlを試料20μに
加えて反応させ、添加後４分から８分までの直線
部を400nｍで測定する。追随酵素によるフラン
ク反応を知るため、水を試料として同様の測定を
行う。 各測定例における１分間の吸光度変化を第１表
に示す（検体についての測定値は水を試料とした
ときの測定値をブランク値として除いてある。）。 同表から明らかなように、本発明の実施例品を
用いた場合は対照例に比べてブランク値が、少な
い場合でも24％、最高92％も低下した。また、助
剤による妨害も認められなかつた。 （なお第１表および後記第２表において、ポリオ
キシエチレンアルキルエーテルは日光ケミカルズ
社製・BL−8SY、ポリオキシエチレンアルキル
フエニルエーテルはシグマ社製・トリトンＸであ
り、いずれもアルキル基の炭素数は不明である。） 実験例 50ｍＭ PIPES緩衝液（PH7.0）マルトヘプタオ
ース 15ｍＭ グルコース−６−リン酸脱水素酵素 6U／ml α−グルコシダーゼ 80U／ml ヘキソキナーゼ 5U／ml CaCl １ｍＭ NaCl １ｍＭ アデノシン−３−リン酸 １ｍＭ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド 2.5ｍＭ 上記の基本組成を有する試薬に第２表記載のと
おりの助剤を添加してα−アミラーゼの活性測定
用試薬Ａ〜Ｘを調製した。また対照例として、助
剤無添加のもの(a)を用意した。 上記試薬について、調製直後および４℃で24時
間保存後に、340nｍの吸光度を測定した。その
結果を第２表に示す。 同表から、本発明の実施例品は対照例に比べて
保存による吸光度変化が少なく、安定性がすぐれ
ていることがわかる。
【表】
【表】
【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ マルトオリゴ糖の還元性分子末端にフエノー
ル類を結合させてなるグルコシドまたはマルトオ
リゴ糖をα−アミラーゼの基質として含有し、α
−グルコシダーゼを追随酵素として含有するα−
アミラーゼの活性測定用試薬において、非イオン
界面活性剤またはデキストラン硫酸エステルもし
くはその塩を含有することを特徴とするα−アミ
ラーゼの活性測定用試薬。 ２ 追随酵素として更にβ−グルコシダーゼを含
有する特許請求の範囲第１項記載の試薬。 ３ 基質がハロゲン置換ニトロフエニルマルトオ
リゴサイドである特許請求の範囲第１項記載の試
薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24629284A JPS61124397A (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | α−アミラ−ゼの活性測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24629284A JPS61124397A (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | α−アミラ−ゼの活性測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61124397A JPS61124397A (ja) | 1986-06-12 |
| JPH0517837B2 true JPH0517837B2 (ja) | 1993-03-10 |
Family
ID=17146376
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24629284A Granted JPS61124397A (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | α−アミラ−ゼの活性測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61124397A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100374358B1 (ko) * | 2000-07-13 | 2003-03-04 | 주식회사 코메드 | 미생물 동정을 위한 비피검사법과 구연산염 검사법을대체하는 글루코시드 분해검사배지와 셀로비오스분해검사배지 및 그 검사법 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3879263A (en) * | 1973-09-06 | 1975-04-22 | Du Pont | Method for the determination of amylase |
| JPS5337096A (en) * | 1976-09-14 | 1978-04-05 | Du Pont | Determination of amylase |
| AT362526B (de) * | 1977-09-13 | 1981-05-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagens zur bestimmung von alpha- -amylase |
| JPH0236238B2 (ja) * | 1982-11-06 | 1990-08-16 | Toyo Boseki | Arufuaaamiraazekatsuseisokuteishaku |
-
1984
- 1984-11-22 JP JP24629284A patent/JPS61124397A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61124397A (ja) | 1986-06-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |